用解淀粉芽孢杆菌GUHP86提高猪血蛋白水解度的方法
技术领域
[0001] 本
发明涉及
微生物，进一步来说，涉及解淀粉芽孢杆菌，特别涉及用解淀粉芽孢杆菌GUHP86提高猪血蛋白水解度的方法。
背景技术
[0002] 新鲜猪血传统的利用办法是蒸煮法，即直接加热或蒸干猪血制成血
块或者血粉供人畜食用。也有将新鲜猪血
蒸汽凝结后再离心脱水、通过气流干燥制备猪血血粉的方法。这些方法存在较大的营养
缺陷：①不易消化，一是由猪血本身的血球蛋白结构所致，二是蒸煮法的蒸煮、干燥过程会导致猪血中
蛋白质、
氨基酸结构发生改变而破坏氨基酸
质量；②猪血中氨基酸组成不均衡，其中亮氨酸和异亮氨酸比例失调，影响了血粉的品质；③适口性差，猪血本身具有的血腥味和血粉的其他异味所造成的。正因如此，猪血虽然有很高的应用价值，但是人们对其直接应用却很少，大部分都是被废弃掉了。
[0003] 近年来一个研究热点是利用微生物产复合酶的性质，将产蛋白酶
微生物接种在新鲜猪血中生长、并对猪血进行液态
发酵水解猪血中蛋白质，可以有效地降解新鲜猪血中的大分子蛋白质，有效地分解猪血中蛋白质变成小分子肽，大大提高猪血产品中氨基酸含量，猪血液态发酵后的初产品中还会有更多的
营养元素如
纤维素，植酸等营养成分，使得液态发酵猪血产品有更多的利用价值，也就大大提高猪血的营养价值和经济价值。而且微生物源的蛋白酶显示出明显优势：微生物繁殖速度快，在合适的条件下半小时左右就可以繁殖一代；微生物种类繁多，酶的品质齐全，不同的生存环境会产生不同种类的酶，如嗜温菌、嗜盐菌、嗜
碱菌、嗜酸菌等。
[0004] 经检索，在中国
专利数据库中涉及猪血蛋白的
申请件不多，仅有2009100679543号《一种利用猪新鲜胰酶生产猪血蛋白肽与血红素的技术》、ZL2013104252308号《一种高性能的猪血蛋白粉制备装置》和ZL2013104250035号《一种环保高效的猪血蛋白粉制备装置》。这些方案均有一定实际应用，但至今为止，尚无用解淀粉芽孢杆菌提高猪血蛋白水解度的申请件。
发明内容
[0005] 本发明旨在提供用解淀粉芽孢杆菌GUHP86提高猪血蛋白水解度的方法，通过优化发酵培养条件来提高解淀粉芽孢杆菌GUHP86对猪血蛋白的水解度，改善猪血
风味和提高其营养价值。
[0006] 为达到上述目的，
发明人提供的用解淀粉芽孢杆菌GUHP86提高猪血蛋白水解度的方法包括以下步骤：
[0007] ⑴制备菌种培养基
[0008] 按照以下物料配方制备菌种培养基：
[0009] 取猪血粉15.0g，NaCl 5.0g，MgSO4·7H2O0.2g，CaCl20.1g，K2HPO45.0g，pH 7.0，蒸馏水1000mL，混合均匀，于121℃下灭菌20min，得到菌种培养基，备用；
[0010] ⑵制备发酵菌种液：
[0011] 在250mL三
角瓶内，挑取2环初筛斜面将解淀粉芽孢杆菌GUHP86接入菌种培养基，装液量50mL，于30℃下以转速为180r/min摇床培养24h，即得发酵菌种液，备用；
[0012] ⑶选取发酵培养基
[0013] 选用新鲜猪血作为发酵培养基；
[0014] ⑷制备发酵液
[0015] 将发酵菌种液按6％的接种量接种于发酵培养基中，在30℃下以转速 为180r/min的摇床培养48h，然后在4℃下以转速为10000r/min的离心分离机离心10min，得到的发酵上清液即为发酵液；
[0016] ⑸催化水解猪血蛋白
[0017] 将上述发酵液与新鲜猪血混合发酵，进行催化水解猪血蛋白。
[0018] 上述解淀粉芽孢杆菌GUHP86(Bacillus amyloliquefaciens GUHP86)已于2016年1月4日保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，该中心地址是:中国武汉·武汉大学，邮政编码为430072；简称解淀粉芽孢杆菌GUHP86，保藏编号为CCTCC NO.M 2016003，该菌株系从中国贵州贵阳生猪屠宰的屠宰场周围
土壤样本中分离得到。
[0019] 猪血蛋白水解度的计算公式如下：
[0020] (菌株水解猪血蛋白的含量/发酵培养基中猪血蛋白的含量)x100％
[0021] 本发明的用解淀粉芽孢杆菌GUHP86提高猪血蛋白水解度的方法是一种优化的液态发酵培养方法，与传统的固态发酵相比，本发明具有以下有益效果:液态发酵时，菌种与底物便于混合均匀，使其充分
接触，缩短发酵时间，提高水解效率。本发明的方法用于发酵生产的蛋白酶可高效催化水解猪血蛋白，使其在最优培养条件下，水解度达到最大，有利于工业化生产。采用本发明优化后的培养条件，该解淀粉芽孢杆菌GUHP86对猪血蛋白的水解度达28.23％，比优化之前提高0.42倍。本发明适用于解淀粉芽孢杆菌GUHP86液态发酵猪
血培养。
附图说明
[0022] 图1为不同转数对菌株GUHP86水解猪血蛋白水解度的影响；
[0023] 图2为发酵培养
温度对菌株GUHP86水解猪血蛋白水解度的影响；
[0024] 图3为不同接种量菌株GUHP86水解猪血蛋白水解度的影响；
[0025] 图4为发酵培养时间菌株GUHP86水解猪血蛋白水解度的影响；
[0026] 图5为温度和发酵时间对猪血蛋白水解度的响应面图；
[0027] 图6为温度和发酵时间对猪血蛋白水解度的等高线图；
[0028] 图7为温度和接种量对猪血蛋白水解度的响应面图；
[0029] 图8为温度和接种量对猪血蛋白水解度的等高线图；
[0030] 图9为温度和转速对猪血蛋白水解度的响应面图；
[0031] 图10为温度和转速对猪血蛋白水解度的等高线图；
[0032] 图11为发酵时间和接种量对猪血蛋白水解度的响应面图；
[0033] 图12为发酵时间和接种量对猪血蛋白水解度的等高线图；
[0034] 图13为发酵时间及转速对猪血蛋白水解度的响应面图；
[0035] 图14为发酵时间及转速对猪血蛋白水解度的等高线图；
[0036] 图15为接种量和转速对猪血蛋白水解度的响应面图；
[0037] 图16为接种量和转速对猪血蛋白水解度的等高线图；
[0038] 图17为解淀粉芽孢杆菌GUHP86液态发酵猪血培养方法
流程图。
具体实施方式
[0039]
实施例1本发明所涉及到的用解淀粉芽孢杆菌GUHP86提高猪血蛋白水解度的方法[0040] 从中国贵州贵阳生猪屠宰的屠宰场周围土壤样本中分离得到的解淀粉芽孢杆菌GUHP86，于2016年1月5日保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M 2016003。
[0041] ⑴制备菌种培养基
[0042] 按照以下物料配方制备菌种培养基：
[0043] 取猪血粉15.0g，NaCl 5.0g，MgSO4·7H2O0.2g，CaCl20.1g，K2HPO45.0g，pH 7.0，蒸馏水1000mL，混合均匀，于121℃下灭菌20min，得到菌种培养基，备用；
[0044] ⑵制备发酵菌种液：
[0045] 在250mL三角瓶内，挑取2环初筛斜面将解淀粉芽孢杆菌GUHP86接入菌种培养基，装液量50mL，于30℃下以转速为180r/min摇床培养24h， 即得发酵菌种液，备用；
[0046] ⑶选取发酵培养基
[0047] 选用新鲜猪血作为发酵培养基；
[0048] ⑷制备发酵液
[0049] 将发酵菌种液按6％的接种量接种于发酵培养基中，在30℃下以转速为180r/min的摇床培养48h，然后在4℃下以转速为10000r/min的离心分离机离心10min，得到的发酵上清液即为发酵液；
[0050] ⑸催化水解猪血蛋白
[0051] 将上述发酵液与新鲜猪血混合发酵，进行催化水解猪血蛋白。
[0052] 实施例2以不同的温度、时间、接种量及摇床转速分别考察解淀芽孢杆菌GUHP86水解猪血的条件，在单因素的
基础上，再对解淀粉芽孢杆菌GUHP86进行响应面优化实验确定最佳的水解条件，每个实验重复三次。以猪血蛋白水解度为指标确定菌株水解猪血的作用条件范围
[0053] 1单因素试验设计
[0054] 1.1发酵培养温度对猪血蛋白水解度的影响
[0055] 水解时间48h，接种量6％，摇床转速180r/min，温度分别调至10、20、30、40、50℃。
[0056] 1.2水解时间对猪血蛋白水解度的影响
[0057] 温度30℃，接种量6％，摇床转速180r/min，发酵培养时间分别取24h、36h、48h、60h、72h。
[0058] 1.3接种量对猪血水解度的影响
[0059] 温度30℃，水解时间48h，摇床转速180r/min，接种量分别为2％、4％、6％、8％、10％。
[0060] 1.4摇床转速对猪血水解度的影响
[0061] 温度30℃，水解时间为48h，接种量为发酵液的6％，摇床转速分别 为160r/min、170r/min、180r/min、190r/min、200r/min。
[0062] 单因素结果见图1-图4。
[0063] 2Box-Benhnken试验
[0064] 在上述单因素实验的基础上设计Box-Benhnken试验，优化解淀粉芽孢杆菌GUHP86对猪血蛋白的培养条件。选取(X1)、发酵时间(X2)、接种量(X3)及转速(X4)进行响应面优化，建立了猪血蛋白水解度的数学模型。Box-Benhnken试验结果见图5-10。
[0065] 表1菌株GUHP86水解猪血蛋白响应面分析因素和水平
[0066]
[0067] 表2菌株GUHP86水解猪血蛋白试验结果
[0068]
[0069]
[0070] 表3菌株GUHP86水解猪血蛋白试验方差分析
[0071]
[0072]
[0073] 注：“*”：P＜0.05显著水平；“**”：P＜0.01极显著水平
[0074] 通过响应面
软件将表2中的结果即猪血蛋白的水解度经方差分析和拟合，就可获得所有因子的显著性(见表3)，获得猪血蛋白水解度响应值(Y)对自变量发酵液的温度(X1)、发酵时间(X2)、接种量(X3)及转速(X4)的二次多项回归模型方程为：
[0075] Y＝+22.69+0.39X1+0.84X2+0.28X3-0.27X4+1.39X1X2+0.22X1X3+0.36X1X4+0.30X2X3-0.27X2X4-0.19X3X4-1.98X12+0.27X22+0.58X32-6.67X42。
[0076] 表3表明新建的模型P＜0.01，即极显著，表明方程和试验结果拟合度较好。还能得出，一次项中X2极显著，说明发酵时间(X2)对猪血蛋白水解度的影响为极显著；方程的一次项X1X2为显著；方程的二次项X1和X4为极显著。
[0077] 采用响应面设计软件对模型分析，可以得到所有响应面和其对应的等高线图。通过软件继续对二次回归方程进行分析以取得最优值，即发酵液的温度(X1)为35℃、接种量(X3)为7％、发酵时间(X2)为60h、摇床转速(X4)为179.6r/min时，响应值水解度达到最大值为28.23％, 与优化前相比提高0.42倍。发酵后猪血无血腥味，有发酵所特有的
香味。
