神经元细胞培养液及培养方法
专利汇可以提供神经元细胞培养液及培养方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种基于外周血单核细胞培养神经元细胞的培养液，所述培养液包括：体积比为1:0.8～1.2的DMEM/F12 基础 培养基和神经细胞培养基，以及神经生长因子、腺苷酸环化酶激活剂、血清替代物、L‑ 抗坏血酸 、L‑谷 氨 酰胺衍 生物 、ALK 抑制剂 、GSK‑3β抑制剂、GSK3α抑制剂、ALK‑2,3,6,AMPK抑制剂和TGF‑βR抑制剂。本发明还公开了一种由外周血单核细胞培养神经元细胞的方法，使用所述培养液，可以外周血单核细胞为原料定向分化培养得到神经元细胞，取材方便，且无数量限制，可避免道德争议。，下面是神经元细胞培养液及培养方法专利的具体信息内容。
1.一种基于外周血单核细胞的神经元细胞培养液，其特征在于，所述培养液由：体积比为1:0.8～1.2的DMEM/F12基础培养基和神经细胞培养基Neurobasal，以及神经生长因子、腺苷酸环化酶激活剂、血清替代物、L-抗坏血酸、L-谷氨酰胺衍生物、ALK抑制剂、GSK-3β抑制剂、GSK3α抑制剂、ALK-2,3,6,AMPK抑制剂、TGF-βR抑制剂和视黄酸组成，所述神经生长因子为Beta人类神经生长因子；所述腺苷酸环化酶激活剂为毛喉素；所述L-谷氨酰胺衍生物为GlutaMAX-I二肽；所述血清替代物为N2和/或B27；所述ALK抑制剂为LDK378和/或AZD3463；所述GSK-3β抑制剂为TWS119、CHIR-98014和/或CHIR-99021HCl；所述GSK3α抑制剂为SB415286；所述ALK-2,3,6,AMPK抑制剂为BML-275、BML-2752HCl和/或LDN-193189；所述TGF-βR抑制剂为EW-7197和/或SB-505124；
所述神经生长因子浓度为6～12μg/mL，所述腺苷酸环化酶激活剂浓度为2～4μmol/L，所述血清替代物浓度为2～4mmol/L，所述L-抗坏血酸浓度为0.08～0.12mmol/L，所述L-谷氨酰胺衍生物浓度为6～12mmol/L，所述ALK抑制剂浓度为0.16～0.22mmol/L，所述GSK-3β抑制剂浓度为0.58～0.63mmol/L，所述GSK-3α抑制剂浓度为0.48～0.60mmol/L，所述ALK-
2,3,6,AMPK抑制剂浓度为0.15～0.23mmol/L，所述TGF-βR抑制剂浓度为0.18～0.25mmol/L，所述视黄酸浓度范围为0.01～0.28mmol/L。
2.如权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述DMEM/F12基础培养基和所述神经细胞培养基的体积比为1:1，所述神经生长因子浓度为10μg/mL，所述腺苷酸环化酶激活剂浓度为3μmol/L，所述血清替代物浓度为3mmol/L，所述L-抗坏血酸浓度为0.10mmol/L，所述L-谷氨酰胺衍生物浓度为10mmol/L，所述ALK抑制剂浓度为0.18mmol/L，所述GSK-3β抑制剂浓度为0.60mmol/L，所述GSK-3α抑制剂浓度为0.50mmol/L，所述ALK-2,3,6,AMPK抑制剂浓度为
0.20mmol/L，所述TGF-βR抑制剂浓度为0.22mmol/L。
3.如权利要求2所述的培养液，其特征在于，其还包括青霉素和/或链霉素，青霉素的浓度为30～200μg/mL，链霉素的浓度为50～300μg/mL。
4.如权利要求3所述的培养液，其特征在于，青霉素的浓度为80～120μg/mL，链霉素的浓度为100～250μg/mL。
5.如权利要求4所述的培养液，其特征在于，青霉素的浓度为110μg/mL，链霉素的浓度为150μg/mL。
6.如权利要求1所述的培养液，其特征在于，视黄酸浓度范围为0.08～0.15mmol/L。
7.如权利要求6所述的培养液，其特征在于，视黄酸浓度范围为0.12mmol/L。
8.如权利要求1～7任一项所述的培养液，其特征在于，其还包括5-氟-2’-脱氧尿苷、尿苷和阿糖胞苷，5-氟-2’-脱氧尿苷的浓度范围为5～20μg/mL，尿苷浓度范围为20～50μg/mL，阿糖胞苷浓度范围为1～8μg/mL。
9.如权利要求8所述的培养液，其特征在于，5-氟-2’-脱氧尿苷的浓度范围为10～18μg/mL，尿苷浓度范围为30～40μg/mL，阿糖胞苷浓度范围为2～6μg/mL。
10.如权利要求9所述的培养液，其特征在于，5-氟-2’-脱氧尿苷的浓度范围为15μg/mL，尿苷浓度范围为35μg/mL，阿糖胞苷浓度范围为3μg/mL。
11.一种由外周血单核细胞培养神经元细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用权利要求1～7任一项所述的培养液对外周血单核细胞进行培养5～8天，然后用权利要求8所述的培养液培养36～60小时，移除未贴壁的细胞，再用权利要求1～7任一项所述的培养液培养2～6天得到原代培养物；
2)原代培养物用权利要求1～7任一项所述的培养液进行传代培养，培养15～28天即可得到神经元细胞。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于：
步骤1)具体为在35～39℃、2～8％条件下，用权利要求1～7任一项所述的培养液对外周血单核细胞进行培养5～8天，培养期间每2～4天更换一次培养液，每次只换一半，留一半原液；然后用权利要求8所述的培养液培养48小时，移除未贴壁的细胞；再用权利要求1～7任一项所述的培养液继续培养2～6天得到原代培养物，继续培养期间每1～3天更换一次培养液；
步骤2)具体为，将步骤1)得到的原代培养物消化下来，于35～39℃、2～8％CO2条件下用权利要求1～7任一项所述的培养液进行传代培养，培养15～28天得到神经元细胞，传代培养期间每1～3天更换一次培养液。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于：
步骤1)具体为在37℃、5％CO2条件下，用权利要求1～7任一项所述的培养液对外周血单核细胞进行培养5～8天，培养期间每3天更换一次培养液，每次只换一半，留一半原液；然后用权利要求8所述的培养液培养48小时，移除未贴壁的细胞；再用权利要求1～7任一项所述的培养液继续培养2～6天得到原代培养物，继续培养期间每2天更换一次培养液；
步骤2)具体为，将步骤1)得到的原代培养物消化下来，于37℃、5％CO2条件下用权利要求1～7任一项所述的培养液进行传代培养，培养15～28天得到神经元细胞，传代培养期间每2天更换一次培养液。
14.如权利要求11所述的培养方法，其特征在于，所述外周血单核细胞用Ficoll-Paque密度梯度离心法分离患者血样得到。
神经元细胞培养液及培养方法
技术领域
背景技术
发明内容
99021HCl(6-[2-[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基]乙基氨基]吡啶-3-甲腈盐酸盐，CAS号为252917-06-9)；所述GSK3α抑制剂可选用SB415286(3-[(3-氯-4-羟苯基)氨基]-4-(2-硝苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮，CAS号为264218-23-7)；所述ALK-
2,3,6,AMPK抑制剂可选用BML-275(6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶，英文名为Dorsomorphin，CAS号为866405-64-3)、BML-275 2HCl和/或LDN-
193189(6-(4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯基)-3-(吡啶-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶，CAS号为
1062368-24-4)；所述TGF-βR抑制剂可选用EW-7197(N-(2-氟苯基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-
4-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基-1H-咪唑-2-甲胺，CAS号为1352608-82-2)和/或SB-
505124(2-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊烷-5-基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-6-甲基-吡啶，CAS号为694433-59-5)。
0.23mmol/L更优选0.20mmol/L，所述TGF-βR抑制剂浓度优选0.18～0.25mmol/L更优选
0.22mmol/L。
具体实施方式
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