专利汇可以提供抗原专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且提供了一种来自 铜 绿色假单胞菌(P.aeruginosa)的 抗原 。也提供了该抗原在检测/诊断铜绿色假单胞菌中的用途以及其在产生一种免疫应答中的用途。,下面是抗原专利的具体信息内容。
1.一种来自铜绿色假单胞菌的外膜蛋白质抗原,其具有范围从约 60KDa至约65KDa的分子量,如SDS-PAGE所测。
2.如权利要求1的蛋白质抗原,其具有如下的N-端序列:
?-E-E-K-?-?-L-?-?-?-?-?-?-?-V-V-?-N-A
3.如权利要求2的蛋白质抗原,其具有如下的N-端序列:
?-E-E-K-T-P-L-T-T-A-A-?-A-P-V-V-?-N-A
4.一种如权利要求1至3中任一项定义的蛋白质的抗原性片段。
5.如权利要求4的抗原性片段,其包括序列:
?-E-E-K-?-?-L-?-?-?-?-?-?-?-V-V-?-N-A
6.如权利要求5的抗原性片段,其包括序列:
?-E-E-K-T-P-L-T-T-A-A-?-A-P-V-V-?-N-A
7.一种抗原组合物,其包括如权利要求1至3中任一项定义的蛋白 质,或至少一种如权利要求4至6中任一项定义的抗原性片段。
8.如权利要求7的抗原组合物,其还包含一种或多种其它铜绿色 假单胞菌抗原。
9.如权利要求1至3中任一项定义的蛋白质、如权利要求4至6中任 一项定义的抗原性片段或者如权利要求7或权利要求8中定义的抗原 组合物在检测和/或诊断铜绿色假单胞菌中的用途。
10.一种检测和/或诊断铜绿色假单胞菌的方法,其包括:
(a)将如权利要求1至3中任一项定义的蛋白质、至少一种如权利 要求4至6中任一项定义的抗原性片段或者如权利要求7或权利要求8 中定义的抗原组合物与待测样品接触;和
(b)检测针对铜绿色假单胞菌的抗体。
11.一种在罹受囊性纤维化的受试者中诊断铜绿色假单胞菌的方 法,其包括:
(a)将如权利要求1至3中任一项定义的蛋白质、至少一种如权利 要求4至6中任一项定义的抗原性片段或者如权利要求7或权利要求8 中定义的抗原组合物与获自受试者的生物学样品接触;和
(b)检测针对铜绿色假单胞菌的抗体。
12.如权利要求10或权利要求11的方法,其中样本为粘液样本, 如唾液。
13.一种如权利要求1至3中任一项定义的蛋白质、至少一种如权 利要求4至6中任一项定义的抗原性片段或者如权利要求7或权利要求 8中定义的抗原组合物在检测和/或诊断铜绿色假单胞菌中的用途。
14.如权利要求10至12中任一项的方法或如权利要求3的用途,其 中检测和/或诊断在体外进行。
15.一种用于检测和/或诊断铜绿色假单胞菌的试剂盒,其包含如 权利要求1至3中任一项定义的蛋白质、至少一种如权利要求4至6中 任一项定义的抗原性片段或者如权利要求7或权利要求8中定义的抗 原组合物。
16.一种在受试者中能引发免疫反应的组合物,其包含如权利要 求1至3中任一项定义的蛋白质、至少一种如权利要求4至6中任一项 定义的抗原性片段或者如权利要求7或权利要求8中定义的抗原组合 物。
17.如权利要求16的组合物,其是一种疫苗组合物,任选地还包 括一种或多种佐剂。
18.如权利要求1至3中任一项定义的蛋白质、至少一种如权利要 求4至6中任一项定义的抗原性片段或者如权利要求7或权利要求8中 定义的抗原组合物在医药中的用途。
19.如权利要求1至3中任一项定义的蛋白质、至少一种如权利要 求4至6中任一项定义的抗原性片段或者如权利要求7或权利要求8中 定义的抗原组合物在制备致免疫组合物优选为疫苗中的用途。
20.如权利要求19中定义的致免疫组合物在受试者中诱发免疫反 应的用途。
21.一种在受试者中治疗或预防铜绿色假单胞菌感染的方法,其 包括向受试者施用有效量的如权利要求1至3中任一项定义的蛋白 质、至少一种如权利要求4至6中任一项定义的抗原性片段或者如权 利要求7或权利要求8中定义的抗原组合物的步骤。
22.如权利要求21的方法,其中受试者罹受囊性纤维化。
23.如权利要求21或权利要求22的方法,其中蛋白质、一种或多 种抗原性片段或抗原组合物以疫苗的形式施用。
24.一种含有如下氨基酸序列的蛋白质:
?-E-E-K-?-?-L-?-?-?-?-?-?-?-V-V-?-N-A
25.一种含有如下氨基酸序列的蛋白质:
?-E-E-K-T-P-L-T-T-A-A-?-A-P-V-V-?-N-A
铜绿色假单胞菌是一种棒状的革兰氏阴性好氧性游动细菌。它 是一种环境中广泛存在的胞外条件性病原菌,在受试者上引起明显 致病性和死亡率。在带有囊性纤维化、烧灼伤、慢性支气管炎、支 气管扩张和癌症的受试者中有特别明显的感染。
免疫应答的鉴定、候选疫苗的寻找以及用于诊断试验的合适成 分均使人们的注意力集中到铜绿色假单胞菌的组成成分上。铜绿色 假单胞菌的外膜含有毒素,包括脂多糖内毒素、磷脂和蛋白质。多 种铜绿色假单胞菌的外膜蛋白质(Opr)已按字母命名系统命名。虽然 已用这种方式表征了数种蛋白质,其中的一些蛋白质仅短暂表达, 且高度依赖于可获得的养分、培养条件及抗生素的存在。目前,称 为F、H2和I的三种主要的Opr已在所有铜绿色假单胞菌菌株中识别 为有共同的抗原性,且以高拷贝数表达。
我们目前已鉴定了一种来自铜绿色假单胞菌外膜制剂的蛋白 质,我们称之为Pa60。此蛋白质的氨基末端序列不与其它先前表征 过的蛋白南(Genbamk数据检索)显示任何序列同源性。此蛋白质有 抗原性,且能引起导致铜绿色假单胞菌加速消除的防御性免疫应 答。
因此,在本发明的一个方面中提供了来自铜绿色假单胞菌的蛋 白质抗原,如SDS-PAGE测得,其分子量范围为约60KDa至约 65KDa,
在一个优选的实施方案中,蛋白质具有下列N末端序列:
?-E-E-K-?-?-L-?-?-?-?-?-?-?-V-V-?-N-A;和
优选地:
?-E-E-K-T-P-L-T-T-A-A-?-A-P-V-V- ?-N-A
完整蛋白质的一部分或片段自身可以有抗原性,因此在第二方 面,本发明提供了本发明蛋白质的抗原性片段。特别的,该抗原性 片段包含如上所述的N-末端序列。
本领域技术人员知晓,片段的序列上的某些变化是可能的,其 仍保留抗原性特性。可用本领域技术人员周知的方法检测片段和/或 其变体的抗原性。这些变体也构成本发明的一部分。
本发明的抗原性蛋白质或其片段可以以纯化或经分离的制剂形 式单独提供,或作为与其它铜绿色假单胞菌抗原蛋白质的混合物的 部分提供。
因此,在第三方面本发明提供了一种抗原组合物,其包含本发 明的一种或多种蛋白质和/或其一种或多种抗原性片段。这种组合物 可用于铜绿色假单胞菌的检测和/或诊断。在一个实施方案中,组合 物包括一种或多种额外的铜绿色假单胞菌抗原。
在第四方面,本发明提供了一种检测和/或诊断铜绿色假单胞菌 的方法,其包括:
(a)将待检测的样本与本发明的抗原蛋白质、或其抗原性片段或 一种抗原组合物接触;且
(b)检测针对铜绿色假单胞菌的抗体的存在。
特别的,本发明的蛋白质、其抗原性片段或抗原组合物可用于 检测IgG抗体。适当的,待检测的样本为生物学样本,如血液或唾液 样本。
在第五方面,本发明提供了在检测和/或诊断铜绿色假单胞菌中 本发明的抗原蛋白质、其抗原性片段或抗原组合物的用途。优选 的,检测和/或诊断在体外进行。
本发明的抗原蛋白质、其抗原性片段或抗原组合物可以作为试 剂盒的部分的形式提供,用于铜绿色假单胞菌的体外检测和/或诊 断。因此,本发明的第六方面中提供用于检测和/或诊断铜绿色假单 胞菌的试剂盒,其包括本发明的抗原蛋白质、其抗原性片段或抗原 组合物。
另外,本发明的抗原蛋白质或其抗原性片段可用于诱导一种针 对铜绿色假单胞菌的免疫反应。因此,在又一方面,本发明提供了 本发明的一种抗原、其片段或本发明的抗原组合物在医学上的用 途。
在又一方面,本发明提供了一种能在受试者中引发免疫反应的 组合物,其包含一种本发明的蛋白质或其一种或多种抗原性片段。 适当地,该组合物为一种疫苗组合物,任选地,其包含一种或其它 合适的佐剂。这种疫苗组合物可以是预防性或治疗性的疫苗组合 物。
本发明的疫苗组合物可包括一种或多种佐剂。佐剂的例子为本 领域技术人员周知,包括无机性胶体诸如氢氧化铝或油包水型乳 剂,诸如弗氏不完全佐剂。其它有用的佐剂为本领域技术人员周 知。
在又一方面,本发明提供了:
(a)本发明的蛋白质或其一种或多种抗原性片段在制备一种致免 疫组合物,优选地为疫苗中的用途;
(b)这种致免疫组合物在诱导受试者免疫反应中的用途;和
(c)一种用于在受试者中治疗或预防铜绿色假单胞菌感染的方 法,其包括如下步骤:向受试者施用一种有效量的本发明的蛋白 质、至少一种抗原性片段或抗原组合物,优选的为疫苗。
本发明各个方面的优选的特点对于每一其它方面在细节上已作 必要的修正。
本发明参照下列实施例加以描述,其不应认为以任何方式限制 了本发明的范围。
实施例中的涉及附图:
图1:Pa60的SDS-PAGE分析。 实施例1蛋白质纯化
从过夜培养的100个琼脂平板上收集铜绿色假单胞菌菌株 385(Pa385)的菌,方法是刮平板后,洗板两次,4℃下10,000×g离心 10分钟。用经缓冲的Zwittergent3-14去污剂提取外膜组分,且用乙 醇沉淀。
冷冻干燥外膜提取物,重悬于出发缓冲液(20mM Tris, pH8.5)。将此制剂经Q2柱(Bio Rad)阴离子交换层析和氯化钠梯度 洗脱蛋白质。从柱上洗脱的级分用分析型SDS-PAGE初步鉴定蛋白 质组成。由此测定Pa60的洗脱分布图,使之从随后的柱层析中收集 含有Pa60的级分用于进一步纯化。将这些级分对蒸馏水透析,冷冻 干燥,重悬于最少量的蒸馏水中,且进一步溶于4倍体积的十二烷基 硫酸钠(SDS)还原缓冲液(62.5mM Tris,pH6.8,10%(V/V)甘油, 2%(W/V)SDS,5%(V/V)β-巯基乙醇,1.2×10-3%(W/V)溴酚蓝)。 将SDS制备物在37℃温育至少30分钟后,上样于电泳柱的堆积胶。
Pa60用制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化(PAGE)。利用聚合在 28mm(内径)柱中9%T-1.42%C丙烯酰胺/BIS(N,N′ -亚甲基- 双丙烯酰胺)分离胶和10ml 4%T-0.36%C丙烯酰胺/BIS堆积胶通过 BioRad 491型制备槽进行制备型SDS-PAGE。从柱中洗脱的级分经 过冷冻干燥加以浓缩,且用分析型SDS-PAGE分析蛋白质成分。利 用这些条件分离的Pa60所含的SDS随后用磷酸钾沉淀去除。合并含 有Pa60的级分且透析,然后用于测定蛋白质浓度。
利用分析型SDS-PAGE进行蛋白质的分析鉴定,方法是用10- 15%的梯度丙烯酰胺凝胶或用均质12.5%的丙烯酰胺凝胶,且用考 马斯蓝或银染。用Pierce微量BCA检验确定蛋白质浓度。 结果
通过上述方法成功地从铜绿色假单胞菌蛋白质中分离了Pa60。 图1显示此蛋白质在SDS-PAGE上的位置。 实施例2 Pa60的N-末端测序
通过从SDS-PAGE凝胶上切割出含有该蛋白质的区域制备用于 N-末端氨基酸分析的Pa60。将凝胶片段送到生物分子资源中心, 澳大利亚国立大学,堪培拉,澳大利亚和MUCAB中心,Macquarie 大学,North ryde,NSW,澳大利亚。 结果
获得了N-末端氨基酸序列,鉴定了前十九个氨基酸中的十六 个。鉴定了其余的残基和用可能的鉴定不能确定处之可能的氨基 酸。
序列:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
确定的 E E K L
或然的 T P T T A
可能的S A L/S A I/D W
11 12 13 14 15 16 17 18 19
确定的 V V N A
或然的A A P
可能的F/L G/S N D
于是获得带有如下确定氨基酸的序列:
1-2-3-4-5-6-7-8-9-10-11-12-13-14-15-16-17-18-19
?-E-E-K-?-?-L-?-?-?-?-?-?-?-V-V-?-N-A
如果包括或然的氨基酸,则得到如下序列:
1-2-3-4-5-6-7-8-9-10-11-12-13-14-15-16-17-18-19
?-E-E-K-T-P-L-T-T-A-A-?-A-P-V-V-?-N-A 实施例3在大鼠模型中免疫接种后的细菌消除
特定的无致病原雄性大鼠于第1天接受淋巴结内(IPP)免疫接种 后,于第14天受到活菌攻击。麻醉镇静动物。通过中线腹部切口暴 露小肠,利用27号针头向每一淋巴结膜下注射抗原。免疫接种蛋白 质(Pa60)是这样制备的:将每毫升200或800μg蛋白质与1∶1的比例 之弗氏不完全佐剂(IFA)和磷酸缓冲盐液(PBS)乳化。向每只动 物施用总接种量分别为10或40μg的蛋白质。免疫接种14天后用活菌 (细菌数5×105CFU)攻击动物4小时。细菌在5%CO2和37℃条件下 在营养琼脂平板上生长过夜,回收、清洗且重悬于PBS中达到要求 的浓度。经气管内导管将细菌导入肺部,4小时后将大鼠处以安死 术。收集血液,且将等份血清贮存于-20℃用于抗体分析。用5× 2ml PBS冲洗肺进行灌洗,收集洗液(BAL)用于鉴定细菌数。肺灌 洗后,移出肺,匀浆后鉴定细菌数。制备切片用于测定肺灌洗液中 不同的细胞数。肺灌洗液中总细胞数目通过台盼蓝染色计算,用血 细胞计数器计数。 结果
用Pa60免疫接种且用Pa385同系菌株的活菌于第14天攻击的大鼠 显示增强的细菌清除。用10μg或40μg Pa60免疫的大鼠在4小时后从 BAL和肺回收的菌数均低于非免疫组(表1)。
在Pa60免疫接种动物中存在更多数目的吞噬细胞,且在这些动 物中与增强的细菌清除相关(表2) 表1用Pa60免疫接种和用铜绿色假单胞菌(菌株385)攻击后的肺清除 大鼠组 nb 攻击后4小时回收的铜绿色假单胞菌(log10CFU)a BAL 肺匀浆 非免疫组 5 7.63±0.11 8.66±0.18 10μg Pa60 6 6.95±0.07 8.43±0.09 40μg Pa60 4 7.19±0.07 8.37±0.19 表2细菌攻击后BAL中吞噬细胞数量 动物组 BAL中的总吞噬细胞数 非免疫组 1.2(±0.3)×106 10μg Pa60 4.3(±1.2)×106 40μg Pa60 7.4(±1.7)×106 实施例4:临床诊断研究
来自墨尔本皇家儿童医院的已经诊断为囊性纤维化的孩子为本 研究提供了样本。支气管肺泡灌洗液(BAL)血清自患者为婴儿的 诊断时开始收集3-4年以上。依铜绿色假单胞菌的临床状况将样本 分成几组:
组1:非囊性纤维化对照(年龄与带有喘鸣的孩子相对应);
组2:铜绿色假单胞菌阴性;
组3:铜绿色假单胞菌上呼吸道分离物,下呼吸道阴性;
组4:下呼吸道中消除的铜绿色假单胞菌(随后BAL样本中阴 性);和
图5:BAL连续样本中铜绿色假单胞菌阳性。
用酶联免疫吸附试验(EIISA)在BAL和血清样本中检测针对 Pa60的抗体。用浓度为每毫升1μg的纯化的Pa60包被多吸附 (Polysorb)微量滴定孔。在温育步骤之间用含有0.05%Tween 20的 PBS洗板5次。用脱脂牛奶在PBS-0.05%Tween 20中封闭孔60分 钟。将孔与由用于分析的封闭缓冲液稀释的血清或BAL样品温育90 分钟。所用的偶联的免疫球蛋白为免抗人IgG、IgA和IgM,且孔与 偶联的免疫球蛋白温育90分钟。然后将板显色。用人IgG、IgA和 IgM定量抗体。 结果
当出现铜绿色假单胞菌感染时同时观察到抗体滴度增加。非囊 性纤维化对照组和非感染的囊性纤维化组病人对Pa60的滴度可忽略 不计。特别是在带有来自BAL(组5)的连续铜绿色假单胞菌培养物 患者中可观察到针对Pa60的IgG滴度增加。 表3来自囊性纤维化和非囊性纤维化孩子的血清和支气管肺泡灌洗液 的Pa60-特异性抗体 患者 血清a BALa IgG IgA IgM IgG IgA IgM 组1 1.74 0.11 0.67 0.03 0.05 0.02 组2 1.40 2.34 2.10 0.03 0 0.02 组3 7.08 ±8.4 10.9 ±18 2.03 ±2.5 0.03 ±0.01 0.21 ±0.13 0.03 ±0.01 组4 18.9 ±21.9 0.56 ±0.6 1.46 ±2.07 0.02 ±0.01 0.12 ±0.04 0.01 ±0.01 组5 54.5 ±76 7.5 ±12.5 6.2 ±0.5 0.03 ±0.01 0.81 ±0.30 0.03 ±0.01 实施例5用Pa60体液免疫后用铜绿色假单胞菌肺部攻击大鼠
用Pa60如此免疫DA大鼠:向大鼠肠淋巴结(IPP)施用10μ gPa60。Pa60以在弗氏不完全佐剂中乳化的形式输送。IPP后14天, 全部经免疫的大鼠用溶于磷酸缓冲盐液中的10μgPa60于气管内 (IT)接受加强免疫。IT加强免疫7天后,经IT施用5×108CFU活铜 绿色假单胞菌攻击免疫组和未处理的对照组。于攻击后4小时处死大 鼠,收集样本用于分析。 结果 细菌清除
在支气管肺泡灌洗液(BAL)和肺组织中的细菌回收 细菌回收log10(FU)* 组别 n+ BAL 肺 非免疫组 10μgPa60 5 5 7.92±0.11 6.34±0.08 9.01±0.15 7.58±0.08
*:数据以标准方差均值(±SEM)表示
+:动物数目
用IPP免疫且于第14天IT加强免疫的大鼠从BAL和肺组中均可显 著清除铜绿色假单胞菌。
针对感染的白细胞募集 BAL中的白细胞数 组别 n 白细胞数*(×106) 非免疫组 5 6.8±14 10μg Pa60 5 36.0±5.0
*:数据代表标准方差均值(±SEM)
用Pa60免疫的大鼠,遭受细菌攻击后更为迅速的向肺中募集白 细胞。几乎全部于BAL中回收的白细胞均为多形核嗜中性白细胞 (PMN)或巨噬细胞。向支气管肺泡空间早期募集白细胞与细菌清 除相关。 抗体反应 用Pa60体液免疫后血清和BAL中的抗体
血清中的抗体 组别 n IgG* IgA* IgM* 非免疫组 10μg Pa60 5 5 0 1310±119 0 10±2 14.8±0.56 100±59
*:以ELISA单位表示IgG、IgA和IgM。
在经免疫的大鼠中检测针对Pa60的血清抗体。有IgG、IgA和 IgM的明显滴度。 BAL中的抗体 组别 n IgG* IgA* IgM* 非免疫组 10μg Pa60 5 5 1.5±0.2 21.3±2.6 0 7.8±4.2 0.5±0.02 0.8±0.3
*:以ELISA单位表示IgG、IgA和IgM。
在经免疫的动物BAL中检测针对Pa60的抗体。特异于Pa60的 IgG和IgA均有明显滴度。
(A)姓名:AUSPHARM国际有限公司
(B)街道:First Floor,OSPREY HOUSE
(C)城市:LOWER SQUARE,ISLEWORTH
(D)州:MIDDLESEX
(E)国家:英国
(F)邮政编码(ZIP):TW76BN (ii)发明名称:抗原 (iii)序列数目:4 (iv)计算机可读形式:
(A)介质类型:软盘
(B)计算机:IBM PC兼容机
(C)操作系统:PC-DOS/MS-DOS
(D)软件:PatentIn Release#1.0,版本#1.30(EPO) (vi)当前申请数据:
(A)申请号:WO PCT/GB98/00217 (2)SEQ ID No:1的信息: (i)序列特征:
(A)长度:19个氨基酸
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