一种空肠弯曲菌、结肠弯曲菌检验的方法
专利汇可以提供一种空肠弯曲菌、结肠弯曲菌检验的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种空肠弯曲菌、结肠弯曲菌检验的方法，涉及细菌鉴定技术，特别是鉴定空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的检测方法。先将待检测样品用PBS预处理；再用含抗生素、生长促进剂和鸡血清浓度为10％的布氏肉汤进行选择性增菌；经一次性PCR扩增弯曲菌、空肠弯曲菌和结肠弯曲菌基因 片段 后；进行选择性培养基分离，最后特异性生化鉴定。本 发明 能形成大量的基因复制片段，方便比较，一次就能鉴定是否为空肠弯曲菌、结肠弯曲菌，较经典方法的细菌分离、鉴定方法快速、准确。，下面是一种空肠弯曲菌、结肠弯曲菌检验的方法专利的具体信息内容。
1、一种空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的快速检验方法，其特征在于包括以下步骤： 1)将待检测样品用PBS预处理； 2)用含抗生素、生长促进剂和鸡血清浓度为10％的布氏肉汤进行选择性增菌； 3)一次性PCR扩增弯曲菌、空肠弯曲菌和结肠弯曲菌基因片段； 4)经选择性培养基分离，最后特异性生化鉴定。
2、 根据权利要求l所述空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的快速检验方法，其特 征在于PCR扩增弯曲菌基因片段引物为：引物I : 5，醒[ATC TAATGG CTT AAC CATTAAAC] - 3，； 引物II: 5， - [GGA CGG TAA CTA GTT TAG TAT T] - 3 ，。
3、 根据权利要求l所述空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的快速检验方法，其特征在于PCR扩增空肠弯曲菌基因片段引物为：引物III: 5 ， - [CTA TTT TAT TTT TGA GTG CTT GTG] - 3 ，； 弓I物IV: 5， - [GCTTTATTTGCCATTTGTTTTATTA] - 3，。
4、 根据权利要求1所述空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的快速检验方法，其特 征在于PCR扩增结肠弯曲菌基因片段引物为：引物V: 5 ， - [AAT TGA AAA ATT GCT CCA ACT ATG] - 3 ，； 引物VI: 5， -[TGATTTTATTATTTGTAGCAGCG]-3，。
5、 根据权利要求l所述空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的快速检验方法，其特 征在于选择性增菌时，增菌培养条件为42。C、摇床转速120rpm、培养环境 为厌氧培养罐，内含微需氧产气袋。
6、 根据权利要求1所述空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的快速检验方法，其特 征在于所述抗生素包括多粘菌素B、甲氧苄氨嘧啶、利福平和放线菌酮。
7、 根据权利要求1所述空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的快速检验方法，其特 征在于所述生长促进剂包括丙酮酸、焦亚硫酸钠和硫酸亚铁。
8、 根据权利要求1所述空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的快速检验方法，其特征在于对多重PCR扩增阳性的样品增菌液，采用由头孢哌酮和两性霉素B 组成的抗生素的CCDA培养分离纯化，分离培养条件为42°C、培养环境为 浓度12%的二氧化碳培养箱。
一种空肠弯曲菌、结肠弯曲菌检验的方法
技术领域
弯曲菌是全球范围内胃肠炎的主要病因，是主要的食源性病原菌，能引 起散发性和地方流行性的胃肠炎爆发，特别是在缺陷性的个体，如癌症病人、 艾滋病病人、糖尿病人、小孩和老人等，5岁以下儿童的发病率最高，另外， 格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrome, GBS)是特定血清型空肠弯曲菌感 染后最严重的并发症，可以导致呼吸肌麻痹而死亡，因此，弯曲菌也是全球 公共卫生关注的重点。近些年来，弯曲菌感染率在世界各地普遍呈上升趋势， 已成为最常见的、急性细菌性肠道传染病，据美国国家食品网的监测，弯曲 菌是发病率最高的病原菌，其病例数己超过李斯特菌病、沙门氏菌病和志贺 氏菌病。使人致病的弯曲菌中99%的是空肠弯曲菌，其次是结肠弯曲菌，其 它弯曲菌偶尔致病。
空肠弯曲菌和结肠弯曲菌作为致病菌检测的一项重要指标，在公共卫生、 食品安全、畜牧兽医和出入境检验检疫中均是检测的项目，有重要的社会、 经济意义。弯曲菌是兼性微需氧菌，培养条件苛刻，常规培养需要丰富的营 养条件和稳定适宜的气体条件，国内外的研究起步较晚，其常规培养方法还 有待于进一歩完善。传统的弯曲菌检测主要依靠生化试验和血清凝集试验。 由于空肠弯曲菌、结肠弯曲菌具有对培养基营养要求高、培养条件苛刻，对 氧气都比较敏感，只能在低氧环境中生长，培养周期较长等特点，采用不同 的检验程序、方法，报告结果差异较大，且确诊检验结果至少需10〜20天， 检验方法存在繁琐、费时费力、特异性低等缺陷。因此，快速、准确、简便
的细菌检测方法将是发展的方向。建立一种能同时快速检测空肠弯曲菌和结 肠弯曲菌的检测方法具有重要的意义。 发明内容
本发明目的在于为人们提供一种能快速鉴定出样本是否被空肠弯曲菌、 结肠弯曲菌污染的检测方法。 本发明包括以下步骤：
1) 将待检测样品用PBS预处理；
2) 用含抗生素、生长促进剂和鸡血清浓度为10%的布氏肉汤进行选择 性增菌；
3) —次性PCR扩增弯曲菌、空肠弯曲菌和结肠弯曲菌基因片段；
4) 经选择性培养基分离，最后特异性生化鉴定。
由于单个疑似样本中的特征菌落数量极少，本发明对样本先进行选择性 增菌，然后，再一次性同时对可能存在的弯曲菌属7沾W?A^基因、空肠弯 曲菌ma/W基因和结肠弯曲菌CeW£基因进行扩增，形成大量的基因复制片 段，方便比较， 一次就能鉴定是否为空肠弯曲菌、结肠弯曲菌。本发明较经 典方法的细菌分离、鉴定方法快速、准确。
进行PCR扩增时，弯曲菌基因片段引物为：
引物I : 5， - [ATC TAATGG CTT AAC CAT TAAAC] - 3 ，；
引物II: 5， - [GGA CGG TAA CTA GTT TAG TAT T] - 3 ，。
扩增空肠弯曲菌基因片段引物为：
弓I物m: 5 ， - [CTA TTT TAT TTT TGA GTG CTT GTG] - 3 ，； 弓I物IV: 5， -[GCTTTATTTGCCATTTGTTTTATTA]-3，。
扩增结肠弯曲菌基因片段引物为：
引物V: 5 ，画[AAT TGA AAA ATT GCT CCA ACT ATG] - 3 ，； 弓1物VI: 5 ， - [TGA TTT TAT TAT TTG TAG CAG CG] - 3 ，。
另，本发明在选择性增菌时，增菌培养条件为42"C、摇床转速120rpm、 培养环境为厌氧培养罐，内含微需氧产气袋。在检测样品中，由于环境压力的作用， 一些细菌能够进入存活不可培养
状态（Viable nonculturable stage, VNC)，在这种状态下，细菌仍然具有代谢 活力和感染性，在培养基中增殖困难，培养气体要求高，本发明较经典方法 的细菌培养方法敏感度高、准确。
以上抗生素包括多粘菌素B、甲氧苄氨嘧啶、利福平和放线菌酮。 以上生长促进剂包括丙酮酸、焦亚硫酸钠和硫酸亚铁。 为了进一步提高检测的准确性，本发明还采用了对扩增的特定基因片段 的纯化：对多重PCR扩增阳性的样品增菌液，采用由头孢哌酮和两性霉素B 组成的抗生素的CCDA (Campylobacter blood-free selective agar base)培养分 离纯化，分离培养条件为42'C、培养环境为浓度12%的二氧化碳培养箱。
另外，本发明对多重PCR扩增阳性的样品，采用含抗生素的CCDA培 养基分离纯化，氧化酶和马尿酸钠水解试验鉴定，分离培养条件为42。C、培 养环境为二氧化碳培养箱（C02浓度为12%)。本发明较经典方法的细菌培养、 分离和鉴定方法简便、特异、准确。 附图说明
图1为PCR扩增产物电泳图。
图2为待检菌在氧化酶试纸上的显色照片图。
图3为待检菌马尿酸钠水解后显色照片图。
具体实施方式
用灭菌棉拭采集样品或直接将样品插入Carry-Blair运送培养基中，于24 h内送检，样品采集遵循统计学要求。
从运送培养基中取出样品，置于含500 pl灭菌PBS(pH 7.2)的指形管中， 充分浸透，20min，间隔振荡数次；取出棉拭，将浸液加至含9.5 ml布氏肉 汤（含抗生素混合液、生长促进剂和浓度10%的鸡血清）的试管中，置2.5L 厌氧培养罐中，加入微需氧产气袋后立即密封厌氧罐，以42°C、转速120 rpm 的摇床振摇培养36h。
抗生素混合液：多粘菌素B0.25g、甲氧苄氨嘧啶0.25g、利福平0.25g 和放线菌酮2.5 g，加入50 mll:l丙酮和蒸馏水混合液中充分溶解，用0.22 ^im 滤膜过滤备用。
弯曲菌生长促进剂：丙酮酸、焦亚硫酸钠和硫酸亚铁各称取3.125 g，加 入50 ml蒸馏水充分溶解，用0.22 pm滤膜过滤备用。
根据弯曲菌属ri?A^基因、空肠弯曲菌w"/W基因和结肠弯曲菌 基因高度保守序列设计三对特异性引物，上述三对特异性引物由上海博亚生 物有限公司合成。预期扩增出的目的片段大小分为弯曲菌：857 bp;空肠弯 曲菌：589 bp;结肠弯曲菌：462 bp。
弯曲菌属：
引物I : 5, - [ATC TAATGG CTT AAC CAT TAAAC] - 3 ，； 引物II: 5， -[GGACGGTAACTAGTTTAGTATT]-3，。
空肠弯曲菌：
弓I物III: 5 ，画[CTA TTT TAT TTT TGA GTG CTT GTG] - 3 ，； 弓l物W: 5， - [GCTTTATTTGCCATTTGTTTTATTA] - 3，。
结肠弯曲菌：
引物V: 5， - [AAT TGA AAA ATT GCT CCA ACT ATG] - 3 ，； 引物VI: 5， - [TGATTTTATTATTTGTAGCAGCG] - 3，。 三、多重PCR
1、 DNA模板制备：
取菌液0.5ml， 8000 rpm离心5min弃上清，加入100 超纯水，用移 液器将其混合均匀，隔水煮沸20min，取出立即置于冰上，8000 rpm离心5 min，取上清进行PCR检测，或置于-20。C冰箱中备用。
2、 多重PCR扩增：
①10 X PCR Buffer (含1.5 mmol/L Mg2+ ): 2.5 u 1
二、引物
引物
弯曲菌引物I、 II (浓度为2.5 Pmol/L):
空肠弯曲菌引物m、 IV (浓度为2.5 ymol/L):
结肠弯曲菌引物V、 VI (浓度为2.5 umol/L): 待检测样品模板：
Taq聚合酶[北京天根生物工程公司普通PCR扩增酶
(5U/(_il)]: 灭菌超纯水：
各1.2" 各1.2 tU 各1.0tU 2.0 u 1
0.2 ti 1
7.0 U 1
总体积 20.0 lU
扩增条件为：95T:预变性10min; 95。C变性30 s， 59。C退火90s， 72°C 延伸lmin，共35个循环；72。C延伸10min后，12"保存。
四、 PCR扩增产物的鉴定
取PCR扩增产物8 y 1，点样于10 g/L琼脂糖凝胶（含0.3 mg/L溴化乙 锭），以1000 bp Marker作为标准分子参照，以5 V/cm的电场强度于1倍的 TAE电泳缓冲液中电泳2h，紫外线下观察产物，凝胶成像系统拍照。如图l 所示。
图l中各列分别为：M.DNAMarker; 1.空肠弯曲菌；2.结肠弯曲菌； 3.空肠、结肠弯曲菌混合；4、 5.沙门氏菌；6.大肠杆菌；7、 8李斯特 菌；9.空白对照。
五、 PCR产物的序列鉴定
利用DNA回收试剂盒（大连宝生物公司）从琼脂糖凝胶中回收PCR产 物进行克隆（pGEM-T vector)和DNA序列测定。DNA序列测定由上海联合 基因公司完成。
六、 选择性培养基分离菌株
取一铂耳环PCR阳性增菌液，三区划线接种于含抗生素的CCDA平板， 分离培养条件为42°C、培养环境为二氧化碳培养箱（C02浓度为12%)、培 养时间为48h;挑取灰白或灰绿色的菌落3〜5个，再次接种于含抗生素的
CCDA平板，重复2〜3次，直至得到单一纯培养菌落。
其中，含抗生素CCDA:按CCDA产品说明书配制培养基，高压灭菌后， 冷却至50〜60。C加入头孢哌酮（32mg/L)和两性霉素B(IO mg/L)。
七、 特异性生化鉴定
氧化酶实验：
取一张氧化酶试纸条置干净平皿内，用灭菌铂儿取待检菌涂于试纸条上， IOS内观察结果，紫色或紫红色为阳性，无色或淡黄色为阴性。空肠弯曲菌
和结肠弯曲菌均呈紫色或紫红色。如图2所示。
马尿酸钠水解实验：
将细菌接种于1。/。的马尿酸钠0.4ml， 37'C水浴2h，徐徐加入滴加3.5% 茚三酮溶液0.2ml，应注意避免相混，放置10min后，观察结果，深紫色或 紫色为阳性，蓝色或无色为阴性。如图3所示。
空肠弯曲菌马尿酸钠水解实验阳性（深紫色或紫色），结肠弯曲菌马尿酸 钠水解试验阴性（蓝色或无色）。
1%马尿酸钠溶液：马尿酸钠lg， 99mlPBS，溶解并分装指形管，每管 400 ^1， -20°(^呆存，备用。
3.5%茚三酮溶液：茚三酮3.5g，丙酮50ml， 丁酮50ml，各成份混合， 置棕色瓶，4'C保存，备用。
八、 总结
本发明公开了一种空肠弯曲菌、结肠弯曲菌检验的新方法，先将待检测 样品用PBS预处理，经含抗生素和生长促进因子的布氏肉汤选择性增菌，然 后进行一次性PCR扩增弯曲菌属/6S ri?W^基因857 bp、空肠弯曲菌ma/W 基因589bp和结肠弯曲菌Cew五基因462bp，电泳鉴定，DNA序列测定结果 与报道的三种基因序列一致。经含抗生素的CCDA选择性培养基分离，最后 氧化酶和马尿酸钠特异性生化鉴定。 <110>扬州大学
<120〉一种空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的快速检验方法
<160>6
<210>1 <211>23 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223〉根据弯曲菌基因组DNA片段设计 <400>1
atctaatggc ttaaccatta aac
<210〉2 <211>22 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>根据弯曲菌基因组DNA片段设计 <400>2
gg3cggt犯c tegtttegta tt
<210>3 <211>24 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>根据空肠弯曲菌基因组DNA片段设计 <400〉3
ctattttatt tttgagtgct tgtg
<210>4 <211>25 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>根据空肠弯曲菌基因组DNA片段设计 <400>4
gctttatttg ccatttgttt tatta
<210>5 <211>24 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>根据结肠弯曲菌基因组DNA片段设计<400>5
aattgaaaaa ttgctccaac tatg
<210>6 <211>23 <212>DNA <213>人工序列
<220〉
<223>根据结肠弯曲菌基因组DNA片段设计 <400>6
tgattttatt atttgtagca gcg
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