此发明涉及抗原肽(antigenic peptide)。

数个对人体健康重要的病原体是可变异的病原体，如HIV-1，HIV-2，乙 型和丙型肝炎病毒，流感病毒(influenza)，1-4型登革热病毒(dengue virus)， 疟疾病原体，和结核病病原体。这些可变异病原体及其高度遗传变异性给开 发针对它们的疫苗带来困难。特别是全世界感染了HIV的人数迅速增长，尤 其是在卫生保健资源贫乏的国家。开发高度有效的疫苗可帮助限制此流行病 的传播。开发此疫苗的一个主要障碍是HIV的极高遗传多样性。在世界的多 个地区观察到在不同的亚型中、在单个亚型中甚至有时在一个个体中存在遗 传多样性。此变异性由在病毒复制时出现的病毒蛋白的高频(high rate)突变导 致。见例如，Coffin，J.M.Science 1995，267：483-489；Delwart等，J.Virol.1994 68：6672-6683；Markham R.B.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998，95： 12568-12573；和McCutchan，F.E.等，AIDS 1996 10 Suppl 3：S13-S20，其每 篇全文引入作为参考。
动物模型中已经显示，同时暴露于多个抗原决定簇通常会诱导对它们中 每一个的免疫反应(Thomson，S.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1995，92： 5845-5849；Thomson，S.A.等，J.Virol.1998，72：2246-2252；和Woodberry，T. 等，J.Virol.1999，73：5320-5325，其每篇全文引入作为参考)。这表明多个抗 原决定簇适合作为单个疫苗构建体的组分。
发明概述
针对可变异病原体的免疫反应的保护性成分通常针对蛋白的可变区。从 另一个角度，如果保护性反应是针对蛋白的保守区的话，那么病原体的变异 性不会给感染的免疫控制和疫苗预防带来问题。然而针对可变异病原体的保 守区的免疫反应通常被证明是无保护性的。基于可变区的肽抗原能诱导保护 性反应，但这些区的可变异性很大，因此添加单个肽序列来覆盖变异性是不 实际的。针对可变异病原体的有效疫苗应包括多种抗原，来产生针对个体可 能会接触的病原体的变体的免疫反应。
针对可变异感染因子(infectious agent)的疫苗预防或治疗需要构建一种 疫苗，它能诱导针对抗原可变区的宽范围(wide-range)的体液和细胞免疫反 应。要针对可变异感染因子进行疫苗预防或治疗，就要开发针对其蛋白组分 可变区或高变区能诱导免疫反应的疫苗。
含有一或多个潜在保护性表位的嵌合肽抗原文库以及包含这些抗原的 疫苗构建体能产生保护性免疫反应。特别是嵌合肽文库能诱导保护性免疫反 应，其包括对HIV-1，HIV-2，丙型和乙型肝炎病毒，流感病毒，1-4型登革 热病毒，疟疾病原体，和结核病病原体，或其它可变异病原体的体液和细胞 反应。
可设计嵌合肽文库来代表蛋白表位的天然出现的及潜在的变体。用此方 式开发的肽文库能产生广泛的免疫交叉反应，并可用来构建疫苗，药物，和 诊断试剂盒。可将此设计方法用于范围广泛的感染因子的抗原决定簇。对一 种感染因子或其蛋白之一或对于该蛋白的单个表位可用不同方法。
嵌合肽的免疫原性组(set)被称为可变异嵌合肽文库(VCPL)，它代表了抗 原活性区的天然出现的和潜在的可变异性。可变异嵌合肽文库是在一或多个 位置可变异的同源性肽的组。设计它们的目的是模拟感染因子的可变异的保 护性决定簇的遗传多样性。此VCPL能诱导产生具有共同特异性的宽范围的 抗体和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，其覆盖了可变异感染因子的抗原变体的 多样性。
本发明一方面提供了产生抗原肽的家族的方法，其包括在病原体蛋白的 区域内定位多个可变异位置，选择包含所述多个可变异位置的病原体蛋白的 肽序列，基于与在所述病原体蛋白可变异位置上天然出现的氨基酸残基的抗 原相似性、为所述可变异位置之一选择一或多个取代物氨基酸残基(substitute amino acid residue)；并产生基于所述肽序列、并包含所述取代物氨基酸残基 的抗原肽的家族。
本发明另一方面提供了设计肽序列的家族的方法，其包括在病原体蛋白 的区域内定位多个可变异位置，选择包含所述多个可变异位置的病原体蛋白 的肽序列，并基于与在所述病原体蛋白可变异位置上天然出现的氨基酸残基 的抗原相似性、为所述肽的可变异位置之一选择一或多个取代物氨基酸残 基，从而形成肽序列的家族。
所述选择可包括用抗原相似性矩阵来确定抗原相似性。指定(assign)抗原 肽的家族的每个取代物氨基酸残基的频率。所述制备可包括基于指定的频率 来权重(weighting)抗原肽的家族中的取代物氨基酸残基。所述指定可包括考 虑天然出现变异的频率。所述病原体蛋白可包括高变区。所述病原体蛋白可 与病毒相关。所述病毒可以是HIV，乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒，或流感 病毒。所述病原体蛋白可以是HIV gp120。所述区域可以是V1，V2，V3，V4 或V5区。所述病原体蛋白可与疟疾病原体，登革热病原体或结核病病原体 相关。
所述抗原肽的家族可包括多个成员，从而所述成员一起与在所述病原体 蛋白区域内每个天然出现的序列具有抗原相似性。所述抗原肽的家族可包括 多个成员，从而所述成员一起与在所述病原体蛋白区域内非天然出现的序列 具有抗原相似性。所述方法可包括鉴定所述家族的肽序列，其中所鉴定的肽 序列代表了整个家族的序列多样性。可鉴定少于500个序列，这些序列作为 整个家族的序列多样性的代表。所述鉴定可包括计算所述家族的肽序列之间 的距离。所述计算距离可包括使用抗原相似性矩阵。
所述方法可包括确定所述家族的肽和人类蛋白的区域之间的抗原相似 性。如果确定所述家族的肽和人类蛋白的区域之间的抗原相似性超过预确定 的阈值，所述方法可包括在制备所述家族之前从所述抗原肽的家族中去除此 肽。
产生所述抗原肽的家族包括通过化学合成所述肽的家族。所述化学合成 包括组合合成(combinatorial synthesis)，其中形成的所述肽为不同序列的混合 物。可混合所述分开的肽。所述化学合成可包括平行合成(parallel synthesis)， 其中每个肽与其它肽分开形成。产生所述抗原肽的家族可包括用宿主生物体 表达所述肽的家族。
本发明另一方面提供了包含抗原肽的家族的组合物，所述抗原肽具有的 氨基酸序列与病原体蛋白可变区的氨基酸序列有抗原相似性，其中所述家族 中每个抗原肽具有至少一个相对于家族中的其它抗原肽变异的氨基酸位置。
在变异的位置上一个氨基酸残基会比另一个出现得更频繁。所述家族可 包括多于150或多于1,000个彼此独特的(mutually unique)抗原肽。所述家族 可包括少于100,000或少于50,000个彼此独特的抗原肽。所述家族可包括在 1,000和50,000个之间的彼此独特的抗原肽。所述抗原肽的家族可包括与HIV 亚型的序列具有抗原相似性的序列。所述亚型可以是A亚型，B亚型，C亚 型，D亚型，F亚型，G亚型，重组亚型，N组HIV的亚型，O组HIV的亚 型或它们的组合。所述抗原肽的家族的至少两个成员可混合在一起。所述抗 原肽的家族可根据序列分开。所述家族可包括多抗原肽(multiple antigenic peptide)。
本发明另一方面提供了在受试者诱发免疫反应的方法，其包括给予所述 受试者包含抗原肽的家族的组合物，所述抗原肽具有的氨基酸序列与病原体 的病原体蛋白可变区的氨基酸序列有抗原相似性。
可用抗原相似性矩阵确定抗原相似性。可在受试者被所述病原体感染前 给予其所述组合物。所述抗原肽的家族具有的氨基酸序列可与所述病原体蛋 白亚型的氨基酸序列有抗原相似性。所述抗原肽的家族具有的氨基酸序列可 与所述病原体蛋白一种以上的亚型的氨基酸序列有抗原相似性。将所述组合 物给予被所述病原体感染的受试者。该受试者可被所述病原体的亚型感染。 所述抗原肽的家族具有的氨基酸序列可与该受试者所感染的亚型的氨基酸 序列有抗原相似性。
本发明另一方面提供了诊断感染的方法，其包括使样品与肽的家族接 触，所述肽的氨基酸序列与病原体蛋白可变区的氨基酸序列有抗原相似性， 其中家族中每个肽有至少一个相对于家族中其它肽变异的氨基酸位置。
所述肽的家族可与病原体亚型在抗原性上相似，或与一种以上病原体亚 型相似。可将所述肽的家族在接触前固定在基质(substrate)上。所述方法可包 括确定所述样品是否包含与所述肽的家族特异性结合的抗体。
通常，抗原肽文库代表了病原体蛋白可变区的存在的和潜在的多样性。 所述肽文库可用于预防、治疗和诊断的应用。可用文库代表病原体表位的完 全抗原多样性(full antigenic diversity)。为反映病原体所有变体的多样性而设 计的文库可以是广谱的(broad-spectrum)疫苗或是诊断性试剂。为反映病原体 一或多个亚型的多样性而设计的文库可以是亚型特异性疫苗或是诊断性试 剂。可从文库去除与发现于人类蛋白的序列高度相似并因此可能诱导自身免 疫反应的肽序列。可设计已知序列的任何可变异的病原体蛋白的文库。可变 异病原体的例子包括HIV-1，HIV-2，乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒，流感病 毒，1-4型登革热病毒，疟疾病原体，和结核病病原体。
如下说明书将详细描述一或多个实施方案。其它特征和优点在说明书和 权利要求书中明显可见。

已经做了很多努力来开发特别是针对HIV的疫苗，但至今未成功。为了 针对宽范围的HIV-1分离体(isolate)有效，潜在的疫苗应包含主要分离体的免 疫原，其代表了HIV-1分离体的整个范围。必需鉴定这些免疫原并提高其免 疫原特性(McMichael，A.J.，和Hanke，T，Nature Medicine 2003，9：874-880； Baltimore，D.和Heilman，C.Sci.Am.1998，279：98-103；和van der Groen，G 等，AIDS Res.Hum.Retroviruses 1998，14Suppl.3：S211-S221，其每篇全文引 入作为参考)。
因此，所得疫苗构建体应结合现代传递工具和佐剂，包含对宽范围的 HIV-1分离体特异的、关键的保护性B细胞和T细胞的表位。需要激活免疫 系统的体液和细胞免疫(Berzofsky，J.A.，和Berkower，I.J.，AIDS 1995，9 Suppl. A：S 143-S 157，其每篇全文引入作为参考)。据认为，粘膜上的局部免疫反 应和循环的中和抗体对预防HIV感染起主要作用，而病毒特异性CTL可能 去除被感染的细胞。见例如，Lehner，T.等，Science 1992，258：1365-1369；和 Goulder，P.J.和Walker，B.D.Nature Med.1999，5：1233-1235，其每篇全文引 入作为参考。
HIV包膜糖蛋白的氨基酸序列(也称env或gp120)在独立分离体之间和 来自一个感染个体的连续分离体之间是高度变异的。gp120的氨基酸可变异 性集中在特定可变区，编号为V1-V5。变化最大的区域通常包含中和表位， 从而该病毒部分地逃避了宿主免疫反应并使感染持续下去。gp120的主要中 和性决定簇位于第三个高变区(V3)。
因发现V3区为主要的中和决定簇，现已开发数个针对HIV-1的侯选肽 疫苗。例如，合理设计针对HIV的多价亚单位疫苗的方法包括确定来自世界 各地区的HIV gp120分离体的V2和V3区的中和表位。见例如，美国专利 6,042,836，其全文引入作为参考。另一个合成的免疫原性HIV-1肽的途径包 括设计串联的合成肽，该肽包括T细胞和B细胞的表位序列和多个不同哦功 能HIV分离体的V3环序列。见例如，美国专利5,817,754，其全文引入作为 参考。然而，V3区的高度遗传变异性产生了多样的序列，所述序列不能被 同时引入疫苗构建体。
基于与疫苗同样的原因，要诊断抗可变异感染因子高变区的抗体是极为 困难的。这些抗体在免疫反应中最早出现并且占优势。一个例子是抗HIV-1 gp120的V3区的抗体。见例如，Baltimore，D.和Heilman，C.Sci.Am.1998， 279：98-103，Berzofsky，J.A.，和Berkower，I.J.，AIDS 1995，9Suppl.A： S143-S157，和Carlos，M.P.等，AIDSRes.Hum.Retroviruses2000，16：153-161， 其每篇全文引入作为参考。
诊断抗gp120的V3高变区的抗体依赖于涉及的抗原的基因型和感染因 子的基因型。它需要使用多个对应于范围广泛的HIV-1变体的多个序列。否 则，漏掉病毒的罕见变体或被修饰的变体的风险很高。
以肽为基础的疫苗可包括肽的文库。所述肽可与病原体蛋白的可变区相 似。特别是所述可变区可包含已知的抗原决定簇。选择文库中的肽序列以使 其代表所述可变区的天然出现和潜在的可变异性。
模拟病原体的可变异蛋白区域遗传多样性的嵌合肽文库能诱导对广谱 病原体变体的保护性免疫反应。为设计嵌合肽文库，进行蛋白序列信息的理 论分析。所述合理(rational)分析设计出能模拟所述可变异蛋白区域的所有已 知和潜在变体的文库。所述文库可以是亚型特异性文库，它只模拟那些属于 病原体特定亚型的变体，或者所述文库是模拟属于一个以上亚型的变体的广 谱文库。所述文库的肽可结合对其各种抗原性变体特异的抗体。
一般通过分析来自可变异病原体的蛋白序列来开始设计抗原性嵌合肽 文库。鉴定所述蛋白的可变区。所述可变区可以是已知的抗原决定簇。选择 所述蛋白序列内包括至少一个可变位置的肽片段为所述嵌合肽文库的基础。 所述片段包括一或多个具有天然序列变异的位置。所述肽片段可包括不改变 的位置。所述片段可以是10-50个残基长度，如15-45个残基或20-40个残 基长度。鉴定出在肽的每个可变异位置出现的残基以及每个出现的频率。通 过考虑与在那个位置天然出现的残基的抗原相似性来选择文库中每个可变 异位置上的残基。根据每个残基或与其对应的抗原性相似的残基的天然出现 频率来设定每个残基在可变异位置上的频率。如下将更具体描述对残基和频 率的选择。可以自动，即用计算机程序来选择残基和确定频率。
文库中的序列数(文库大小)是肽中每个位置上可能的残基数的产物。所 述文库大小可包括，例如，多于200,000,000个序列，少于200,000,000个序 列，少于500,000个序列，少于200,000个序列，少于100,000个序列，少于 50,000个序列，多于5,000个序列，多于10,000个序列，或多于20,000个序 列。可以通过去除出现频率最低的残基来减少所述文库大小，直到达到理想 大小。
嵌合肽的免疫原性组(可变异的嵌合肽文库或VCPL)在一起时，代表抗 原活性区的天然出现的和潜在的可变异性。可变异嵌合肽文库是在一或多个 位置可变异的同源性肽的组。设计它们是为了模拟感染因子的主要可变异保 护性决定簇的遗传多样性。这些VCPL可诱导多种抗体和细胞毒性T淋巴细 胞(CTL)，其具有覆盖所述感染因子抗原性变体的多样性的联合(joint)特异 性。因此，VCPLs诱导体液和细胞免疫反应，所述反应针对感染因子现存变 体的多样性并且针对未来可能出现的潜在变体。
可构建可变异嵌合肽的文库，从而这些肽的保守位置代表了对所有序列 共有的氨基酸，并且由一或多个氨基酸来模拟可变异位置的同种异型 (heterogeneous)多样性。所述模拟氨基酸可以是嵌合的，换言之，它们模拟 可变异位置通常的同种异型性，但无须在天然序列的已知和潜在的多样性的 对应位置上出现。
设计VCPL的方法是基于对优势免疫蛋白表位的排列(organization)和诱 导针对靶病原体的保护性免疫反应的整体结构证据的深入调查。通过收集并 分析来自靶病原体的氨基酸序列，并估计病原体亚型的遗传可变异性和流行 病学显著性来开始设计文库。搜索所述氨基酸序列中对开发针对病原体的保 护性免疫反应有用的保守、可变和高变区。
可对设计文库所来自的病原体蛋白序列进行选择来控制所述肽文库的 抗原特性。例如，模拟病原体特定亚型的文库可通过仅选择来自那个亚型的 序列来设计。在整个基因组中，在任一亚型或亚-亚型中序列彼此的相似性 一般超过了这些序列和其它亚型的序列的相似性。M组是HIV-1全球流行的 (pandemic)主要病毒组，并且它包含多个亚型。O组是“偏离(outlier)”组， 而N组是非-M、非-O病毒的很独特的形式。M组HIV-1的HIV-1亚型，例 如，是HIV-1序列的系统发生相关的组或进化枝(clade)，并被标记为A1，A2， B，C，D，F1，F2，G，H，J和K。除此以外，重组的HIV-1序列是可能的，其中 病毒基因组包含来自一个以上亚型的序列的区域。例如见hiv-web.lanl.gov 上的HIV Sequence Database。这些亚型代表了HIV的不同谱系，并具有一些 地理相关性。例如当发现特定亚型在特定地理位置占优势时，模拟特定亚型 或重组形式的文库是有用的。
抗原活性区序列的潜在进化变体数可以很多。例如，HIV-1 gp120的V3 区的潜在抗原可变异性可以高达1025-1030个变体。一旦由天然出现的序列确 定了在肽的每个位置的完全可变异性，可以通过识别决定所述抗原变体基因 型多样性的最显著氨基酸来降低所需VCPL的可变异性。多个氨基酸在免疫 原性表位的可变异位置出现的频率由它们在所需(at issue)区的序列比对中的 相对出现情况来决定。
可通过识别在每个可变异位置最具有抗原优势的氨基酸来减少所述 VCPL的大小，并将它们组合到可变异组合物的组中，并以一或多个氨基酸 代表可变异组合物的组。基于抗原相似性确定代表可变异组合物的组的氨基 酸。
抗原相似性是一个氨基酸残基在蛋白-蛋白相互作用，例如抗体-抗原作 用中取代另一个的容易程度的定量量度。如果在特定表位用一个残基取代另 一个残基对那个表位的抗原表现影响小的话，那么这两个残基在抗原性方面 非常相似。相反，如果所述取代的影响大，那么这两个残基的抗原相似性低。 一般物理和化学性质相似的残基会具有高的抗原相似性。
可用矩阵，即抗原相似性矩阵(ASM)表示抗原相似性。构建矩阵见例如， Maksyutov，A.Z.，Eroshkin，A.M.，和Kulichkov，V.A，Mol.Biol.1987，21： 30-47所述，其全文引入作为参考。所述矩阵可解释两个残基的亲合力，即 两个残基在球状蛋白中如何频繁地接触，如同3D结构检查所确定的那样。 见例如，Warme，P.K.，和Morgan，R.S.，J.Mol.Bill 1978，118：289-304，其全 文引入作为参考。也对免疫球蛋白高变区中的氨基酸出现频率作了矩阵核 算。见例如，Bourgarit，J.，J.Ann.Immunol.1980，131D：267-287，其全文引入 作为参考。
可用如下公式转化起始矩阵的值：
ASMij＝100-(Rij+Rji)/2
对于每对氨基酸i和j，和Rij和Rji是起始矩阵的元件(element)，因此产 生了对称(symmetric)矩阵。为区分合适的(coinciding)氨基酸的作用，并增加 在抗原表位频繁出现的残基权重，可根据如下公式调整对角线元件(diagonal element)：
ASMii＝ASMii+5(hi+si+c)
其中hi是氨基酸的亲水性(Hopp，T.P.，和Woods，K.R.，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 1981，78：3824-3828，其全文引入作为参考)，si是蛋白抗原决定簇中 该氨基酸的相对频率(Maksyutov，A.Z.和Zagrebelnaya，E.S.，Comp.Applic. Biosci.1993，9：291-297，其全文引入作为参考)，并且c是hi+si的最小值6.6， 引入它是为了确保(hi+si+c)的总和为正。最终，为满足局部(local)比对程序 SIM，从矩阵中的每个元件减去数量75。表1显示了一个这样的矩阵。表1 的ASM是为了搜索出在抗体或另一结合配体与结合位置相互作用方面表现 出相近结构特征的局部相似区(locally similar region)(见例如，Maksyutov A.Z. 等，Molecular Biology 2002，36：346-358，其全文引入作为参考)。
一对氨基酸的矩阵值大(qualitatively)表示它们是彼此的良好取代物，数 值小表示它们彼此取代不好。例如，根据矩阵缬氨酸和亮氨酸(矩阵值为9) 的抗原相似性高，但缬氨酸和天冬氨酸(矩阵值为-59)却不是，这与从化学方 面的考虑所期望的相同。
表1

查找在肽的每个位置天然出现的每对残基的矩阵值。矩阵值为正的一对 残基在文库中会被在天然序列中出现较频繁的一个残基所代表，并且该残基 在文库的频率将会是它所代表的每个残基频率的总和。剩下的残基以亚组 (subgroup)组合，对于每个亚组，在矩阵中搜索与亚组中的每个残基矩阵值 为正的残基。如果发现了此残基，那么指定它的频率等于亚组中残基频率的 总和。此残基可以是不在那个位置天然出现的残基。如果天然出现的残基与 在那个位置天然出现的任何其它残基无为正的矩阵值，并不能被在那个位置 非天然出现的其它残基所代表，那么它将在文库中代表自身。
举例如何用矩阵来选择肽文库中特定位置的残基，考虑一个可变异位 置，该位置天然出现如下六个不同残基：A(5％)，D(20％)，E(35％)，M(22％)， V(10％)，和Y(8％)。然后查找每对天然出现的残基的矩阵值：
AD            -41
AE            -49
AM            -7
AV            -1
AY            -25
DE            4
DM            -7
DV            -59
DY            -26
EM            -55
EV            -62
EY            -20
MV            -1
MY            -10
VY            -32
只有一对残基DE的矩阵值为正。这对残基会被天然出现较频繁的残基 E代表，并会有与它所代表的残基的频率总和(20+35＝55％)相等的频率。将 剩下的残基A，M，V和Y分为亚组，并且搜索矩阵来寻找与这些残基抗原 性相似的其它残基。每个残基A，M和V的亚组与L都有为正的矩阵值：
AL            3
ML            4
VL            9
因此文库中的A，M和V会被L代表，L与它们三个在抗原性上相似。 L在文库中的频率是A，M和V的频率总和：5+10+22＝37％。最终因为Y 不与另一个残基在抗原性上相似，Y在文库中以频率8％代表自身。表2总 结了在此例中，天然序列的残基如何被文库代表的。
               表2   天然出现的         文库   D   20％   E   55％   E   35％   A   5％   L   37％   M   22％   V   10％   Y   8％   Y   8％
理论分析针对肽文库的抗体的潜在交叉反应性表明，为诱导足够广泛的 免疫交叉反应来覆盖可变异感染因子的整组抗原变体，需要包含数万个同源 性肽的文库。具有数百个同源性肽的较小文库不能诱导针对可变异感染因子 的届已存在的和潜在变体的足够广泛的免疫反应。然而，使文库大小变大也 会增加该文库未来引发自身免疫反应的风险。通过评估抗同源性抗原的抗体 的交叉反应性的方法来进行此分析。见例如，Maksyutov A.Z.，Voprosy Virusologii 1989，3：283-288；Maksyutov A.Z.，Eroshkin A.M.，和Kulichkov V.A.，Molekularnaya Biologiya 1987，21：39-47；Maksyutov，A.Z.，和 Zagrebelnaya，E.S.，Computer Applications in the Biosciences 1993，9：291-297； 以及Maksyutov，A.Z.，和Zagrebelnyi S.N.，Molekularnaya Biologiya 1993，27：980-991，其每篇引入本文作为参考。
一般在个体自然感染并选择感染因子的抗原变体时，时间太短以致不能 形成能与正常人类蛋白发生交叉反应来诱导自身免疫反应的足量免疫效应 物。诱导自身免疫进程通常需要长时间，并通常需要致敏抗原恒定存在。因 此，由于可变异感染因子高变区变体与人类蛋白之间的局部相似性(local similarity)可能使在个体自身致敏的可能性不显著。另一方面，重复使用肽疫 苗来预防或治疗传染病会诱导自身免疫状况的风险增加。因此，在设计多表 位疫苗构建体，特别是包含佐剂来增强免疫反应的疫苗构建体时，需要考虑 能引起自身免疫状况的可变异感染因子可变区的“时间保守性”变体的长期 持续性。所以，基于VCPL设计疫苗构建体需要全面地在理论上考虑VCPL 肽和整组人类蛋白之间的局部相似性。
对文库中有产生自身免疫反应潜力的序列进行筛选是有利的。如果文库 中的肽与在人类蛋白存在的肽高度相似，那么会产生对所述人类蛋白的免疫 反应，从而对人的健康产生有害影响。可通过确定文库中的肽序列与在人类 蛋白中发现的序列的抗原相似性，来计算肽序列可产生自身免疫反应的可能 性量度。
在设计VCPL方法的最后一步中，可分析VCPL肽和整组人类蛋白的局 部相似性。针对由于VCPL肽与人类蛋白的局部相似性而产生的潜在的自身 免疫原性决定簇，可筛选基于VCPL的侯选疫苗。可从文库去除这些潜在的 自身免疫原性决定簇。
可选择要在VCPL模拟的表位，使其无自身免疫性。在识别与人类蛋白 表现出接近的局部相似性的区域的基础上，鉴定感染因子蛋白中潜在的免疫 致病性区域的方法为合理设计针对病原微生物的安全多表位疫苗提供了途 径，因为它可以去除带有免疫致病潜力的表位。特别是，应该去除与出现频 繁和/或支持机体重要生理功能的人类蛋白表现出相似性的抗原决定簇。
为检索文库序列和人类蛋白之间的相似性，可用SIM程序(Huang，X.和 Miller，W.，Adv.Appl.Math.，1991，12，337-357，其全文引入作为参考)。人类 蛋白序列可得自公共数据库例如SWISS-PROT(rl.41，FEB-2003)和 SP-TrEMBL(rl.23，MAR-2003)。可用欧洲分子生物学实验室(European Molecular Biology Laboratory)(EMBL)服务器上的SIM版本进行比对。SIM程 序可用参数如下：缺口(gap)-打开(open)罚分100，缺口-延伸罚分20。
局部相似性搜索会带来很多偶然的发现(hit)，其中很多在来自文库的肽 序列和人类蛋白的区域之间有低相似性。它可用于过滤相似性检索的结果来 鉴定最相关的肽-蛋白相似性。可如下进行过滤。将二十个常出现的氨基酸 分为交叉的具有物理化学相似性的组：1组-Lys，Arg；2组-Asp，Glu；3组-Asn， Gln；4组-Ser，Thr；5组-Ala，Ile，Leu，Val；6组-Ala，Gly；7组-Leu，Phe；8 组-Leu，Met，Val；和9组-Phe，Trp，Tyr。
对于文库肽和人类蛋白之间的局部相似性的每个发现，计算如下值：相 似性指数(SIM程序确定的Score)；匹配氨基酸的百分比(Match％)；匹配氨 基酸数(M)；错配(mismatch)氨基酸数(MM)；缺口数(Gap)；保守取代数(Ccons) (即1，2，3&4，5-9组内的取代数)；带电荷氨基酸(His，Lys，Arg，Asp，Glu)被 带相反电荷(C+-)的氨基酸取代的数；带电荷氨基酸的非保守取代或缺失数 (C±)；极性氨基酸(Asn，Gln，Ser，Thr)的非保守取代或缺失数(Cpolar)；和芳香 族氨基酸(Phe，Trp，Tyr)的非保守取代或缺失数(Carom)。
然后用经验(empirical)的算法检测是否符合如下条件：
1)不低于320的相似性指数(Score≥320)。
2)已知区中的匹配氨基酸数不低于6(M≥6)。
3)匹配百分比不低于50％(Match％≥50％)。
4)已知区中的匹配氨基酸和保守取代数不低于8：M+Ccons≥8。然而， 如果在同源性区中有亚区，其包含一行8个保守的或者匹配的氨基酸的链 (string)，那么将此区看作一个整体而不再考虑匹配的百分比(Match％)。
5)(MM-Ccons+Gap)/(M+Ccons)≤{0.37|M＝6+∞}
6)1.5*C+-+C±+0.5*(Cpolar+Carom)≤0.1+0.5*(M+Ccons-6)
如果符合了所有上述标准，那么可考虑人类蛋白的性质和/或功能。如果 文库的序列与在人类蛋白频繁出现的序列相似，或与具有重要生理功能的蛋 白的序列相似，可从文库中去除该序列。
某些情况下，理想的文库具有少量的序列，如少于1,000个序列，少于 500个序列，或少于250个序列。所述文库代表了在天然出现的序列中发现 的完全抗原多样性。可通过从大文库(例如VCPL)选择序列来建立这样的代 表性嵌合肽文库(RCPL)，从而所选择的序列代表了在天然出现的序列和从大 文库产生的非天然序列中发现的完全抗原多样性。非天然序列能反映潜在的 序列，例如，通过包括在单一序列中非天然发现在一起的不同位置上的变体。
因为RCPL具有的肽数比VCPL少，它本身不太可能诱导自身免疫反应。 与VCPL中的残基频率相似，选作RCPL的序列可向某些位置上的某些残基 偏移(bias)。RCPL也可偏向特定个别序列。换言之，如果RCPL包括100个 独特的肽序列，那么这些肽可以任意比率组合。除了小很多的序列数外， RCPL的抗原多样性可以象RCPL所来自的VCPL的抗原多样性一样大。由 此，相对少量的化学种类(chemical species)(即肽序列)的混合物会和极大量的 化学种类的混合物产生同样广泛的免疫反应。
RCPL是均匀覆盖感染因子高变区多样性变体的同源性肽组。RCPL由 文库中较小量的肽(与VCPL相比)来表征，其均匀覆盖可变异感染因子高变 区的抗原性变体组，包括潜在的变体。设计RCPL来模拟感染因子的主要可 变异保护性决定簇的抗原多样性。RCPL会产生宽范围的抗体和细胞毒性T 淋巴细胞(CTL)，其组合的特异性覆盖了可变异感染因子的抗原性变体组。 因此，RCPL能诱导对抗可变异感染因子的现存及潜在变体的多样性的体液 和细胞反应。
为选择RCPL中肽的具体数目N，随机从所模拟的高变异抗原活性区(例 如VCPL)的变体的完全(whole)多样性中选择大量的(例如＞1,000，＞10,000， ＞100,000，＞1,000,000，或＞10,000,000)肽序列，来计算模拟区具体位置上的 氨基酸出现频率。随机选择的肽序列组的排列顺序是根据它们在所模拟的高 变异抗原区的变体的完全多样性中出现的相对频率。使用随机选择的肽组中 最初37-100％的序列。根据经验来确定所用的所述百分比。
选择在每个位置具有最大出现频率的氨基酸的肽序列作为RCPL的第一 个序列。或者，可用所模拟的高变异抗原区变体组的任何肽作为第一个序列， 或者作为参照序列。
从随机选择的肽的组中选择每个随后加到RCPL的肽序列，从而使新序 列和所有以前加到文库中的所有序列之间的距离达到最大或接近最大。可用 抗原相似性矩阵来确定两个肽之间的距离Rij(例如见表1)。根据如下计算Rij：
$R_{\mathrm{ij}}=\underset{k=1}{\overset{l}{\Sigma }}F(i_k,j_k)$
其中ik是肽i的第k个残基，jk肽j的第k个残基，并且l是文库中每个 肽的氨基酸残基数。可用抗原相似性矩阵描述函数F：
                        F(ik，jk)＝ASM(ik，jk)
其中ASM(ik，jk)值是被ik和jk代表的残基对的矩阵值。
对随机选择肽的每个肽n，根据公式来计算所选的最初N个肽(即已存在 于RCPL的那些)和肽n之间的Sn距离总和：
$S_n=\underset{i=1}{\overset{N}{\Sigma }}{R}_{\mathrm{in}}$
其中Rin的计算如上。将具有Sn最大值的肽n加到所述文库。一直从一 大组随机选择的序列中选择序列直到RCPL达到理想的序列数。
或者可简单用函数F来计数两个肽之间的取代数。在这种情况下，当ik 等于jk(即两个肽在位置k具有相同的残基)时F(ik，jk)值是1，并且当ik和jk 不同时F(ik，jk)是0。以此方式选择时，RCPL的序列应均匀覆盖所模拟的高 变异抗原活性区的整组变体。
可筛选RCPL中包括的具有上述自身免疫原性质的每个肽。如果确定肽 序列具有诱导自身免疫反应的潜力，可将它从RCPL排除。然后选择另一个 具有实际相同的所需性质的候选物作为RCPL中的下一个肽。设计选择的算 法，从而使加到RCPL的每个新的肽是从许多等值的序列中选择的(即与文 库中以前的肽序列距离相同)。
本文描述的所选择的足量的肽可均匀覆盖可变异感染因子的高变异表 位的抗原变体的完全多样性。构成RCPL的肽数越多，它能诱导的免疫反应 “越强(denser)”。因为选择N个肽的运算法是递增的，所以开始的N/2个肽 也会均匀覆盖变体的完全多样性，只是不如选择N个肽所诱导的免疫反应 强。
可将代表性嵌合肽文库构建为侯选疫苗。文库中的肽序列一起覆盖了可 变异感染因子的高变异抗原活性区变体的完全多样性。设计所述序列以模拟 感染因子的主要可变异的保护性决定簇的遗传多样性。模拟的肽也可以是嵌 合的，因为尽管它们模拟了变体的同种异型组，RCPL中的序列事实上出现 在极少的(如果有)表位序列的已知和潜在变体中。
一般可人工或用自动合成仪来合成肽文库，见例如Lebl M.和Krchnak V. (1997)Solid-Phase Peptide Synthesis，Methosls in Enzymology，289，Academic Press，Minneapolis，Minnesota所述，其全文引入作为参考。该合成可以是组 合合成，其中氨基酸混合物被偶联到延长的肽上，并形成肽序列的混合物。 在组合合成中，按照残基在肽中每个位置的理想比率的规定将氨基酸加入偶 联反应，调整对每个氨基酸的相对偶联比率。或者可用平行合成来制备文库， 其中每个序列被分开合成，并且所述文库可以是一组单一的纯肽序列。此文 库可通过混合纯肽来转化为混合物。
要制备大文库时可优选自动组合合成。要制备单个序列(例如RCPL)的 小文库时，可优选分开合成(split synthesis)。
肽文库可以是多抗原肽(MAP)的一部分。多抗原肽包括延伸出多条肽 的分支核(branched core)。该分支核可基于赖氨酸的分支重复序列(branching repeat)。MAP包括例如4或8条肽链。MAP包括疏水基团，如从棕榈酸衍 生的烷基链。该疏水基团可利于MAP与脂质体或病毒样颗粒的装配。
所述肽可包括20个通常天然出现的L-氨基酸。所述肽可任选包括对应 的D-氨基酸，或D-和L-氨基酸的混合物。肽中也可同样包括非天然氨基酸。
可用重组方法制备肽文库。可将编码文库肽的DNA构建体引入能用所 述构建体表达蛋白的宿主生物中。合适的宿主生物包括细菌如大肠杆菌，乳 杆菌(Lactobacillus)，和Bifida，和植物，如烟草。
肽文库可用于诊断应用，例如确定抗体的存在或确定CTL的功能。例 如，此文库可被用作酶联免疫吸附实验(ELISA)的抗原来确定受试样本中是 否存在抗体。在固相分析如ELISA中，文库的肽被固定在基质(例如，聚苯 乙烯孔)上。然后在可形成特异性肽-抗体复合体的条件下，使基质暴露于受 试样本(例如受试者的血清)。再洗脱任何未结合的抗体。然后检测通过特异 性肽-抗体相互作用与基底相连的抗体。所述检测包括使所述抗体暴露于对 所述受试者免疫球蛋白特异的二抗。所述二抗可被放射性标记，或偶联到催 化有色产物形成的酶，如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶上。
诊断性肽文库可以是广谱诊断试剂，或亚型特异性试剂。如果将该文库 设计成与病原体的所有已知亚型在抗原性上相似，那么无论该受试者是被何 种亚型感染的，它都可被用于检测已经被该病原体感染的受试者。然而，如 果将该文库设计成只与一种亚型在抗原性上相似，那么如果受试者被相同亚 型感染，它可被用于检测。可以一起使用一组亚型特异性文库来确定受试者 是被若干亚型中的哪一种感染的。
已知基于抗原肽的疫苗。见例如，美国专利4,601,903，4,599,230和 4,599,231，它们均引入本文作为参考。可将疫苗制备成可注射的，如液体溶 液或乳浊液。所述肽可与和该肽匹配的药物可接受载体混合。所述载体包括 水，生理盐水，右旋糖，甘油，乙醇及其组合。所述疫苗还可包含辅助物质 如润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂，或加强疫苗有效性的佐剂。对于疫苗起佐 剂作用的方法包括使用制剂如氢氧化铝或磷酸铝(alum)，通常使用其 0.05-0.1％的磷酸盐缓冲盐水溶液。可通过皮下或肌肉内注射肠胃外给药疫 苗。或者，其它给药模式(包括栓剂和口服制剂)也可能是理想的。对于栓剂， 粘合剂(binder)和载体可包括，例如聚乙二醇或甘油三酯。口服制剂可包括通 常使用的辅料，例如，药品级的糖精，纤维素和碳酸镁。这些组合物呈溶液， 悬液，片剂，丸剂，胶囊，缓释剂或粉末的形式。
以与剂型匹配的方式，并以治疗有效性的、保护性的、并具有免疫原性 的量来给药疫苗。要给药的量依赖于要治疗的受试者，包括例如，个体免疫 系统合成抗体并产生细胞介导的免疫反应的能力。需要给药的活性成分的精 确量依赖于医师的判断。然而，本领域技术人员可容易地确定合适的剂量范 围，该剂量范围可以是肽的微克级。起始给药和加强剂量的合适方案也可改 变，它可包括在起始给药之后随后给药。疫苗的剂量也可依赖于给药途径并 根据宿主的大小而改变。
也可将编码文库肽的核酸分子通过直接给药核酸分子(例如通过注射)直 接用于免疫接种，或通过先构建活的载体，如沙门氏杆菌(Salmonella)，卡介 苗，腺病毒，痘病毒，痘苗病毒或脊髓灰质炎病毒，再给药该载体。
在受试者暴露于病原体之前，疫苗可以是诱导受试者中的保护性免疫反 应的预防性疫苗。一般预防性的疫苗包括广谱肽文库。有时，例如在疫苗接 种的受试者可能仅暴露于一种亚型的病原体时，预防性疫苗包括亚型特异性 肽文库。疫苗可以是治疗性疫苗，设计它是为了诱导或加强在被病原体感染 的受试者中的免疫反应。如果已知该受试者被特定亚型的病原体感染，那么 此治疗性疫苗可被设计为针对那个亚型的免疫反应的疫苗。
实施例
基于HIV gp120的可变区V1-V5之一来设计肽文库。用于产生文库的序 列来自HIV A，B，C，D，F，G亚型，或一起使用来自这些亚型的序列。 可将仅从一种亚型序列产生的肽文库作为亚型特异性疫苗，而将从多个亚型 产生的文库作为广谱疫苗。起始设计的每个文库都包含少于200,000,000个 序列。从起始文库中将较小文库设计为包含少于500,000个序列和少于 50,000个序列。通过从较大文库中去除出现不频繁的残基来设计较小的文 库，如下表3-37给出了残基的性质(identities)和相对频率。例如，表3中， 残基X11在最大的文库中可以是S，N或G；在下一个较小文库中是S或N， 在最小文库中是S。此数字代表每个残基在那个位置的相对频率。在最大的 文库中，S，N或G以80∶13∶7的比率占据位置X11；在下一个较小文库中S 或N以80∶13的比率占据X11；并且在最小的文库中每个肽在X11都有S。
嵌合肽文库-HIV gp120的V1区
基于来自A，B，C，D，F，和G亚型的HIV gp120的V1区而设计的 肽文库。所述文库具有如下结构：
C-T-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-E-X18- K-N
其中X1-X18如表3限定。
表3   ABCDFG亚型，HIV gp 120 V1区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9   X10  X11  X12   X13  X14   X15  X16  X17   X18   50,000   D   88   L   81   K   43   N   87   T   33   T   81   N   67   T   69   N   70   S   61  S  80  S  77   G   49  M  59   E   88  K  58  G  79   I   73   N   32   T   22   N   26   T   33   T   30   N   20  N  15   S   33  T  15  E  16  E  21   M   27   N   18   A   24   N   18  I  14   D   17   500,000   T   13   N   13  N  13   K   12   200,000,000   W   12   G   8   N   10   V   11   A   12  G  7  E  8  E  12  G  10   Y   7   E   8   V   10   A   7   I   7  N  9  T  8
基于来自A亚型的HIV gp120的V1区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
C-T-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-E-X17-K-N
其中X1-X17如表4限定。
表4   A亚型，HIV gp 120 V1区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9   X10  X11   X12   X13   X14   X15  X16  X17   50,000   N   87   V   67   N   70   V   76   T   65   S   53   T   62   S   42   N   45   T   34  T  57   E   32   G   37   D   29   K   62  E  69  I  82   D   13   A   33   T   30   S   24   N   24   N   32   N   20   N   36   A   40   I   29   T   26   E   34   M   21   E   19  G  31   N   22   N   20   500,000   S   15   N   19   S   16   Q   19  M  18   D   18   200,000,000   V   11   V   15   V   10   V   14  I  13   V   13   N   13   G   14   A   8   A   8  R  13   Y   8   T   9  D  9   I   7  N  7
基于来自B亚型的HIV gp120的V1区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
C-T-X1-X2-X3-N-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-E-X16-X17-E-X18- K-N
其中X1-X18如表5限定。
表5   B亚型，HIV gp 120 V1区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9   X10   X11  X12   X13   X14  X15   X16  X17   X18   50,000   D   85   L   79   K   55   A   30   T   91   N   74   T   90   N   66   S   74   S   83   S   88  G  49   E   29   I   34  M  67   K   69  G  92   I   75   N   14   T   30   T   26   T   34   N   19  S  36   M   20   T   22  I  14   G   12   M   25   T   12   N   21  N  15   G   17   M   18   D   19   T   17   K   18   500,000   N   15   W   14   N   12  T  12   200,000,000   Y   7   E   11   N   9   N   10   A   7   N   8   I   9   E   8  E  7   E   11  E  8   G   9   G   8   K   8   T   8
基于来自C亚型的HIV gp120的V1区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
C-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-E-X18-K- N
其中X1-X18如表6限定。
表6   C亚型，HIV gp 120 V1区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9   X10  X11  X12  X13  X14   X15   X16   X17   X18   50,000   T   73   N   88   A   48   T   76   R   28   N   63   G   48   N   68   V   43   T   84  Y  52  N  67  N  59  T  80   M   58   E   30   G   57   I   61   V   41   N   24   S   24   T   30   N   22   T   32   T   33  V  21  D  21   I   24   K   27   E   34   M   39   N   20   S   22   A   24   N   26   500,000   R   19   V   18  S  18  N  20   T   18   200,000,000   V   8   D   14   T   11   A   10   D   7   V   9   N   16  N  9  T  18  S  11   T   17   K   9  D  15  G  9
基于来自D亚型的HIV gp120的V1区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
C-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-T-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-E-X17-K-N
其中X1-X17如表7限定。
表7   D亚型，HIV gp 120 V1区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9  X10   X11   X12  X13  X14  X15   X16 X17   50,000   T   87   D   85   W   38   K   45   N   47   N   73   T   35   T   39   N   44  N  55   N   47   T   45  T  75  M  32  E  64   G   71 M 91   A   20   W   18   G   28   E   28   A   29   N   24   G   25  S  29   T   24   V   37  D  25  I  21  G  36   S   25   K   17   K   18  E  19   500,000   N   18   D   19   A   18   I   17   Y   18   G   18   200,000,000   I   13   N   15   V   17   T   16   T   14  K  16   A   11  N  10   T   12 V 9   E   15   N   11  K  9   Y   11   L   11  T  9
基于来自F亚型的HIV gp120的V1区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
C-X1-X2-X3-X4-X5-X6-T-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-T-L-K-X14-X15-X16-X17- X18-X19-X20-N
其中X1-X20如表8限定。
表8   F亚型，HIV gp 120 V1区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9   X10  X11   X12  X13   X14  X15   X16  X17  X18   X19   X20   50,000   T   60   N   47   A   37   T   53   N   61   A   84   N   73   D   40   T   60   I   54  T  37   N   53  T  56   E   90  E  89   P   70  G  80  A  65   I   86   Q   67   R   28   D   32   T   25   I   47   T   27   S   27   N   27   N   27   T   46  N  32   G   35  D  31  E  35   K   33   N   25  A  31   500,000   T   16   G   20   Q   18  E  20   200,000,000   A   12   A   11   I   13   V   12   S   13   A   13   D   12  P  13   I   10  S  11   S   12   M   14   S   11
基于来自G亚型的HIV gp120的V1区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
C-T-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-N
其中X1-X17如表9限定。
表9   G亚型，HIV gp 120 V1区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9   X10   X11   X12   X13   X14  X15   X16 X17   50,000   N   77   V   88   T   65   N   67   N   71   S   34   T   70   K   35   N   72   V   62   T   56   E   51   K   44   E   53  E  52   I   73 K 78   D   23   N   35   T   29   C   26   N   16   T   25   S   22   E   17   S   19   E   24   N   31  R  29   M   27   N   24   N   16   A   17  N  19   500,000   G   16   C   16   C   15   G   16   G   17   N   14   N   15   200,000,000   A   12   Y   12   A   14   E   14   E   14   V   11 T 12   K   10   G   10   T   14 E 10   T   10
嵌合肽文库-HIV gp120的V2区
基于来自A，B，C，D，F，和G亚型的HIV gp120的V2区而设计的 肽文库。所述文库具有如下结构：
S-X1-N-X2-T-T-X3-X4-R-X5-K-X6-X7-X8-X9-X10-X11-L-F-Y-X12-L-D-V-V-X13-I- X14-X15-X16-X17-X18-X19-Y-X20-L-X21-X22-C
其中X1-X22如表10限定。
表10   A，B，C，D，F，G亚型，HIV gp 120 V2区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9  X10  X11  X12  X13  X14  X15   X16  X17  X18  X19   X20   X21 X22   50,000   F   91   I   84   E   37   I   91   D   95   V   45   Q   69   K   89   E   62  Y  89  A  79  K  93  P  73  D  63  N  78   D   54  S  51  T  91  S  76   R   95   I   95 S 51   M   16   S   32   K   40   V   33  S  21  Q  27  N  22  D  22   N   32  N  49  N  10 N 49   N   18   M   15   S   15   500,000   M   9   K   31   Q   11  H  11  N  9   200,000,000   Y   9   V   7   N   5   Q   5  S  7  G  8  E  8   T   5   T   5   G   6  K  7  R  6
基于来自A亚型的HIV gp120的V2区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
S-X1-X2-X3-T-T-X4-L-R-D-K-K-X5-X6-V-X7-X8-L-F-Y-R-L-D-V-V-X9-I-X10-X11- X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-Y-R-L-I-X19-C
其中X1-X19如表11限定。
表11   A亚型，HIV gp 120 V2区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9   X10   X11   X12   X13  X14  X15   X16   X17   X18   X19   50,000   F   63   N   91   M   58   E   92   Q   62   K   90   Y   79   S   83   Q   59   N   61   E   68   N   62   N   71  S  86  S  82   N   69   S   59   E   60   N   96   Y   37   I   42   K   38   H   15   A   17   P   35   D   20   S   15   T   20  N  18   S   18   N   32   Q   18   K   13   G   10   D   13   S   16   500,000   Q   10   Q   11   D   9   A   11   K   9   200,000,000   S   9   V   8   S   6   K   6   T   6   K   8  N  9   E   4   K   6   S   4   D   4  A  5   K   4
基于来自B亚型的HIV gp120的V2区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
S-F-X1-I-T-T-X2-X3-X4-X5-K-X6-X7-X8-X9-X10-A-X11-F-X12-X13-L-D-V-V- X14-I-X15-X16-X17-X18-T-X19-Y-X20-L-X21-X22-C
其中X1-X22如表12限定。
表12   B亚型，HIV gp 120 V2区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9  X10  X11   X12  X13   X14  X15   X16   X17   X18  X19  X20   X21 X22   50,000   N   94   S   53   I   85   R   94   D   85   V   68   Q   80   K   95   E   93  Y  95  L  95   Y   95  K  g1   P   88  D  79   N   76   D   70   N   61  S  87  R  92   I   86 S 81   N   28   M   15   N   8   M   24   K   20  S  9   Q   13  G  11   D   18   N   22   T   39  T  8   T   7 N 19   G   11   R   8   D   9   500,000   Q   7   S   7  R  7   R   7   200,000,000   K   6   S   6   G   7   E   5  H  5  T  5   N   5  K  5   K   7  N  6  N  5
基于来自C亚型的HIV gp120的V2区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
S-F-N-X1-T-T-E-L-R-D-K-X2-X3-X4-X5-X6-A-L-F-Y-R-X7-D-I-V-X8-L-X9- X10-X11-X12-X13-X14-Y-X15-L-I-X16-C
其中X1-X16如表13限定。
表13   C亚型，HIV gp 120 V2区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9   X10  X11   X12  X13  X14   X15   X16   50,000   I   45   K   88   K   49   K   61   V   53   Y   60   L   94   P   87   N   63   N   71  N  56   S   89  S  71  E  76   R   90   N   96   A   21   Q   42   Q   26   E   35   H   23   Q   8   D   28   S   18  S  32  G  14  T  10   I   10   T   17   T   13   A   11   K   9  R  9   M   16   500,000   T   7   D   7   G   7  K  7   200,000,000   Q   5   E   4   N   6   P   6   S   5   K   4  D  7   N   4  N  5  N  6   S   4   H   4   S   5  A  5   R   5
基于来自D亚型的HIV gp120的V2区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
S-F-N-I-T-T-X1-V-X2-D-K-X3-X4-X5-X6-X7-A-L-X8-Y-R-X9-D-V-V-X10-X11 -X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-Y-R-L-I-X19-C
其中X1-X19如表14限定。
表14   D亚型，HIV gp 120 V2区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9   X10  X11  X12   X13  X14   X15   X16   X17  X18   X19   50,000   V   58   R   93   K   91   K   86   Q   86   V   57   Y   50   F   97   L   96   Q   77  I  85  D  83   N   79  Q  62   N   80   S   83   S   87  S  83   N   96   E   38   Q   9   K   10   E   34   H   35   P   23  M  15  N  11   T   12  S  22   T   20   Q   13   A   8  N  14   Q   10  K  13   500,000   I   7   E   7  G  6   D   8   Q   7   200,000,000   A   4   E   4   K   5   S   5   Y   3   P   4  D  3   G   2   N   5  D  3   H   4   A   4   K   2
基于来自F亚型的HIV gp120的V2区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
S-F-N-X1-T-X2-E-V-R-D-K-X3-X4-K-X5-X6-A-L-F-Y-R-L-D-I-X7-X8-I-X9- X10-X11-X12-X13-X14-X15-Y-R-L-X16-X17-X18
其中X1-X18如表15限定。
表15   F亚型，HIV gp 120 V2区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9   X10  X11  X12   X13  X14  X15  X16  X17  X18   50,000   I   50   T   90   Q   53   K   47   V   67   H   54   V   85   P   75   N   56   N   72  S  35  S  50   N   73  S  42  T  47  I  95  N  57  C  95   M   30   K   47   L   29   E   19   Q   21   Q   25   S   24  N  30  D  28   S   27  R  37  E  38  S  24   T   20   Q   24  D  20  N  22   500,000   Y   15   E   15  G  15  I  15  H  14   200,000,000   M   10   Q   14   S   11   K   10   K   14  G  10  T  5  G  5  I  5   G   10   A   7  N  5   M   7  D  5
基于来自G亚型的HIV gp120的V2区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
S-F-N-X1-T-X2-X3-X4-X5-D-K-X6-K-X7-E-Y-A-L-F-Y-R-X8-D-V-V-X9-I-X10-X11 -X12-X13-X14-X15-Y-X16-L-X17-X18-C
其中X1-X18如表16限定。
表16 p   G亚型，HIV gp 120 V2区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9   X10  X11   X12   X13  X14  X15   X16  X17   X18   50,000   I   94   T   95   E   97   I   97   R   93   K   80   T   51   L   95   P   91   N   60  D  85   N   49   N   54  N  63  N  66   R   87  I  95   N   97   Q   7   Q   10   K   29   D   28  G  15   S   24   S   27  S  31  S  27   V   10   T   7   A   8   T   8   G   13   D   10  G  6  D  7   E   7   D   9   R   6   500,000   Q   5   T   5   Q   5  T  5   200,000,000   M   3   A   5   A   3   M   3   E   3   S   4   R   4   K   4   I   3   T   3   H   3   T   3
嵌合肽文库-HIV gp120的V3区
基于来自A，B，C，D，F，和G亚型而设计的HIV gp120的V3区的 肽文库。所述文库具有如下结构：
X1-C-X2-R-P-X3-N-N-T-R-X4-X5-X6-X7-X8-G-X9-G-X10-X11-X12-X13-X14-T -G-X15-I-X16-G-X17-I-R-X18-A-X19-C-X20
其中X1-X20如表17限定。
表17   A，B，C，D，F，G亚型，HIV gp 120 V3区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9   X10  X11  X12  X13  X14   X15   X16  X17  X18   X19   X20   50,000   N   78   T   89   N   77   K   90   S   78   I   92   H   45   I   93   P   95   R   53  A  72  F  90  Y  92  A  60   D   68   1   96  D  86  Q  85   H   85   N   95   V   9   I   11   S   10   G   15   R   29   Q   47  T  23  W  10  T  40   Q   14  N  14  K  15   Y   15   T   8   P   12   A   11   S   8   500,000   G   8   R   7   N   6   M   7   200,000,000   Q   5   T   4  F  4   E   4   Y   4   T   4   M   4   L   5  V  4  H  3   R   7   T   4   T   5
基于来自A亚型的HIV gp120的V3区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
X1-C-X2-R-P-X3-N-N-X4-R-X5-X6-V-X7-I-G-P-G-X8-X9-F-X10-X11-X12-X13- X14-I-X15-G-X16-I-R-X17-A-X18-C-X19
其中X1-X19如表18限定。破折号“-”表示该位置无残基。例如，如果 X12用破折号代表，那么无残基占据X12，并且X11的残基直接结合到X13的 残基。
表18   A亚型，HTV gp 120 V3区 文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9   X10  X11  X12   X13   X14  X15   X16   X17   X18   X19   50,000   N   76   T   72   N   68   T   97   K   78   S   85   R   66   Q   93   A   56   Y   95  A  95  T  91   G   89   D   79  I  92   D   84   Q   76   H   76   N   87   T   19   I   28   G   23   T   19   G   11   H   34   R   7   T   41   -   6   A   12  T  8   N   16   K   22   Y   24   T   7   S   9   500,000  T  5  R  5   D   5   E   5   200,000,000   D   5   K   3   Q   3   R   2   V   3   F   3  A  2   N   4   E   2   N   2   H   2  -  2   R   3   V   2
基于来自B亚型的HIV gp120的V3区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
X1-C-X2-R-P-X3-N-N-T-R-K-X4-I-X5-X6-G-X7-G-X8-X9-X10-X11-X12-T-X13- X14-I-X15-G-X16-I-R-X17-A-X18-C-X19
其中X1-X19如表19限定。
表19   B亚型，HIV gp 120 V3区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9  X10   X11   X12   X13  X14   X15  X16  X17   X18   X19   50,000   N   94   T   91   N   86   S   75   H   58   I   89   P   94   R   85   A   90  F  80   Y   91   T   59   G   94  E  62   I   97  D  88  Q  89   H   91   N   95   I   9   S   10   G   18   P   18   M   11   Q   9  W  15   A   41  Q  21  N  13  K  11   Y   9   T   5   R   7   N   11  R  9   T   11  G  9   500,000   V   5   F   4   T   5   H   4   200,000,000   T   4   G   4   Y   3   L   3   G   3  V  4   E   3   T   3   H   2   W   3   S   3   R   3
基于来自C亚型的HIV gp120的V3区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
X1-C-X2-R-P-X3-N-N-T-R-X4-X5-X6-X7-I-G-P-G-Q-X8-F-X9-X10-T-X11-X12- I-X13-G-X14-I-R-X15-A-X16-C-X17
其中X1-X17如表20限定。
表20   C亚型，HIV gp 120 V3区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9   X10   X11   X12  X13   X14   X15   X16 X17   50,000   V   57   T   91   N   77   K   88   S   98   I   76   R   97   T   82   Y   96   A   98   G   85   D   77  I  98   D   87   Q   90   H   82 N 92   N   26   I   6   G   12   E   9   M   24   G   3   A   16   F   4   N   11   G   20   N   13   K   6   Y   17 T 4   E   9   S   10   T   4   500,000   A   3   Q   3  T  2   E   2 I 2   200,000,000   M   2   H   1   G   2   V   2   T   2   D   2   N   1   L   1   N   1 D 1   R   2   K   1   S   1   H   1 H 1   T   1   I   1
基于来自D亚型的HIV gp120的V3区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
X1-C-X2-R-P-X3-X4-X5-X6-R-X7-X8-X9-X10-I-G-X11-G-X12-X13-X14-X15-X16 -T-X17-X18-G-X19-I-X20-X21-A-X22-C-X23
其中X1-X23如表21限定。
表21   D亚型，HIV gp 120 V3区   文库大小＜ X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15 X16 X17 X18 X19 X20 X21 X22 X23 50,000 N 78 T 83 Y 74 N 87 N 89 T 72 Q 71 S 37 T 74 H 61 P 64 Q 70 A 92 L 80 Y 80 T 92 I 82 I 83 D 84 R 92 Q 84 H 67 N 82 T 22 I 17 N 26 R 29 R 35 I 28 P 19 L 16 R 30 Y 20 F 20 K 18 N 16 K 16 Y 33 G 28 500,000 K 13 I 16 S 11 K 12 200,000,000 K 11 S 10 Q 8 T 8 A 8 T 10 G 8 T 11 R 9 K 8 K 8
基于来自F亚型的HIV gp120的V3区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
X1-C-T-R-P-X2-N-N-X3-R-K-X4-I-X5-L-G-P-G-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12- X13-I-X14-G-X15-I-R-X16-A-X17-C-X18
其中X1-X18如表22限定。
表22   F亚型，HIV gp 120 V3区 文库大小＜ X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15 X16 X17 X18 50,000 N 93 N 96 T 97 S 91 H 73 Q 69 A 87 F 97 Y 92 A 73 T 95 G 92 D 87 I 96 D 91 K 92 H 86 N 83 T 7 G 6 R 10 R 28 V 10 T 27 A 5 D 5 A 8 T 4 N 9 Q 8 Y 14 I 11 Q 6 N 5 500,000 S 4 P 4 H 4 Y 4 F 4 200,000,000 I 3 R 3 S 3 H 3 T 3 I 3 S 3 D 3 K 3
基于来自G亚型的HIV gp120的V3区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
X1-C-X2-R-P-X3-N-N-T-R-K-S-X4-X5-X6-G-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-T-X14-I- X15-G-X16-I-R-X17-A-X18-C-X19
其中X1-X19如表23限定。
表23   G亚型，HIV gp 120 V3区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9   X10   X11   X12   X13   X14  X15  X16  X17  X18  X19   50,000   N   44   T   90   N   88   I   98   T   32   F   66   P   93   G   98   Q   86   A   76   F   93   Y   98   A   95   G   91  I  98  D  76  Q  94  H  83  N  96   I   19   I   10   S   12   R   25   I   34   R   7   T   17   I   5   T   5   D   5  N  24  Y  15   T   15   H   22   V   7   M   12   P   15   R   9   N   5   500,000   T   5   H   5   S   4  K  2   200,000,000   K   2   L   2   R   2   G   2   S   2   H   2  T  2  L  2  F  2  T  2  K  2  P  2
嵌合肽文库-HIV gp120的V4区
基于来自A，B，C，D，F，和G亚型的HIV gp120的V4区而设计的 肽文库。所述文库具有如下结构：
C-N-T-T-X1-L-F-N-S-T-W-X2-X3-X4-X5-W-X6-T-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14- X15-X16-X17-I-X18-L-X19-C
其中X1-X19如表24限定。
表24   ABCDFG亚型，HIV gp 120 V4区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9   X10   X11  X12   X13   X14   X15   X16   X17  X18   X19   50,000   Q   67   N   52   N   78   S   61   T   90   N   37   E   58   G   70   S   79   N   86   N   59  T  90   E   67   G   78   N   70   D   63   T   65  T  85   P   84   K   33   F   18   N   22   S   33   E   18   L   21   S   24   S   22   S   30   N   13   N   25  I  15   Q   16   T   16   G   17   D   18   500,000   V   14   T   15   S   12   D   14   N   14   K   13   200,000,000   S   11   A   10   D   11  N  10   K   12   G   12   I   9   G   10   V   9   T   11   S   12   G   8   N   10
基于来自A亚型的HIV gp120的V4区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
C-X1-T-S-X2-L-F-N-X3-T-W-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-T-X12-X13-X14-X15-X16 -I-X17-L-X18-C
其中X1-X18如表25限定。
表25   A亚型，HIV gp 120 V4区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9   X10  X11   X12   X13   X14   X15   X16   X17   X18   50,000   N   87   G   56   S   90   T   43   N   62   I   26   Q   48   E   58   S   85   N   91  S  85   E   60   S   80   N   85   D   72   T   66   T   91   P   66   D   22   N   32   S   20   T   25   T   41   S   17   L   15   K   17   L   20   G   28   N   28   Q   34   E   25   M   23   G   14   G   16   G   14   500,000   D   13   G   10   A   10   N   12   E   10   V   10   200,000,000   S   8   D   8   D   9  D  9   N   7   S   9   K   6   I   9   K   7  N  8   D   6   N   7  I  7
基于来自B亚型的HIV gp120的V4区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
C-N-T-T-X1-L-F-N-S-T-W-X2-X3-X4-X5-X6-X7-T-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-G- X15-X16-X17-I-X18-L-X19-G
其中X1-X19如表26限定。
表26   B亚型，HIV gp 120 V4区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9   X10  X11   X12   X13  X14   X15  X16  X17   X18  X19   50,000   Q   64   N   55   N   89   S   62   T   90   W   90   N   43   E   61   G   74   S   79  N  85   N   59   T   89  E  69   N   72  D  65  T  63   T   83  P  86   K   27   T   16   N   20   S   34   T   15   E   17   L   21   D   16  K  12   S   28  N  13  N  27   I   17   F   16   G   17   K   15   S   16   500,000   V   13   D   13  D  15  S  11  Q  14   200,000,000   P   9   G   11   A   10   G   10   V   10   N   9   R   10   G   9   N   11  T  10  G  11  I  9  N  9
基于来自C亚型的HIV gp120的V4区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
C-N-T-S-X1-L-F-N-X2-T-Y-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15- I-X16-L-X17-C
其中X1-X17如表27限定。
表27   C亚型，HIV gp 120 V4区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9   X10   X11   X12   X13   X14   X15   X16 X17   50,000   K   36   S   65   N   47   N   58   G   63   T   91   Y   50   N   78   S   58   T   79   E   45   S   59   N   78   S   70   T   71   T   92 P 77   G   24   G   35   M   27   S   25   S   18   S   20   G   19   N   21   S   28   D   15   S   22   N   16 Q 23   N   20   S   18   P   17   N   15   500,000   F   16   A   16   I   13   N   14   E   15   200,000,000   S   10   R   8   D   10   L   9   I   11   N   13   G   12   N   11   I   8   D   9   N   8   T   11   D   10   V   9   G   7
基于来自D亚型的HIV gp120的V4区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
C-X1-T-S-X2-L-F-N-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-I-X15-C
其中X1-X15如表28限定。
表28   D亚型，HIV gp 120 V4区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9   X10  X11  X12  X13  X14   X15   50,000   N   94   K   62   S   83   T   92   W   85   D   40   N   47   N   32   T   78   G   43  D  60  N  74  I  70  T  54   P   67   G   26   N   26   T   42   G   26   W   25  N  17  T  26  M  30  N  24   S   21   N   13   S   23   S   23   N   17  S  12  I  13   Q   11   E   12   T   10   500,000   L   11   K   9   N   8  G  7  K  9   L   8   200,000,000   D   6   R   7   E   5   Y   4   G   4   I   6   K   7   E   5   D   5  V  4   N   6   V   3   I   3   D   2   G   5   K   2
基于来自F亚型的HIV gp120的V4区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
X1-X2-T-X3-X4-L-F-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-I-X14-L-X15-C
其中X1-X15如表29限定。
表29   F亚型，HIV gp 120 V4区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9   X10   X11   X12  X13  X14   X15   50,000   C   95   N   91   S   91   G   53   N   85   D   44   T   92   N   81   D   46   T   84   N   86   G   53  T  81  T  82   P   89   D   9   E   20   T   9   N   31   T   6   N   28   A   10   T   6   D   32  N  8  I  18   L   8   K   10   S   17   S   10   S   9  I  6   Q   8   500,000   D   6   I   6   K   6   A   5   G   5   N   6  P  5   200,000,000   Y   5   A   3   S   3   H   3   A   4   E   5   M   4   N   3   K   4   Q   3   V   4   I   5   K   3   I   3   D   4   A   3   I   3
基于来自G亚型的HIV gp120的V4区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
C-N-T-S-X1-L-F-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-I-X15-L-X16-C
其中X1-X16如表30限定。
表30   G亚型，HIV gp 120 V4区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9   X10   X11   X12  X13  X14  X15  X18   50,000   G   54   N   86   N   54   S   88   N   63   S   57   N   61   T   39   S   88   N   35   N   61   N   74  T  45  T  78  T  87  P  95   K   26   S   25   S   16   D   22   S   34   I   23   E   29   S   27   D   15  D  34  N  15   E   21   N   20   N   14   K   14   E   12  G  21   E   12   T   14   500,000   E   11   K   12   A   8   S   11   Q   10   D   9   200,000,000   R   8   N   6   D   5   A   7   A   7  I  6  I  7  Q  5   T   6   E   6   R   4   N   6  M  6
嵌合肽文库-HIV gp120的V5区
基于来自A，B，C，D，F，和G亚型的HIV gp120的V5区而设计的 肽文库。所述文库具有如下结构：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-E-X7-F-R-P-X8
其中X1-X8如表31限定。
表31   ABCDFG亚型，HIV gp 120 V5区 文库大小＜ X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 50,000 N 75 S 42 N 42 N 68 E 35 T 75 I 53 G 99 D 9 N 25 T 36 S 18 T 23 N 20 T 47 G 6 E 16 D 13 E 6 N 18 P 2 T 5 G 10 K 5 G 5 G 13 I 2 K 3 K 5 G 4 K 3 K 10 P 2 I 1 500,000 M 1 E 1 E 1 H 1
基于来自A亚型的HIV gp120的V5区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-R-P-X10
其中X1-X10如表32限定。
表32   A亚型，HIV gp 120 V5区 文库大小＜ X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 50,000 G 31 N 60 N 76 S 76 T 57 N 61 E 99 T 85 F 99 G 78 N 24 T 22 S 17 N 16 E 16 T 27 I 15 I 16 D 24 G 6 D 3 R 4 N 10 E 7 T 4 S 8 D 5 A 9 P 3 K 6 I 4 I 4 V 6 K 3 500,000 G 2 K 2 K 2 Q 1 S 1 R 2 M 1 200,000,000 R 1 E 1 P 1 G 1 F 1 I 1 H 1
基于来自B亚型的HIV gp120的V5区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-E-X7-F-R-P-G
其中X1-X7如表33限定。
表33   B亚型，HIV gp 120 V5区 文库大小＜ X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 50,000 N 78 S 44 N 40 N 69 E 37 T 77 I 57 D 9 N 25 T 37 S 16 T 21 N 19 T 43 G 4 E 16 D 15 G 6 N 18 P 2 T 4 G 9 K 5 E 6 G 13 I 2 K 3 K 6 G 4 K 3 K 10 P 2 M 1 M 2
基于来自C亚型的HIV gp120的V5区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
X1-X2-X3-X4-X5-E-X6-X7-X8-X9-X10
其中X1-X10如表34限定。
表34   C亚型，HIV gp 120 V5区 文库大小＜ X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 50,000 E 45 T 44 N 81 D 28 T 85 T 55 F 99 R 98 P 99 G 89 N 18 N 16 T 13 N 26 N 6 I 42 E 5 T 12 D 13 D 4 T 85 E 5 K 2 I 2 G 11 G 13 K 6 G 2 Q 2 K 7 K 7 G 9 I 2 T 2 L 5 I 5 500,000 P 2 P 2 G 2 I 2 Q 1 T 1 200,000,000 N 1 I 1 S 1
基于来自D亚型的HIV gp120的V5区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-E-X8-X9-R-X10-X11
其中X1-X11如表35限定。
表35   D亚型，HIV gp 120 V5区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9   X10   X11   50,000   N   58   N   92   N   44   S   70   N   52   Q   50   N   78   T   94   F   97   P   98   G   99   T   13   G   3   S   40   N   25   S   32   E   22   S   18   I   6   I   3   A   13   D   3   D   6   R   7   H   12   K   9   G   6   G   4   S   10   E   3   H   3   P   3   H   3   500,000   I   2   G   2   D   2   R   2   H   2   T   2   H   2   R   2   R   2   200,000,000   Y   1   H   1   D   1   G   1   Q   1   K   1
基于来自F亚型的HIV gp120的V5区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-F-R-P-X8
其中X1-X8如表36限定。
表36   F亚型，HIV gp 120 V5区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   50,000   N   43   N   65   N   46   T   51   N   60   E   97   T   83   G   80   L   30   D   14   S   35   K   14   S   29   Q   3   I   17   E   10   E   16   G   7   G   7   D   14   D   7   I   7   S   8   K   7   E   6   N   14   I   4   Q   3   K   4   T   7   K   6   G   7
基于来自G亚型的HIV gp120的V5区而设计的肽文库。所述文库具有 如下结构：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12
其中X1-X12如表37限定。
表37   G亚型，HIV gp 120 V5区   文库大小＜   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9   X10  X11  X12   50,000   N   40   N   78   N   75   S   53   T   85   N   63   E   98   T   82   F   91   R   93  P  87  G  88   A   18   T   9   T   10   N   35   G   7   T   25   I   17   I   5  A  7  R  8   T   16   A   8   D   10   E   4   E   6  T  4   D   15   A   4   R   9   500,000   A   3   E   3   G   4   N   2   E   4   T   2   S   2   200,000,000   Y   2   K   2   K   2   I   2   K   2   K   1   N   1   D   1   G   1  D  1  E  1   D   2   K   1   N   2   F   1   S   1  K  1  W  1   P   1   H   1   F   1  Y  1  V  1
VCPL的合成和抗原性质
设计模拟序列天然出现的多样性的肽文库，所述序列位于HIV-1(B亚 型)gp 120包膜蛋白的主要高变V3区。基于序列比对和抗原相似性来选择文 库中氨基酸的身份(identity)和频率。从HIV Sequence Database (hiv-web.lanl.gov)可得HIV-1序列。所述肽文库具有如下结构：
N-N-N-T-R-K-X1-I-X2-X3-X4-X5-G-X6-X7-X8-Y-X9-T-G-X10-I-I-G-X11-I-R-Q
其中X1-X11根据表38限定。
表38   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9   X10  X11   S   75   H   60   I   82   G   97   P   95   R   77   A   93   F   76   T   58   E   39  D  88   G   18   P   18   M   12   A   3   W   5   Q   9   T   7   W   15   A   42   D   28  N  12   R   7   N   11   K   8   L   9   Q   24   S   11   S   3   R   9   G   3
在Applied Biosystems 430A和Vega Coupler C250自动合成仪上使用肽 链延长的Boc/Bzl方案来合成文库的肽。用苯乙烯与1％二乙烯基苯的共聚 物作为聚合物支持物，并且苯甲酰酰胺甲基(phenacylamidomethyl)(PAM)基团 为锚定基团(Sparrow，J.T.J.Org.Chem.1976，41：1350-1353，其全文引入作为 参考)。使用之前用直接制备的1-羟基苯并三唑酯进行缩合，其制备是通过 混合相对于氨基酸Boc产物的聚合物三倍摩尔过量的1-羟基苯并三唑和二 异丙基碳二亚胺。监视缩合的完成(Kaiser，E.等，Anal.Biochem.1970，34： 395-398，其全文引入作为参考)。在水合茚三酮试验为阳性的情况下，在中 和肽基聚合物后重复缩合过程。如果试验是阴性的，那么用未稀释的三氟乙 酸去除临时性的Boc保护基团，并通过向反应混合物直接加入N，N′-二异丙 基乙胺来进行中和(Schnolzer，M.等Int.J Pept.Prot.Res.1992，40：180-183， 其全文引入作为参考)。去除Boc基团后连接如下的氨基酸残基。用作侧链 的永久保护性基团为：对于赖氨酸为2-氯基苄氧基羰基基团，对于酪氨酸为 二氯基苄基，对于天冬氨酸，谷氨酸，丝氨酸和苏氨酸为对应的苄基酯，对 色氨酸为甲酰基，对精氨酸为甲苯磺酰基，而蛋氨酸以对应的亚砜形式来引 入。完成保护性多肽链的装配后，由无水氟化氢辅助在净除剂存在时从聚合 物以一次方式断裂(one-time cleavage)来使终产物解除封闭(Tam，J.P.等，J Am. Chem.Soc.1983，105：6442-6444，其全文引入作为参考)。
合成肽文库时，在可变异位置的缩合阶段将被保护的氨基酸残基混合物 以相对于肽基聚合物的某种定量关系加入，它会将不同氨基酸残基按给定掺 入延长的多肽链。因为不同氨基酸的氨基酰化速率不同，合成了数种模型化 合物并得到反应速率系数。按比例使用引入混合物的氨基酸的Boc产物来调 整反应速率系数，从而提供在可变异位置具有理想比率(如表38所示)的肽产 物。
通过凝胶渗透色谱法用Sepharose G-50并用50％乙酸作为洗脱液来纯化 肽文库。表征所合成的化合物是用分析性单光子(analytical single-photon)高 效液相色谱法(Gilson chromatograph，France；XterraRP18柱，125，3.9×150 mm，5μm，流速1mL/min，对于pentarphin和cyclopentarphin分别为在16分 钟内洗脱液0.1％三氯乙酸，10-40％和20-40％的乙腈梯度)，和氨基酸分析(6N HCl水解24小时110℃；LKB氨基酸分析仪，Alpha Plus，Sweden)。根据分 析性HPLC，终产物的纯度不低于95％。肽水解产物的氨基酸组成(6N HCl， 120℃，24小时，LKB 4151分析仪，Alpha Plus)和理论上的一致。
用有完全福氏佐剂(CFA)的磷酸盐缓冲溶液稀释的肽文库在腹膜内免疫 接种5-6周龄BALB/c系小鼠三次。以剂量50μg/只将0.2mL的肽溶液给药 小鼠。在首次免疫接种后分别在2和4周进行第二次和第三次免疫接种。将 模拟蜱传脑炎病毒的蛋白E的抗原性部分的肽溶液(肽序列： KRDQSDRGWGNHAGLFGKGSIVT)以相同方案和相同剂量给药对照组的 动物。最后一次免疫接种10天后，从动物的眶后静脉取血液样本来确定血 清中的特异性抗体的滴度。
将如下抗原固定在微滴板的分开的孔中来做酶免疫测定(Medpolimer， Moscow)：嵌合-肽文库，并且15个合成肽中的每个代表来自不同HIV-1亚 型的gp120的V3区的氨基酸序列。所述15个合成肽代表适当亚型的共有序 列。当存在来自一个亚型的若干肽时，它们代表了不同变体。
将抗原溶解在0.05M的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲溶液，pH9.6中至终浓度 为10μg/mL，将0.1mL的量置于微滴板的每个孔中并在37℃的温度温育过 夜。用含Tween 20的磷酸盐缓冲溶液洗板3次，并用0.5％的牛血清白蛋白， 级分5(Sigma)的溶液阻断非特异性结合。将小鼠血清样本在Tris-HCl缓冲溶 液中系列稀释两倍，并将0.1mL的量置于固定了抗原的孔中并在37℃温育 30分钟。温育后用磷酸盐缓冲溶液洗孔5次。通过加入量为0.1mL的辣根 过氧化物酶-偶联的山羊抗小鼠IgG的抗体(Sigma)的磷酸盐缓冲溶液来确定 抗原-抗体复合体。在37℃温育30分钟后，加入含邻苯二胺的底物混合物。 通过加入硫酸溶液来中止酶反应，并在492nm用Multiscan EX微滴板光度 计来测量光密度。确定的小鼠血清中抗原-特异性抗体的滴度结果见表39。
用嵌合-肽文库免疫接种小鼠产生血清抗体，该抗体对嵌合-肽文库自身 (免疫接种抗原)特异，对于形成一些已知HIV-1亚型的V3区上的抗原决定 簇的肽也是特异的。特别是，对B亚型肽的抗体滴度比对其它亚型的高，这 与预期为了模拟B亚型多样性而不是其它亚型的肽文库设计目的是一致的。 所述嵌合肽文库是免疫原性的，它诱导与广谱HIV-1变体抗原决定簇相互作 用的抗体形成。
表39   固定的抗原(对应HIV-1亚型gp120V3区的   肽)   特异性抗体的平均滴度   嵌合肽文库   1∶1600   肽1，A亚型   1∶400   肽2，B亚型   1∶3200   肽3，B亚型   1∶1600   肽4，B亚型   1∶800   肽5，B亚型   1∶1600   肽6，B亚型   1∶1600   肽7，C亚型   1∶400   肽8，D亚型   1∶400   肽9，E亚型   1∶400   肽10，E亚型   1∶200   肽11，F亚型   1∶100   肽12，G亚型   ＜1∶100   肽13，H亚型   ＜1∶100   肽14，I亚型   1∶100   肽15，J亚型   1∶100   蜱传脑炎病毒蛋白E的肽(对照)   ＜1∶100
用上述肽文库作为诊断试剂，对50个HIV感染的病人和30个健康供体 的血清样本进行固相免疫酶分析(即ELISA)来确定特异性抗体。用数个可购 试验系统辅助来分析HIV感染病人的原始(preliminarily)血清。另外，用抗 -HIV-1系列010和系列007的标准血清组来辅助评估肽文库检测抗HIV-1抗 体的能力。
将嵌合-肽文库溶解在0.05M的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲溶液，pH 9.6至终 浓度1.5微克/mL。将溶液以0.1mL的量加到微滴板的孔并在室温温育过夜， 从而将肽固定在孔中。然后用FSB-T溶液(含Tween 20的磷酸盐-盐缓冲溶液) 洗孔3-5次。从这以后，本方法与用DGUEPP“Vektor-BiAlgam”(Kol’tsovo， Novosibirsk Oblast)产生抗HIV-1抗体的免疫酶试验系统的说明书完全相符。
将血清样本用含0.2％酪蛋白的FSB-T溶液稀释20倍，以0.1mL的量置 于微滴板的孔中，并在37℃温育30分钟来使抗体与已固定的肽结合。然后 用FSB-T溶液洗孔5-7次。将量为0.1mL的(以1∶20在合0.2％酪蛋白FSB-T 的溶液中稀释的)抗IgG的单克隆抗体(与辣根过氧化物酶偶联)加入孔中。在 37℃温育微滴板30分钟，然后用FSB-T溶液洗板5-7次。再之后，将量为 0.1mL的0.05％TMB和0.005％过氧化氢的底物混合物在0.05M磷酸盐-柠檬 酸盐缓冲液中的溶液，pH5.0，加入孔中。将微滴板避光在室温(18-22℃)保 持15-20分钟。将量为0.05mL的2M硫酸溶液加到孔中来中止反应。在 Multiscan型自动分光光度计上、用波长450nm测量样本光密度来计算结果。
根据俄罗斯和国外第三代筛选试验系统试验的数据，使用底物混合物 (BCP+底物)，和对照偶联物(BCP+偶联物+底物)，以及不含抗HIV抗体的对 照血清作为排除反应设定非特异性结果的对照。
如果孔中被试溶液(与被试血清对应)的光密度(OD)值根据如下公式计算 超过了ODcrit临界水平，那么判断被测血清含有抗HIV-1抗体：
               ODcrit＝OD(C’)均值+0.2
其中OD(C’)均值表示阴性对照血清的光密度均值。
使用嵌合-肽文库研究抗-HIV-1标准组血清系列010和007的结果显示 了81％的敏感性和93％的特异性。另外，用来自HIV感染病人的50份血清 和来自健康供者的30份血清，来研究嵌合-肽文库检测抗血清样本中抗HIV-1 特异性抗体的有效性。基于可购的第三代试验系统结果，本试验的结果表明 检测出了80％以上的含抗HIV-1抗原的特异性抗体的阳性样品。
为检测呈不同抗原形式的嵌合肽文库的免疫原性，将文库合成为线性 肽，4条线性肽的多抗原肽(MAP4)，或8条线性肽的多抗原肽(MAP8)。将 300微克的上述构建体与完全福氏佐剂(第一次免疫接种)或不完全福氏佐剂 (第二次和第三次免疫接种)混合、以12天间隔皮下免疫接种兔子。在第三次 免疫接种后12天，给兔子放血并用抗线性、MAP4和MAP8抗原的ELISA 来检测所有血清。表40表明用呈不同抗原形式的HIV-1V3文库免疫接种兔 子会诱导针对嵌合肽文库的高可变异V3环序列的强体液免疫反应。
                        表40   ELISA中对不同抗原形式的抗体滴度   免疫接种剂   线性   MAP4   MAP8   线性   5,120   -   -   MAP4   81,920   163,840   163,840   MAP8   10,240   81,920   81,920
对呈不同剂型的MAP4嵌合肽文库的免疫原性进行试验。在福氏佐剂， 人工病毒样颗粒(VLP)或磷酸盐缓冲溶液(PBS)中配制文库。另外，用棕榈酸 修饰的MAP4构建体(MAP4-P)并在脂质体或微乳状液中制制。所述脂质体 包括100微克的MAP4-P和250微克的dsRNA，所述微乳状液包括100微 克的MAP4-P和100微克的dsRNA。
VLPs包含被携带MAP4肽文库的多肽覆盖的DNA分子。将靶向的多 肽暴露于颗粒表面，并通过亚精胺-polygluquine偶联物连接到DNA。颗粒的 大小(dimension)允许靶抗原以一到数百个拷贝数偶联到表面上。VLP的核可 包含大到10,000bp的DNA节段。见例如，Lebedev，L.R.等，(2000)Molecular genetics，microbiology and virology(Russian)(3)，36-40；Lebedev，L.R.，等， (2000).Molecular Biology(Russian)34(3)，480-485；和Lebedev，L.R.等， (2001)Biotechnology(Russian)(1)，3-12；和Sizov，A.A.等，(2001) Biotechnology(Russian)(1)，13-18，其每篇引入本文作为参考。
用MAP4-P文库制备脂质体形式。用棕榈酸修饰增加了肽的亲脂性。肽 的脂质体组合物是通过增溶-注射制备的。脂质体体积的大小在200nm以内。
也用MAP4-P肽构建体制备微乳状液，该微乳状液(在1mL中)包含100 微克肽，250微克ridostin，和800微克可购的(ICN)阳离子两亲性二甲基双 十八烷溴化铵(cationic amphiphile dimethyldioctadecyl ammonium bromide)(DDAB)。
用上述构建体以12天间隔腹膜内免疫接种小鼠(每组五只小鼠)3次。表 41的数据指示了在常规小鼠的个体免疫反应的高多样性，但是在第三次免疫 接种后所有系统都检测到了强体液免疫反应，除了肽文库的PBS溶液之外。 MAP4-P在脂质体中的抗原制剂诱导了第二次免疫接种后的高水平抗体。
表41   抗原形   式   抗原   递送   系统  总剂  量μg   Im.   No.   ELISE中小鼠血清对固相中MAP4的   AB滴度   AB   滴度，   均数   AB   滴度，   标准   偏差   AB   滴度，   195                          小鼠#   1   2   3   4   5   MAP4   PBS   40   2nd   0   0   0   0   -   0   0   60   3rd   0   0   0   0   -   0   0   MAP4   福氏   佐剂   40   2nd   0   3200   1600   1600   12800   3840   5135   4501   60   3rd   51200   12800   102400   25600   204800   79360   78070   68430   MAP4-P   脂质   体   40   2nd   0   51200   51200   25600   -   32000   24510   24019   60   3rd   51200   102400   51200   102400   -   76800   29560   28969   MAP4-P   微乳   状液   40   2nd   0   0   6400   25600   -   8000   12115   11872   60   3rd   0   0   204800   51200   -   64000   96920   94980   MAP4-P   VLP   100   2nd   12800   12800   6400   -   -   10667   3695   4181   150   3rd   51200   204800   25600   -   -   93867   96920   109673
为确定用MAP4文库在上述不同呈递系统中免疫接种小鼠的免疫反应 的极化作用(polarization)，在第3次免疫接种后第10天鉴定脾细胞。用线性 肽的文库体外刺激脾细胞。分别如ELISPOT测量，数个脾细胞分别产生IFN-γ 或IL-4细胞因子，Th1或Th2免疫反应的标志物。记录刺激后或无刺激时产 生两种细胞因子之一的细胞数(表42)。表42中的结果显示用MAP4肽文库 和福氏佐剂的溶液免疫接种小鼠，不会导致受刺激细胞数与对照的测量值 (无刺激)有显著差异(显著性水平0.05)，这证明用抗原与福氏佐剂的混合物 免疫接种不会诱导T辅助细胞应答。我们注意到，在用含MAP4文库的微乳 状液免疫接种的小鼠中，用线性肽文库体外刺激后产生了最多数量的产生 IFN-γ的细胞。用VLP免疫接种会形成不太明显的(pronounced)Th1型免疫反 应。产生IL-4和IFN-γ的细胞数比较表明，用VLP中的MAP4文库免疫接 种小鼠会产生平衡的T辅助细胞应答，即产生IFN-γ和IL-4的细胞数无显著 不同。另一方面，用相同抗原的微乳状液免疫接种小鼠会使用线性肽文库刺 激后的Th1型免疫反应占显著优势。因此，上述实施例显示了用嵌合肽的 MAP4文库诱导强T辅助细胞应答的可能性。
表42   抗原递   送系统   脾细胞在   体外是否   受到刺激   产生IFN-gamma的细胞数   测定ELISPOT中500,000个脾细胞    细胞样品##   平均   细胞   数   标准   偏差   细胞   数的   195   1   2   3   4   5   6   VLP   是   59   99   272   -   55   29   102.80   97.84   85.76   否   2   5   1   -   3   5   3.20   1.79   1.57   CFA/IFA   是   6   3   33   37   12   10   16.83   14.47   11.58   否   1   0   7   6   1   1   2.67   3.01   2.41   微乳状液   是   165   145   525   450   600   600   414.17   208.41   166.76   否   4   0   1   2   3   1   1.83   1.47   1.18   产生IL-4的细胞数   测定ELISPOT中500,000个脾细胞   VLP   是   21   36   420   490   61   43   178.50   215.70   172.59   否   11   8   9   13   3   0   7.33   4.93   3.94   CFA/IFA   是   47   24   39   54   2   5   28.50   21.81   17.45   否   27   33   26   31   4   4   20.83   13.29   10.63   微乳状液   是   56   42   159   135   79   79   91.67   45.76   36.62   否   11   4   17   16   3   2   8.83   6.74   5.39
VLP-人工病毒样颗粒
CFA/IFA-完全福氏佐剂/不完全福氏佐剂
具有30个肽、每个肽长度为28个残基的RCPL，模拟了HIV-1的B亚 型变体的抗原多样性，该RCPL是以MAP4形式合成的。RCPL的抗原性特 性与VCPL是相当的，VCPL也模拟了HIV-1的B亚型变体的抗原性多样性。
RCPL序列(省略号‘.’表示残基与所列的第一个序列相同)：
NNNTRKSIHIGPGQAFYATGDIIGDIRQ
.....T..RL...RT..T..E......K
S.....GV.......W....Q.......
S.......R....R..FR......N...
.......V......V..T..E.T....K
.....RR.RM...RT.............
G.......T....R.L.T..E...N...
.....RG.P......L...........K
.....T.V.L...RT..T..Q.......
........RM..........G.T.N...
S.......P.....T....D.......K
......G......R.WHT..Q.......
S......V.L....V.........N...
.....TG......R..FT..E......K
G....R..R..L.R......E.......
.......TR......L.T....T.....
S......VT....RT..R.........K
.....T...L....V.F...E.......
......G.R..........D....N..K
......R..M...RT.....Q...N...
S......VT....R.L.T..G.......
.....R...L....VW.T..E.......
G.......R......L......T....K
.....RGV.....RT..T......N...
S....T.VP....R......Q......K
........RL.W..T..T.........K
..K..R..........H...........
S.....R..L...R...T..E...N...
..............T...R.Q.T.....
.....TG.P....R.W.T..Q.......
用MAP4 VCPL和CFA(第一次免疫)或IFA(第二次免疫)免疫接种兔子3 次。用免疫抗原或MAP4 RCPL作为固定的肽来通过ELISA检测血清的抗体 滴度。ELISA中的兔血清滴度，对于固相上的MAP4 VCPL为1∶204,800， 对于固相上的MAP4 RCPL为1∶102,400。
已描述数个实施方案。然而，可理解可对它作多种修改。例如，可设计 嵌合肽文库来模拟其它HIV蛋白的抗原多样性，或来自其它可变异病原体的 蛋白的抗原多样性。因此，其它实施方案也在如下权利要求的范围之内。