具有降胆固醇作用的鼠李糖乳杆菌及用途
阅读：3发布：2021-02-16
专利汇可以提供具有降胆固醇作用的鼠李糖乳杆菌及用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种具有降胆固醇作用的鼠李糖乳杆菌及用途。如果人们摄入高胆固醇食物过高，体内胆固醇的合成与代谢负荷过重，血液中胆固醇升高，引起包括动脉血管壁胆固醇的沉淀，诱发动脉硬化等心血管等 疾病 的发生，本发明由采集于自然 发酵 豆制品中，经分离、纯化、物理诱变、优选获得的高活性菌株，菌学分类名称：鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus SCF 20120718。菌学特性：置于37℃恒温 培养箱 的培养基中进行培养，通过培养发现稀释浓度为10‑5时菌生长较良好，菌落分散。在相同条件下菌落生长有大有小，菌落呈圆形，乳白色，边缘整齐，表面光滑，其中较小的菌落微黄色，保藏号为：CGMCC No.7085。本发明提供 预防 和 治疗 心脑 血管疾病 的 益生菌 功能性保健品原料。，下面是具有降胆固醇作用的鼠李糖乳杆菌及用途专利的具体信息内容。
1.一种来源于发酵豆浆具有降胆固醇作用的鼠李糖乳杆菌，其特征是：所述的鼠李糖乳杆菌是 采集于自然发酵豆制品中，经分离、纯化、物理诱变、优选获得的高活性菌株，菌学分类名称Lactobacillus rhamnosus SCF 20120718，菌学特性：置于37℃恒温培养箱的培养基中进行培养，通过培养发现稀释浓度为10-5时菌生长较良好，菌落分散；在相同条件下菌落生长有大有小，菌落呈圆形，乳白色，边缘整齐，表面光滑，其中较小的菌落微黄色，保藏号为：CGMCC No.7085。
2.一种利用权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌制作的豆浆，其特征是：将权利要求1的菌株接种于经大豆浸泡，研磨、匀浆、煮沸，过滤、高温灭菌制得的豆浆中，37℃ -42℃发酵24 小时以上，制得酸豆浆。
具有降胆固醇作用的鼠李糖乳杆菌及用途
[0001] 技术领域：
[0003] 背景技术：
[0004] 人体内胆固醇通常是游离和胆固醇酯两种形式存在于细胞和组织中，在脑及神经组织、肾、皮肤、肝脏和胆汁中分布较高，是体内膜结构中的重要组分，参与形成生物膜，在血浆脂蛋白合成、脂类代谢、神经兴奋的传导过程中也起重要作用，还是胆汁酸，维生素D 以及多种激素的合成原料，因此，胆固醇是维持机体生理机能所不可缺少的重要物质。但是胆固醇在机体内发挥其重要作用的同时，如在机体尤其血液中过高也会产生一定的危害，影响到新陈代谢，诱发癌症；还可以导致心血管内皮细胞功能紊乱，特别是低密度脂蛋白过高会影响到钙离子调控异常，是心血管功能失常，导致心脑血管受损和疾病发生。还有可能诱发老年痴呆症的发生。
[0005] 正常情况下机体胆固醇三分之二主要由肝脏、小肠壁等器官内源合成，其余由饮食中含有胆固醇的食物主要有家禽蛋类、动物内脏及肌肉组织如猪肝、肥肉外源获取，如果人们长期饮食结构不合理，摄入高胆固醇食物过高，体内胆固醇的合成与代谢负荷过重，血液中胆固醇升高，引起包括动脉血管壁胆固醇的沉淀，诱发动脉硬化等心血管等疾病的发生，严重威胁人类健康。
[0006] 发明内容：
[0007] 本发明的目的是提供一株发酵具有降低胆固醇作用豆浆的鼠李糖乳杆菌[0008] (Lactobacillus rhamnosus)SCF20120718，提供进一步研究开发预防和治疗由于胆固醇过高所引起的心脑血管疾病的益生菌功能性保健食品和药品的原料。
[0009] 上述目的通过以下技术方案实现：
[0010] 一种来源于发酵豆浆具有降低胆固醇作用豆浆的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)SCF 20120718，由采集于自然发酵豆制品中，经分离、纯化、物理诱变、优选获得的高活性菌株，菌学分类名称Lactobacillus rhamnosus，菌学特性：置于
37℃恒温培养箱的培养基中进行培养，通过培养发现稀释浓度为10-5 时菌生长较良好，菌落分散。在相同条件下菌落生长有大有小，菌落呈圆形，乳白色，边缘整齐，表面光滑，其中较小的菌落微黄色，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为：CGMCC No.7085。
37℃恒温培养箱的培养基中进行培养，通过培养发现稀释浓度为10-5 时菌生长较良好，菌落分散。在相同条件下菌落生长有大有小，菌落呈圆形，乳白色，边缘整齐，表面光滑，其中较小的菌落微黄色，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为：CGMCC No.7085。
[0011] 所述的来源于发酵豆制品具有降低胆固醇作用豆浆的鼠李糖乳杆菌[0012] (Lactobacillus rhamnosus)SCF20120718，所述的高活性菌株的菌学特性为：革兰氏染色结果呈阳性；芽孢染色菌体呈绿色；接触酶试验中没有气泡产生；溶钙圈法培养能观察到菌落周围出现透明圈，具备明显乳酸菌的特征。
[0013] 所述的来源于发酵豆制品具有降低胆固醇作用豆浆的鼠李糖乳杆菌[0014] (Lactobacillus rhamnosus)SCF20120718，菌株经16S rDNA 部分序列在线进行BLAST 比对，结果具有Lactobacillus 菌属rhamnosus菌种的主要遗传特性；
[0015] 16S rDNA 测序部分序列如下所示：
[0016] 具有降胆固醇作用的鼠李糖乳杆菌及用途
[0017]
[0018]
[0019]
[0020] 所述的来源于发酵豆制品具有降低胆固醇作用豆浆的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SCF20120718，所述的培养基处方为：
[0021]
[0022] 所述的比例为重量份数比。
[0023] 表1：鼠李糖乳杆菌SCF 20120718 经VITEK 2Compact 鉴定结果
[0024]
[0025]
[0026]
[0028] 一种上述的豆浆的制备方法：
[0029] 称取100g 大豆清洗后放于250mL 自来水中于室温下浸泡12h ；经去皮后, 清水洗净，将浸泡好的大豆以重量份数1：8 的豆水比用组织捣碎机磨浆，加热至沸腾10 分钟后用，三层纱布过滤后。倒入三角瓶中于121℃灭菌15min，纱布封口冷却后，无菌用接种环挑取MRS 试管斜面培养的鼠李糖乳杆菌SCF 20120718 菌落五环，振摇均匀后，放置在37℃培养12小时，冷却至室温，后放入冰箱4℃冷存，备用于后续发酵；同上称取2000g 大豆清洗后放于50000mL 自来水中于室温下浸泡12h ；经去皮后，清水洗净, 将浸泡好的大豆以重量份数1：8 的豆水比用豆浆机磨浆，加热至沸腾后，离心过滤除去豆渣。经巴氏灭菌器135℃灭菌10 秒快速灭菌，置于清洗灭菌好的发酵罐中, 按5％体积比例加入上述备用的发酵豆浆，以30r/min,37-40℃的发酵2 小时，而后分装、密封，室温发酵12 小时后，放入冰箱4℃冷存；
[0030] 剩余部分置于清洗灭菌好的烧杯中，纱布封口后室温发酵24 个小时以上，当pH 达到4.9 以下，酸豆浆呈凝固状，搅拌器将酸豆浆都搅成可流动性状，平铺2cm 厚度的珐琅盘中，-40℃到30℃冷冻干燥，成松脆黄色固体状，粉碎成100 目的粉末，经凯氏定氮法测定蛋白含量45.1％。密封低温干燥保存备用。
[0031] 将所述的来源于发酵豆制品具有降低胆固醇作用豆浆的鼠李糖乳杆菌[0032] (Lactobacillus rhamnosus)SCF 20120718，可用于发酵制备具有降低胆固醇作用的豆浆和相关保健产品及药品。
[0033] 有益效果：
[0034] 随着经济的发展和人们生活水平的提高，健康和保健意识加强，特别是对胆固醇含量过高对机体的危害认识程度的提高，已引起了全世界范围对控制胆固醇的重视，我国已步入心血管疾病的高发期。在目前治疗心血管疾病没有有效手段，预防和保健就显得尤为重要。
[0035] 控制胆固醇的升高，是目前预防和治疗先血管疾病的主要手段之一，国际上控制胆固醇的比较有效的方法，除了改善生活方式即调整饮食结构饮、限制摄入含热量高、脂肪高、胆固醇高的食物( 如动物脂肪等) 摄入，合理的运动，再有就是通过贝特类( 非诺贝特、苯扎贝特、环丙贝特等) 和羟甲基戊二酸单酰CoA还原酶抑制剂( 辛伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀) 等药物治疗，来减少胆固醇的吸收、合成和促进代谢。但是临床药物治疗作用特异性比较强，只能达到阶段性的降低胆固醇指标，还有会造成机体不良反应和组织器官的功能损伤。产生高胆固醇原因比较复杂( 如饮食不合理、遗传因素、病源性胆固醇代谢紊乱等)，目前针对全面影响原因，系统的治疗手段很不理想。通过食源的渠道，在保证机体全面营养和能量供应的同时，通过强化降低胆固醇的功能保健食品来达到长期保健和预防作用，已成为现代医学研究和消费的时尚。
[0036] 益生菌及其代谢产物通过调整肠道菌群功能而发挥保健作用，已引起高度重视，很早人们就发现对有饮食发酵乳制品的Massai人和美国人血清胆固醇很少出现异常，但是还引起学术轰动。后来有人通过实验和动物验证了食品中的嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌具有明显的降胆固醇作用。陆续有有人从香肠、腊肉、泡菜、奶酪、酸奶中筛选出多种降胆固醇能力较高的乳酸菌。国内外的科研人员同时还在人体试验证实了不同益生菌功效的确切性。同时研究成果也表明降胆固醇益生菌菌株的多样性和功能的差异性。但是关于从发酵于豆制品中具有降低胆固醇作用的益生菌，并开发成产品还未见报道。
[0037] 益生菌包括降低胆固醇的作用确切，但由于益生菌生理功能的复杂性和代谢产物的多样性，目前机理研究的还不透彻，这也是制约益生菌产品开发的主要原因之一。目前研究表明，益生菌通过代谢过程中产生的乳酸促进胆盐和胆固醇沉淀，以及菌体粘附和吸收利用，影响了肠道对胆固醇的摄入，达到了降低血液胆固醇的作用，国外对益生菌研究比深入，我国还有很大的差距，制约了益生菌研究和产业的发展，其中有基础研究不够和机理不清的原因，最主要是的是益生菌产业化研究不够，如菌种的筛选、优化和益生菌功能的稳定性还纯在严重不足，一些研究成果，没有经过系统性的研究，无法或经不起人体和动物的功效学验证和评价，目前我们国家生产的规模化益生菌产品( 酸奶、双歧杆菌保健产品) 的菌种和多半还是依赖进口，严重制约了产业化和行业的发展，因此，益生菌的包括优良菌种的筛选等基础性研究，还有很多的工作要做，任重道远！随着我国经济发展，人们生活水平和保健意识的提高，益生菌制品的市场需求量有不断增加趋势，我国是大豆发源地，人们有长期食用大豆的习惯，大豆产品产品，本身就有一定的保健功能( 降血压、降血脂、提高免疫力、改善血心脑管功能等)，其中降胆固醇的功能也比较明显，因此采用益生菌发酵制成产品，强化和增加其保健功能意义更为重大。还有助于带动我国大豆产业和提高产品附加值，推动相关产业和市场的发展，为健康和保健提供创新的理念和开拓性的手段作出应有的贡献。
[0038] 本发明鼠李糖乳杆菌SCF 20120718 对于降低胆固醇作用的研究供试菌种：Lactobacillus rhamnosus SCF 20120718供试对照菌株:SJ20120511、SJ20120601、SJ20120611、SJ20120612、、HHL201206、HHL20120311、HHL20120322、HHL20120405、HHL20120516、HHL20120622、共10 株来源于市售酸奶、泡菜、酸菜、奶酪，均以斜面保藏的形式于4℃条件下保存。地点，黑龙江大学生命科学学院药理实验室
[0039] 实验试剂的配制
[0040] 1.0mg/mL 胆固醇溶液的配制
[0041] 精确称取胆固醇100.00mg，用50mL 无水乙醇溶解，并定容至100mL ；
[0042] 0.1mg/mL 胆固醇标准溶液的配制
[0043] 精确量取(2.1.1)1.0mg/mL 胆固醇溶液10.0mL，用50mL 无水乙醇溶解，并定容至100mL。
[0045] 精确称取硫酸铁铵固体4.463g，用用50mL85％磷酸溶解后并定容至100mL 密封，贮于干燥器内。
[0046] 硫酸铁铵显色液的配制
[0047] 精确量取硫酸铁铵储备液10.0mL，用用50mL 浓硫酸溶解，并定容至100mL，密封并置于干燥器内保存。
[0048] 标准曲线的绘制
[0049] 精确量取(2.1.2)0.1mg/mL 胆固醇标准溶液0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2.0mL、2.4mL、2.8mL、3.2mL 置于5mL 容量瓶中，并分别用无水乙醇定容刻度，分别精密量取2mL 滴入预先加入2.0mL 硫酸铁铵显色液的试管中，振摇混匀2min，于560nm 处采用紫外分光光度计测定吸光值。以胆固醇浓度为横坐标，OD560为纵坐标，绘制标准曲线。
[0050] 供试菌发酵液胆固醇含量的测定
[0051] 培养基配制
[0052] 乳酸细菌培养基(MRS) 培养基配制
[0055] (CH3COONa·3H2O)5.0g、磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)2.0g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.58g、硫酸锰(MnSO4·H2O)0.25g，到预装有500mL 蒸馏水的烧杯中，加热搅拌溶解，并定容至1000mL，pH 控制在6.2-6.4，湿热121℃灭菌15min，备用。
[0056] 胆固醇MRS(CHOL-MRS) 培养基配制
[0057] 精确称取胆固醇1g，用少量无水乙醇溶解并定容至100mL，用0.45μm 的微孔滤膜过滤后，按照2％的量加入到MRS 液体培养基中。
[0058] 供试菌株的培养
[0059] 实验菌株的活化培养
[0060] 将供试菌株及10 株供试对照菌株分别接种至10mL MRS 液体培养基中，37℃恒温培养48h。
[0061] 实验菌株菌悬液制备
[0062] ①标准比浊液配制
[0063] 分别量取1％硫酸溶液8.0mL、1％氯化钡溶液2.0mL 至10mL 容量瓶中，混合均匀，备用。
[0064] ②检测样品液配制
[0065] 分别取供试菌株及10 株供试对照菌株发酵液进行4000r/min 离心15min，用无菌生理
[0066] 盐水洗涤菌体沉淀三遍，将菌体沉淀转移至与标准比浊液试管完全相同的容量瓶中，并用灭菌生理盐水稀释至到浓度( 菌体浊度与10 个麦式浊度标准管相当3×109个/mL 的菌悬液)。
[0067] 实验菌株胆固醇强化培养
[0068] 按2％的接种量将供试菌株及10 株供试对照菌株菌悬液分别接种到10mLCHOL-MRS 培养基中，37℃恒温培养72h。
[0069] 供试菌发酵液中胆固醇含量的测定
[0070] 精确量取各供试菌株及10 株供试对照菌株发酵液0.2mL 至10mL 离心管中，加入9.8mL无水乙醇，振摇1min,4000r/min 离心15min。离心后分别取上清液2.0mL 至试管中，沿管壁缓慢加入2.0mL 硫酸铁铵显色液，振摇充分混匀，至室温，以同样处理的培养基作对照，测定吸光值OD560。计算胆固醇脱除率。
[0071]
[0072] 结果与讨论
[0073] 表2：供试菌株体清除胆固醇能力的结果
[0074]
[0075]
[0076] 采用硫酸铁铵法检测益生菌去除胆固醇评价实验结果表明：供试菌株及10 株供试对照菌株都具有不同程度的发酵过程胆固醇能力，实验所获得本专利项目鼠李糖乳杆菌菌株SCF20120718，和从市售酸奶、泡菜、酸菜、奶酪所获的益生菌相比，具有较强的去除培养基里胆固醇的作用，为进一步动物研究奠定了基础；
[0077] 实验菌株药理学研究
[0078] 1，鼠李糖乳杆菌SCF 20120718 发酵豆浆急性毒性实验研究
[0079] 实验动物
[0080] 昆明种小鼠，体重范围18-22g，雌雄各半，购自哈尔滨市南岗区玉兔养殖场。
[0081] 发酵豆浆样品的制备
[0082] 发酵豆浆检测样品的制备
[0083] 将上述贮存于酸奶包装塑料杯中的酸豆浆加入等体积蒸馏水(100ml)，用搅拌器混匀后，8000r/min 离心10min，收集上清液、检测PH 值，用5mol/L 的NaOH和0.1mol/LNaOH 调节其pH 至8.2-8.4，再以8000r/min 下离心10min，取上清液于-4℃保存。备用[0084] 豆浆检测样品的制备
[0085] 将上述制备发酵豆浆所用的经巴士灭菌后的豆浆，量取100ml 加入等体积蒸馏水(100ml)，8000r/min 离心10min，收集上清液、检测PH 值，用5mol/L 的NaOH和0.1mol/LNaOH调节其pH 至8.2-8.4，再以8000r/min 下离心10min，取上清液于-4℃保存。备用[0086] 将上述贮存于酸奶包装塑料杯中的酸豆浆加入等体积蒸馏水(100ml)，用搅拌器混匀后( 凯氏定氮法测得蛋白质含量3.4％ ). 备用
[0087] 实验方法
[0088] 将40 只昆明小鼠雌雄各半随机分为对照组和实验组，实验组连续三天，每次灌胃0.1mL 发酵豆浆样品溶液，对照组灌胃0.1mL 的生理盐水，每天早上定量添加饲料和饮水，恒温21±3℃，相对湿度为50-70％，12h 照明，持续观察7 天。记录小鼠的体重、体征及死亡情况。将试验组和对照组各取出10 只小鼠处死，取出肝脏、脾脏，称重，计算肝体比、脾体比。
[0089] 细菌易位感染实验
[0090] 剩余小鼠连续灌胃至28 天后，无菌操作眼球取血后，立即处死，取出肝脏、脾脏，称重，计算肝体比、脾体比。按1mL/g 的量加入无菌生理盐水，用无菌组织匀浆器捣碎，取肝脾100μL 组织匀浆液及血液涂布于MRS 固体培养基平板上，37℃倒置培养48 小时，随时观察菌落生长情况。
[0091] 实验结果
[0092] 鼠李糖乳杆菌SCF 20120718 发酵制备的酸豆浆急性毒性实验和易位实验结果表明，各组实验小鼠未发生死亡，实验期间实验组和对照组体征( 体重、行为、活动、毛发、色泽、饮食、粪便等) 各项指标无明显异常；脏器( 肝脏、脾脏) 的生理指标无显著性差异，并且未见菌株易位感染现象，初步证明了鼠李糖乳杆菌SCF 20120718 发酵制备的酸豆浆安全性。
[0093] 表3：发酵豆浆急性毒性实验结果：
[0094] 注：P>0.05，与对照组相比无显著性差异。
[0095]
[0096] 鼠李糖乳杆菌SCF 20120718 发酵降低血液胆固醇实验研究
[0097] 实验动物及试剂
[0098] 实验动物：
[0099] 健康雄性昆明小鼠100 只，购自哈尔滨市南岗区玉兔养殖场，体重20-24g。动物一般状态良好，皮毛光泽，进食与活动正常。动物饲养环境：黑龙江大学生命科学学院动物实验室，室内洁净，通风良好。
[0100] 实验操作
[0101] 实验动物分组
[0102] 小鼠在实验环境中适应6d，剔除体重不合格，体表有伤、体征不正常的小鼠，实验前均
[0103] 自由采食和饮水，实验过程中专业管理。动物室灯光12h 照明，室温控制在21±3℃，相对湿度为50-70％。
[0104] 实验对照组：取健康雄性小鼠20 只20-24g，，随机分为2 组，对照Ⅰ组(n ＝ 10 只) ：正常自由进食小鼠基础饲料和饮水，4 周后处死，采取肝脾和血液。
[0105] 对照Ⅱ组(n ＝ 10 只) ：正常自由进食小鼠基础饲料和饮水，持续8 周。第5 周开始生理盐水灌胃，第9 周处死，采取肝脾和血液。
[0106] 高脂模型组
[0108] 取健康雄性小鼠20 只，20-24g 随机分为2 组，每组10 只，高胆固醇模型Ⅰ组(n ＝ 10 只) ：正常自由进食小鼠高脂饲料和饮水，4 周后处死，采取肝脾和血液。
[0109] 高胆固醇模型Ⅱ组(n ＝ 10 只) ：正常自由进食小鼠高脂肪饲料和饮水，持续8 周。第5 周开始生理盐水灌胃。第9 周处死，采取肝脾和血液。给药治疗组[0110] 试验组：取体重健康雄性小鼠30 只20-24g，随机分为2 组，
[0111] 高剂量组(n ＝ 10 只) ：正常自由进食小鼠高脂肪饲料和饮水，持续8 周，第5 周开始用30mL/Kg 发酵豆浆样品灌胃。第9 周处死，采取肝脾和血液。
[0112] 中剂量组(n ＝ 10 只) ：正常自由进食小鼠高脂肪饲料和饮水，持续8 周，第5 周开始用20mL/Kg 发酵豆浆样品灌胃。第9 周处死，采取肝脾和血液。
[0113] 低剂量组(n ＝ 10 只) ：正常自由进食小鼠高脂肪饲料和饮水，持续8 周，第5 周开始用10mL/Kg 发酵豆浆样品灌胃。第9 周处死，采取肝脾和血液。
[0114] 小鼠体征观察
[0115] 实验各组随时观察小鼠的食欲、行为、粪便、毛发及动物死亡情况。
[0116] 血液生化检查指标检测小鼠血清制备
[0118] 小鼠血清总胆固醇的测定( 硫磷铁法)
[0119] 试剂的配制
[0120] 2％ FeCl3溶液配制：称取研碎后的三氯化铁(FeCl 3·6H2O)2g，溶于100ml 浓磷酸内，暗处静置过夜。
[0121] 硫磷铁试剂配制：取上述2％ FeCl38ml，放入100ml 容量瓶内，加浓硫酸至刻度，混合，放置暗处。
[0122] 胆固醇标准溶液配制：精确称取重结晶、干燥的胆固醇30mg，溶于甲醇中至100ml。
[0123] 实验方法及步骤
[0124] ①制作胆固醇标准曲线：将0.3mg/ml 胆固醇标准溶配制成浓度分别为0.03mg/ml、0.06mg/ml、0.09mg/ml、0.12mg/ml、0.15mg/ml 的胆固醇溶液。分别取5 只试管中加入上述5 种浓度的胆固醇溶液3ml，另一只试管中加入甲醇溶液作为空白管。分别沿管壁缓缓加入加硫磷铁试剂3ml，立即迅速振摇混匀，放置冷却15 分钟后空白管为对照于520nm 进行比色，以以胆固醇浓度为横坐标绘制标准曲线，
[0125] ②取离心管编号，准确加入小鼠血清0.1ml，再向管底加入甲醇4.9ml。用玻璃纸堵住管口，振摇使之混匀，室温放置15min，再振摇混匀，然后离心5 分钟(2000r/min)，取上清液。分别在测定管内加入上述甲醇提取液3ml，空白管内加入甲醇3ml。各管中分别加入硫磷铁试剂3ml，须沿管壁缓缓加入，与甲醇液分成两层，立即迅速振摇混匀，放置冷却15 分钟，以空白为对照于520nm 进行比色，计算胆固醇
[0126] 血清甲醇提取液的吸光值为y，带入标准曲线方程得到x 值。
[0127] 小鼠血清谷丙转氨酶的测定( 比色法)
[0128] 试剂的配制
[0130] 底物液( 基质液) ：精密量取DL- 丙氨酸1.79g，α- 酮戌二酸29.2mg，先溶于约50ml 磷酸缓冲液中，然后以1mol/L NaOH 校至pH ＝ 7.4，再以磷酸盐缓冲液稀释到
100ml，加氯仿数滴防腐，贮存在冰箱中。
100ml，加氯仿数滴防腐，贮存在冰箱中。
[0131] μg/ml 丙酮酸标准液：精密称取已干燥至衡重的丙酮酸12.64mg，置于100ml 容量[0132] 瓶中，以pH ＝ 7.4 的磷酸缓冲液稀释到刻度。( 此液必须临用前配制，不能存放)
[0133] 0.02％ 2.4- 二硝基苯肼液：称取2.4- 二硝基苯肼20mg，溶于10N HCl 10ml 中，溶解后再加蒸馏水至100ml。
[0134] 实验方法及步骤
[0135] 按照下面的操作进行实验：
[0136] 表4：小鼠谷丙转氨酶检测操作步骤
[0137]
[0138] 静止10 分钟后，选用520nm 的单色光，以蒸馏水调零，测定各管光密度。
[0139] 按计算:
[0140]
[0141] 肝脏组织病理学检查
[0142] 取血之后作腹部正中切口进入腹腔，观察各脏器大体情况，仔细分辨各组小鼠肝脏外观变化。完整切除肝脏并称湿重，计算肝指数＝ ( 肝湿重/ 体重)×100％。并将肝脏分割成小块，投入10％甲醛中固定，石蜡包埋，切片，HE 染色，光镜下观察。其实验流程如下：
[0143] (1) 固定：将分割好的小块肝脏置于10％甲醛溶液中固定24h ；
[0144] (2) 水洗：置于流水中洗涤肝脏组织12h ；
[0145] (3) 脱水：正丁醇脱水：① 70％酒精，1.5h ；② 80％酒精，1.5h ；③正丁醇( Ⅰ )，1.5h ；
[0146] ④正丁醇( Ⅱ )，1.5h ；⑤正丁醇( Ⅲ )，2h。
[0147] 浸蜡：①蜡Ⅰ ( 熔点48℃ -50℃ )，20min ；②蜡Ⅱ ( 熔点52℃ -54C)，20min ；③蜡Ⅲ ( 熔点56℃ -58℃ )，20min。
[0148] 包埋：采用最大面包埋，包埋过程中用镊子轻压组织块拱起部分，使之平贴于底部；
[0149] (6) 切片：取厚度为5μg 切片；
[0150] (7) 展片与捞片：切片于温水中(42℃ -45℃ ) 展开，捞取完整且无皱褶的切片，粘贴于玻片的中1/3 和下1/3 的中间；
[0151] (8) 烤片：将贴有切片的玻片于60℃烘箱中烤片1h ；
[0152] (9) 脱蜡：将烤好的玻片置于二甲苯中脱蜡(2 次) ；而后从高浓度的酒精到低浓度的酒精脱二甲苯；
[0153] (10) 染色：苏木精染色8min，而后用水洗去结合在切片中的染液，用1％盐酸分色，用流水水洗10h，以防盐酸残留导致切片褪色，最后入伊红复染5min ；
[0154] (11) 脱水：切片脱水的具体流程为：70％酒精2min，80％酒精2min，95％酒精2min，100％酒精5min，100％酒精5min，二甲苯5min，二甲苯5min ；
[0155] (12) 镜检：光镜下观察评价肝脏脂肪变性改变，拍摄照片。
[0156] 肝脂肪变性程度判断标准：无肝细胞脂肪变为( － )，肝小叶内＜ 30％肝细胞发生脂肪变为(+)，30％ -50％者为轻度脂肪肝(++)，50％ -75％者为中度脂肪肝(+++)，＞ 75％者为重度脂肪肝(++++)。
[0157] 实验结果
[0158] 在进行时实验制造病理高血脂模型过程中高脂模型组和对照组比较：胆固醇饲料过程中初期食欲好，体重增长迅速，逐渐体征出现一些异常( 鼠毛欠光泽，粪便稀软变黄)。在第十三天开始出现食欲下降现象，并且在第十六天开始明显下降。体重、肝湿重、肝指数、血胆固醇及血清谷丙转氨酶与正常对照组比较有显著性差异(P ＜ 0.01)。
[0159] 表5：制造高血脂小鼠对体征、与肝生理和生化影响
[0160]
[0161] 注：** 表示与正常对照Ⅰ组比较P ＜ 0.01
[0162] 肝组织直观和病理切片也同时表明：喂食高胆固醇饲料小鼠肝脏和对照组比较，体积增大，边缘圆钝，质软而脆、切面油腻，颜色泛白。组织出现脂肪性病变，肝细胞胞质内出现脂滴，严重者细胞内大脂滴将细胞核挤向一侧。实验所采取的方法促使正常小鼠体征、肝组织和生化指标发生病理性改变，制造高血脂模型成功。
[0163] 表6：小鼠肝组织变性观察
[0164]
[0165] 喂食发酵豆浆对喂食高胆固醇饲料小鼠的影响
[0166] 喂食鼠李糖乳杆菌SCF 20120718 发酵豆浆各剂量组和喂食高胆固醇对照组比较体征( 食量增加不明显、体态呆板、粪便稀软) 明显改善( 食量、反应、粪便逐渐恢复正常)，中、高剂量组改善最为明显，接近于正常对照组小鼠。肝组织解剖和病理切片观察也同样证明了结果，体重、肝湿重、肝指数、血胆固醇及血清谷丙转氨酶与高胆固醇喂食对照组比较有显著性差异(P ＜ 0.01)。结果证明喂食发酵豆浆对高胆固醇喂食所造成的小鼠生理异常和肝组织损伤有修复及治疗作用
[0167] 表7：制造高血脂小鼠对体征、与肝生理和生化影响
[0168]
[0169] 注：** 表示与正常对照Ⅱ组比较P ＜ 0.01，* 表示与正常对照Ⅱ组比较P ＜ 0.05★★表示与模型对照Ⅱ组比较P ＜ 0.01，★表示与模型对照Ⅱ组比较P ＜ 0.05[0170] 表8：小鼠肝组织病理切片观察结果
[0171]
[0172] 服用本发明的发酵豆浆人体效果实验
[0173] 一位患有十年中高度脂肪肝患者，每天服用1000mL 鼠李糖乳杆菌发酵制备酸豆浆的两个月后，体检报告结果表明，食用前心烦、浑身乏力、失眠、头晕等症状非常严重，2012 年2 月27 日在哈尔滨动力区大健康体检哈尔滨香坊分院进行的体检报告，其中甘油三酯(TG)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT) 以及比值(AST/ALT) 均出现显著性的异常。服用后2012 年5 月26 日在中国人民解放军第二一一医院进行血液生化检测复查。两次检测结果比较后发现，ALT、AST、TG、谷氨酰转肽酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP) 含量均明显下降，除LDL-C 略有升高外，谷草/ 谷丙数值恢复正常，说明专利所采用的鼠李糖乳杆菌发酵制备酸豆浆不仅有降低ALT的作用，同时还能降低AST、GGT、TG 多作用，可作为预防和治疗伴有高血脂升高的心脑血管疾病的保健食品。具有很高的进一步研究和开发的价值。
[0175] 第一组附图，各试验组小鼠肝组织解剖图
[0176] 图1 ：正常对照Ⅰ组小鼠肝组织解剖图
[0177] 图2 ：模型对照Ⅰ组小鼠肝组织解剖图
[0178] 图3 ：正常对照Ⅱ组小鼠肝组织解剖图
[0179] 图4 ：模型对照Ⅱ组小鼠肝组织解剖图
[0180] 图5 ：高剂量组小鼠肝组织解剖图
[0181] 图6 ：低剂量组小鼠肝组织解剖图。
[0182] 第二组附图，各试验组小鼠肝组织病理切片图
[0183] 图7 ：对照组小鼠肝组织病理切片图( － )
[0184] 图8 ：高剂量组小鼠肝组织病理切片图(+)
[0185] 图9 ：低剂量组小鼠肝组织病理切片图(++)
[0186] 图10 ：中剂量组小鼠肝组织病理切片
[0187] 图(+++)
[0188] 图11 ：模型对照组小鼠肝组织病理切片图(++++)。
[0189] 第三组附图，试验者服用发酵豆浆前后血液生化指标检测结果
[0190] 图12 ：服用发酵豆浆前试验者血液生化指标检测结果(2012 年2 月27 日)[0191] 图13 ：服用发酵豆浆后试验者血液生化指标检测结果(2012 年5 月26 日)。
[0192] 具体实施方式：
[0193] 实施例1：
[0194] 一种来源于发酵豆制品具有降低胆固醇作用的鼠李糖乳杆菌，由采集于自然发酵豆制品中，经分离、纯化、物理诱变、优选获得的高活性菌株，菌学分类名称Lactobacillusrhamnosus，菌学特性：置于37℃恒温培养箱的培养基中进行培养，通过培养发现稀释浓度为10-5时菌生长较良好，菌落分散。在相同条件下菌落生长有大有小，菌落呈圆形，乳白色，边缘整齐，表面光滑，其中较小的菌落微黄色，保藏号为：CGMCC No.7085。
[0195] 实施例2：
[0196] 实施例1 所述的来源于发酵豆浆具有降低胆固醇作用的鼠李糖乳杆菌，所述的高活性菌株的菌学特性为：革兰氏染色结果呈阳性；芽孢染色菌体呈绿色；接触酶试验中没有气泡产生；溶钙圈法培养能观察到菌落周围出现透明圈，具备明显乳酸菌的特征。
[0197] 实施例3：
[0198] 实施例1 或2 所述的来源于发酵豆浆具有降低胆固醇作用的鼠李糖乳杆菌，所述的菌株经16S rDNA 部分序列在线进行BLAST 比对，结果具有Lactobacillus 菌属rhamnosus菌种的主要遗传特性；
[0199] 16S rDNA 测序部分序列如下所示：
[0200] 具有降胆固醇作用的鼠李糖乳杆菌及用途
[0201]
[0202]
[0203]
[0204] 实施例4：
[0205] 实施例1 或2 或3 所述的来源于发酵豆浆具有降低胆固醇作用的鼠李糖乳杆菌，所述的培养基处方为：
[0206]
[0207] 所述的比例为重量份数比。
[0208] 实施例5：
[0209] 一种利用实施例1、2、3 所述的鼠李糖乳杆菌制作的豆浆，将实施例1-4 之一的菌株接种于经大豆浸泡，研磨、匀浆、煮沸，过滤、高温灭菌制得的豆浆中，37℃ -42℃发酵24 小时以上，制得酸豆浆。
[0210] 实施例6：
[0211] 一种实施例5 所述的豆浆的制备方法：
[0212] 称取100g 大豆清洗后放于250mL 自来水中于室温下浸泡12h ；经去皮后, 清水洗净,将浸泡好的大豆以重量份数1 ∶ 8 的豆水比用组织捣碎机磨浆，加热至沸腾10 分钟后用，三层纱布过滤后。倒入三角瓶中于121℃灭菌15min, 纱布封口冷却后，无菌用接种环挑去MRS 试管斜面培养的李糖乳杆菌SCF 20120718 菌落五环，振摇均匀后，放置在37℃培养12小时，冷却至室温，后放入冰箱4℃冷存，备用于后续发酵；
[0213] 同上称取2000g 大豆清洗后放于50000mL 自来水中于室温下浸泡12h ；经去皮后, 清水洗净, 将浸泡好的大豆以重量份数1 ∶ 8 的豆水比用豆浆机磨浆，加热至沸腾后，离心过滤出去豆渣。经巴士灭菌器135℃灭菌10 秒快速灭菌，置于清洗灭菌好的发酵罐中, 按5％体积比例加入上述备用的发酵豆浆，以30r/min,37-40℃的发酵2 小时，而后分装、密封，室温发酵12 小时后，放入冰箱4℃冷存；
[0214] 剩余部分置于清洗灭菌好的烧杯中，纱布封口后室温发酵24 个小时以上，当pH 达到4.9 以下，酸豆浆呈凝固状，搅拌器将酸豆浆都搅成可流动性状，平铺2cm 厚度的珐琅盘中，-40℃到30℃冷冻干燥，成松脆黄色固体状，粉碎成100 目的粉末，经凯氏定氮法测定蛋白含量45.1％。密封低温干燥保存备用。
[0215] 实施例7：
[0216] 将上述的来源于发酵豆制品具有降低胆固醇作用的鼠李糖乳杆菌，用于制作降低包括胆固醇在内的血脂异常升高，用于制作预防和治疗心脑血管疾病的保健食品和药品的用途。
[0217] 实施例8：
[0218] 一种来源于发酵豆浆具有降低胆固醇作用的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus[0219] rhamnosus)SCF 20120718，已于2013 年1 月4 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是：中国北京市朝阳区北辰西路1 号院(100101) 电话：64807355 保藏号为：CGMCC No.7085。
[0220] 鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SCF 20120718，是由采集于自然发酵豆制品( 干豆腐) 中，经分离、纯化、物理诱变、优选获得的高活性菌株，置于37℃恒温培养箱中进行培养，通过培养菌生长较良好，菌落分散，大小不一，菌落呈圆形，乳白色，边缘整齐，表面光滑，其中较小的菌落微黄色。
[0221] 优化所获得的鼠李糖乳杆菌SCF 20120718，培养条件为：培养基为蛋白胨10 份、牛肉膏10份、酵母膏5 份、柠檬酸氢二铵[(NH4)2HC6H5O7]2 份葡萄糖(C6H12O6·H2O)20份、吐温801 份、乙酸钠(CH3COONa·3H2O)5 份、磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)2 份、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.58 份、硫酸锰(MnSO4·H2O)0.25 份、琼脂18 份、蒸馏水1000 份、pH 6.2 ～6.6，37℃恒温培养。
[0222] 革兰氏染色结果呈阳性；芽孢染色菌体呈绿色；接触酶试验中没有气泡产生；溶钙圈法培养可以观察到菌落周围出现透明圈，经高级全自动细菌鉴定/ 药敏系统(VITEK2Compact) 具备明显乳酸菌的特征。
[0223] 表9：鼠李糖乳杆菌SCF 20120718 经VITEK 2Compact 鉴定结果
[0224]
[0225]
[0226]
[0227] 经16S rDNA 部分序列在线进行BLAST 比对，结果具有Lactobacillus 菌属rhamnosus
[0228] 菌种的主要遗传特性。
[0229] 测序部分序列如下所示：
[0230] 具有降胆固醇作用的鼠李糖乳杆菌及用途
[0231]
[0232]
[0233]
[0234] 实施例9：
[0235] 采用鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SCF 20120718 发酵酸豆浆工艺：
[0236] 称取100g 大豆清洗后放于250mL 自来水中于室温下浸泡12h ；经去皮后, 清水洗净，将浸泡好的大豆以1：8的豆水比用组织捣碎机磨浆，加热至沸腾10 分钟后用，三层纱布过滤后。倒入三角瓶中于121℃灭菌15min, 五层纱布封口冷却后，无菌用接种环挑去MRS试管斜面培养的李糖乳杆菌SCF 20120718 菌落，大约五环，振摇均匀后，放置在37℃培养12 小时，冷却至室温，后放入冰箱4℃冷存，备用于后续发酵。
[0237] 同上称取2000g 大豆清洗后放于50000mL 自来水中于室温下浸泡12h ；经去皮后，清水洗净, 将浸泡好的大豆以1 ∶ 8 的豆水比用豆浆机磨浆，加热至沸腾后，离心过滤出去豆渣。经巴士灭菌器135℃灭菌10 秒快速灭菌，置于清洗灭菌好的发酵罐中, 按5％体积比例加入上述备用的发酵豆浆，以30r/min,37-40℃的发酵2 小时，而后部分以每杯100mL分装、密封于150mL 酸奶塑料杯里，室温(25℃左右) 发酵12 小时后，放入冰箱4℃冷存。
[0238] 剩余部分置于清洗灭菌好的100mL 大烧杯中，五层纱布封口后室温发酵24 个小时以上，当pH 达到4.9 以下，酸豆浆呈凝固状，搅拌器将酸豆浆都搅成可流动性状，平铺2cm厚度的珐琅盘中，-40℃到30℃冷冻干燥，成松脆黄色固体状，粉碎成100 目的粉末，经凯氏定氮法测定蛋白含量45.1％。密封低温干燥保存备用。
[0239] 实施例10：
[0240] 一种来源于发酵豆浆具有降低胆固醇的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SCF20120718，已于2013 年1 月4 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是：中国北京市朝阳区北辰西路1 号院(100101) 电话：64807355 保藏号为：CGMCCNo.7085。
[0241] 鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SCF20120718，是由采集于自然发酵豆制品( 水豆腐俗称大豆腐) 中，经分离、纯化、物理诱变、优选获得的高活性菌株，置于37℃恒温培养箱中进行培养，通过培养菌生长较良好，菌落分散，大小不一，菌落呈圆形，乳白色，边缘整齐，表面光滑，其中较小的菌落微黄色。
[0242] 实施例11：
[0243] 所述的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SCF20120718，经16S rDNA 部分序列在线进行BLAST 比对，结果具有Serratia菌属marcescens菌种的主要遗传特性。其特征是：革兰氏染色结果呈阳性；芽孢染色菌体呈绿色；接触酶试验中没有气泡产生；溶钙圈法培养可以观察到菌落周围出现透明圈，采用生理生化鉴定仪对鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SCF20120718 进行鉴定，具有下表的生理生化特征。
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