诱导对抗原的粘膜耐受
阅读：1046发布：2020-06-02
专利汇可以提供诱导对抗原的粘膜耐受专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及诱导对 抗原 的耐受，这通过粘膜(优选经口)施用抗原与产生免疫调节化合物的 微 生物 的组合来实现。更具体地，本发明涉及诱导产生Foxp3+和/或IL－10和/或TGF－β的调节性T细胞，其能够抑制不想要的针对抗原的免疫应答，所述诱导通过经口递送所述抗原与分泌免疫抑制细胞因子的微生物的组合来实现。，下面是诱导对抗原的粘膜耐受专利的具体信息内容。
1.分泌免疫调节化合物的微生物与抗原的组合用于制备在哺乳动物中 诱导免疫耐受或治疗免疫应答相关疾病的药物、医疗食品或营养品的用 途。
2.组合物用于制备在哺乳动物中治疗、预防和/或缓解涉及免疫应答相 关疾病的疾病或病症或者诱导免疫耐受的药物、医疗食品或营养品的用 途，其特征为所述组合物至少包含分泌免疫调节化合物的微生物以及抗 原。
3.根据权利要求1或2的用途，其中所述哺乳动物选自小鼠、大鼠、 狗、猫、牛、马、猪和人。
4.根据权利要求1至3中任一项的用途，其中所述对免疫耐受的诱导 是所述诱导前的至少1.5倍、2倍、3倍或更多倍。
5.根据权利要求1至4中任一项的用途，其中所述对免疫耐受的诱导 是通过所述哺乳动物中细胞因子水平的调节来衡量。
6.根据权利要求1至5中任一项的用途，其中所述调节是细胞因子水 平的提高，其中所述细胞因子选自IL-10、TGF-β、IL-4和IFNα。
7.根据权利要求6的用途，其中所述细胞因子水平的提高是所述诱导 前的至少1.5倍、2倍、3倍或更多倍。
8.根据权利要求5的用途，其中所述调节是细胞因子水平的降低，其 中所述细胞因子选自IFN-γ、IL-2、IL-5、IL-6、IL-12、IL-13和TNF-α、 MCP-1。
9.根据权利要求8的用途，其中所述细胞因子水平的降低是所述诱导前 的至少1.5倍、2倍、3倍或更多倍。
10.根据权利要求1至9中任一项的用途，其中所述抗原激发T细胞介 导和/或B细胞介导的免疫应答。
11.根据权利要求1至10中任一项的用途，其中所述T细胞介导的免 疫应答是Th1免疫应答。
12.根据权利要求1至10中任一项的用途，其中所述T细胞介导的免 疫应答是Th2免疫应答。
13.根据权利要求1至12中任一项的用途，其中所述抗原是变应原、同 种抗原、自身抗原或自体抗原。
14.根据权利要求1至13中任一项的用途，其中所述抗原参与诱导变应 性哮喘、多发性硬化、I型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲 状腺炎、自身免疫性重症肌无力、类风湿性关节炎、食物变态反应或乳糜 泻。
15.根据权利要求1至12中任一项的用途，其中所述抗原是治疗性抗原， 优选为抗CD3。
16.根据权利要求1至15中任一项的用途，其中所述抗原通过表达抗原 的微生物进行递送。
17.根据权利要求16的用途，其中所述抗原展示于所述表达抗原的微生 物的表面。
18.根据权利要求16的用途，其中所述抗原被分泌出来。
19.根据权利要求1至18中任一项的用途，其中所述方法是治疗性的。
20.根据权利要求1至18中任一项的用途，其中所述方法是预防性的。
21.根据权利要求1至20中任一项的用途，其中所述粘膜递送选自直肠 递送、口腔递送、肺递送、眼递送、鼻递送、阴道递送和经口递送。
22.根据权利要求1至21中任一项的用途，其中所述抗原和/或所述表 达免疫调节化合物的微生物通过喷雾剂、胶囊剂、气雾剂、锭剂、大丸 剂、片剂、囊剂、液体剂、混悬剂、乳剂或糖锭剂递送。
23.根据权利要求1至22中任一项的用途，其中所述抗原和所述表达免 疫调节化合物的微生物以单位剂型递送，例如片剂、胶囊剂或计量气雾 剂剂量。
24.根据权利要求1至23中任一项的用途，其中所述抗原与所述表达免 疫调节化合物的微生物同时或依次递送。
25.根据权利要求1至24中任一项的用途，其中所述免疫调节化合物是 免疫抑制化合物。
26.根据权利要求25的用途，其中所述免疫抑制化合物是耐受增强细胞 因子或耐受增强抗体。
27.根据权利要求1至25中任一项的用途，其中所述免疫抑制化合物是 免疫抑制细胞因子或抗体。
28.根据权利要求27的用途，其中所述免疫抑制细胞因子选自IL-4、 IL10、IFN-α、Flt3L、TGFβ和RANK-L。
29.根据权利要求27的用途，其中所述免疫抑制抗体选自抗IL-2、抗 IL12和抗IFN-γ。
30.根据权利要求1至29中任一项的用途，其中所述微生物是细菌或酵 母。
31.根据权利要求30的用途，其中所述细菌是乳酸菌。
32.根据权利要求31的用途，其中所述乳酸菌选自乳杆菌属 (Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、 乳球菌(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、气球菌属 (Aerococcus)、肉杆菌属(Carnobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、 酒球菌属(Oenococcus)、四联球菌属(Teragenococcus)、漫游球菌属 (Vagococcus)和魏斯氏菌属(Weisella)。
33.根据权利要求32的用途，其中所述乳球菌是乳酸乳球菌。
34.根据权利要求30的用途，其中所述酵母是酿酒酵母。
35.根据权利要求30至34中任一项的用途，其中所述微生物是益生微 生物。
36.根据权利要求1至35中任一项的用途，其中所述免疫调节化合物被 分泌出来。
37.根据权利要求1至35中任一项的用途，其中所述免疫调节化合物展 示于微生物表面。
38.根据权利要求1至37中任一项的用途，其中所述抗原和所述免疫调 节化合物被相同微生物表达。
39.根据权利要求1至38中任一项的用途，其中所述抗原和/或所述分 泌免疫调节化合物的微生物还包含佐剂、可药用载体和/或赋形剂。
40.根据权利要求1至39中任一项的用途，其中所述抗原和/或所述分 泌免疫调节化合物的微生物还包含刺激产生免疫抑制细胞因子的化合 物。
41.根据权利要求40的用途，其中所述刺激产生免疫抑制细胞因子的化 合物是霍乱毒素B亚基。
42.根据权利要求1至41中任一项的用途，其中所述抗原和/或所述分 泌免疫调节化合物的微生物递送至少1天，优选至少1周，更优选至少 1个月或1年。
43.根据权利要求1至42中任一项的用途，其中所述抗原和所述分泌免 疫调节化合物的微生物至少每天递送一次，优选每天递送二次。
44.根据权利要求1至43中任一项的用途，其中所述抗原和/或所述分 泌免疫调节化合物的微生物以至少10飞克至100毫克/天的剂量递送。
45.一种组合物，其包含分泌免疫调节化合物的微生物与抗原的组合。
46.根据权利要求45的组合物，其中所述组合物是药物组合物。
47.根据权利要求45或46的组合物，其中所述抗原是变应原、同种抗 原、自身抗原或自体抗原。
48.根据权利要求45至47中任一项的组合物，其中所述抗原参与诱导 变应性哮喘、多发性硬化、I型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫 性甲状腺炎、自身免疫性重症肌无力、类风湿性关节炎、食物变态反应或 乳糜泻。
49.根据权利要求45至47中任一项的组合物，其中所述抗原是治疗性 抗原，优选抗CD3。
50.根据权利要求45至49中任一项的组合物，其中所述抗原通过表达 抗原的微生物进行递送。
51.根据权利要求45至50中任一项的组合物，其中所述抗原展示于所 述表达抗原的微生物的表面。
52.根据权利要求45至50中任一项的组合物，其中所述抗原被分泌出 来。
53.根据权利要求45至52中任一项的组合物，其中所述抗原和/或所述 表达免疫调节化合物的微生物存在于喷雾剂、胶囊剂、气雾剂、锭剂、 大丸剂、片剂、囊剂、液体剂、混悬剂、乳剂或糖锭剂中。
54.根据权利要求45至53中任一项的组合物，其中所述抗原和所述表 达免疫调节化合物的微生物存在于单位剂型中，例如片剂、胶囊剂或计 量气雾剂剂量。
55.根据权利要求45至54中任一项的组合物，其中所述免疫调节化合 物是免疫抑制化合物或抗体。
56.根据权利要求55的组合物，其中所述免疫抑制化合物是耐受增强细 胞因子或耐受增强抗体。
57.根据权利要求55的组合物，其中所述免疫抑制化合物是选自IL-4、 IL-10、IFN-α、Flt3L、TGFβ和RANK-L的细胞因子。
58.根据权利要求55的组合物，其中所述免疫抑制抗体选自抗IL-2、 抗IL12和抗IFN-γ。
59.根据权利要求45至58中任一项的组合物，其中所述微生物是益生 微生物。
60.根据权利要求45至59中任一项的组合物，其中所述微生物是细菌 或酵母。
61.根据权利要求60的组合物，其中所述细菌是乳酸菌。
62.根据权利要求61的组合物，其中所述乳酸菌选自乳杆菌属 (Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、 乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、气球菌属 (Aerococcus)、肉杆菌属(Carnobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、 酒球菌属(Oenococcus)、四联球菌属(Teragenococcus)属、漫游球菌 属(Vagococcus)和魏斯氏菌属(Weisella)。
63.根据权利要求62的组合物，其中所述乳球菌是乳酸乳球菌。
64.根据权利要求60的组合物，其中所述酵母是酿酒酵母。
65.根据权利要求45至64中任一项的组合物，其中所述抗原和所述免 疫调节化合物被相同微生物表达。
66.根据权利要求45至65中任一项的组合物，其还包含佐剂、可药用 载体和/或赋形剂。
67.根据权利要求45至66中任一项的组合物，其还包含刺激产生免疫 抑制细胞因子的化合物。
68.根据权利要求67的组合物，其中所述刺激产生免疫抑制细胞因子的 化合物是霍乱毒素B亚基。
69.根据权利要求45至68中任一项的组合物，其中所述抗原和/或所述 分泌免疫调节化合物的微生物以至少10飞克至100毫克的剂量存在。
70.用于在动物中诱导对抗原的免疫耐受的方法，其包括组合进行粘膜 递送所述抗原与粘膜递送表达免疫调节分子的微生物。
71.用于在有此需要的哺乳动物中治疗免疫应答相关疾病的方法，其包 括组合进行粘膜递送所述抗原与粘膜递送分泌免疫调节分子的微生物。
72.用于治疗、预防和/或缓解涉及免疫应答相关疾病的疾病或病症或者 用于诱导免疫耐受的药物、营养品或医疗食品，其至少包含抗原与分泌 免疫调节化合物的微生物的组合。
本发明涉及诱导对抗原的耐受，这通过粘膜(优选经口)施用抗原 与产生免疫调节化合物的微生物的组合来实现。更具体地，本发明涉及 诱导产生Foxp3+和/或IL-10和/或TGF-β的抗原特异性调节性T细胞， 其能够抑制不想要的针对抗原的免疫应答，所述诱导通过经口递送所述 抗原与分泌免疫抑制细胞因子的微生物的组合来实现。
技术领域
免疫系统负有分辨自身和非自身的任务。沿呼吸道、胃肠道和泌尿 生殖道存在的粘膜免疫系统还负有与多种细菌和无害抗原共存的责任， 所述细菌和抗原为例如食物、空气传播的抗原或者共生菌群。粘膜免疫 系统的关键特征是能够保持对这些抗原的耐受而同时保持有效抵御病 原体的能力。全身性引入抗原(无论通过注射还是损伤)导致炎症细胞 局部浸润以及特异性免疫球蛋白的产生。相反，在粘膜表面(例如胃肠 道和泌尿生殖道)引入的抗原全身性引发对针对这些抗原的免疫应答的 主动抑制。通过经胃肠道施用抗原来特异性诱导这些受调控的应答称为 经口耐受。经口施用抗原可导致全身性不应答，这是对具有不理想副作 用的免疫抑制医学发明(例如类固醇)的一种很有吸引力的替代方案。 本发明特别涉及通过重复接触低剂量抗原而获得低剂量耐受的领域。已 经提出将经粘膜进行的耐受诱导用作针对自身免疫病、变应性疾病和炎 性疾病的治疗策略。
背景技术
尽管经口耐受首先描述于1911年，但是直到二十世纪70年代后期 研究人员才开始阐明其涉及的机制(Mayer和Shao，2004a)。已经提 出了用于开发经口耐受的一些机制，范围从抗特异性T细胞的清除、免 疫偏离以及诱导对Treg抑制的无反应性(Mucida等，2005)。大多数 研究人员赞同有两种不同的获得经口耐受的方式：单次抗原高剂量之后 获得的高剂量耐受和通过重复接触低剂量抗原而获得的低剂量耐受，前 者是基于无反应性和/或清除(Friedman和Weiner，1994)，后者由CD4+ T细胞(包括生产Foxp3+、IL-10和/或TGF-β的调节性T细胞)免疫 应答的主动抑制来介导。重要的是，已经显示粘膜耐受所诱导的调节性 T细胞介导旁观者抑制(bystander suppression)，通过这一过程，对一 种蛋白质具有特异性的调节性细胞抑制附近效应细胞对另一种蛋白质 的应答。旁观者抑制是抗原诱导的抑制的重要特征，因为诱导器官特异 性自身免疫的抗原库大部分是未知的，并且它避免了表位扩展(epitope spreading)现象。表位扩展是自身免疫和变应性疾病的并发症，由此最 初的免疫应答随时间扩展到包括对其它抗原的应答。
通过显示Flt3L驱动DC扩增(Viney等，1998)和RANK-L介导 的DC活化(Williamson等，2002)之后经口耐受增强的研究，人们已 经间接提及了树突细胞在诱导经口耐受中的作用。具体地，未成熟树突 细胞可介导耐受，据推测是通过诱导调节性T细胞。另外，IL-10可调 节未成熟树突细胞的功能并抑制其终末分化，扩增参与诱导调节性T细 胞的致耐受树突细胞的局部存在(De Smedt等，1997)。
粘膜耐受的诱导已在多种变态反应和自身免疫病实验模型中进行 了评价，但是来自人类试验的临床数据普遍令人失望。已经进行了多种 努力来递送与免疫调节化合物组合或不组合的抗原，以实现经口耐受， 但是在大多数情况下效果不显著。在任何事件中，结果都不足以将所述 方法转用到人类中。在所有这些实验中的主要问题在于，没有观察到通 过诱导CD4+T细胞以及之后产生抗原特异性调节性T细胞所导致的主 动抑制。只有当观察到上述情况，才可在人类中获得对抗原免疫应答的 真实和主动的抑制。
靶向性且更高效地递送用于治疗和预防应用的分子是制药工业优 先考虑的问题。有效的策略应通过将分子集中到期望的作用部位来降低 所需剂量、提高安全性并改善疗效。相比于注射，药物和疫苗递送的粘 膜途径提供了多种物流方面和生物学方面的优点。经口递送由于施用简 单而特别具有吸引力。但是，胃肠降解以及低吸收水平通常使得这种肽 和蛋白质药物递送途径无效。替代性粘膜途径(例如经鼻、直肠、肺和 眼途径)也在研究中。粘膜递送蛋白质和肽疫苗抗原通常刺激弱免疫应 答，并可诱导免疫耐受。
IL-4、TGF-β、IL-10(Slavin等，2001)以及抗IL-12的粘膜递送 都被猜测为增强耐受。白介素-10(IL-10)在低剂量耐受的发生中起关 键作用(Slavin等，2001；Mauer等，2003)。已经显示，经口使用低 剂量髓磷脂碱性蛋白和同时的经口IL-10处理小鼠降低了实验性自身免 疫脑脊髓炎的严重程度和发病率，但是疗效很低，远不足以对人类有效。 在这些实验中，添加的IL-10量很高(1μg至10μg)，而数据提示，施 用更高的剂量更为有效。尽管观察到体外0.1μg的IL-10对增殖、IL-12 和IFN-γ分泌的抑制效应，但是未观察到0.1μg的IL-10加MBP治疗 对疾病有效果。已经使用经口施用IL-10与低剂量经口髓磷脂少突胶质 细胞糖蛋白(oligodendrocyte glycoprotein，MOG)的组合进行了相同 的小鼠实验，其导致MOG诱导的小鼠模型中复发降低。同样，这时疗 效低且IL-10添加量高，显示使用较高剂量更为有效的数据。在两个实 验中，均没有通过在人中有效的长期免疫耐受来主动抑制免疫应答，或 者至少是不足的。具体地，因为断定具有足以转用至人体的真实疗效时， 应观察到抗原特异性CD4+T细胞的诱导，最终产生调节性T细胞。只 有这样的机制能够在人中主动抑制免疫应答。在所有前述例子中均没有 观察到CD4+T细胞的诱导。
人们通常认同微生物菌群在经口耐受的诱导中发挥作用(Moreau 和Corthier，1988；Gaboriau-Routhiau等，2003)。Di Giacinto等(2005) 提出，益生菌可诱导IL-10和IL-10依赖性的带有TGF-β的调节性细胞。 但是，此作用是如何产生的仍十分不清楚，并且简单地在肠道中存在微 生物并不足够(Rask等，2005)。另外，尽管益生菌可改善变态反应和 哮喘的症状，但结果不总是明确的，仅使用益生菌不足以诱导可靠的经 口耐受应答。已经进行了多种尝试以通过乳酸菌递送低剂量抗原，以抑 制变应性免疫应答(Daniel等，2006)，其导致变应原特异性IgE的减 少和变应原特异性分泌性IgA应答的增强。尽管在小鼠中实现了免疫平 衡从T辅助细胞2型应答到主要为T辅助细胞-1型应答的理想变化， 但是对游离变应原的递送没有显著改善。一般地，这样单独递送变应原 的方法不足以在人中实现相同的结果。这是由于这些策略需要很长的间 隔治疗期，而调节性T细胞的诱导不能实现，或者至少不足以建立调节 性区室以实现真正、主动且长期的免疫耐受效应。在另一个例子中，经 口施用表达髓磷脂抗原的重组乳杆菌在小鼠模型中导致实验性自身免 疫脑脊髓炎的减少(Maassen等，2003)。但是，认为所述疗效低并且 不足以转用于人体。具体地，因为断定具有足以转用至人体的真实疗效 时，应观察到抗原特异性CD4+T细胞的诱导，最终产生调节性T细胞。 只有这样的机制能够在人中主动抑制免疫应答。在所有前述例子中均没 有观察到CD4+T细胞的诱导。
因此，本领域中有效诱导抗原耐受仍然是一个问题。
通过显示Flt3L驱动DC扩增(Viney等，1998)和RANK-L介导 的DC活化(Williamson等，2002)之后经口耐受增强的研究，人们已 经间接提及了树突细胞在诱导经口耐受中的作用。具体地，未成熟树突 细胞可介导耐受，据推测是通过诱导调节性T细胞。另外，IL-10可调 节未成熟树突细胞的功能并抑制其终末分化，扩增参与诱导调节性T细 胞的致耐受树突细胞的局部存在(De Smedt等，1997)。
粘膜耐受的诱导已在多种变态反应和自身免疫病实验模型中进行 了评价，但是来自人类试验的临床数据普遍令人失望。已经进行了多种 努力来递送与免疫调节化合物组合或不组合的抗原，以实现经口耐受， 但是在大多数情况下效果不显著。在任何事件中，结果都不足以将所述 方法转用到人类中。在所有这些实验中的主要问题在于，没有观察到通 过诱导CD4+T细胞以及之后产生抗原特异性调节性T细胞所导致的主 动抑制。只有当观察到上述情况，才可在人类中获得对抗原免疫应答的 真实和主动的抑制。
靶向性且更高效地递送用于治疗和预防应用的分子是制药工业优 先考虑的问题。有效的策略应通过将分子集中到期望的作用部位来降低 所需剂量、提高安全性并改善疗效。相比于注射，药物和疫苗递送的粘 膜途径提供了多种物流方面和生物学方面的优点。经口递送由于施用简 单而特别具有吸引力。但是，胃肠降解以及低吸收水平通常使得这种肽 和蛋白质药物递送途径无效。替代性粘膜途径(例如经鼻、直肠、肺和 眼途径)也在研究中。粘膜递送蛋白质和肽疫苗抗原通常刺激弱免疫应 答，并可诱导免疫耐受。
IL-4、TGF-β、IL-10(Slavin等，2001)以及抗IL-12的粘膜递送 都被猜测为增强耐受。白介素-10(IL-10)在低剂量耐受的发生中起关 键作用(Slavin等，2001；Mauer等，2003)。已经显示，经口使用低 剂量髓磷脂碱性蛋白和同时的经口IL-10处理小鼠降低了实验性自身免 疫脑脊髓炎的严重程度和发病率，但是疗效很低，远不足以对人类有效。 在这些实验中，添加的IL-10量很高(1μg至10μg)，而数据提示，施 用更高的剂量更为有效。尽管观察到体外0.1μg的IL-10对增殖、IL-12 和IFN-γ分泌的抑制效应，但是未观察到0.1μg的IL-10加MBP治疗 对疾病有效果。已经使用经口施用IL-10与低剂量经口髓磷脂少突胶质 细胞糖蛋白(oligodendrocyte glycoprotein，MOG)的组合进行了相同 的小鼠实验，其导致MOG诱导的小鼠模型中复发降低。同样，这时疗 效低且IL-10添加量高，显示使用较高剂量更为有效的数据。在两个实 验中，均没有通过在人中有效的长期免疫耐受来主动抑制免疫应答，或 者至少是不足的。具体地，因为断定具有足以转用至人体的真实疗效时， 应观察到抗原特异性CD4+T细胞的诱导，最终产生调节性T细胞。只 有这样的机制能够在人中主动抑制免疫应答。在所有前述例子中均没有 观察到CD4+T细胞的诱导。
人们通常认同微生物菌群在经口耐受的诱导中发挥作用(Moreau 和Corthier，1988；Gaboriau-Routhiau等，2003)。Di Giacinto等(2005) 提出，益生菌可诱导IL-10和IL-10依赖性的带有TGF-β的调节性细胞。 但是，此作用是如何产生的仍十分不清楚，并且简单地在肠道中存在微 生物并不足够(Rask等，2005)。另外，尽管益生菌可改善变态反应和 哮喘的症状，但结果不总是明确的，仅使用益生菌不足以诱导可靠的经 口耐受应答。已经进行了多种尝试以通过乳酸菌递送低剂量抗原，以抑 制变应性免疫应答(Daniel等，2006)，其导致变应原特异性IgE的减 少和变应原特异性分泌性IgA应答的增强。尽管在小鼠中实现了免疫平 衡从T辅助细胞2型应答到主要为T辅助细胞-1型应答的理想变化， 但是对游离变应原的递送没有显著改善。一般地，这样单独递送变应原 的方法不足以在人中实现相同的结果。这是由于这些策略需要很长的间 隔治疗期，而调节性T细胞的诱导不能实现，或者至少不足以建立调节 性区室以实现真正、主动且长期的免疫耐受效应。在另一个例子中，经 口施用表达髓磷脂抗原的重组乳杆菌在小鼠模型中导致实验性自身免 疫脑脊髓炎的减少(Maassen等，2003)。但是，认为所述疗效低并且 不足以转用于人体。具体地，因为断定具有足以转用至人体的真实疗效 时，应观察到抗原特异性CD4+T细胞的诱导，最终产生调节性T细胞。 只有这样的机制能够在人中主动抑制免疫应答。在所有前述例子中均没 有观察到CD4+T细胞的诱导。
因此，本领域中有效诱导抗原耐受仍然是一个问题。
发明内容
令人惊奇的是，我们发现将粘膜递送抗原与粘膜递送产生免疫调节 化合物的微生物组合在一起可诱导稳定的粘膜耐受应答，优选这样的抗 原通过微生物表达，并且优选这样的粘膜递送经口进行。我们观察到， 相比于仅粘膜递送表达抗原的微生物，粘膜递送这样的组合给予了对抗 原特异性免疫应答明显更好的抑制。甚至更令人惊奇的是，通过本发明 获得的免疫抑制明显比经口递送游离的免疫调节化合物(无论是否与经 口递送抗原组合)更加有效。
我们已证实，与仅使用抗原或产生IL-10的乳酸乳球菌(L.lactis) 的单一疗法相比或者与使用与经口施用游离IL-10组合的抗原相比，本 发明可诱导经口耐受的效力高得多。抗原特异性调节性T细胞的体内活 化显著增强。这些细胞将免疫显性耐受(dominant tolerance)传递给 免疫活性受者，并介导均匀的局外抑制。本发明的效力在自身免疫病和 变应性疾病小鼠模型中以及治疗剂的免疫失活的方面中得到了证明。
发明详述
在本公开内容的全文中，通过加注的引用参考了多个出版物、专利 以及已公开的专利说明书。这些出版物、专利以及公开的专利说明书的 公开内容通过参考并入本文，以更加完整的描述本发明所属领域的状 态。
A.普通技术
除非另外指明，本发明的实施将利用有机化学、药学、分子生物学 (包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，它们 在本领域的技术范围内。这些技术在以下文献中有完整描述，例如： 《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》第二版(Sambrook等，1989)； 《Oligonucleotide Synthesis》(M.J.Gait编辑，1984)；《Animal Cell Culture》(R.I.Freshney编辑，1987)；《Methods in Enzymology》丛书 (Academic Press，Inc.)；《Handbook of Experimental Immunology》(D. M.Weir&C.C.Blackwell编辑)；《Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells》(J.M.Miller&M.P.Calos编辑，1987)；《Current Protocols in Molecular Biology》(F.M.Ausubel等编辑，1987和期刊)《Polymerase Chain Reaction》(Mullis等编辑，1994)以及《Current Protocols in Immunology》(J.E.Coligan等编辑，1991)。
B.定义
本文使用的一些术语可具有以下定义。如说明书和权利要求中所使 用的，单数形式包括复数形式，除非上下文中另有明确指明。例如术语 “细胞”包括多个细胞，包括其混合物。类似的，如本文所述将“化合物” 用于治疗或药物制备还涵盖将一种或多种本发明化合物用于这样的治 疗或制备，除非上下文另有明确指明。
本文所使用的术语“包含”或“包括”意为组合物和方法包括所提及 的要素，但并不排除其它要素。“基本由......组成”在用于定义组合物和 方法时，意为排除任何对所述组合物具有重要意义的其他要素。因此， 如本文所定义的基本由要素组成的组合物不排除来自分离和纯化方法 的痕量污染物以及可药用载体，例如磷酸缓冲盐水、防腐剂等。
“由......组成”意为排除多于痕量的其它成分要素以及用于施用本发 明组合物的重要方法步骤。
这些连接词中的每一个所定义的实施方案都在本发明的范围内。
本发明的第一个方面是用于诱导对抗原的免疫耐受的方法，其包括 组合进行粘膜递送所述抗原与粘膜递送产生免疫调节化合物的微生物。
优选地，本发明涉及将产生免疫调节化合物的微生物与抗原组合用 于制备用于粘膜递送以诱导免疫耐受的药物。
优选地，所述免疫耐受在动物中诱导。所述动物是哺乳动物，优选 选自小鼠、大鼠、猪、牛、绵羊、马和人。优选地，所述哺乳动物是人。
优选地，所述免疫耐受是粘膜耐受。
本文使用的粘膜可以是任何粘膜，例如口粘膜、直肠粘膜、尿道粘 膜、阴道粘膜、眼粘膜、颊粘膜、肺粘膜以及鼻粘膜。本申请全文中使 用的粘膜递送包括递送至所述粘膜。口粘膜递送包括颊、舌下和牙龈递 送途径。因此，本发明涉及其中所述粘膜递送选自以下的方法：直肠递 送、颊递送、肺递送、眼睛递送、鼻递送、阴道递送和经口递送。优选 地，所述粘膜递送是经口递送，所述耐受是经口耐受。
本申请全文中使用的粘膜耐受是动物(包括人)经粘膜途径接触抗 原之后所述动物中对所述抗原的特异性免疫应答性的抑制。优选地，所 述粘膜耐受是全身性耐受。后来的接触所述抗原可以是本领域技术人员 已知的每一种接触，例如通过胃肠外注射、通过粘膜递送、或者通过内 源产生(例如自身抗原的情况下)的接触。经口耐受是动物(包括人) 通过经口途径接触抗原之后所述动物中对所述抗原的特异性免疫应答 性的抑制。低剂量经口耐受是通过低剂量抗原诱导的经口耐受，其特征 为通过环磷酰胺敏感性调节性T细胞介导的主动免疫抑制，所述T细 胞可对未活化宿主(host)传递耐受性。高剂量经口耐受是通过 高剂量抗原诱导的经口耐受，对环磷酰胺处理不敏感，并通过抗原特异 性T细胞的无反应性和/或清除继续诱导T细胞低应答性。可使用对环 磷酰胺敏感性的差异来区分低剂量和高剂量耐受(Strobel等，1983)。 优选地，所述经口耐受是如Mayer和Shao(2004b)所述的低剂量经口 耐受。
因此，本发明涉及本文所述的方法或用途，其中所述对免疫耐受的 诱导是所述诱导之前的至少1.5倍、优选2倍、更优选3倍或更多。或 者，所述抗原相对于所述诱导之前耐受至少1.5倍、2倍、3倍或更多。 所述对免疫耐受的诱导可通过本领域已知的方法测量。优选地，所述对 免疫耐受的诱导可通过调节所述动物中细胞因子水平来测量。这样，所 述调节可以是细胞因子水平的提高，例如所述细胞因子水平的提高为所 述诱导之前的至少1.5倍、2倍、3倍或更多。或者，所述调节可以是具 体细胞因子水平的下降，例如所述细胞因子水平的下降为所述诱导之前 的至少1.5倍、2倍、3倍或更多。所述细胞因子可选自任何相关细胞因 子，优选地，所述细胞因子选自IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α、 IFN-γ、IFN-α、MCP-1、TGFβ、RANK-L和Flt3L。
抗原可以是本领域技术人员已知的任何抗原。本申请全文中使用的抗 原优选是在引入动物身体时激发免疫应答的任何物质，其中所述免疫应答 可以是T细胞介导的和/或B细胞介导的应答。T细胞介导的应答包括Th1 和/或Th2应答。所述抗原可以是任何抗原，例如但不仅限于变应原(包括 食物变应原)、同种抗原、自体抗原(self antigen)、自身抗原(auto-antigen) 以及诱导免疫应答的治疗性分子或抗原。优选地，所述抗原参与诱导免疫 应答相关疾病。甚至更优选地，所述抗原参与诱导变应性哮喘、多发性硬 化、I型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫 性重症肌无力、类风湿性关节炎、食物变态反应、乳糜泻或者移植物抗宿 主病。
本文使用的免疫应答相关疾病是由身体对抗原不想要的免疫应答造成 的疾病，其中所述抗原可以是异源抗原或自身抗原。免疫应答相关疾病包 括但不仅限于变应性反应(包括食物变态反应)、乳糜泻、变应性哮喘、 自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性重症肌无力、类 风湿性关节炎、I型糖尿病和多发性硬化。免疫应答相关疾病还包括不想 要的免疫反应，例如移植物抗宿主病，或者药物的免疫活化，例如针对非 内源性因子VIII的抗体产生。优选地，所述疾病选自变应性哮喘、食物变 态反应、乳糜泻、I型糖尿病和治疗剂的免疫失活。因此应该理解，免疫 应答相关疾病包括但不仅限于变应性反应(包括食物变态反应)、乳糜泻、 变应性哮喘、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性重 症肌无力、类风湿性关节炎、I型糖尿病和多发性硬化。免疫应答相关疾 病还包括不想要的免疫反应，例如移植物抗宿主病，或者药物的免疫活化， 例如针对非内源性因子VIII的抗体产生。优选地，所述疾病选自变应性哮 喘、食物变态反应、乳糜泻、移植物抗宿主病、I型糖尿病和治疗剂的免 疫失活。
在另一些实施方案中，通过抗原表达微生物来递送所述抗原。优选地， 通过分泌抗原或展示抗原的微生物来递送所述抗原。因此，本发明涉及本 文所述的方法，其中所述抗原展示在所述抗原表达微生物的表面，或者其 中所述抗原被表达。可通过相同微生物或者不同微生物递送所述免疫调节 化合物和所述抗原。
综上所述，应该理解，本发明涉及本文所述的方法或用途，其中所述 方法或用途是治疗性和/或预防性的。
化合物指任何化学或生物学的化合物或复合物，包括简单或复杂的有 机和无机分子、肽、拟肽、蛋白质、蛋白质复合物、抗体、碳水化合物、 核酸或其衍生物。免疫调节化合物是改变免疫系统功能的化合物。本文使 用的免疫调节化合物是诱导耐受的化合物；作为非限制性实例，耐受诱导 可以直接方式通过诱导调节性T细胞例如Treg、Tr1或Th3或者通过将 Th1/Th2平衡向Th1偏移来获得；或者可以间接方式通过活化未成熟树突 细胞成耐受性树突细胞和/或抑制诱导成熟树突细胞表达“共刺激”因子的 Th2免疫应答来获得。免疫调节和免疫抑制化合物是本领域技术人员已知 的，包括但不仅限于细菌代谢物例如精胍菌素、真菌和链霉菌代谢物例如 他克莫司或环孢素、免疫抑制细胞因子例如IL-4、IL-10、IFNα、TGFβ (作为调节性T细胞的选择性佐剂)、Flt3L、TSLP和Rank-L(作为选择 性致耐受DC诱导物)、抗体和/或拮抗剂(例如抗CD40L、抗CD25、抗 CD20、抗IgE、抗CD3)和蛋白质、肽或融合蛋白(例如CTL-4Ig或CTLA-4 激动剂融合蛋白)。
因此，所述免疫调节化合物可以是本领域技术人员已知的任何免疫调 节化合物。优选地，所述免疫调节化合物是免疫抑制化合物，甚至更优选 地，所述化合物是免疫抑制细胞因子或抗体。优选地，所述免疫抑制细胞 因子是耐受增强细胞因子或抗体。免疫抑制细胞因子是本领域技术人员已 知的，包括但不仅限于IL-4、IL-10、IFN-α和TGFβ(作为调节性T细胞 的选择性佐剂)和Flt3L、TSLP和Rank-L(作为选择性致耐受DC诱导 物)。优选地，所述免疫抑制细胞因子选自IL-4、IL-10、IFN-α和Flt3L。 本领域技术人员应理解，本发明还涉及其功能同系物。功能同系物指具有 基本相同或类似功能(至少对于意图目的)但是结构上可以不同的分子。 最优选地，所述免疫抑制耐受增强细胞因子是IL-10，或者其功能同系物。 优选地，所述免疫抑制抗体选自抗IL-2、抗IL12、抗IL6和抗IFN-γ。
本文所使用的递送是指本领域技术人员已知的任何递送方法，包括但 不限于待递送化合物的包衣或无包衣药物制剂、胶囊、脂质体、油体、包 含或带有待递送化合物的聚合物颗粒，或者分泌、展示或积累待递送化合 物的微生物，任选地存在可增强粘膜递送和/或粘膜摄入的化合物。
本文所述化合物或组合物可以以纯化形式施用、与其它活性成分组合 或者与可药用无毒赋形剂或载体组合。经口组合物一般包含惰性稀释载体 或者可食用载体。药用相容性粘合剂和/或佐剂材料可作为一部分包含在所 述组合物中。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有任何以下成分或性质类 似的化合物：粘合剂例如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂例如淀粉或 乳糖，分散剂例如褐藻酸、羧甲基淀粉钠(Primogel)或玉米淀粉；润滑 剂例如硬脂酸镁；助流剂例如胶体二氧化硅；甜味剂例如蔗糖或糖精；或 者芳香剂例如薄荷、水杨酸甲酯或者橙味剂。当所述剂量单位形式是胶囊 剂时，除上述材料类型外它还可含有液体载体例如脂肪油。另外，剂量单 位形式可含有多种改变所述剂量单位物理形式的其它材料，例如糖包衣、 紫胶或肠溶剂(enteric agent)。另外，除了活性化合物之外，糖浆可含有 蔗糖作为甜味剂以及某些防腐剂、染料、着色剂以及芳香剂。应理解，可 药用载体的形式和特征由与它组合的活性成分的量、给药途径以及其它熟 知的变量来决定。所述载体必须是“可接受的”，即与所述制剂的其它成分 相容，并对受试者没有毒性。
用于施用的替代制剂包括无菌的水性或非水性溶液剂、混悬剂和乳剂。 非水性溶剂的实例是二甲亚砜、醇、丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄 榄油)以及注射用有机酯(例如油酸乙酯)。水性载体包括醇与水的混合 物、经缓冲的介质以及盐水。静脉内载体包括流体和养分补充剂、电解质 补充剂，例如基于林格氏葡萄糖(Ringer’s dextrose)的载体等。还可存在 防腐剂及其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。 多种液体制剂均有可能用于这些递送方法，包括盐水、醇、DMSO以及基 于水的溶液。
优选地，所述免疫抑制细胞因子以低量表达，优选地，在小鼠实验情 况中为所施用的每剂细菌中0.1μg或更少，在人体疾病的情况中这些用 量要作相应转换。我们已证明，与仅使用抗原或产生IL-10的微生物如 乳酸乳球菌的单一疗法相比，或者与使用与经口施用游离IL-10组合的 抗原相比，本发明能以高得多的效力诱导经口耐受。抗原特异性调节性 T细胞的体内活化得到极大增强。这些细胞将显性耐受传递给免疫活性 受者，并介导均匀的局外抑制。本发明的效力在自身免疫病和变应性疾 病小鼠模型中以及治疗剂免疫失活的情况中得到了证明。
本文所使用的术语“治疗”等包括改善或消除已发生的精神疾病或 病症(已建立后)，或者缓解这些疾病或病症的特征性症状。本文所使 用的这些术语还包含(取决于患者的状态)预防疾病或病症或者其相关 症状的发生，包括在患所述疾病或病症之前降低疾病或病症或其相关的 症状的严重程度。这些在患病之前的预防或降低指对不在患该疾病或病 症的给药时间的患者施用本发明的化合物或组合物。“预防”也包括阻止 疾病或病症或其相关症状的再发，或者其复发预防，例如在改善期之后。 应该明确，精神病症可以是身体不适的原因。在这一方面，术语“治疗” 还包括预防身体疾病或病症，或者改善或消除已发生的身体疾病或病症 (已建立后)，或者缓解这些病症的特征性症状。
本文所使用的术语“药剂”还包含术语“药物”、“治疗剂”、“剂”或在 医学领域用于表示具有治疗或预防效果的制剂的其他术语。
应理解，本发明的化合物(即抗原和免疫调节分子)以治疗有效量 递送或表达。本文所使用的术语“治疗有效量”意为当根据期望的治疗方 案施用时，将引发期望的治疗或预防效果或应答的本发明化合物或组合 物的量。优选地，所述化合物或组合物以单位剂型提供，例如片剂、胶 囊剂或者计量气雾剂剂量，从而将单剂量施用于受试者，例如患者。
在某些时候，本申请中所使用的与......组合或组合进行意为在所述 粘膜水平上同时存在抗原和免疫调节化合物。它不意味着抗原和免疫调 节化合物总是必须同时都在粘膜水平上存在。因此，所述方法包括同时 施用抗原和产生免疫调节化合物的微生物，以及依次施用抗原和产生免 疫调节化合物的微生物，或其任意组合。
在另一个实施方案中，所述抗原与所述产生免疫调节化合物的微生 物同时递送或者依次递送。
一个优选实施方案是同时施用抗原和产生免疫调节化合物的微生 物。在此情况下，抗原和产生免疫调节化合物的微生物可包含在相同的 药物制剂中，或者在一起使用的多于一个药物制剂中。一个优选实施方 案是通过同时产生所述抗原和所述免疫调节化合物的微生物来递送。
当抗原和表达免疫调节化合物的微生物或者同时包含这两种要素 的组合物同时施用时，所述化合物或者活性成分可存在于单一药物组合 物或制剂中。
或者，所述化合物或活性成分在分开的药物组合物或制剂中施用， 用于同时或分开应用。因此，本发明还涉及包含本发明抗原和表达免疫 调节分子的微生物的药物组合物，还涉及这些药物组合物的用途。
在依次施用的情况下，可首先施用抗原或者产生免疫调节组合物的 微生物。在依次施用的情况下，施用之间相隔的时间或者抗原与产生免 疫调节组合物的微生物之间的时间优选不长于3个小时，更优选不长于 2个小时，最优选不长于1个小时。
所述活性成分可每天施用1至6次，足以显示出期望活性。这些日 剂量可以单剂量每天给予一次，或者可以以两个或多个较小剂量在每天 中相同或不同的时间给予，总共给予特定的日剂量。优选地，所述活性 成分每天施用一次或两次。还考虑了两种活性成分在相同时间或者非常 接近的时间施用。或者，一种化合物在早晨施用，另一种在这天的晚些 时候施用。或者在另一种情况下，一种化合物每天施用两次，另一种每 天施用一次，其时间在每天两次给药的其中一次时，或者是独立的。优 选地，两种化合物同时施用，并作为混合物施用。在一个实施方案中， 第二种化合物与所述第一种化合物同时、分别或者依次施用。
在本发明的所有方面中，可在临床期望的时期内对所述患者给予每 日维持剂量，例如从一天至数年(例如所述哺乳动物的余生)；例如从 约(2或3或5天，1或2周，或1个月)向上和/或例如长达约(5年、 1年、6个月、1个月、1周，或者3或5天)。典型的是施用每日维持 剂量约3至约5天，或者约1周至约1年。所述液体制剂的其它组分可 包括防腐剂、无机盐、酸、碱、缓冲剂、营养物、维生素或者其它药物。
分泌免疫调节化合物和/或抗原的微生物可以以至少每天104菌落形 成单位(colony forming unit，cfu)至1012cfu的剂量递送，优选为每天 106cfu至1012cfu，最优选为每天109cfu至1012cfu。根据Steidler等 (Science 2000)描述的方法，例如109cfu分泌的免疫调节化合物为至 少1ng至100ng。通过本领域技术人员已知的ELISA，例如109cfu分 泌的免疫调节化合物是至少1ng至100ng；本领域技术人员可计算对 于任何其它cfu剂量的免疫调节化合物和/或抗原分泌范围。
抗原可以以诱导低剂量应答的剂量递送。优选地，所述抗原以至少 每天10fg至100μg、优选每天1pg至100μg、最优选每天1ng至100 μg的剂量递送。
本发明的免疫调节化合物可以以至少每天10fg至100μg、优选每 天1pg至100μg、最优选每天1ng至100μg的剂量递送。
优选地，所述化合物或组合物以单位剂型提供，例如片剂、溶液剂、 胶囊剂或计量气雾剂剂量，从而对受试者(例如患者)施用单剂量。
根据给药模式(例如经口或任何上文描述的模式)，本领域技术人 员知道如何确定或计算施用于患者的实际剂量。本领域技术人员会了解 根据患者、微生物、载体等对剂量进行调整。
本发明的化合物还可采取可药用盐、水化物、溶剂化物或代谢物的 形式。可药用盐包括无机和有机酸的碱盐，所述酸包括但不仅限于盐酸、 氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、 苹果酸、乙酸、草酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、延胡索酸、琥珀酸、马 来酸、水杨酸、苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸等等。当本发明化合物包含酸 性功能时(例如羧基)，那么所述羧基的合适的可药用阳离子对是本领 域技术人员公知的，包括碱、碱土、铵、季铵阳离子等等。
所述微生物可以是任何适于粘膜递送的微生物，包括细菌、酵母或 真菌。优选的，所述微生物是非病原性微生物，甚至更优选所述微生物 是益生微生物。益生生物是本领域技术人员已知的。益生生物包括但不 限于细菌例如乳杆菌(Lactobacillus sp.)、乳球菌(Lactococcus sp.)、 双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)以及酵母例如酿酒酵母布拉亚种 (Saccharomyces cerevisiae subspecies boulardii)。优选地，所述细菌是 乳酸菌；甚至更优选地，所述乳酸菌选自乳杆菌属(Lactobacillus)、明 串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、乳球菌属 (Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、气球菌属(Aerococcus)、 肉杆菌属(Carnobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、酒球菌属 (Oenococcus)、四联球菌属(Teragenococcus)、漫游球菌属 (Vagococcus)和魏斯氏菌属(Weisella)。在一个更优选的实施方案中， 所述微生物是乳酸乳球菌(Lactococcuslαctis)。在另一个优选实施方案 中，所述微生物是酿酒酵母。
在一个优选实施方案中，所述免疫抑制细胞因子与针对免疫诱导细胞 因子的拮抗抗体(抗IL-2、抗IL-12和/或抗IFNγ)和共刺激分子(例如 抗CD40L和抗CD3)组合。或者，可递送刺激产生所述免疫抑制细胞因 子的化合物，例如霍乱毒素B亚基；以及刺激调节性T细胞功能的分子， 例如ICOS和CTLA-4激动剂。如上所述，所述微生物优选为非病原性微 生物，更优选是益生微生物。益生生物是本领域技术人员已知的，包括但 不限于细菌例如乳杆菌、乳球菌、双歧杆菌，以及酵母例如酿酒酵母布拉 亚种。在一个优选实施方案中，所述微生物是乳酸乳球菌。在另一个优选 实施方案中，所述微生物是酿酒酵母。最优选地，所述益生微生物是乳酸 菌，因为已经描述了通过乳酸菌将异源蛋白质(即非乳酸菌蛋白质)递送 进粘膜，包括经口递送和阴道递送(Steidler和Rottiers，2006；Liu等， 2006)，这使得这些乳酸菌对于抗原和免疫抑制化合物的递送都非常适合。
本发明的另一个方面是将产生免疫调节化合物的微生物与抗原组合用 于制备治疗免疫应答相关疾病的药物的用途。优选地，所述免疫调节化合 物是免疫抑制细胞因子。优选地，所述抗原通过分泌抗原的微生物递送。 所述免疫调节化合物和所述抗原可通过相同的微生物递送，或者可以是不 同的微生物。优选地，所述免疫抑制细胞因子是抑制免疫、增强耐受的细 胞因子。抑制免疫、增强耐受的细胞因子是本领域技术人员已知的，包括 但不限于IL-4、IL-10、IFNα和TGFβ、Flt3L和Rank-L。优选地，所述 免疫抑制细胞因子选自IL-4、IL-10、IFNα和Flt3L。最优选地，所述免 疫抑制细胞因子是IL-10或其功能同系物。在一个优选实施方案中，所述 免疫抑制细胞因子与针对免疫诱导细胞因子的拮抗抗体(例如抗IL-2、抗 IL-12和/或抗IFNγ)以及共刺激分子(例如抗CD40L和抗CD3)组合。 优选地，所述免疫抑制细胞因子以低量表达，优选在小鼠实验性情况中为 0.1μg或更低，在人疾病的情况下这些量需要转换。
应理解，本发明的化合物和组合物可用作营养品、功能性食品或医 用食品，或者作为所述营养品、功能性食品或医用食品的添加剂。另一 个实施方案提供了食品或饮料，优选适于人类消费，其由营养品和调味 剂组成，其中所述营养品由农产品提取物组成。
营养品(无论是液体提取物还是干燥组合物的形式)都是可食用的， 并且可直接被人食用，但是优选以添加剂或营养补充剂的形式(例如在 健康食品店销售的那种片剂)或者作为可食用固体中的成分对人类提 供，更优选地以加工食品(例如谷类、面包、豆腐、曲奇、冰淇淋、蛋 糕、薯片、手卷面包(pretzel)、奶酪等)和可饮用液体(例如饮料， 如奶、苏打水、运动饮料和果汁)中的成分提供。因此，在一个实施方 案中，提供了通过将食品或饮料与有效增强所述食品或饮料营养价值的 量的营养品混合，以提高所述食品或饮料的营养价值的方法。
另一个实施方案提供了提高食品或饮料营养价值的方法，包括将所 述食品或饮料与营养品混合，以产生营养提高的食品或饮料，其中所述 营养品以有效提高所述食品或饮料营养价值的量混合，其中所述营养品 由包含本发明抗原的来自农作物的提取物组成，并且其中所述营养提高 的食品或饮料可另外包含调味剂。优选的调味剂包括甜味剂，例如糖、 玉米糖浆、果糖、葡萄糖、麦芽葡萄糖(maltodextrose)、环已基氨基 磺酸盐、糖精、苯丙氨酸、木糖醇、山梨醇、麦芽糖醇和草本甜味剂例 如甜菊。
本文所述的营养品旨在由于人消费，因此获得它们的方法优选根据 良好生产规范(Good Manufacturing Practices，GMP)以及管理这些 方法的任何适用的政府法规来进行。特别优选的方法仅应用天然来源的 溶剂。本文所述营养品优选含有相对高水平的健康增强物质。营养品可 与另一种营养品混合以增加它们的健康增强效果。
与营养品相反，所谓的“医疗食品”并不意为被普通公众使用，而且 不在商店或超市提供。医疗食品不是包含在健康膳食中、用于降低疾病 风险的食品(例如降脂食品或低盐食品)，也不是减肥产品。医师在患 者有特殊营养需求时开出医疗食品的处方，以处理疾病或健康状况，并 且所述患者处于医师的持续关注下。标签必须清楚的指出所述产品用于 处理特定的疾病或病症。医疗食品的一个例子是营养多样化医疗食品， 其设计成为慢性炎性病症的患者提供靶向性营养支持。此产品的活性化 合物为例如一种或多种本文所描述的化合物。功能性食品可涵盖包含在 健康膳食中、用于降低疾病风险的食品，例如降脂食品或低盐食品，或 者减肥产品。因此，本发明还涉及包含根据本发明营养品的食品或饮料。
因此，本发明涉及将分泌免疫调节化合物的微生物与抗原组合用于 制备用于诱导免疫耐受或用于治疗免疫应答相关疾病的药物、医疗食品 或营养品中的用途。优选地，本发明涉及组合物在制备和/或生产用于 治疗、预防和/或缓解涉及免疫应答疾病的疾病或病症的药物、医疗食 品或营养品中的用途，其特征在于所述组合物至少包含分泌免疫调节化 合物的微生物以及抗原。
在另一个方面，本发明涉及至少分泌免疫调节化合物的微生物以及 抗原用于治疗、预防和/或缓解涉及免疫应答疾病的疾病或病症的用途。 因此，本发明还涉及用于在有此需要的动物中治疗免疫应答相关疾病的 方法，包括组合进行粘膜递送抗原与粘膜递送分泌免疫调节化合物的微 生物。
在又一个实施方案中，本发明涉及组合物，其包含分泌免疫调节化 合物的微生物与抗原的组合。优选地，所述组合物是药物组合物。优选 地，所述抗原是变应原、同种抗原、自体抗原或自身抗原。更优选地， 所述抗原参与诱导变应性哮喘、多发性硬化、I型糖尿病、自身免疫性 葡萄膜炎、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性重症肌无力、类风湿性关节 炎、食物变态反应或乳糜泻。在一个优选实施方案中，所述抗原是治疗性 抗原，优选抗CD3。优选地，本发明的抗原通过表达抗原的微生物递送。 在此情况下，所述抗原可展示在所述抗原表达微生物的表面，或者它可被 所述微生物分泌。优选地，所述组合物以喷雾剂、胶囊剂、气雾剂、锭剂、 大丸剂、片剂、囊剂、液体剂、混悬剂、乳剂或者糖锭剂存在，优选为单 位剂型，例如片剂、胶囊剂或者计量气雾剂剂量。优选地，本发明组合物 中的免疫调节化合物是免疫抑制化合物或抗体。在一个优选实施方案中， 所述免疫抑制化合物是耐受增强细胞因子或者耐受增强抗体，最优选地， 它选自IL-4、IL-10、IFN-α、Flt3L、TGFβ和RANK-L。在另一个优选实 施方案中，所述免疫抑制化合物是免疫抑制抗体，其选自抗IL-2、抗IL-12 和抗IFN-γ。在一个优选实施方案中，本发明组合物中分泌免疫调节化合 物的微生物是益生微生物。在另一个优选实施方案中，本发明组合物中分 泌免疫调节化合物的微生物是细菌或酵母，优选地，所述细菌是乳酸菌， 更优选它是选自以下的乳酸菌：乳杆菌、明串珠菌、片球菌、乳球菌、 链球菌、气球菌、肉杆菌、肠球菌、酒球菌、四联球菌、漫游球菌和魏 斯氏菌，最优选地，所述乳球菌是乳酸乳球菌。优选地，所述酵母是酿 酒酵母。优选地，本发明组合物中所述抗原和所述免疫调节化合物由同 一微生物表达。优选地，本发明组合物还包含佐剂、可药用载体和/或 赋形剂。优选地，本发明组合物还包含刺激产生免疫抑制细胞因子的化 合物，优选地，所述刺激产生免疫抑制细胞因子的化合物是霍乱毒素B 亚基。优选地，在本发明组合物中，所述抗原和/或所述分泌免疫调节 化合物的微生物以至少10fg至100mg的剂量存在。
在最后一个实施方案中，本发明涉及用于治疗、预防和/或缓解涉及 免疫应答相关疾病的疾病或病症的药物、营养品或医疗食品，其至少包 含分泌免疫调节化合物的微生物与抗原的组合。
本领域技术人员应理解，可对本发明的优选实施方案做出多种改变 和修饰，并且可以产生这样的改变和修饰而不脱离本发明的构思。因此， 所附权利要求旨在覆盖落入本发明实质构思和范围内的所有这些等同 变化。
另外，在本发明化合物的描述中所使用的所有术语均具有本领域熟 知的含义。
附图说明
图1.在对Balb/c小鼠经口喂饲GM乳酸乳球菌或卵白蛋白(OVA) 之后，腘窝及腹股沟淋巴结(PLN/ILN)中的增殖性免疫应答。在用弗 氏完全佐剂中的OVA皮下攻击小鼠(第0天)后11天测量OVA特异 性的增殖性应答。小鼠在第-46天至第-42天、第-39天至第-35天、第-32 天至第-28天、第-25天至第-21天、第-18天至第-14天、第-11天至第 -7天、第-4天至第-1天接受混合的乳酸乳球菌悬液。LL-pT：LL-pT1NX (载体对照)和LL-pT1NX的混合细菌悬液；LL-OVA：分泌卵白蛋白 的乳酸乳球菌菌株和LL-pT1NX的混合细菌悬液； LL-OVA+LL-mIL10：LL-OVA和分泌小鼠白介素-10的乳酸乳球菌菌 株的混合细菌悬液。阳性对照1在第-7天接受20mg OVA。阳性对照2 在乳酸乳球菌喂饲的同一天接受1μg OVA。所显示的结果是来自一组4 只小鼠的合并细胞的一式三份培养物的平均[3H]-胸苷掺入(±SD)，以 cpm计。
图2.对Balb/c小鼠经口喂饲GM乳酸乳球菌或OVA之后，MLN 和PLN/ILN中的细胞因子应答。评价对照小鼠和喂饲GM乳酸乳球菌 或OVA的小鼠中IL12p70(a)、TNF-α(b)、IFN-γ(c)、MCP-1(d)、 IL-10(e)和IL-6(f)的分泌。在体外用300μg/ml OVA再刺激之后， 使用小鼠炎症试剂盒，由CBA(BD Bioscience)测试MLN(A)和 PLN/ILN(B)细胞的细胞培养物上清液中细胞因子的存在情况。所显 示的结果是来自一组4只小鼠的合并细胞的细胞因子产生。
图3.对Balb/c小鼠经口喂饲GM乳酸乳球菌或OVA之后， PLN/ILN中OVA特异性的增殖性CD4+T细胞应答。在用弗氏完全佐 剂中的OVA皮下攻击小鼠(第0天)后11天测量OVA特异性的增殖 性应答。小鼠在第-46天至第-42天、第-39天至第-35天、第-32天至第 -28天、第-25天至第-21天、第-18天至第-14天、第-11天至第-7天、 第-4天至第-1天接受混合的乳酸乳球菌悬液。LL-pT：LL-pT1NX(载 体对照)和LL-pT1NX的混合细菌悬液；LL-OVA：分泌卵白蛋白的乳 酸乳球菌菌株和LL-pT1NX的混合细菌悬液；LL-OVA+LL-mIL10： LL-OVA和分泌小鼠白介素-10的乳酸乳球菌菌株的混合细菌悬液。阳 性对照1在第-7天接受20mg OVA。阳性对照2在乳酸乳球菌喂饲的同 一天接受1μg OVA。所显示的结果是来自一组4只小鼠的合并细胞的 一式三份培养物的平均[3H]-胸苷掺入(±SD)，以cpm计。
实施例
实施例A：在经口施用分泌卵白蛋白的乳酸乳球菌与原位递送IL-10 组合之后诱导对所述卵白蛋白的耐受。
该实施例的材料和方法
细菌和质粒
在本研究中始终使用乳酸乳球菌菌株MG1363。细菌培养于GM17 培养基中，即补充了0.5％葡萄糖的M17(Difco Laboratories，Detroit， MI)。所有菌株的保藏悬液均在-20℃下保存于GM17中的50％甘油中。 对于胃内接种，将保藏悬液在新鲜GM17中稀释500倍，在30℃孵育。 它们在16小时内达到每毫升2×109个菌落形成单位(CFU)的饱和浓 度。在此研究中始终使用混合细菌悬液。因此，通过离心收获必须混合 的细菌，将两种细菌培养物的沉淀均在BM9培养基中浓缩10倍 (Schotte，等，2000)。对于治疗，每只小鼠通过胃内导管接受100μl 此悬液。
编码原鸡(Gallus gallus)卵白蛋白的mRNA序列取自Genbank(登 录号AY223553)。从鸡子宫中分离总RNA，并使用25μl体积中的2μg 总RNA、2μM寡聚dT引物(Promega Corporation Benelux，Leiden， The Netherlands)、0.01mM DTT(Sigma-Aldrich，Zwijndrecht，The Netherlands)、0.5mM dNTP(Invitrogen，Merelbeke，Belgium)、20 U Rnasin(Promega Incorporation Benelux)和100U superscript II逆 转录酶(Invitrogen)合成cDNA。使用下列条件，通过聚合酶链式反 应(PCR)扩增OVA cDNA片段：94℃2分钟，然后是94℃45秒、62℃30 秒和72℃90秒的30个循环，使用下列正向和反向引物
5’-GGCTCCATCGGTGCAGCAAGCATGGAATT-3’和
5’-ACTAGTTAAGGGGAAACACATCTGCCAAAGAAGAGAA-3’。
将扩增的片段与红霉素抗性pT1NX载体中乳球菌P1启动子下游的 Usp45分泌信号融合。用携带OVA cDNA和IL-10的质粒转化的 MG1363菌株命名为分泌OVA的乳酸乳球菌(LL-OVA)以及LL-IL10。 乳酸乳球菌-pT1NX(含有空载体pT1NX的MG1363)作为对照 (LL-pT1NX)。
动物
7周龄的雌性Balb/c小鼠获得自Charles River Laboratories (Italy)。它们在SPF条件下饲养，以标准实验室饲料和自来水随意进 行饲养。该动物研究得到根特大学分子生物医学研究系伦理委员会的批 准。
经口耐受的诱导和评价
小鼠在第-46天至第-42天、第-39天至第-35天、第-32天至第-28 天、第-25天至第-21天、第-18天至第-14天、第-11天至第-7天、第-4 天至第-1天接受混合的乳酸乳球菌悬液。LL-pT：LL-pT1NX(载体对 照)和LL-pT1NX的混合细菌悬液；LL-OVA：分泌卵白蛋白的乳酸乳 球菌菌株和LL-pT1NX的混合细菌悬液；LL-OVA+LL-mIL10：LL-OVA 和分泌小鼠白介素-10的乳酸乳球菌菌株的混合细菌悬液。该研究中包 含经口耐受诱导的两个阳性对照。阳性对照1在第-7天接受100μl BM9 培养基中的20mg卵白蛋白。阳性对照2在乳酸乳球菌喂饲的同一天接 受100μl BM9培养基中的1μg卵白蛋白。小鼠通过导管胃内接受喂饲。 对照小鼠不进行经口处理。在第0天，用在含有100μg结核分枝杆菌(M. tuberculosis)H37RA(Difco)的完全弗氏佐剂中1∶1乳化的100μg OVA 皮下免疫小鼠。免疫11天后，收集肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node，MLN)和腘窝及腹股沟淋巴结(popliteal lymph node， PLN/inguinal lymph node，ILN)，评估所述细胞的OVA特异性增殖和 细胞因子产生。
体外OVA特异性境殖
制备引流腘窝及腹股沟淋巴结的单细胞悬液。对细胞进行计数，然 后单独或者与11、33、100或300μg/ml OVA一起以2×105个细胞重悬 于200μl含10％胎牛血清(FCS)、10U/ml青霉素、10μg/ml链霉素、2 mM L-glutamax、0.4mM丙酮酸钠的RPMI-1640(RPMI完全)中重 悬所述细胞。所述细胞在37℃下在5％CO2加湿的培养箱中的U形底 96孔组织培养板(Becton Dickinson)中培养90小时。通过在培养的最 后18个小时添加1μCi/孔的[3H]-胸苷来评估增殖。在玻璃纤维过滤器 (Perkin Elmer)上收集DNA结合的放射性，在闪烁计数器(Perkin Elmer)上测量胸苷掺入。
CD4纯化的T细胞在体外的OVA特异性增殖
使用CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)，从来自PLN/ILN 的全细胞制备物中纯化CD4+T细胞。将2×105个CD4+T细胞与作为 抗原呈递细胞载有OVA的丝裂霉素C处理脾细胞一起培养于200μl的 RPMI完全培养基中，CD4+T细胞与APC的比例为：1/3、1/1、1/0.3、 1/0.1和1/0。所述细胞在37℃下在5％CO2加湿的培养箱中的U形底 96孔组织培养板(Becton Dickinson)中培养90小时。通过在培养的最 后18个小时添加1μCi/孔的[3H]-胸苷来评估增殖。在玻璃纤维过滤器 (Perkin Elmer)上收集DNA结合的放射性，在闪烁计数器(Perkin Elmer)上测量胸苷掺入。
测量OVA特异性细胞因子产生
制备来自肠系膜淋巴结(MLN)和引流腘窝及腹股沟淋巴结的淋巴 结细胞，以2×106细胞/ml重悬，将100μl等分试样与300μg/ml OVA 一起在U型底96孔组织培养板中培养72小时。上清液保存于-20℃直 至使用小鼠炎症试剂盒(BD Bioscience)通过流式细胞珠测定来定量细 胞因子水平。
实施例A1：LL-IL10显著增强LL-Ova的耐受诱导能力。为了研究 经口耐受的诱导，在连续5天(在第-46天至第-42天、第-39天至第-35 天、第-32天至第-28天、第-25天至第-21天、第-18天至第-14天、第 -11天至第-7天以及第-4天至第-1天)中对小鼠经口饲喂GM乳酸乳球 菌[LL-pt：LL-pT1NX[全](＝载体对照)和LL-pT1NX的混合细菌悬液； LL-OVA：分泌OVA的乳酸乳球菌和LL-pT1NX的混合细菌悬液； LL-OVA+LL-mIL10：分泌OVA的乳酸乳球菌和分泌小鼠IL-10的乳酸 乳球菌的混合细菌悬液]6次，或者在第-7天饲喂20mg的OVA单剂量 [阳性对照1]，或者在乳酸乳球菌喂饲的同一天饲喂1μg OVA的多次剂 量[阳性对照2]。对照小鼠不进行经口处理。在第0天，用完全弗氏佐 剂中的OVA皮下免疫小鼠，在第11天评估PLN/ILN细胞的OVA特异 性增殖。LL-IL-10的加入显著增强了针对OVA的耐受诱导，因为 PLN/ILN细胞的OVA特异性增殖性应答(图1)在 LL-OVA[全]+LL-mIL-10组中比对照和LL-ova组显著降低。
实施例A2：LL-IL10加强经口耐受与应答于Ova的促炎症细胞因 子产生降低相关。
为了研究经口耐受的诱导，如上所述(实施例1)对小鼠经口喂饲GM 乳酸乳球菌或OVA，然后用弗氏完全佐剂中的OVA皮下免疫小鼠。免 疫11天后，使用小鼠炎症试剂盒通过流式细胞珠测定来定量MLN和 PLN/ILN中应答于OVA的细胞因子产生。在MLN中，与观察到这些 促炎症细胞因子强烈产生的LL-ova组相比，LL-ova+LL-mIL-10组中促 炎症细胞因子IL-12、TNF-α、IFN-γ和IL-6的产生检测不到，或者显著 降低(图2A)。在PLN中，与LL-ova组相比，LL-ova+LI-mIL-10组中 促炎症细胞因子TNF-α、IFN-γ、MCP-1和IL-6的产生显著降低，在此 组中，TNF-α、MCP-1和IL-6的水平低于对照组中所观察到的水平(图 2B)。
实施例A3：LL-IL10通过CD4+T细胞增强经口耐受。
为了评估经口耐受的诱导是否通过CD4+[全]T细胞介导，在MLN和 PLN/ILN中研究了OVA特异性的增殖性CD4T细胞应答。因此，在如 上所述的日子(实施例1)对小鼠经口喂饲GM乳酸乳球菌或OVA。在 第0天用弗氏完全佐剂中的OVA皮下免疫小鼠，11天后从MLN和 PLN/ILN中纯化CD4T细胞，然后在载有OVA的丝裂霉素C处理的 脾细胞存在下培养。相比于LL-ova组和对照组，在LL-ova+LL-mIL-10 组中OVA特异性CD4T细胞应答显著降低(图3)。
实施例B：在经口施用分泌凝血因子VIII和因子IX的乳酸乳球菌 与原位递送的IL-10组合之后诱导对所述因子的耐受。
引言
多种治疗性(重组)蛋白质，例如干扰素、因子VIII/IX和抗体 (Remicade)在长治疗时期中以高剂量施用。但是，与其应用相关的并 发症是发生蛋白质特异性免疫应答，例如抗体。这些抗体(Ab)(也称 为抑制剂)使得所述治疗性蛋白质有效性降低。实例包括形成以下物质 的抑制剂：血友病中的因子VIII/IX、接受慢性肾衰竭治疗的患者中的 促红细胞生成素(Epo)，以及接受多发性硬化治疗的患者中的IFN-β。 本文中，我们证明了经口递送因子VIII(以及因子IX)与产生IL-10 的乳酸乳球菌的组合通过诱导抗原特异性CD4+调节性T细胞而抑制了 所述因子抑制剂的生成。
该实施例的材料和方法
细菌和质粒
在本研究中始终使用乳酸乳球菌菌株MG1363。细菌培养于GM17 培养基中，即补充了0.5％葡萄糖的M17(Difco Laboratories，Detroit， MI)。所有菌株的保藏悬液均在-20℃下保存于GM17中的50％甘油中。 对于胃内接种，将保藏悬液在新鲜GM17中稀释200倍，在30℃孵育。 它们在16小时内达到每毫升2×109个菌落形成单位(CFU)的饱和浓 度。在此研究中始终使用混合细菌悬液。因此，通过离心收获必须混合 的细菌，将两种细菌培养物的沉淀均在BM9培养基中浓缩10倍(Schotte， Steidler等，2000)。对于治疗，每只小鼠通过胃内导管接受100μl此悬 液。
扩增人FVIII和FIX cDNA或cDNA片段(代表FVIII和FIX特异 性的CD4+T细胞表位)，与红霉素抗性pT1NX载体中乳球菌P1启动 子下游的Usp45分泌信号融合。
用携带小鼠IL-10、FVIII(和/或表位片段)、FIX(和/或表位片段) 的质粒转化的MG1363菌株命名为分泌IL10的乳酸乳球菌LL-IL10、 LL-FVIII、LL-FIX。LL-pT1NX(含有空载体pT1NX的MG1363)作 为对照。
FVIII和FIX的定量
使用前述(Chuah等，2003)的人FVIII和FIX特异性酶联免疫吸 附测定(ELISA)对来自LL-FVIII和LL-IX的FVIII或FIX进行测定。 还通过Western印迹分析以及COATest和aPTT测定对所述重组蛋白 进行分析，如(Chuah等，2003；VandenDriessche等，1999)所述。 通过自动化Edman降解来确定此蛋白质的NH2端。因为FVIII和FIX 在肝脏中正常表达，在其中它们经受了广泛的翻译后修饰，所以从改造 乳酸乳球菌中产生的所述凝血因子可能是无生物活性。但是，这些翻译 后差异可能对这些乳酸乳球菌产生的重组蛋白诱导免疫耐受的能力没 有影响。事实上，大多数迄今已详细表征的抑制剂通常识别氨基酸残基 (Villard等，2003)，而不是糖基化部分。
动物
在实验室中育种血友病A或B小鼠，所述小鼠通过在ES细胞中使用同 源重组敲除小鼠的FVIII或FIX基因来获得，如(Bi等，1995和Wang 等，1997)所述。当在CFA存在下使用纯化的重组FVIII或FIX抗原 攻击这些小鼠时，这些受者小鼠产生中和抗体(Mingozzi等，2003)。 可使用Bethesda测定或抗FVIII/抗FIX特异性ELISA随时间监测抑制 剂状态。用FVIII或FIX(+CFA)攻击的受者小鼠通常在抗原攻击后 2-3周后产生抑制剂。
实验情况
作为阴性对照、与LL-IL10或IL-10蛋白(1或10μg)组合或者不组 合地使4-6周龄小鼠接受LL-FVIII、LL-FIX或LL-pT1NX或LL-OVA (无关抗原)。作为耐受诱导的阳性对照，我们用由肝细胞特异性启动 子表达FIX的腺相关病毒载体(AAV)注射小鼠。受者动物产生FIX 特异性免疫耐受，其阻止其后的FIX+CFA攻击诱导抗FIX的抗体。
在预防性情况中，使用胃导管将LL-FVIII、LL-FIX单独或者与 LL-IL10或IL10一起对血友病A或B小鼠经口施用，其中使用不同的 治疗间隔和剂量。然后用纯化的重组FVIII或FIX抗原在CFA存在下 攻击这些受者小鼠(Mingozzi等，2003)。对照动物接触LL-pT1NX和 LL-OVA。通过眶后取血收集血浆。使用Bethesda测定(Kasper等， 1975)或者使用改良的抗FVIII或抗FIX特异性ELISA (VandenDriessche等，1999)以不同时间间隔评估抗FVIII或FIX抗 体的产生。
在治疗性情况中，首先用FVIII或FIX免疫血友病A或B小鼠， 如(Mingozzi等，2003)所述。可使用Bethesda测定或抗FVIII/抗FIX 特异性ELISA随时间监测抑制剂状态。然后，使用不同的处理间隔和 剂量，用单独或者与LL-IL10或IL10一起的LL-FVIII、LL-FIX对低 或高抑制剂效价的小鼠进行处理，并随时间测定抑制剂效价。通过用无 关抗原(破伤风毒素或Ova)攻击接受单独或与LL-IL10一起的 LL-FVIII、LL-FIX的小鼠来评估可能的免疫耐受的特异性。作为阳性 对照，小鼠经口接触纯化的FVIII或FIX。
细胞培养、增殖和细胞因子测定
通过使细胞穿过70μm细胞滤器(Becton/Dickinson Labware)来 制备脾和淋巴结的单细胞悬液。通过与红细胞裂解缓冲液孵育从脾细胞 悬液中除去红细胞。
总脾细胞群的增殖测定，将2×105个细胞培养在96孔U形底培养 板中，其中是总体积200μl的单独的或者带有纯化FVIII或FIX的完 全培养基，其带有或不带抗IL-10或抗TGF-β中和单克隆抗体。以1 至100μg/ml的浓度加入FVIII和FIX。以1、0.1和0.01μg/ml加入所 述中和抗体。对于CD4+T细胞和CD4+CD25-T细胞群的增殖测定，将 0.2×105个CD4+T细胞或CD4+CD25-T细胞与1×105个经辐射的CD4- 细胞(作为抗原呈递细胞)以及FVIII或FIX(0或100μg/ml)一起培 养于96孔U形底培养板中总体积200μl的带有或不带中和抗体的完全 培养基中。在37℃5％CO2加湿培养箱中72小时之后，通过加入1μCi/ 孔的[3H]-胸苷来评估增殖。16-18小时后在玻璃纤维过滤器(Perkin Elmer，Boston，USA)上收集DNA结合的放射性，在闪烁计数器(Perkin Elmer)上测定胸苷掺入。
对于细胞因子测量，在培养的第24、48和72小时收集用于不同增 殖测定的细胞培养物的上清液，冷冻于-20℃直至进行细胞因子测定。 使用小鼠炎症流式细胞珠测定(BD Biosciences，Mountain View，CA， USA)对细胞因子产生进行定量。
体内T调节活性测定
为了测试小鼠中对抗体形成的主动抑制，将分离自不同实验性乳酸 乳球菌治疗组的脾细胞、珠纯化的CD4+T细胞、CD4+CD25-T细胞或 CD4+CD25+T细胞过继转移(adoptively transfer)到幼稚C3H/HeJ小 鼠中。使用未处理小鼠作为对照。对于全脾细胞、去除亚群的脾细胞或 者正选择的CD4+T细胞和CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+T细胞，所 转移的细胞数是107。过继转移36小时后，受者小鼠(每个实验组n＝4-5) 皮下注射cFA中的5μg hF.IX。免疫后2.5周测量血浆中的抗hF.IX IgG 效价。
实施例BI：LL-IL10在血友病A或B小鼠中显著增强LL-FVIII 和LL-IX的耐受诱导能力。
为了研究经口耐受的诱导，如上所述(实验性情况)经口喂饲小鼠。 LL-IL10的添加显著增强了对FVIII和FIX的耐受诱导，因为相比于对 照和LL-FVIII/IX组，在LL-FVIII/FIX+LL-mIL-10组中脾细胞的因子 特异性增殖应答显著降低。
实施例B2：LL-IL10加强经口耐受与应答于所述因子的FVIII和FIX 特异性效价和IFN-γ降低以及更多的IL10和TGF-β产生相关。
为了研究经口耐受的诱导，如上所述(实验性情况)经口喂饲小鼠。 如上所述定量在脾细胞和淋巴结中应答于所述因子的FVIII和FIX特异性 抗体以及细胞因子产生。相比于对照和LL-FVIII/IX组，在 LL-FVIII/FIX+LL-mIL-10组中，抑制剂形成和促炎症细胞因子IFN-γ 的产生显著下降，免疫抑制细胞因子IL-10和TGF-β显著增加。
实施例B3：LL-IL10通过CD4+T细胞增强经口耐受。
为了评估CD4+T细胞是否介导经口耐受的诱导，在脾细胞和淋巴 结中研究了因子特异性的增殖性CD4+T细胞应答。因此，如上所述(实 验性情况)经口喂饲小鼠，如细胞培养、增殖和细胞因子测定中所述测 定因子特异性的CD4+T细胞增殖。相比于对照和LL-FVIII/IX组，在 LL-FVIII/FIX+LL-mIL-10组中，因子特异性的CD4T细胞应答显著降 低。
实施例B4：IL-10在加强经口耐受上的效力低于LL-IL10
为了评估LL-IL10是否与IL10一样有效，如上所述(实验性情况) 经口喂饲小鼠。在脾细胞和淋巴结中研究因子特异性的增殖性CD4T细胞 应答。相比于LL-FVIII/IX+IL-10组，在LL-FVIII/FIX+LL-mIL-10组 中，因子特异性的CD4T细胞应答显著降低。
实施例B5：LL-FVIII/FIX-LL-IL10组合治疗后抗原诱导的T调 节性细胞可在体内传递保护免于形成抑制剂
为了测试在经口耐受方案处理的小鼠中抗体形成的主动抑制，我们 如上所述(体内T调节活性测定)过继转移来自不同治疗组的脾细胞。相 比于对照和LL-FVIII/IX组，在LL-FVIII/FIX+LL-mIL-10组中，抗因 子IgG的形成显著降低，表明在我们的组合经口耐受方案中调节性 CD4+T细胞的活化。
实施例C：在经口施用分泌变应原(Der p 1)的乳酸乳球菌与原 位递送的IL-10的组合之后对所述变应原耐受的诱导
引言
变应性哮喘是气道的慢性炎性疾病。它的特征是可逆的呼吸道阻 塞、变应原特异性免疫球蛋白E的血清水平升高、粘液分泌过多以及对 支气管刺激的气道高应答性(airway hyperresponsiveness，AHR)。接 触患者已经致敏的变应原(例如树、草以及野草的花粉、灰尘和尘螨、 真菌、动物毛屑)使其症状恶化。2型T辅助(Th2)淋巴细胞在所述 疾病的起始、发展和持续中起重要作用。目前的数据表明，Th2对变应 原的应答通常被调节性T细胞抑制。另外，此亚群的抑制在变应性个体 中降低。本文中，我们证明经口递送变应原与产生IL-10的乳酸乳球菌 的组合通过诱导抗原特异性CD4+调节性T细胞抑制哮喘样应答。
该实施例的材料和方法
模拟人类疾病的两个变应性哮喘的小鼠模型是Ova变应原模型和 人源化SCID模型。
Ova变应原模型
用OVA气雾剂通过吸入攻击OVA致敏小鼠，导致Th2细胞因子 依赖型嗜酸性粒细胞增多性气道炎症、支气管高反应性以及IgE产生， 这些发现具有高度的人变应性哮喘特征(Brusselle，1994，Clin Exp Allergy 24：73；Kips等1996，Am J Respir Crit Care Med 153：535； Brusselle等1995，Am J Respir Cell Mol Biol 12：254)。
细菌
在本研究中始终使用乳酸乳球菌菌株MG1363。细菌培养于 GM17培养基中，即补充了0.5％葡萄糖的M17(Difco Laboratories， Detroit，MI)。所有菌株的保藏悬液均在-20℃下保存于GM17中的50％ 甘油中。对于胃内接种，将保藏悬液在新鲜GM17中稀释200倍，在 30℃孵育。它们在16小时内达到每毫升2×109个菌落形成单位(CFU) 的饱和浓度。通过离心收获细菌，并在BM9培养基中浓缩10倍。对于 治疗，每只小鼠通过胃内导管接受100μl此悬液。
质粒
编码原鸡(Gallus gallus)卵白蛋白的mRNA序列取自Genbank (登录号AY223553)。从鸡子宫中分离总RNA，并使用25μl体积中的 2μg总RNA、2μM寡聚dT引物(Promega Corporation Benelux， Leiden，The Netherlands)、0.01mM DTT(Sigma-Aldrich，Zwijndrecht， The Netherlands)、0.5mM dNTP(Invitrogen，Merelbeke，Belgium)、 20U Rnasin(Promega Incorporation Benelux)和100U superscript II 逆转录酶(Invitrogen)合成cDNA。使用下列条件，通过聚合酶链式 反应(PCR)扩增OVA cDNA片段：94℃2分钟，然后是94℃45秒、 62℃30秒和72℃90秒的30个循环，使用下列正向和反向引物
5’-GGCTCCATCGGTGCAGCAAGCATGGAATT-3’和
5’-ACTAGTTAAGGGGAAAC-ACATCTGCCAAAGAAGAGAA-3’。
将扩增的片段与红霉素抗性的pT1NX载体中乳球菌P1启动子下游的 Usp45分泌信号融合。
用携带小鼠IL-10和OVA cDNA的质粒转化的MG1363菌株命名 为LL-IL10和LL-OVA。LL-pT1NX(含有空载体pT1NX的MG1363) 作为对照。
OVA定量
使用自行开发的OVA特异性酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定 来自LL-OVA的OVA。还通过Western印迹分析评估所述重组蛋白的 产生。
OVA变应原模型
小鼠
BALB/c小鼠(6-8周龄)购自Charles River Laboratories(Calco， Italy)。在无特异性病原的条件下保持所述小鼠。
免疫小鼠
腹膜内注射2mg氢氧化铝(alum)中的2μg OVA(V级； Sigma-Aldrich)来免疫小鼠。10天间隔后重复这一免疫(在第0天和 第10天)。对照小鼠接受盐水注射而不是OVA/alum溶液。免疫后7天， 致敏小鼠吸入溶解于PBS的3％OVA雾化溶液10分钟。OVA吸入连续 进行3天(第18、19和20天)。对照小鼠在与实验组相同的条件下仅 吸入PBS。
诱导经口耐受
小鼠接受单独的或与IL-10(1或10μg)或LL-IL10组合的 LL-OVA、单独的LL-IL10、单独的IL-10(1或10μg)、LL-pT1NX或 水(无喂饲对照)。在预防性情况下，小鼠在第一次腹膜内免疫之前使 用2个不同的方案喂饲。喂饲方案1和2由4和6个循环的每日施用5 天所组成，分别间隔两天的非施用期。作为经口耐受诱导的阳性对照， 从第一次免疫前10天至2天每隔一天(总共5次喂饲)通过胃导管以 降低支气管嗜酸性粒细胞增多以及呼吸道过度反应性的1mg(低剂量) 或30mg(高剂量)的OVA喂饲小鼠，高剂量喂饲比低剂量喂饲更为 有效。
在治疗性情况下，用与预防性背景所述相同的乳酸乳球菌每天喂 饲小鼠，只是从第一次免疫开始时至免疫后8天。
作为经口耐受诱导的阳性对照，用30mg的OVA喂饲小鼠。
呼吸道高反应性(AHR)的测定
最终吸入(第21天)后第24小时，通过乙酰甲胆碱诱导的气流 阻塞来评估气道的高反应性。所述小鼠接触雾状生理盐水(Otsuka Pharmaceutical)2.5分钟，然后是递增剂量(1-30mg/ml)的雾状乙酰 甲胆碱。喷雾作用后，这些小鼠被置于全身体积描记器中2.5分钟，使 用Biosystem XA WBP系统(Buxco Electronics)测定增强的停顿 (enhanced pause，Penh)。“Penh”代表肺气流阻塞，用下式进行计算： Penh＝((Te-Tr)/(Tr×PEF/PIF))，其中Penh＝增强的停顿(无量纲)，Te＝ 呼气时间(秒)，Tr＝松弛时间(秒)，PEF＝峰值呼出气流(毫升/秒)， PIF＝峰值吸入气流(毫升/秒)。平均约每5秒测定Penh，对累计值求 平均数作为每个时间点的Penh值。气道高反应性表示为PC200Mch (200％刺激性浓度的乙酰甲胆碱)，乙酰甲胆碱的浓度是基线Penh值 的两倍。
分析支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)
在测量气道高反应性之后，获得支气管肺泡灌洗样品。通过腹膜 内注射100mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪来麻醉小鼠，然后用0.5 ml的盐水灌洗肺四次。离心灌洗液，将细胞重悬于含1％BSA的1ml 盐水中。使用血细胞计数器对总细胞数进行计数。通过在300rpm离心 所述悬液5分钟制备细胞离心样品(Cytospin sample)。为了清楚地区 分嗜酸性粒细胞与嗜中性粒细胞，应用了三种不同的染料：Diff-Quick， May-Grünwald-Giemsa和Hansel(伊红)染料。基于标准形态学标准， 通过光学显微镜区分出至少300个白细胞。按照生产商的说明，通过流 式细胞珠测定(BD Biosciences，Mountain View，CA，USA)来测定 BALF中IL-13、IL-4和IL-5的水平。
测量血清总IgE和OVA特异性Ig
在第21天，在麻醉情况下从后眶窦中获得血样。血样完全凝结后， 离心，收集血清保存于-80℃待用。根据生产商的说明，使用成对Ab(BD Pharmingen)通过ELISA测定总IgE。为了测量血清中的OVA特异性 IgE、IgG1和IgG2a，用2μg/ml OVA包被微量滴定板(Maxisorp，Nunc， VWR International，Haasrode，Belgium)。然后，用PBS中0.1％酪蛋 白封闭孔，之后将平板与含有0.1％酪蛋白和0.05％吐温20的PBS中 (PBS-CT)1∶10至1∶20480稀释的小鼠血清样品一起孵育，其中还含 有山羊抗小鼠IgG2a-HRP[Southern Biotechnology Associates(SBA)， Imtec ITK Diagnostics，Antwerpen，Belgium，1∶5000稀释]、山羊抗 小鼠IgG1-HRP或山羊抗小鼠IgE-HRP(SBA，1∶5000稀释)。洗涤 之后，将底物[3，3’，5，5’四甲基联苯胺(TMB)底物试剂，Pharmingen， Becton Dickinson，Erembodegem，Belgium]加到每个孔中。最后，通 过向孔中加入1M H2SO4来中止反应。在450nm读取吸光度。ELISA 结果以效价来表示，它是OD450仍高于计算截止值的最高稀释度的倒数。 截止值计算为5只非免疫小鼠的平均OD450加3倍SD。
肺组织的组织学检查
获得支气管肺泡灌流液样品之后，用生理盐水灌注肺，然后从小 鼠中摘除。将肺用中性缓冲的甲醛固定，并包埋在石蜡中。用H&E或 过碘酸-希夫(periodic acid-Schiff，PAS)染色切片(3μm厚)。用四 级得分(0，无炎症；1，轻微/轻度；2，中度；和3，重度)评价肺中 组织学变化，所述评分是基于以下所见的分布和强度：1)上皮脱落或 支气管上皮细胞核的波动，2)杯状细胞数量增加，3)炎症细胞从管浸 润到支气管和支气管周间质的粘膜和粘膜下区域，以及4)平滑肌细胞 层的肥大和增厚。
用于分析肺中细胞因子和趋化因子基因表达的RT-PCR
用生理盐水灌注后摘除肺，根据生产商的说明使用ISOGEN (Nippon Gene)提取总RNA。使用寡聚(dT)15引物(Promega)和 Superscript II RNase H-逆转录酶(Invitrogen Life Technologies)在42℃ 下将总RNA(10μg)逆转录2小时。为了保证每个样品中含有相同的 cDNA量，首先使用β-肌动蛋白特异性引物测定每个样品中的β-肌动蛋 白cDNA浓度。以合适的循环数扩增这些样品，以使PCR产物的量保 持在扩增曲线的线性部分。将PCR产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，通过 溴化乙锭染色显影。使用下列特异性引物组测定IL-13、嗜酸性粒细胞 活化趋化因子(eotaxin)、IL-10、IFN-γ和TGF-β的水平。
β-肌动蛋白的有义引物5’-ACGACATGGAGAAGATCTGG-3’，和
反义引物5’-TCGTAGATGGGCACAGTGTG-3’。
IL-13的有义引物5’-TCTTGCTTGCCTTGGTGGTCTCGC-3’，和
反义引物5’-GATGGCATTGCAATTGGAGATGTTG-3’。
嗜酸性粒细胞活化趋化因子的有义引物5’-GGGCAGTAACTTCCATCTGTCTCC-3’和
反义引物5’-CACTTCTTCTTGGGGTCAGC-3’。
IL-10的有义引物5’-TACCTGGTAGGAGTGATGCC-3’，和
反义引物5’-GCATAGAAGCATACATGATG-3’。
IFN-γ的有义引物5’-CATAGATGTGGAAGAAAAGA-3’，和
反义引物5’-TTGCTGAAGAAG GTAGTAAT-3’。
TGF-β的有义引物5’-CTTTAGGAAGGACCTGGGTT-3’，和
反义引物5’-CAGGAGCGCACAATCATGTT-3’。
细胞培养、增殖和细胞因子测定
在最终吸入(第21天)后一天，通过使细胞穿过70μm细胞滤 器(Becton/Dickinson Labware)来制备脾和淋巴结的单细胞悬液。通 过与红细胞裂解缓冲液孵育从脾细胞悬液中除去红细胞。分别使用 CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Germany)或CD4+CD25+ 调节性T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Germany)和MACS柱 (midiMACS；Miltenyi Biotec)富集CD4+T细胞和CD4+CD25-T细 胞。
大量脾细胞和LN细胞群的增殖测定，将2×105个细胞单独或与 纯化OVA一起，在96孔U形底培养板中总体积200μl的有或没有抗 IL-10或抗TGF-β中和单克隆抗体的完全培养基中进行培养。OVA以1 至100μg/ml的浓度加入。中和抗体以1、0.1和0.01μg/ml加入。对于 CD4+T细胞和CD4+CD25-T细胞群的增殖测定，将2×105个细胞的 CD4+T细胞或CD4+CD25-T细胞与载有1mg/ml OVA的经丝裂霉素处 理的脾细胞(作为抗原呈递细胞)一起，在96孔U形底培养板中总体 积200μl的有或没有中和抗体的完全培养基中培养16小时，CD4+T 细胞或CD4+CD25-T细胞/APC的比例是1/1、I/0.3、I/0.1、I/0.03、I/0。 在37℃5％CO2加湿培养箱中72小时之后，通过加入1μCi/孔的[3H]-胸 苷来评估增殖。18小时后在玻璃纤维过滤器(Perkin Elmer，Boston， USA)上收集DNA结合的放射性，在闪烁计数器(Perkin Elmer)上 测定胸苷掺入。
对于细胞因子测量，在培养的第24、48和72小时收集用于不同 增殖测定的细胞培养物上清液，冷冻于-80℃直至进行细胞因子测定。 使用小鼠炎症流式细胞珠测定(BD Biosciences，Mountain View，CA， USA)对细胞因子产生进行定量。
体内T调节活性测定
在最终吸入(第21天)后一天，在37℃下用0.1％胶原酶 (Sigma-Aldrich)消化所处理小鼠的脾20分钟。在一些实验中，制备 全脾细胞的单细胞悬液，并与Con A(2μg/ml；Sigma-Aldrich)一起培 养48小时。收集细胞，将107个细胞静脉内过继转移至幼稚BALB/c 小鼠。对于负选择，根据生产商的说明，使用生物素化的抗小鼠CD4、 CD8、CD11c、CD19和CD11b mAb(BD Pharmingen)的磁珠(MACS； Miltenyi Biotec)从全脾细胞中去除CD4+，CD8+，CD11c+，CD19+，或 CD11b+细胞。通过流式细胞术检测去除的效率(＞99％)。使用CD4+细胞 分离试剂盒纯化CD4+、CD4+CD25-细胞。按照生产商的说明使用调节 性T细胞分离试剂盒。使用流式细胞术检查正选择细胞的纯度。对于细 胞移植实验，恰在其第一次OVA/alum免疫之前或第二次免疫之后将细 胞从尾静脉转移进BALB/c小鼠。对于全脾细胞、去除亚群的脾细胞或 者正选择的CD4+细胞和CD4+CD25-细胞，所转移的细胞数是107。
在人源化SCID(hu-SCID)模型中(如Duez等，2000；Hammad等， 2000所述)
在此模型中，可研究对屋尘螨(house dust mite，HDM)变应原Der p1的变应性免疫应答。这种使用来自HDM变应性患者的PBMC腹膜内 注射重建、然后接触HDM气雾剂的hu-SCID小鼠产生人IgE、产生由活 化T细胞和DC组成的肺渗入物，并表现出应答于支气管收缩剂的AHR (Pestel等1994，J Immunol，153：3804；Duez等，Am J Respir Crit Care Med，vol 161，ppp 200-206，2000)。
细菌
在本研究中始终使用乳酸乳球菌菌株MG1363。细菌培养于 GM17培养基中，即补充了0.5％葡萄糖的M17(Difco Laboratories， Detroit，MI)。所有菌株的保藏悬液均在-20℃下保存于GM17中的50％ 甘油中。对于胃内接种，将保藏悬液在新鲜GM17中稀释200倍，在 30℃孵育。它们在16小时内达到每毫升2×109个菌落形成单位(CFU) 的饱和浓度。通过离心收获细菌，并在BM9培养基中浓缩10倍。对于 治疗，每只小鼠通过胃内导管接受100μl此悬液。
质粒
Der p 1(222个氨基酸残基的球形糖蛋白)是来自屋尘螨 (Dermatophagoides pteronyssinus)(Dpt)的一种主要变应原。合成具有 最佳乳酸乳球菌密码子使用的编码Der p 1蛋白的DNA序列，扩增并与 红霉素抗性pT1NX载体中乳球菌P1启动子下游的Usp45分泌信号融 合。用携带小鼠IL10、Der p 1、Der p 1氨基酸52-71和Der p 1氨基 酸117-133cDNA的质粒转化的MG1363菌株命名为LL-IL10、 LL-Derp1、LL-Derp1aa52-71和LL-Derp1aa117-133。LL-pT1NX(含 有空载体pT1NX的MG1363)作为对照。
Der p 1的定量
使用自行开发的Der p 1特异性酶联免疫吸附测定(ELISA)来 测定来自LL-Derp1的Der p 1。还通过Western印迹分析评估所述重组 蛋白的产生。
患者
血液收集自对屋尘螨敏感或不敏感的供体。变应性患者表现屋尘螨 致敏的通常特征。针对屋尘螨(Dpt)变应原(Stallergènes，Fresnes，France) 的皮肤点刺试验(直径≥10mm)为阳性，所有患者均具有血清特异性IgE 抗体。总IgE浓度大于150IU/ml(150-1600IU/ml)。测试健康供体作为 阴性对照(总IgE水平低于150IU/ml，并且它们对于常见吸入变应原的 皮肤点刺试验为阴性)。
人外周血单个核细胞制备物
离心(120×g，15分钟)获得富集血小板的血浆，将其弃去。然后 在RPMI 1640中稀释血细胞(Life Technologies，Paisley，Scotland)(体积/ 体积)，在Ficoll梯度(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上分层。离心(400×g， 30分钟)后，收集界面处的PBMC，转移前在无菌RPMI培养基中洗三 次。
小鼠
C.B.-17SCID小鼠(6-8周龄)保持在特定动物设施中的具有无菌垫 层的隔离装置中。通过ELISA定期检查SCID群体中小鼠血清免疫球蛋白 的缺乏。
外周血单个核细胞转移进SCID小鼠：PBMC hu-SCID小鼠
细胞转移时，SCID小鼠为6-8周龄。所述小鼠通过用23号针腹膜 内注射400μl RPMI中来自变应性患者或健康供体的10×106个单核细胞来 进行重建。在同一天，它们接受腹腔内注射2反应指标(index reactivity) [IR]单位的Dpt。细胞重建后四天，连续四天(第0天至第4天)使SCID 小鼠每天接触含100IR单位Dpt(100IR单位等同于Dpt提取物中所含 的约200μg蛋白质)变应原气雾剂。对照组不接触Dpt。气道应答测定前 一天(第35天和第60天)，使hu-SCID小鼠接触另一个100IR单位Dpt 溶液的气雾剂。
实验性情况
小鼠接受组合或未组合LL-IL10或IL-10蛋白(1或10μg)的改造 成表达Der p 1或无关抗原(OVA)(作为阴性对照)的乳酸乳球菌。 经改造的乳酸乳球菌使用胃导管经口施用给SCID小鼠，其中使用开始 于PBMC重建后一天不同的治疗间隔和剂量。通过测量人血清IgE抗 体、分析肺浸润、测量AHR以及分析BALF中的细胞群和细胞因子产 生来评估对经口耐受的诱导。另外，通过分析增殖性T细胞对Der p 1 的应答来评估对耐受的诱导。
气道应答(AHR)的评估
如Duez等2000所述，在第35天或第60天测量气道应答(表达为 造成肺阻力增加50％的卡巴胆碱激发剂量)。
人IgE测定
移植人细胞后数天，在醚麻醉的情况下从后眶窦对小鼠取血。通过 两位点免疫放射测定法(two-site immuno-radiometric method)使用两种 不同的ε链特异性小鼠mAb(Immunotech International，Luminy，France) 研究总人IgE。在一式两份的测定中至少使用20μl血清。所述方法的灵 敏度允许检测0.1IUiml(0.24ng/ml)。
通过ELISA定量针对Dpt变应原的特异性IgE Ab。简言之，在4℃ 下用0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中的Dpt变应原(pH9.6)过夜包被 塑料管(Maxisorb Startube，Nunc，Denmark)，在室温用0.1M PBS 中的1％BSA(pH 7.4)使所述塑料管饱和2小时。洗涤后，管在室温 下与含有BSA(1％)和吐温(0.01％)的PBS中稀释的Hu-SCID小鼠 血清孵育2小时，然后在4℃过夜。彻底洗涤之后，加入HRP标记的 抗人IgE Ab。洗涤之后，将底物[3，3’，5，5’四甲基联苯胺(TMB)底物 试剂，Pharmingen，Becton Dickinson，Erembodegem，Belgium]加到 每个孔中。最后，向孔中加入1M H2SO4中止反应。在450nm读取吸 光度值。
肺的组织学检测
在第35天切除肺，在多聚甲醛中固定，加工用于石蜡包埋。对石蜡 组织切片染色以检测人CD45+细胞，之后通过如Duez等2000所述的组织 学得分对小鼠肺切片上的人细胞进行定量。
分析支气管肺泡灌洗液(BALF)
如OVA变应原模型所述分析BALF。
细胞培养、增殖和细胞因子测定：
通过使细胞穿过70μm细胞滤器(Becton/Dickinson Labware) 制备脾的单细胞悬液。通过与红细胞裂解缓冲液孵育从脾细胞悬液中除 去红细胞。分别使用CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec， Germany)或人CD4+CD25+调节性T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec， Germany)和MACS柱(midiMACS；Miltenyi Biotec)富集CD4+T 细胞和CD4+CD25-T细胞。
大量脾细胞的增殖测定，将2×105个细胞单独或与纯化Der p 1一 起，在96孔U形底培养板中总体积200μl的有或没有抗IL-10或抗 TGF-β中和单克隆抗体的完全培养基中进行培养。Der p 1以1至100 μg/ml的浓度加入。中和抗体以1、0.1和0.01μg/ml加入。对于CD4+T 细胞和CD4+CD25-T细胞群的增殖测定，将2×105个细胞的CD4+T细 胞或CD4+CD25-T细胞与载有1mg/ml Der p 1的经丝裂霉素处理的人 PBMC一起，在96孔U形底培养板中总体积200μl的有或没有中和抗 体的完全培养基中培养16小时，CD4+T细胞或CD4+CD25-T细胞/APC 的比例是1/1、1/0.3、1/0.1、1/0.03、1/0。在37℃5％CO2加湿培养箱中 72小时之后，通过加入1μCi/孔的[3H]-胸苷来评估增殖。18小时后在玻 璃纤维过滤器(Perkin Elmer，Boston，USA)上收集DNA结合的放 射性，在闪烁计数器(Perkin Elmer)上测定胸苷掺入。
对于细胞因子测量，在培养的第24、48和72小时收集用于不同 增殖测定的细胞培养物上清液，冷冻于-80℃直至进行细胞因子测定。 使用小鼠炎症流式细胞珠测定(BD Biosciences，Mountain View，CA， USA)对细胞因子产生进行定量。
实施例C1：LL-IL10分别在OVA和哮喘的huSCID小鼠模型中 显著增强LL-OVA和LL-Der p 1的耐受诱导能力。
为了研究经口耐受的诱导，如上所述(实验性情况)经口喂饲小鼠。 LL-IL10的添加显著增强对OVA/Derp1的耐受诱导，因为相比于对照 和LL-OVA/Derp1组，在LL-OVA/Derp1+LL-mIL-10组中脾细胞的变 应原特异性的增殖应答显著降低。
实施例C2：LL-IL10加强经口耐受与应答于所述变应原的AHR、 嗜酸性粒细胞浸润、血清IgE水平的降低和IL-13、IL-4和IL-5细胞因子 的产生降低相关。
为了研究经口耐受的诱导，如上所述(实验性情况)经口喂饲小鼠。如上 所述测定应答于所述因子的AHR、嗜酸性粒细胞BALF浸润、IgE效价以 及细胞因子的产生。相比于对照和LL-OVA/Derp1组，在 LL-OVA/Derp1+LL-mIL-10组中，AHR、嗜酸性粒细胞BALF浸润、IgE 效价显著降低，并且IL-13、IL-4和IL-5显著减少。
实施例C3：LL-IL10通过CD4+T细胞增强经口耐受。
为了评估CD4+T细胞是否介导经口耐受的诱导，在脾细胞和淋巴结中研 究了变应原特异性的增殖性CD4T细胞应答。因此，如上所述(实验性情 况)经口喂饲小鼠，如细胞培养、增殖和细胞因子测定中所述测定所述 变应原特异性的CD4+T细胞增殖。相比于对照和LL-OVA/Derp1组，在 LL-OVA/Derp1+LL-mIL-10组中，所述变应原特异性的CD4T细胞应答 显著降低。
实施例C4：相比LL-IL10，IL-10在加强经口耐受上有效性较低
为了评估LL-IL10是否与IL10一样有效，如上所述(实验性情况)经 口喂饲小鼠。在脾细胞和淋巴结中研究变应原特异性的增殖性CD4T细胞 应答。相比于LL-OVA/Derp1+IL-10组，在LL-OVA/Derp1+LL-mIL-10 组中，变应原特异性的CD4T细胞应答显著降低。
实施例C5：LL-OVA-LL-IL10组合治疗后抗原诱导的T调节性细 胞可在体内传递对哮喘样应答的保护
为了测试在经口耐受方案处理的小鼠中对哮喘样应答的主动抑制，我们如 上所述(体内T调节活性测定)过继转移来自不同治疗组的脾细胞。相比 于对照和LL-OVA组，在LL-OVA+LL-mIL-10组中哮喘样应答显著降 低，表明在我们的组合经口耐受方案中的调节性CD4+T细胞的活化。
实施例D：在经口施用分泌α麦醇溶蛋白的乳酸乳球菌与原位递送 IL-10的组合后诱导对所述变应原的耐受
引言
乳糜泻也称为口炎性腹泻或者麸质敏感性肠病，是由于对含有麸质 的特定食用谷物的免疫应答而发生的一种慢性炎性疾病。乳糜泻是复杂的 多基因疾病，与编码人白细胞抗原变体HLA-DQ2或HLA-DQ8的基因密 切相关。乳糜泻的发病机制中最重要方面之一是1型T辅助细胞免疫应答 的活化。这在表达HLA-DQ2/DQ8分子的抗原呈递细胞将毒性免疫肽呈递 给CD4(+)T细胞时发生。两类麸质蛋白(麦醇溶蛋白和麦谷蛋白)都含有 结合DQ2和DQ8的肽。一般公认，免疫应答(例如麸质特异性T细胞产 生IFN-γ)触发乳糜泻患者小肠中粘膜的破坏。因此，在乳糜泻患者的肠 内活化有害的免疫T细胞应答看来是该疾病发生和发展的关键。
本文中，我们证明经口递送麦醇溶蛋白与产生IL-10的乳酸乳球菌 的组合通过诱导抗原特异性CD4+调节性T细胞而抑制麦醇溶蛋白特异性 免疫应答。
本实施例的材料和方法
细菌
在本研究中始终使用乳酸乳球菌菌株MG1363。细菌培养于 GM17培养基中，即补充了0.5％葡萄糖的M17(Difco Laboratories， Detroit，MI)。所有菌株的保藏悬液均在-20℃下保存于GM17中的50％ 甘油中。对于胃内接种，将保藏悬液在新鲜GM17中稀释200倍，在 30℃孵育。它们在16小时内达到每毫升2×109个菌落形成单位(CFU) 的饱和浓度。通过离心收获细菌，并在BM9培养基中浓缩10倍。对于 治疗，每只小鼠通过胃内导管接受100μl此悬液。
质粒
合成具有最佳乳酸乳球菌密码子使用的DNA序列，扩增并与红霉 素抗性的pT1NX载体中乳球菌P1启动子下游的Usp45分泌信号融合， 所述DNA序列编码α-麦醇溶蛋白(基于小麦(Triticum aestivum)的序列， AJ133612)、HLA-DQ8(对应于UniProtKB/TrEMBL登记号Q9M4L6的 203-220残基，序列QYPSGQGSFQPSQQNPQA)和HLA-DQ8脱酰胺基 形式(对应于UniProtKB/TrEMBL登记号Q9M4L6的203-220残基，序 列QYPSGEGSFQPSQENPQA)的麦醇溶蛋白。
使用带有小鼠IL-10、α-麦醇溶蛋白、HLA-DQ8和HLA-DQ8脱酰 胺基形式的MG1363质粒转化的菌株命名为LL-IL10、LL-HLA/DQ8、 LL-HLA/DQ8d。LL-pT1NX(含有空载体pT1NX的MG1363)作为对照。 HLA-DQ8和DQ8d的定量
使用自行开发的ELISA测定来自LL-HLA/DQ8、LL-HLA/DQ8d 的HLA-DQ8和HLA-DQ8d。还通过Western印迹分析评估重组蛋白的产 生。
小鼠
HLA-DQ8转基因小鼠(Senger等2003)在特定的无病原条件下采 取无麸质喂饲进行维持，在8-14周龄时使用。通过足垫内注射50μl CFA (Difco；BD)中的50μg粗制麸质(Sigma-Aldrich)来免疫小鼠。 诱导经口耐受
对于致耐受实验，使用不同的治疗间隔和剂量，在免疫之前和之后 施用LL-HLA/DQ8、单独的或与IL-10(1或10μg)或LL-IL10组合的 LL-HLA/DQ8d、单独的LL-IL10、单独的IL-10(1或10μg)、LL-pT1NX 或水(无喂饲对照)。作为经口耐受诱导的阳性对照，在免疫(第0天)前 第-7、-6、-5、-4天用保存溶液溶于水中的50mg剂量麦醇溶蛋白或重组α- 麦醇溶蛋白喂饲小鼠。
血清麦醇溶蛋白特异性Ig的测量
以10mg/ml将粗制麦醇溶蛋白(Sigma-Aldrich)重悬于甲醇，然 后以1μg/ml的浓度稀释到无水乙醇中。将100μl 1μg/ml的麦醇溶蛋白乙 醇溶液置于Immulon 2板的每个孔中(Fisher Scientific International Inc.)，然后使其在通风罩中干燥。接着在37℃下用4％BSA/PBS将板封闭 2小时。用1×PBS、0.05％吐温20洗涤板。将样品血清以1∶200、1∶400和 1∶800稀释到0.1％BSA/PBS中，37℃孵育1小时。检测抗体是生物素化 大鼠抗小鼠IgA(来自Accurate Chemical&Scientific Corp.)以及生物素 化抗小鼠IgG(来自Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)。酶缀 合物是链霉抗生物素蛋白-HRP，底物是TMB。
细胞培养、增殖和细胞因子测定
通过使细胞穿过70μm细胞滤器(Becton/Dickinson Labware) 制备脾和纵隔淋巴结的单细胞悬液。通过与红细胞裂解缓冲液孵育从脾 细胞悬液中除去红细胞。分别使用CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Germany)或CD4+CD25+调节性T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Germany)和MACS柱(midiMACS；Miltenyi Biotec)富集 CD4+T细胞和CD4+CD25-T细胞。
大量脾细胞和LN群的增殖测定，将2×105个细胞单独或与粗制 麦醇溶蛋白或合成HLA-DQ8/DQ8d一起，在96孔U形底培养板中总 体积200μl的有或没有抗IL-10或抗TGF-β中和单克隆抗体的完全培 养基中进行培养。抗原以1至100μg/ml的浓度加入。中和抗体以1、 0.1和0.01μg/ml加入。对于CD4+T细胞和CD4+CD25-T细胞群的增 殖测定，将2×105个细胞的CD4+T细胞或CD4+CD25-T细胞与载有1 mg/ml粗制麦醇溶蛋白或合成HLA-DQ8/DQ8d的经丝裂霉素处理的脾 细胞(作为抗原呈递细胞)一起，在96孔U形底培养板中总体积200μl 的有或没有中和抗体的完全培养基中培养16小时，CD4+T细胞或 CD4+CD25-T细胞/APC的比例是1/1、1/0.3、1/0.1、1/0.03、1/0。在 37℃5％CO2加湿培养箱中72小时之后，通过加入1μCi/孔的[3H]-胸苷 来评估增殖。18小时后在玻璃纤维过滤器(Perkin Elmer，Boston，USA) 上收集DNA结合的放射性，在闪烁计数器(Perkin Elmer)上测定胸 苷掺入。
对于细胞因子测量，在培养的第24、48和72小时收集用于不同 增殖测定的细胞培养物上清液，冷冻于-80℃直至进行细胞因子测定。 使用小鼠炎症流式细胞珠测定(BD Biosciences，Mountain View，CA， USA)对细胞因子产生进行定量。
实施例D1：LL-IL10显著增强LL-HLA/DQ8d的耐受诱导能力。
为了研究经口耐受的诱导，如上所述(诱导经口耐受)经口喂饲小鼠。 LL-IL10的添加显著增强对HLA-DQ8d的耐受诱导，因为相比于对照 和LL-HLA-DQ8d组，在LL-HLA-DQ8d+LL-mIL-10组中脾细胞的变 应原特异性的增殖应答显著降低。
实施例D2：LL-IL10加强经口耐受与应答于所述变应原的INF-γ产 生降低相关。
为了研究经口耐受的诱导，如上所述(诱导经口耐受)经口喂饲小鼠。如 上所述(细胞培养、增殖和细胞因子测定)定量应答于HLA-DQ8d的细 胞因子产生。相比于对照和LL-HLA-DQ8d 组，在 LL-HLA-DQ8d+LL-mIL-10组中，脾细胞和淋巴结中促炎症细胞因子 INF-γ的产生显著减少。
实施例D3：LL-IL10通过CD4+T细胞增强经口耐受。
为了评估CD4+T细胞是否介导经口耐受的诱导，在脾细胞和淋巴结中研 究了DQ8特异性的增殖性CD4T细胞应答。因此，如上所述(实验性情 况)经口喂饲小鼠，如细胞培养、增殖和细胞因子测定中所述测定DQ8 特异性的CD4+T细胞增殖。相比于对照和LL-HLA/DQ8d组，在 LL-HLA/DQ8d+LL-mIL-10组中，DQ8特异性的CD4T细胞应答显著 降低。
实施例D4：相比LL-IL10，IL-10在加强经口耐受上有效性较低
为了评估LL-IL10是否与IL10一样有效，如上所述(诱导经口耐受) 经口喂饲小鼠。在脾细胞和淋巴结中研究DQ8特异性的增殖性CD4T细 胞应答。相比于LL-HLA/DQ8d+IL-10组，在 LL-HLA/DQ8d+LL-mIL-10组中，DQ8特异性的CD4T细胞应答显著 降低。
实施例E：在经口施用分泌BLG食物变应原的乳酸乳球菌与原位递 送IL-10的组合之后诱导对所述变应原的耐受。
引言
食物变态反应是一种影响约2％至5％人群的疾病。在人类中，升高 的IgE抗体以及存在产生IL-4的抗原特异性T淋巴细胞的提示了Th2偏 向性机制。
本文中，我们证明经口施用食物变应原与产生IL-10的乳酸乳球菌的组合 通过诱导抗原特异性CD4+调节性T细胞而抑制变应原特异性免疫应答。
本实施例的材料和方法
细菌和质粒
在本研究中始终使用乳酸乳球菌菌株MG1363。细菌培养于 GM17培养基中，即补充了0.5％葡萄糖的M17(Difco Laboratories， Detroit，MI)。所有菌株的保藏悬液均在-20℃下保存于GM17中的50％ 甘油中。对于胃内接种，将保藏悬液在新鲜GM17中稀释200倍，在 30℃孵育。它们在16小时内达到每毫升2×109个菌落形成单位(CFU) 的饱和浓度。通过离心收获细菌，并在BM9培养基中浓缩10倍。对于 治疗，每只小鼠通过胃内导管接受100μl此悬液。
扩增牛β-乳球蛋白cDNA并与红霉素抗性的pT1NX载体中乳球菌P1 启动子下游的Usp45分泌信号融合。
使用带有小鼠IL-10或BLG的质粒转化的MG1363菌株命名为LL-IL10 和LL-BLG。LL-pT1NX(含有空载体pT1NX的MG1363)作为对照。
牛β-乳球蛋白(BLG)的定量
使用自行开发的BLG特异性酶联免疫吸附测定(ELISA)和Western 印迹分析来自LL-BLG的BLG。
实验性情况
用于研究乳酸乳球菌保护性作用的食物变态反应小鼠模型是食物诱 导IgE型应答的小鼠模型，如Frossard等(J Allergy Clin Immunol 113： 958-964，2004)所述。小鼠接受组合或未组合LL-IL10或重组IL-10(1 或10μg)的LL-BLG或作为阴性对照的无关抗原(OVA)。作为阳性对照， 小鼠在饮用水中接受高剂量的BLG，以防止用BLG经口攻击时产生的变 应性反应。
在预防性情况中，使用不同的治疗间隔和剂量，用胃导管对小鼠经 口施用经改造的产生BLG的乳酸乳球菌。然后，在霍乱毒素存在下，使 用纯化的BLG抗原经口攻击这些受者小鼠。对照动物接触用对照载体改 造得到的不表达BLG(而是表达OVA)乳酸乳球菌。通过分析胃内抗原 攻击后的过敏反应、测量血清和粪便中BLG特异性IgG1、IgG2a和IgE 效价，测定脾和PP中抗体分泌细胞的数目，分析MLN、PP和脾中的T 细胞增殖和细胞因子产生来评估耐受诱导。
为了研究针对BLG的免疫耐受诱导是否可被IL-10增强，将 LL-BLG和LL-IL10一起施用于小鼠。
BLG的经口致敏
在第0、7、14和21天，通过胃内填饲使用0.2mol/L NaHCO3中20 mg BLG(Sigma)和10μg CTX(购自List Biological Laboratories)攻击 4至5周龄雌性C3H/HeOuJ小鼠(Charles River)。阳性对照组(耐受小 鼠)4周中在饮用水中随意接受0.8mg/ml BLG。给出的蛋白质总量(22.4 mg)与致敏小鼠中给出的BLG总量相似。为了证明致耐受过程还持久活 化外周免疫系统，而不仅是活化粘膜免疫系统，在第28和42天对一组耐 受的小鼠两次注射吸附于1mg氢氧化铝的80μg BLG。
抗原攻击
在第28天，通过胃内填饲使用0.4ml 0.2mol的NaHCO3中的100 mg BLG攻击所有小鼠。观察过敏反应并使用反应得分进行分级(0无反 应至3重度反应或死亡)，所述反应得分在别处有详细描述(Frosssard等， 2001)。攻击前和填饲后30分钟，通过红外在耳朵处测定体核温度。处死 动物，通过心脏穿刺收集血液到含有EDTA的管中，获得血浆以用于通过 商品ELISA试剂盒(Immunotech，Marseille，France)进行组胺测定。
细胞培养、增殖和细胞因子测定
如Frossard等(2004)所述制备脾、纵隔淋巴结和PP的单细胞 悬液。分别使用CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Germany) 或CD4+CD25+调节性T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Germany) 和MACS柱(midiMACS；Miltenyi Biotec)富集CD4+T细胞和 CD4+CD25-T细胞。
大量脾细胞和LN群的增殖测定，将2×105个细胞单独或与纯化BLG一 起，在96孔U形底培养板中总体积200μl的有或没有抗IL-10或抗 TGF-β中和单克隆抗体的完全培养基中进行培养。BLG以1至100 μg/ml的浓度加入。中和抗体以1、0.1和0.01μg/ml加入。对于CD4+T 细胞和CD4+CD25-T细胞群的增殖测定，将2×105个细胞的CD4+T细 胞或CD4+CD25-T细胞与载有1mg/ml BLG的经丝裂霉素处理的脾细 胞(作为抗原呈递细胞)一起，在96孔U形底培养板中总体积200μl 的有或没有中和抗体的完全培养基中培养16小时，CD4+T细胞或 CD4+CD25-T细胞/APC的比例是1/1、1/0.3、1/0.1、1/0.03、1/0。在 37℃5％CO2加湿培养箱中72小时之后，通过加入1μCi/孔的[3H]-胸苷 来评估增殖。18小时后在玻璃纤维过滤器(Perkin Elmer，Boston，USA) 上收集DNA结合的放射性，在闪烁计数器(Perkin Elmer)上测定胸 苷掺入。
对于细胞因子测量，在培养的第24、48和72小时收集用于不同 增殖测定的细胞培养物上清液，冷冻于-80℃直至进行细胞因子测定。 使用小鼠炎症流式细胞珠测定(BD Biosciences，Mountain View，CA， USA)对细胞因子产生进行定量。
体内T调节活性测定
为了测试小鼠中对抗体形成的主动抑制，将分离自不同实验性乳 酸乳球菌治疗组的脾细胞、珠纯化的CD4+T细胞、CD4+CD25-T细胞 或CD4+CD25+T细胞过继转移(adoptively transfer)到幼稚C3H/HeouJ 小鼠中。使用未处理小鼠作为对照。对于全脾细胞、去除亚群的脾细胞 或者正选择的CD4+细胞和CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+T细胞，所 转移的细胞数是107。如果涉及Treg，那么接下来用BLG抗原对这些 小鼠的攻击应抑制诱导针对BLG的体液免疫应答以及过敏反应。
对于BLG特异性血清和粪便抗体的酶联免疫测定
在第0、7、14、21和28天从尾静脉取血获得血清。在相同时间获 得粪便，并以0.1mg/ml重悬于PBS加补充了1∶1000胃酶抑素(Fluka) 的1％FCS(Life technologies)。机械分散所述样品并涡旋2分钟，然后在 4℃下以14000rpm进行两次20分钟的离心。
通过修改自Adel-Patient等(2000，J.Immunol Methods)的方法 测定血清和粪便的BLG特异性IgE、IgG1、IgG2a和/或IgA抗体水平。 简言之，在室温下用250ng/孔的链霉抗生物素蛋白(Fluka)包被MaxiSorp 微量滴定板(Nunc)18小时，然后用300μl聚乙烯吡咯烷酮K25(Fluka) 溶液处理过夜。将1微克生物素化BLG孵育3小时，在0.5μg/ml山羊抗 小鼠IgA、大鼠抗小鼠IgG1或抗小鼠IgG2a过氧化物酶标记的抗体 (Southern Biotechnologies)存在下，一式两份地加入PBS加10％马血清 中稀释的血清(对于IgG1是1∶6666和1∶2222，对于IgG2a是1∶666和1∶222， 对于IgE是1∶66和1∶22)或粪便(1∶3、1∶10和1∶33)，保持2小时。对于 IgE测量，加入单克隆大鼠抗小鼠IgE抗体(克隆R35-72，BD Pharmingen)，然后加入过氧化物酶偶联的抗大鼠抗体(Caltag)。在490nm 处测定吸光度。结果以任意单位表示，使用来自BLG加氢氧化铝免疫的 小鼠的合并血清作为参照血清。
通过ELISPOT测量抗原特异性抗体的产生
从肠道上机械剪下派伊尔氏淋巴结(Peyer’s patch，PP)，将其在补充有5 mmol EDTA(Life Technologies)的HBSS培养基中孵育30分钟。类似地， 轻轻粉碎派伊尔氏淋巴结和肠系膜淋巴结，穿过70μm尼龙滤膜进行过滤。 脾细胞在Tris缓冲的NH4Cl中预孵育5分钟，以除去红细胞。在Percoll 60％/66％梯度下(Amersham)分离淋巴细胞。
对于BLG特异性IgG1、IgG2a和IgA抗体的测量，在37℃下用链 霉抗生物素蛋白过夜包被ELISPOT板(Millipore)，然后加入1μg生物 素化BLG保持3小时。将在Percoll 60％/66％梯度下分离的淋巴细胞以两 个不同浓度(1和2×106)重悬于Iscove改良的Dulbecco培养基中，所述 培养基中补充有青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺、庆大霉素、多粘菌素B和 5％FCS，在37℃保持24小时，然后在4℃下与抗IgA、抗IgG1和抗IgG2a 抗体(Southern Biotechnology)一起过夜孵育。以100μl孔加入氨基-乙 基-咔唑，保持10分钟，然后通过使用KS ELISPOT 4.2.1软件(Zeiss) 对点进行自动计数，表达为每106个细胞中的细胞形成单位(cell-forming unit，CFU)。
实施例E1：LL-IL10在食物变态反应小鼠模型中显著增强 LL-BLG的耐受诱导能力。
为了研究经口耐受的诱导，如上所述(实验性情况)经口喂饲小鼠。 LL-IL10的添加显著增强对BLG的耐受诱导，因为相比于对照和 LL-BLG组，在LL-BLG+LL-mIL-10组中脾细胞的变应原特异性的增 殖应答显著降低。
实施例E2：LL-IL10加强经口耐受与应答于所述变应原的BLG特 异性抗体应答降低和IL-4细胞因子的产生降低相关。
为了研究经口耐受的诱导，如上所述(实验性情况)经口喂饲小鼠。如上 所述测定应答于所述因子的BLG特异性抗体应答和细胞因子的产生。相 比于对照和LL-BLG组，在LL-BLG+LL-mIL-10组中，BLG特异性抗 体水平和IL-4显著降低。
实施例E3：LL-IL10通过CD4+T细胞增强经口耐受。
为了评估CD4+T细胞是否介导经口耐受的诱导，在脾细胞和淋巴结中研 究了变应原特异性的增殖性CD4T细胞应答。因此，如上所述(实验性情 况)经口喂饲小鼠，如细胞培养、增殖和细胞因子测定中所述测定所述 变应原特异性的CD4+T细胞增殖。相比于对照和LL-BLG组，在 LL-BLG+LL-mIL-10组中，变应原特异性的CD4T细胞应答显著降低。
实施例E4：相比LL-IL10，IL-10在加强经口耐受上有效性较低
为了评估LL-IL10是否与IL10一样有效，如上所述(实验性情况)经 口喂饲小鼠。在脾细胞和淋巴结中研究变应原特异性的增殖性CD4T细胞 应答。相比于LL-BLG+IL-10组，在LL-BLG+LL-mIL-10组中，变应 原特异性的CD4T细胞应答显著降低。
实施例E5：LL-BLG-LL-IL10组合治疗后抗原诱导的T调节性细 胞可在体内传递对哮喘样应答的保护
为了测试在经口耐受方案处理的小鼠中对哮喘样应答的主动抑制，我们如 上所述(体内T调节活性测定)过继转移来自不同治疗组的脾细胞。相比 于对照和LL-BLG组，在LL-BLG+LL-mIL-10组中哮喘样应答显著降 低，表明在我们的组合经口耐受方案中的调节性CD4+T细胞的活化。
实施例F：在经口施用分泌胰岛素的乳酸乳球菌与原位递送IL-10 的组合之后诱导对胰岛素的耐受。
简介
自身免疫的特征为自发的炎性性组织损伤，以及丧失自身抗原耐受 所导致的生理功能的破坏。它与免疫系统的部分过度反应有关，其特征为 T辅助(Th)细胞的过剩。难以对易感因素(例如易感基因和环境因素) 施加影响，因此最近开发免疫疗法的尝试均着眼于通过清除病原效应细胞 和/或增强免疫调节性T细胞来重建二者之间的功能平衡。胰岛β细胞的自 身免疫破坏是I型糖尿病(Type 1diabetes mellitus，T1D)的主要原因。 这种破坏与对一些β细胞自身抗原的细胞及体液免疫应答有关，这两种应 答引起临床发病。
在本文中，我们证明经口递送自身抗原与产生IL-10的乳酸乳杆菌的组合 通过诱导抗原特异性CD4+调节性T细胞来抑制糖尿病特异性免疫应答。
本实施例的材料和方法
细菌和质粒
在本研究中始终使用乳酸乳球菌菌株MG1363。细菌培养于 GM17培养基中，即补充了0.5％葡萄糖的M17(Difco Laboratories， Detroit，MI)。所有菌株的保藏悬液均在-20℃下保存于GM17中的50％ 甘油中。对于胃内接种，将保藏悬液在新鲜GM17中稀释200倍，在 30℃孵育。它们在16小时内达到每毫升2×109个菌落形成单位(CFU) 的饱和浓度。通过离心收获细菌，并在BM9培养基中浓缩10倍。对于 治疗，每只小鼠通过胃内导管接受100μl此悬液。
合成具有最佳乳酸乳球菌密码子使用的DNA序列，扩增并与红霉素抗性 的pT1NX载体中乳球菌P1启动子下游的Usp45分泌信号融合，所述 DNA序列编码人胰岛素原1I B24-C36肽(hpIIp)、猪胰岛素和免疫显 性肽InsB9-23(B9-23在许多物种人、大鼠和小鼠之间基本相同)。
使用带有小鼠IL-10、hpIIp、胰岛素、InsB9-23的质粒转化的MG1363 菌株命名为LL-IL10、LL-hpIIp、LL-胰岛素、LL-InsB9-23。LL-pT1NX (含有空载体pT1NX的MG1363)作为对照。使用抗原特异性ELISA和 Western印迹分析测定这些蛋白质的表达。
小鼠
非肥胖雌性及雄性糖尿病(NOD)小鼠和NOD-重度联合免疫缺陷 (severe combined immunodeficient，SCID)(Balb/c背景)小鼠购自 Jackson Laboratory。Balb/c野生型(WT)小鼠购自Charles River Italy。 在特定的无病原中央动物设施中保持小鼠。按照制度规定处理和使用小 鼠。
实验性情况
在预防性情况下，从21天龄(断奶)开始对NOD小鼠经口施用单 独的或与LL-IL10或重组小鼠IL-10(1-10μg)一起的LL-hpIIp、LL-胰 岛素、LL-InsB9-23经口施用给NOD小鼠，并且使用最佳喂饲方案或者直 至100日龄(当大部分小鼠发生糖尿病时)。另外，LL-pT1NX作为阴性 对照经口施用。对于阳性(致耐受)对照组，在2或4周中每周三次对3 周龄NOD小鼠经口使用0.8mg人胰岛素。糖尿病的发生通过每周三次连 续监测尿糖水平来确定，在糖尿的情况下监测血糖水平。在12-23周以及 在实验的结束时(35周)收集胰腺，用苏木精/伊红对连续切片进行染色， 以对单个核细胞的浸润进行评分，或者通过免疫组化来分析T细胞浸润。 在治疗性情况下，对显示稳定糖尿和高血糖的糖尿病NOD雌性小鼠(12-23 周)经口施用单独的或与LL-IL10或重组小鼠IL-10一起的LL-hpIIp、 LL-胰岛素、LL-InsB9-23。另外，LL-pT1NX作为阴性对照经口施用。对 于阳性(致耐受)对照组，如Bresson等2006所述治疗糖尿病NOD小鼠。 完全好转定义为糖尿消失以及血糖恢复正常。
在使用特异性自身抗原再次攻击所述NOD小鼠之后，通过将T细胞过继 转移进NOD SCID小鼠来分析耐受诱导的确切机制。
糖尿病的检测：
葡萄糖监测：使用Diastix(Miles)测定尿糖，通过使用血糖监测系 统OneTouch Ultra(LifeScan Inc.)的血糖测定进行确认。糖尿病定义为 2个连续血糖值高于250mg/dl。
胰岛炎：通过CO2窒息处死小鼠，胰腺在10％甲醛中固定过夜，包 埋在石蜡中，使用苏木精和伊红对连续5μm切片进行染色。通过显微镜对 10-15个胰岛/小鼠中的细胞浸润程度进行如下分级来确定胰岛炎得分(平 均值±SD)：0，无胰岛浸润的可见体征；1，周围胰岛浸润；2，＜50％浸润； 3，＞50％浸润。
免疫组织化学
为了检测胰腺β细胞中胰岛素、CD4和CD8的表达，对冰冻组织切 片使用第一抗体(豚鼠抗猪胰岛素，来自Dako[稀释度1∶300]，抗CD4 RM4.5和抗CD8a IHC，来自BD Biosciences[稀释度1∶50])，如Christen 等2004所述。
体外增殖测定
制备脾脏、肠系膜LN(MLN)和PLN的单细胞悬液。总脾细胞群 的增殖测定，将2×105个细胞单独或与分级浓度(1-100μg/ml)的纯化 人胰岛素或者对CD4T细胞(InsB9-23，H-2d或g限制性)或CD8T细胞 (InsB15-23，Kd限制性)具有特异性的肽(Sigma)一起，在96孔U形 底培养板中总体积200μl的有或没有抗IL-10或抗TGF-β中和单克隆 抗体的完全培养基中进行培养。中和抗体以1、0.1和0.01μg/ml加入。 对于总CD3+T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞和CD4+CD25-T细胞 群的增殖测定，将0.2×105个细胞的T细胞与载有胰岛素或GAD65或 对CD4+或CD8+T细胞具有特异性的肽的1×105个经辐射的WT Balb/c 小鼠脾细胞一起，在96孔U形底培养板中总体积200μl的有或没有中 和抗体的完全培养基中培养。在37℃5％CO2加湿培养箱中72小时之后， 通过加入1μCi/孔的[3H]]-胸苷来评估增殖。16至18小时后在玻璃纤维 过滤器(Perkin Elmer，Boston，USA)上收集DNA结合的放射性， 在闪烁计数器(Perkin Elmer)上测定胸苷掺入。通过使用CD3+、CD4+ 或CD8+分离试剂盒(MACS；Milteny Biotec，Auburn，CA)的磁珠 分离，通过负选择从PLN或脾脏中纯化T细胞。使用CD4+T细胞作 为总细胞，或者使用CD25+分离试剂盒(Milteny Biotec)，通过MACS 进一步分成CD25+或CD25-。通过流式细胞分析确定细胞群的纯度 (＞90％)。
对于细胞因子测量，在培养72小时后收集用于不同增殖测定(抗 原特异性刺激)的细胞培养物上清液，冷冻于-80℃直至进行细胞因子 测定。使用小鼠炎症流式细胞珠测定(BD Biosciences，Mountain View， CA，USA)定量细胞因子产生。培养纯化的CD3+T细胞、CD4+T细胞 或CD8+T细胞并使用抗CD3/抗CD28混合物(每个1μg/ml)刺激24 小时，或者它们作为对照而不进行刺激。收获上清液，使用FCAP阵列 软件(BD Biosciences)，使用BD FACSArray Bioanalyzer上的BDTM 流式细胞珠阵列Flex Set分析IL-10、IL-4、IL-5和IFNγ的产生。使用 Quantikine试剂盒(R&D Systems)，使用捕获ELISA实验测定TGF-β。
体外T细胞增殖抑制测定
将分离自近期糖尿病雌性NOD(8-12周)的2×104个纯化的总脾 CD4+CD25-T细胞与多种数量的分离自不同实验组的脾、MLN或PLN的 CD8+T细胞、CD4+T细胞和CD4+CD25-T细胞群一起共培养，所述培 养中存在2×104个来自WT Balb/c小鼠的已清除T细胞的脾细胞，所述脾 细胞经过辐射，并载有胰岛素或肽。在37℃5％CO2加湿培养箱中72小 时之后，通过加入1μCi/孔的[3H]-胸苷来评估增殖。16-18小时后在玻 璃纤维过滤器(Perkin Elmer，Boston，USA)上收集DNA结合的放射 性，在闪烁计数器(Perkin Elmer)上测定胸苷掺入。
体外细胞毒性测定
所使用的淋巴母细胞靶标是来自BALB/c小鼠的Con A活化的脾细 胞。在37℃下，用100μCi51Cr(Amersham International， Buckinghamshire，U.K)将106个靶细胞标记90分钟，洗涤三次，然后 在37℃下与1μg/ml肽(InsB15-23或无关肽)一起孵育1小时。洗涤靶 细胞两次，并以104个细胞/孔接种。以不同的效应子：靶标比例(E∶T) 将分离自脾、MLN或PLN的CD8+T细胞一式三份加入每个孔中。将 平板以500rpm离心2分钟，并在37℃孵育4小时。孵育后，收集上 清液以测定51Cr释放[裂解％＝100×(测试cpm-自发cpm)/(总cpm- 自发cpm)]。对于间接杀伤测定，在与效应子一起孵育前，先将CD8+ T细胞与5μg/ml抗CD3抗体(克隆145-2C11，Pharmingen)一起孵 育。
糖尿病的过继转移
对8-10周龄的NOD-SCID小鼠静脉注射2×107个或腹膜内注射 5×106个分离自糖尿病雌性NOD小鼠(6周、12周和18周)的脾细胞， 所述脾细胞与分离自不同实验乳酸乳球菌治疗组的分级数量的珠纯化 CD3+T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、CD4+CD25-T细胞或 CD4+CD25+T细胞组合，或者不进行组合。使用未治疗小鼠作为对照。糖 尿病的发生通过每周三次连续监测血糖水平来确定。
实施例F1：LL-IL10在非肥胖糖尿病小鼠中显著增强LL-hpIIp、 LL-胰岛素、LL-InsB9-23的耐受诱导能力。
为了研究经口耐受的诱导，如上所述(实验性情况)经口喂饲小鼠。 LL-IL10的添加显著增强对自身抗原的耐受诱导，因为相比于对照和 LL-hpIIp/胰岛素/InsB9-23组，在LL-hpIIp/胰岛素/InsB9-23+LL-mIL-10 组中脾细胞的自身抗原特异性的增殖应答显著降低。
实施例F2：LL-IL10加强经口耐受与胰岛炎减少、β细胞破坏率降 低和脾细胞的IL-10产生提高相关。
为了研究经口耐受的诱导，如上所述(实验性情况)经口喂饲小鼠。如上 所述测定应答于所述自身抗原的胰岛炎存在情况、β细胞破坏率和细胞因 子产生。组织学分析显示，相比于对照和LL-hpIIp/胰岛素/InsB9-23组， 在LL-hpIIp/胰岛素/InsB9-23+LL-mIL-10组中胰岛炎和β细胞破坏的水 平显著降低，IL-10产生提高。
实施例F3：LL-IL10通过CD4+T细胞增强经口耐受。
为了评估CD4+T细胞是否介导经口耐受的诱导，在脾细胞和淋巴结中研 究了自身抗原特异性的增殖性CD4T细胞应答。因此，如上所述(实验性 情况)经口喂饲小鼠，接着如所述(体外增殖测定)测定所述自身抗原特 异性的CD4+T细胞增殖。相比于对照和LL-hpIIp/胰岛素/InsB9-23组， 在LL-hpIIp/胰岛素/InsB9-23+LL-mIL-10组中，自身抗原特异性的CD4T 细胞应答显著降低。
实施例F4：相比LL-IL10，IL-10在加强经口耐受上有效性较低
为了评估LL-IL10是否与IL10一样有效，如上所述(实验性情况)经 口喂饲小鼠。在脾细胞和淋巴结中研究自身抗原特异性的增殖性CD4T细 胞应答。相比于LL-hpIIp/胰岛素/InsB9-23+IL-10组，在LL-hpIIp/胰岛 素/InsB9-23+LL-mIL-10组中，自身抗原特异性的CD4T细胞应答显著降 低。
实施例F5：LL-InsB15-23-LL-IL10组合治疗后NOD小鼠中的自 身攻击性CD8+应答被抑制
为了测试我们的组合方法是否诱导能通过旁观者机制调节糖尿病的抑制 性CD4+T细胞，我们分析了对自身攻击性CD8+T细胞的影响。组合治 疗后，抗原特异性自身攻击性CD8+细胞的百分比和/或活性显著降低。
实施例F6：LL-InsB15-23-LL-IL10组合治疗后抗原诱导的T调节 性细胞可在体内传递对糖尿病样应答的保护
为了测试在经口耐受方案处理的小鼠中对糖尿病样应答的主动抑制，我们 如上所述(糖尿病的继转移)过继转移来自不同治疗组的脾细胞。相比 于对照和LL-hpIIp/InsB9-23组，在LL-hpIIp/InsB9-23+LL-mIL-10组中 糖尿病样应答显著降低，表明在我们的组合经口耐受方案中调节性 CD4+T细胞的活化。
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序列表
<110>阿克托杰尼斯有限公司
<120>诱导对抗原的粘膜耐受
<130>PRO/DC/V225
<150>EP 05111467.6
<151>2005-11-29
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<170>PatentIn version 3.3
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<213>小麦
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<213>小麦
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1 5 10 15
Gln Ala
我们已证实，与仅使用抗原或产生IL-10的乳酸乳球菌(L.lactis) 的单一疗法相比或者与使用与经口施用游离IL-10组合的抗原相比，本 发明可诱导经口耐受的效力高得多。抗原特异性调节性T细胞的体内活 化显著增强。这些细胞将免疫显性耐受(dominant tolerance)传递给 免疫活性受者，并介导均匀的局外抑制。本发明的效力在自身免疫病和 变应性疾病小鼠模型中以及治疗剂的免疫失活的方面中得到了证明。
发明详述
在本公开内容的全文中，通过加注的引用参考了多个出版物、专利 以及已公开的专利说明书。这些出版物、专利以及公开的专利说明书的 公开内容通过参考并入本文，以更加完整的描述本发明所属领域的状 态。
A.普通技术
除非另外指明，本发明的实施将利用有机化学、药学、分子生物学 (包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，它们 在本领域的技术范围内。这些技术在以下文献中有完整描述，例如： 《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》第二版(Sambrook等，1989)； 《Oligonucleotide Synthesis》(M.J.Gait编辑，1984)；《Animal Cell Culture》(R.I.Freshney编辑，1987)；《Methods in Enzymology》丛书 (Academic Press，Inc.)；《Handbook of Experimental Immunology》(D. M.Weir&C.C.Blackwell编辑)；《Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells》(J.M.Miller&M.P.Calos编辑，1987)；《Current Protocols in Molecular Biology》(F.M.Ausubel等编辑，1987和期刊)《Polymerase Chain Reaction》(Mullis等编辑，1994)以及《Current Protocols in Immunology》(J.E.Coligan等编辑，1991)。
B.定义
本文使用的一些术语可具有以下定义。如说明书和权利要求中所使 用的，单数形式包括复数形式，除非上下文中另有明确指明。例如术语 “细胞”包括多个细胞，包括其混合物。类似的，如本文所述将“化合物” 用于治疗或药物制备还涵盖将一种或多种本发明化合物用于这样的治 疗或制备，除非上下文另有明确指明。
本文所使用的术语“包含”或“包括”意为组合物和方法包括所提及 的要素，但并不排除其它要素。“基本由......组成”在用于定义组合物和 方法时，意为排除任何对所述组合物具有重要意义的其他要素。因此， 如本文所定义的基本由要素组成的组合物不排除来自分离和纯化方法 的痕量污染物以及可药用载体，例如磷酸缓冲盐水、防腐剂等。
“由......组成”意为排除多于痕量的其它成分要素以及用于施用本发 明组合物的重要方法步骤。
这些连接词中的每一个所定义的实施方案都在本发明的范围内。
本发明的第一个方面是用于诱导对抗原的免疫耐受的方法，其包括 组合进行粘膜递送所述抗原与粘膜递送产生免疫调节化合物的微生物。
优选地，本发明涉及将产生免疫调节化合物的微生物与抗原组合用 于制备用于粘膜递送以诱导免疫耐受的药物。
优选地，所述免疫耐受在动物中诱导。所述动物是哺乳动物，优选 选自小鼠、大鼠、猪、牛、绵羊、马和人。优选地，所述哺乳动物是人。
优选地，所述免疫耐受是粘膜耐受。
本文使用的粘膜可以是任何粘膜，例如口粘膜、直肠粘膜、尿道粘 膜、阴道粘膜、眼粘膜、颊粘膜、肺粘膜以及鼻粘膜。本申请全文中使 用的粘膜递送包括递送至所述粘膜。口粘膜递送包括颊、舌下和牙龈递 送途径。因此，本发明涉及其中所述粘膜递送选自以下的方法：直肠递 送、颊递送、肺递送、眼睛递送、鼻递送、阴道递送和经口递送。优选 地，所述粘膜递送是经口递送，所述耐受是经口耐受。
本申请全文中使用的粘膜耐受是动物(包括人)经粘膜途径接触抗 原之后所述动物中对所述抗原的特异性免疫应答性的抑制。优选地，所 述粘膜耐受是全身性耐受。后来的接触所述抗原可以是本领域技术人员 已知的每一种接触，例如通过胃肠外注射、通过粘膜递送、或者通过内 源产生(例如自身抗原的情况下)的接触。经口耐受是动物(包括人) 通过经口途径接触抗原之后所述动物中对所述抗原的特异性免疫应答 性的抑制。低剂量经口耐受是通过低剂量抗原诱导的经口耐受，其特征 为通过环磷酰胺敏感性调节性T细胞介导的主动免疫抑制，所述T细 胞可对未活化宿主(host)传递耐受性。高剂量经口耐受是通过 高剂量抗原诱导的经口耐受，对环磷酰胺处理不敏感，并通过抗原特异 性T细胞的无反应性和/或清除继续诱导T细胞低应答性。可使用对环 磷酰胺敏感性的差异来区分低剂量和高剂量耐受(Strobel等，1983)。 优选地，所述经口耐受是如Mayer和Shao(2004b)所述的低剂量经口 耐受。
因此，本发明涉及本文所述的方法或用途，其中所述对免疫耐受的 诱导是所述诱导之前的至少1.5倍、优选2倍、更优选3倍或更多。或 者，所述抗原相对于所述诱导之前耐受至少1.5倍、2倍、3倍或更多。 所述对免疫耐受的诱导可通过本领域已知的方法测量。优选地，所述对 免疫耐受的诱导可通过调节所述动物中细胞因子水平来测量。这样，所 述调节可以是细胞因子水平的提高，例如所述细胞因子水平的提高为所 述诱导之前的至少1.5倍、2倍、3倍或更多。或者，所述调节可以是具 体细胞因子水平的下降，例如所述细胞因子水平的下降为所述诱导之前 的至少1.5倍、2倍、3倍或更多。所述细胞因子可选自任何相关细胞因 子，优选地，所述细胞因子选自IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α、 IFN-γ、IFN-α、MCP-1、TGFβ、RANK-L和Flt3L。
抗原可以是本领域技术人员已知的任何抗原。本申请全文中使用的抗 原优选是在引入动物身体时激发免疫应答的任何物质，其中所述免疫应答 可以是T细胞介导的和/或B细胞介导的应答。T细胞介导的应答包括Th1 和/或Th2应答。所述抗原可以是任何抗原，例如但不仅限于变应原(包括 食物变应原)、同种抗原、自体抗原(self antigen)、自身抗原(auto-antigen) 以及诱导免疫应答的治疗性分子或抗原。优选地，所述抗原参与诱导免疫 应答相关疾病。甚至更优选地，所述抗原参与诱导变应性哮喘、多发性硬 化、I型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫 性重症肌无力、类风湿性关节炎、食物变态反应、乳糜泻或者移植物抗宿 主病。
本文使用的免疫应答相关疾病是由身体对抗原不想要的免疫应答造成 的疾病，其中所述抗原可以是异源抗原或自身抗原。免疫应答相关疾病包 括但不仅限于变应性反应(包括食物变态反应)、乳糜泻、变应性哮喘、 自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性重症肌无力、类 风湿性关节炎、I型糖尿病和多发性硬化。免疫应答相关疾病还包括不想 要的免疫反应，例如移植物抗宿主病，或者药物的免疫活化，例如针对非 内源性因子VIII的抗体产生。优选地，所述疾病选自变应性哮喘、食物变 态反应、乳糜泻、I型糖尿病和治疗剂的免疫失活。因此应该理解，免疫 应答相关疾病包括但不仅限于变应性反应(包括食物变态反应)、乳糜泻、 变应性哮喘、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性重 症肌无力、类风湿性关节炎、I型糖尿病和多发性硬化。免疫应答相关疾 病还包括不想要的免疫反应，例如移植物抗宿主病，或者药物的免疫活化， 例如针对非内源性因子VIII的抗体产生。优选地，所述疾病选自变应性哮 喘、食物变态反应、乳糜泻、移植物抗宿主病、I型糖尿病和治疗剂的免 疫失活。
在另一些实施方案中，通过抗原表达微生物来递送所述抗原。优选地， 通过分泌抗原或展示抗原的微生物来递送所述抗原。因此，本发明涉及本 文所述的方法，其中所述抗原展示在所述抗原表达微生物的表面，或者其 中所述抗原被表达。可通过相同微生物或者不同微生物递送所述免疫调节 化合物和所述抗原。
综上所述，应该理解，本发明涉及本文所述的方法或用途，其中所述 方法或用途是治疗性和/或预防性的。
化合物指任何化学或生物学的化合物或复合物，包括简单或复杂的有 机和无机分子、肽、拟肽、蛋白质、蛋白质复合物、抗体、碳水化合物、 核酸或其衍生物。免疫调节化合物是改变免疫系统功能的化合物。本文使 用的免疫调节化合物是诱导耐受的化合物；作为非限制性实例，耐受诱导 可以直接方式通过诱导调节性T细胞例如Treg、Tr1或Th3或者通过将 Th1/Th2平衡向Th1偏移来获得；或者可以间接方式通过活化未成熟树突 细胞成耐受性树突细胞和/或抑制诱导成熟树突细胞表达“共刺激”因子的 Th2免疫应答来获得。免疫调节和免疫抑制化合物是本领域技术人员已知 的，包括但不仅限于细菌代谢物例如精胍菌素、真菌和链霉菌代谢物例如 他克莫司或环孢素、免疫抑制细胞因子例如IL-4、IL-10、IFNα、TGFβ (作为调节性T细胞的选择性佐剂)、Flt3L、TSLP和Rank-L(作为选择 性致耐受DC诱导物)、抗体和/或拮抗剂(例如抗CD40L、抗CD25、抗 CD20、抗IgE、抗CD3)和蛋白质、肽或融合蛋白(例如CTL-4Ig或CTLA-4 激动剂融合蛋白)。
因此，所述免疫调节化合物可以是本领域技术人员已知的任何免疫调 节化合物。优选地，所述免疫调节化合物是免疫抑制化合物，甚至更优选 地，所述化合物是免疫抑制细胞因子或抗体。优选地，所述免疫抑制细胞 因子是耐受增强细胞因子或抗体。免疫抑制细胞因子是本领域技术人员已 知的，包括但不仅限于IL-4、IL-10、IFN-α和TGFβ(作为调节性T细胞 的选择性佐剂)和Flt3L、TSLP和Rank-L(作为选择性致耐受DC诱导 物)。优选地，所述免疫抑制细胞因子选自IL-4、IL-10、IFN-α和Flt3L。 本领域技术人员应理解，本发明还涉及其功能同系物。功能同系物指具有 基本相同或类似功能(至少对于意图目的)但是结构上可以不同的分子。 最优选地，所述免疫抑制耐受增强细胞因子是IL-10，或者其功能同系物。 优选地，所述免疫抑制抗体选自抗IL-2、抗IL12、抗IL6和抗IFN-γ。
本文所使用的递送是指本领域技术人员已知的任何递送方法，包括但 不限于待递送化合物的包衣或无包衣药物制剂、胶囊、脂质体、油体、包 含或带有待递送化合物的聚合物颗粒，或者分泌、展示或积累待递送化合 物的微生物，任选地存在可增强粘膜递送和/或粘膜摄入的化合物。
本文所述化合物或组合物可以以纯化形式施用、与其它活性成分组合 或者与可药用无毒赋形剂或载体组合。经口组合物一般包含惰性稀释载体 或者可食用载体。药用相容性粘合剂和/或佐剂材料可作为一部分包含在所 述组合物中。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有任何以下成分或性质类 似的化合物：粘合剂例如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂例如淀粉或 乳糖，分散剂例如褐藻酸、羧甲基淀粉钠(Primogel)或玉米淀粉；润滑 剂例如硬脂酸镁；助流剂例如胶体二氧化硅；甜味剂例如蔗糖或糖精；或 者芳香剂例如薄荷、水杨酸甲酯或者橙味剂。当所述剂量单位形式是胶囊 剂时，除上述材料类型外它还可含有液体载体例如脂肪油。另外，剂量单 位形式可含有多种改变所述剂量单位物理形式的其它材料，例如糖包衣、 紫胶或肠溶剂(enteric agent)。另外，除了活性化合物之外，糖浆可含有 蔗糖作为甜味剂以及某些防腐剂、染料、着色剂以及芳香剂。应理解，可 药用载体的形式和特征由与它组合的活性成分的量、给药途径以及其它熟 知的变量来决定。所述载体必须是“可接受的”，即与所述制剂的其它成分 相容，并对受试者没有毒性。
用于施用的替代制剂包括无菌的水性或非水性溶液剂、混悬剂和乳剂。 非水性溶剂的实例是二甲亚砜、醇、丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄 榄油)以及注射用有机酯(例如油酸乙酯)。水性载体包括醇与水的混合 物、经缓冲的介质以及盐水。静脉内载体包括流体和养分补充剂、电解质 补充剂，例如基于林格氏葡萄糖(Ringer’s dextrose)的载体等。还可存在 防腐剂及其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。 多种液体制剂均有可能用于这些递送方法，包括盐水、醇、DMSO以及基 于水的溶液。
优选地，所述免疫抑制细胞因子以低量表达，优选地，在小鼠实验情 况中为所施用的每剂细菌中0.1μg或更少，在人体疾病的情况中这些用 量要作相应转换。我们已证明，与仅使用抗原或产生IL-10的微生物如 乳酸乳球菌的单一疗法相比，或者与使用与经口施用游离IL-10组合的 抗原相比，本发明能以高得多的效力诱导经口耐受。抗原特异性调节性 T细胞的体内活化得到极大增强。这些细胞将显性耐受传递给免疫活性 受者，并介导均匀的局外抑制。本发明的效力在自身免疫病和变应性疾 病小鼠模型中以及治疗剂免疫失活的情况中得到了证明。
本文所使用的术语“治疗”等包括改善或消除已发生的精神疾病或 病症(已建立后)，或者缓解这些疾病或病症的特征性症状。本文所使 用的这些术语还包含(取决于患者的状态)预防疾病或病症或者其相关 症状的发生，包括在患所述疾病或病症之前降低疾病或病症或其相关的 症状的严重程度。这些在患病之前的预防或降低指对不在患该疾病或病 症的给药时间的患者施用本发明的化合物或组合物。“预防”也包括阻止 疾病或病症或其相关症状的再发，或者其复发预防，例如在改善期之后。 应该明确，精神病症可以是身体不适的原因。在这一方面，术语“治疗” 还包括预防身体疾病或病症，或者改善或消除已发生的身体疾病或病症 (已建立后)，或者缓解这些病症的特征性症状。
本文所使用的术语“药剂”还包含术语“药物”、“治疗剂”、“剂”或在 医学领域用于表示具有治疗或预防效果的制剂的其他术语。
应理解，本发明的化合物(即抗原和免疫调节分子)以治疗有效量 递送或表达。本文所使用的术语“治疗有效量”意为当根据期望的治疗方 案施用时，将引发期望的治疗或预防效果或应答的本发明化合物或组合 物的量。优选地，所述化合物或组合物以单位剂型提供，例如片剂、胶 囊剂或者计量气雾剂剂量，从而将单剂量施用于受试者，例如患者。
在某些时候，本申请中所使用的与......组合或组合进行意为在所述 粘膜水平上同时存在抗原和免疫调节化合物。它不意味着抗原和免疫调 节化合物总是必须同时都在粘膜水平上存在。因此，所述方法包括同时 施用抗原和产生免疫调节化合物的微生物，以及依次施用抗原和产生免 疫调节化合物的微生物，或其任意组合。
在另一个实施方案中，所述抗原与所述产生免疫调节化合物的微生 物同时递送或者依次递送。
一个优选实施方案是同时施用抗原和产生免疫调节化合物的微生 物。在此情况下，抗原和产生免疫调节化合物的微生物可包含在相同的 药物制剂中，或者在一起使用的多于一个药物制剂中。一个优选实施方 案是通过同时产生所述抗原和所述免疫调节化合物的微生物来递送。
当抗原和表达免疫调节化合物的微生物或者同时包含这两种要素 的组合物同时施用时，所述化合物或者活性成分可存在于单一药物组合 物或制剂中。
或者，所述化合物或活性成分在分开的药物组合物或制剂中施用， 用于同时或分开应用。因此，本发明还涉及包含本发明抗原和表达免疫 调节分子的微生物的药物组合物，还涉及这些药物组合物的用途。
在依次施用的情况下，可首先施用抗原或者产生免疫调节组合物的 微生物。在依次施用的情况下，施用之间相隔的时间或者抗原与产生免 疫调节组合物的微生物之间的时间优选不长于3个小时，更优选不长于 2个小时，最优选不长于1个小时。
所述活性成分可每天施用1至6次，足以显示出期望活性。这些日 剂量可以单剂量每天给予一次，或者可以以两个或多个较小剂量在每天 中相同或不同的时间给予，总共给予特定的日剂量。优选地，所述活性 成分每天施用一次或两次。还考虑了两种活性成分在相同时间或者非常 接近的时间施用。或者，一种化合物在早晨施用，另一种在这天的晚些 时候施用。或者在另一种情况下，一种化合物每天施用两次，另一种每 天施用一次，其时间在每天两次给药的其中一次时，或者是独立的。优 选地，两种化合物同时施用，并作为混合物施用。在一个实施方案中， 第二种化合物与所述第一种化合物同时、分别或者依次施用。
在本发明的所有方面中，可在临床期望的时期内对所述患者给予每 日维持剂量，例如从一天至数年(例如所述哺乳动物的余生)；例如从 约(2或3或5天，1或2周，或1个月)向上和/或例如长达约(5年、 1年、6个月、1个月、1周，或者3或5天)。典型的是施用每日维持 剂量约3至约5天，或者约1周至约1年。所述液体制剂的其它组分可 包括防腐剂、无机盐、酸、碱、缓冲剂、营养物、维生素或者其它药物。
分泌免疫调节化合物和/或抗原的微生物可以以至少每天104菌落形 成单位(colony forming unit，cfu)至1012cfu的剂量递送，优选为每天 106cfu至1012cfu，最优选为每天109cfu至1012cfu。根据Steidler等 (Science 2000)描述的方法，例如109cfu分泌的免疫调节化合物为至 少1ng至100ng。通过本领域技术人员已知的ELISA，例如109cfu分 泌的免疫调节化合物是至少1ng至100ng；本领域技术人员可计算对 于任何其它cfu剂量的免疫调节化合物和/或抗原分泌范围。
抗原可以以诱导低剂量应答的剂量递送。优选地，所述抗原以至少 每天10fg至100μg、优选每天1pg至100μg、最优选每天1ng至100 μg的剂量递送。
本发明的免疫调节化合物可以以至少每天10fg至100μg、优选每 天1pg至100μg、最优选每天1ng至100μg的剂量递送。
优选地，所述化合物或组合物以单位剂型提供，例如片剂、溶液剂、 胶囊剂或计量气雾剂剂量，从而对受试者(例如患者)施用单剂量。
根据给药模式(例如经口或任何上文描述的模式)，本领域技术人 员知道如何确定或计算施用于患者的实际剂量。本领域技术人员会了解 根据患者、微生物、载体等对剂量进行调整。
本发明的化合物还可采取可药用盐、水化物、溶剂化物或代谢物的 形式。可药用盐包括无机和有机酸的碱盐，所述酸包括但不仅限于盐酸、 氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、 苹果酸、乙酸、草酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、延胡索酸、琥珀酸、马 来酸、水杨酸、苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸等等。当本发明化合物包含酸 性功能时(例如羧基)，那么所述羧基的合适的可药用阳离子对是本领 域技术人员公知的，包括碱、碱土、铵、季铵阳离子等等。
所述微生物可以是任何适于粘膜递送的微生物，包括细菌、酵母或 真菌。优选的，所述微生物是非病原性微生物，甚至更优选所述微生物 是益生微生物。益生生物是本领域技术人员已知的。益生生物包括但不 限于细菌例如乳杆菌(Lactobacillus sp.)、乳球菌(Lactococcus sp.)、 双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)以及酵母例如酿酒酵母布拉亚种 (Saccharomyces cerevisiae subspecies boulardii)。优选地，所述细菌是 乳酸菌；甚至更优选地，所述乳酸菌选自乳杆菌属(Lactobacillus)、明 串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、乳球菌属 (Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、气球菌属(Aerococcus)、 肉杆菌属(Carnobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、酒球菌属 (Oenococcus)、四联球菌属(Teragenococcus)、漫游球菌属 (Vagococcus)和魏斯氏菌属(Weisella)。在一个更优选的实施方案中， 所述微生物是乳酸乳球菌(Lactococcuslαctis)。在另一个优选实施方案 中，所述微生物是酿酒酵母。
在一个优选实施方案中，所述免疫抑制细胞因子与针对免疫诱导细胞 因子的拮抗抗体(抗IL-2、抗IL-12和/或抗IFNγ)和共刺激分子(例如 抗CD40L和抗CD3)组合。或者，可递送刺激产生所述免疫抑制细胞因 子的化合物，例如霍乱毒素B亚基；以及刺激调节性T细胞功能的分子， 例如ICOS和CTLA-4激动剂。如上所述，所述微生物优选为非病原性微 生物，更优选是益生微生物。益生生物是本领域技术人员已知的，包括但 不限于细菌例如乳杆菌、乳球菌、双歧杆菌，以及酵母例如酿酒酵母布拉 亚种。在一个优选实施方案中，所述微生物是乳酸乳球菌。在另一个优选 实施方案中，所述微生物是酿酒酵母。最优选地，所述益生微生物是乳酸 菌，因为已经描述了通过乳酸菌将异源蛋白质(即非乳酸菌蛋白质)递送 进粘膜，包括经口递送和阴道递送(Steidler和Rottiers，2006；Liu等， 2006)，这使得这些乳酸菌对于抗原和免疫抑制化合物的递送都非常适合。
本发明的另一个方面是将产生免疫调节化合物的微生物与抗原组合用 于制备治疗免疫应答相关疾病的药物的用途。优选地，所述免疫调节化合 物是免疫抑制细胞因子。优选地，所述抗原通过分泌抗原的微生物递送。 所述免疫调节化合物和所述抗原可通过相同的微生物递送，或者可以是不 同的微生物。优选地，所述免疫抑制细胞因子是抑制免疫、增强耐受的细 胞因子。抑制免疫、增强耐受的细胞因子是本领域技术人员已知的，包括 但不限于IL-4、IL-10、IFNα和TGFβ、Flt3L和Rank-L。优选地，所述 免疫抑制细胞因子选自IL-4、IL-10、IFNα和Flt3L。最优选地，所述免 疫抑制细胞因子是IL-10或其功能同系物。在一个优选实施方案中，所述 免疫抑制细胞因子与针对免疫诱导细胞因子的拮抗抗体(例如抗IL-2、抗 IL-12和/或抗IFNγ)以及共刺激分子(例如抗CD40L和抗CD3)组合。 优选地，所述免疫抑制细胞因子以低量表达，优选在小鼠实验性情况中为 0.1μg或更低，在人疾病的情况下这些量需要转换。
应理解，本发明的化合物和组合物可用作营养品、功能性食品或医 用食品，或者作为所述营养品、功能性食品或医用食品的添加剂。另一 个实施方案提供了食品或饮料，优选适于人类消费，其由营养品和调味 剂组成，其中所述营养品由农产品提取物组成。
营养品(无论是液体提取物还是干燥组合物的形式)都是可食用的， 并且可直接被人食用，但是优选以添加剂或营养补充剂的形式(例如在 健康食品店销售的那种片剂)或者作为可食用固体中的成分对人类提 供，更优选地以加工食品(例如谷类、面包、豆腐、曲奇、冰淇淋、蛋 糕、薯片、手卷面包(pretzel)、奶酪等)和可饮用液体(例如饮料， 如奶、苏打水、运动饮料和果汁)中的成分提供。因此，在一个实施方 案中，提供了通过将食品或饮料与有效增强所述食品或饮料营养价值的 量的营养品混合，以提高所述食品或饮料的营养价值的方法。
另一个实施方案提供了提高食品或饮料营养价值的方法，包括将所 述食品或饮料与营养品混合，以产生营养提高的食品或饮料，其中所述 营养品以有效提高所述食品或饮料营养价值的量混合，其中所述营养品 由包含本发明抗原的来自农作物的提取物组成，并且其中所述营养提高 的食品或饮料可另外包含调味剂。优选的调味剂包括甜味剂，例如糖、 玉米糖浆、果糖、葡萄糖、麦芽葡萄糖(maltodextrose)、环已基氨基 磺酸盐、糖精、苯丙氨酸、木糖醇、山梨醇、麦芽糖醇和草本甜味剂例 如甜菊。
本文所述的营养品旨在由于人消费，因此获得它们的方法优选根据 良好生产规范(Good Manufacturing Practices，GMP)以及管理这些 方法的任何适用的政府法规来进行。特别优选的方法仅应用天然来源的 溶剂。本文所述营养品优选含有相对高水平的健康增强物质。营养品可 与另一种营养品混合以增加它们的健康增强效果。
与营养品相反，所谓的“医疗食品”并不意为被普通公众使用，而且 不在商店或超市提供。医疗食品不是包含在健康膳食中、用于降低疾病 风险的食品(例如降脂食品或低盐食品)，也不是减肥产品。医师在患 者有特殊营养需求时开出医疗食品的处方，以处理疾病或健康状况，并 且所述患者处于医师的持续关注下。标签必须清楚的指出所述产品用于 处理特定的疾病或病症。医疗食品的一个例子是营养多样化医疗食品， 其设计成为慢性炎性病症的患者提供靶向性营养支持。此产品的活性化 合物为例如一种或多种本文所描述的化合物。功能性食品可涵盖包含在 健康膳食中、用于降低疾病风险的食品，例如降脂食品或低盐食品，或 者减肥产品。因此，本发明还涉及包含根据本发明营养品的食品或饮料。
因此，本发明涉及将分泌免疫调节化合物的微生物与抗原组合用于 制备用于诱导免疫耐受或用于治疗免疫应答相关疾病的药物、医疗食品 或营养品中的用途。优选地，本发明涉及组合物在制备和/或生产用于 治疗、预防和/或缓解涉及免疫应答疾病的疾病或病症的药物、医疗食 品或营养品中的用途，其特征在于所述组合物至少包含分泌免疫调节化 合物的微生物以及抗原。
在另一个方面，本发明涉及至少分泌免疫调节化合物的微生物以及 抗原用于治疗、预防和/或缓解涉及免疫应答疾病的疾病或病症的用途。 因此，本发明还涉及用于在有此需要的动物中治疗免疫应答相关疾病的 方法，包括组合进行粘膜递送抗原与粘膜递送分泌免疫调节化合物的微 生物。
在又一个实施方案中，本发明涉及组合物，其包含分泌免疫调节化 合物的微生物与抗原的组合。优选地，所述组合物是药物组合物。优选 地，所述抗原是变应原、同种抗原、自体抗原或自身抗原。更优选地， 所述抗原参与诱导变应性哮喘、多发性硬化、I型糖尿病、自身免疫性 葡萄膜炎、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性重症肌无力、类风湿性关节 炎、食物变态反应或乳糜泻。在一个优选实施方案中，所述抗原是治疗性 抗原，优选抗CD3。优选地，本发明的抗原通过表达抗原的微生物递送。 在此情况下，所述抗原可展示在所述抗原表达微生物的表面，或者它可被 所述微生物分泌。优选地，所述组合物以喷雾剂、胶囊剂、气雾剂、锭剂、 大丸剂、片剂、囊剂、液体剂、混悬剂、乳剂或者糖锭剂存在，优选为单 位剂型，例如片剂、胶囊剂或者计量气雾剂剂量。优选地，本发明组合物 中的免疫调节化合物是免疫抑制化合物或抗体。在一个优选实施方案中， 所述免疫抑制化合物是耐受增强细胞因子或者耐受增强抗体，最优选地， 它选自IL-4、IL-10、IFN-α、Flt3L、TGFβ和RANK-L。在另一个优选实 施方案中，所述免疫抑制化合物是免疫抑制抗体，其选自抗IL-2、抗IL-12 和抗IFN-γ。在一个优选实施方案中，本发明组合物中分泌免疫调节化合 物的微生物是益生微生物。在另一个优选实施方案中，本发明组合物中分 泌免疫调节化合物的微生物是细菌或酵母，优选地，所述细菌是乳酸菌， 更优选它是选自以下的乳酸菌：乳杆菌、明串珠菌、片球菌、乳球菌、 链球菌、气球菌、肉杆菌、肠球菌、酒球菌、四联球菌、漫游球菌和魏 斯氏菌，最优选地，所述乳球菌是乳酸乳球菌。优选地，所述酵母是酿 酒酵母。优选地，本发明组合物中所述抗原和所述免疫调节化合物由同 一微生物表达。优选地，本发明组合物还包含佐剂、可药用载体和/或 赋形剂。优选地，本发明组合物还包含刺激产生免疫抑制细胞因子的化 合物，优选地，所述刺激产生免疫抑制细胞因子的化合物是霍乱毒素B 亚基。优选地，在本发明组合物中，所述抗原和/或所述分泌免疫调节 化合物的微生物以至少10fg至100mg的剂量存在。
在最后一个实施方案中，本发明涉及用于治疗、预防和/或缓解涉及 免疫应答相关疾病的疾病或病症的药物、营养品或医疗食品，其至少包 含分泌免疫调节化合物的微生物与抗原的组合。
本领域技术人员应理解，可对本发明的优选实施方案做出多种改变 和修饰，并且可以产生这样的改变和修饰而不脱离本发明的构思。因此， 所附权利要求旨在覆盖落入本发明实质构思和范围内的所有这些等同 变化。
另外，在本发明化合物的描述中所使用的所有术语均具有本领域熟 知的含义。
附图说明
图1.在对Balb/c小鼠经口喂饲GM乳酸乳球菌或卵白蛋白(OVA) 之后，腘窝及腹股沟淋巴结(PLN/ILN)中的增殖性免疫应答。在用弗 氏完全佐剂中的OVA皮下攻击小鼠(第0天)后11天测量OVA特异 性的增殖性应答。小鼠在第-46天至第-42天、第-39天至第-35天、第-32 天至第-28天、第-25天至第-21天、第-18天至第-14天、第-11天至第 -7天、第-4天至第-1天接受混合的乳酸乳球菌悬液。LL-pT：LL-pT1NX (载体对照)和LL-pT1NX的混合细菌悬液；LL-OVA：分泌卵白蛋白 的乳酸乳球菌菌株和LL-pT1NX的混合细菌悬液； LL-OVA+LL-mIL10：LL-OVA和分泌小鼠白介素-10的乳酸乳球菌菌 株的混合细菌悬液。阳性对照1在第-7天接受20mg OVA。阳性对照2 在乳酸乳球菌喂饲的同一天接受1μg OVA。所显示的结果是来自一组4 只小鼠的合并细胞的一式三份培养物的平均[3H]-胸苷掺入(±SD)，以 cpm计。
图2.对Balb/c小鼠经口喂饲GM乳酸乳球菌或OVA之后，MLN 和PLN/ILN中的细胞因子应答。评价对照小鼠和喂饲GM乳酸乳球菌 或OVA的小鼠中IL12p70(a)、TNF-α(b)、IFN-γ(c)、MCP-1(d)、 IL-10(e)和IL-6(f)的分泌。在体外用300μg/ml OVA再刺激之后， 使用小鼠炎症试剂盒，由CBA(BD Bioscience)测试MLN(A)和 PLN/ILN(B)细胞的细胞培养物上清液中细胞因子的存在情况。所显 示的结果是来自一组4只小鼠的合并细胞的细胞因子产生。
图3.对Balb/c小鼠经口喂饲GM乳酸乳球菌或OVA之后， PLN/ILN中OVA特异性的增殖性CD4+T细胞应答。在用弗氏完全佐 剂中的OVA皮下攻击小鼠(第0天)后11天测量OVA特异性的增殖 性应答。小鼠在第-46天至第-42天、第-39天至第-35天、第-32天至第 -28天、第-25天至第-21天、第-18天至第-14天、第-11天至第-7天、 第-4天至第-1天接受混合的乳酸乳球菌悬液。LL-pT：LL-pT1NX(载 体对照)和LL-pT1NX的混合细菌悬液；LL-OVA：分泌卵白蛋白的乳 酸乳球菌菌株和LL-pT1NX的混合细菌悬液；LL-OVA+LL-mIL10： LL-OVA和分泌小鼠白介素-10的乳酸乳球菌菌株的混合细菌悬液。阳 性对照1在第-7天接受20mg OVA。阳性对照2在乳酸乳球菌喂饲的同 一天接受1μg OVA。所显示的结果是来自一组4只小鼠的合并细胞的 一式三份培养物的平均[3H]-胸苷掺入(±SD)，以cpm计。
实施例
实施例A：在经口施用分泌卵白蛋白的乳酸乳球菌与原位递送IL-10 组合之后诱导对所述卵白蛋白的耐受。
该实施例的材料和方法
细菌和质粒
在本研究中始终使用乳酸乳球菌菌株MG1363。细菌培养于GM17 培养基中，即补充了0.5％葡萄糖的M17(Difco Laboratories，Detroit， MI)。所有菌株的保藏悬液均在-20℃下保存于GM17中的50％甘油中。 对于胃内接种，将保藏悬液在新鲜GM17中稀释500倍，在30℃孵育。 它们在16小时内达到每毫升2×109个菌落形成单位(CFU)的饱和浓 度。在此研究中始终使用混合细菌悬液。因此，通过离心收获必须混合 的细菌，将两种细菌培养物的沉淀均在BM9培养基中浓缩10倍 (Schotte，等，2000)。对于治疗，每只小鼠通过胃内导管接受100μl 此悬液。
编码原鸡(Gallus gallus)卵白蛋白的mRNA序列取自Genbank(登 录号AY223553)。从鸡子宫中分离总RNA，并使用25μl体积中的2μg 总RNA、2μM寡聚dT引物(Promega Corporation Benelux，Leiden， The Netherlands)、0.01mM DTT(Sigma-Aldrich，Zwijndrecht，The Netherlands)、0.5mM dNTP(Invitrogen，Merelbeke，Belgium)、20 U Rnasin(Promega Incorporation Benelux)和100U superscript II逆 转录酶(Invitrogen)合成cDNA。使用下列条件，通过聚合酶链式反 应(PCR)扩增OVA cDNA片段：94℃2分钟，然后是94℃45秒、62℃30 秒和72℃90秒的30个循环，使用下列正向和反向引物
5’-GGCTCCATCGGTGCAGCAAGCATGGAATT-3’和
5’-ACTAGTTAAGGGGAAACACATCTGCCAAAGAAGAGAA-3’。
将扩增的片段与红霉素抗性pT1NX载体中乳球菌P1启动子下游的 Usp45分泌信号融合。用携带OVA cDNA和IL-10的质粒转化的 MG1363菌株命名为分泌OVA的乳酸乳球菌(LL-OVA)以及LL-IL10。 乳酸乳球菌-pT1NX(含有空载体pT1NX的MG1363)作为对照 (LL-pT1NX)。
动物
7周龄的雌性Balb/c小鼠获得自Charles River Laboratories (Italy)。它们在SPF条件下饲养，以标准实验室饲料和自来水随意进 行饲养。该动物研究得到根特大学分子生物医学研究系伦理委员会的批 准。
经口耐受的诱导和评价
小鼠在第-46天至第-42天、第-39天至第-35天、第-32天至第-28 天、第-25天至第-21天、第-18天至第-14天、第-11天至第-7天、第-4 天至第-1天接受混合的乳酸乳球菌悬液。LL-pT：LL-pT1NX(载体对 照)和LL-pT1NX的混合细菌悬液；LL-OVA：分泌卵白蛋白的乳酸乳 球菌菌株和LL-pT1NX的混合细菌悬液；LL-OVA+LL-mIL10：LL-OVA 和分泌小鼠白介素-10的乳酸乳球菌菌株的混合细菌悬液。该研究中包 含经口耐受诱导的两个阳性对照。阳性对照1在第-7天接受100μl BM9 培养基中的20mg卵白蛋白。阳性对照2在乳酸乳球菌喂饲的同一天接 受100μl BM9培养基中的1μg卵白蛋白。小鼠通过导管胃内接受喂饲。 对照小鼠不进行经口处理。在第0天，用在含有100μg结核分枝杆菌(M. tuberculosis)H37RA(Difco)的完全弗氏佐剂中1∶1乳化的100μg OVA 皮下免疫小鼠。免疫11天后，收集肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node，MLN)和腘窝及腹股沟淋巴结(popliteal lymph node， PLN/inguinal lymph node，ILN)，评估所述细胞的OVA特异性增殖和 细胞因子产生。
体外OVA特异性境殖
制备引流腘窝及腹股沟淋巴结的单细胞悬液。对细胞进行计数，然 后单独或者与11、33、100或300μg/ml OVA一起以2×105个细胞重悬 于200μl含10％胎牛血清(FCS)、10U/ml青霉素、10μg/ml链霉素、2 mM L-glutamax、0.4mM丙酮酸钠的RPMI-1640(RPMI完全)中重 悬所述细胞。所述细胞在37℃下在5％CO2加湿的培养箱中的U形底 96孔组织培养板(Becton Dickinson)中培养90小时。通过在培养的最 后18个小时添加1μCi/孔的[3H]-胸苷来评估增殖。在玻璃纤维过滤器 (Perkin Elmer)上收集DNA结合的放射性，在闪烁计数器(Perkin Elmer)上测量胸苷掺入。
CD4纯化的T细胞在体外的OVA特异性增殖
使用CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)，从来自PLN/ILN 的全细胞制备物中纯化CD4+T细胞。将2×105个CD4+T细胞与作为 抗原呈递细胞载有OVA的丝裂霉素C处理脾细胞一起培养于200μl的 RPMI完全培养基中，CD4+T细胞与APC的比例为：1/3、1/1、1/0.3、 1/0.1和1/0。所述细胞在37℃下在5％CO2加湿的培养箱中的U形底 96孔组织培养板(Becton Dickinson)中培养90小时。通过在培养的最 后18个小时添加1μCi/孔的[3H]-胸苷来评估增殖。在玻璃纤维过滤器 (Perkin Elmer)上收集DNA结合的放射性，在闪烁计数器(Perkin Elmer)上测量胸苷掺入。
测量OVA特异性细胞因子产生
制备来自肠系膜淋巴结(MLN)和引流腘窝及腹股沟淋巴结的淋巴 结细胞，以2×106细胞/ml重悬，将100μl等分试样与300μg/ml OVA 一起在U型底96孔组织培养板中培养72小时。上清液保存于-20℃直 至使用小鼠炎症试剂盒(BD Bioscience)通过流式细胞珠测定来定量细 胞因子水平。
实施例A1：LL-IL10显著增强LL-Ova的耐受诱导能力。为了研究 经口耐受的诱导，在连续5天(在第-46天至第-42天、第-39天至第-35 天、第-32天至第-28天、第-25天至第-21天、第-18天至第-14天、第 -11天至第-7天以及第-4天至第-1天)中对小鼠经口饲喂GM乳酸乳球 菌[LL-pt：LL-pT1NX[全](＝载体对照)和LL-pT1NX的混合细菌悬液； LL-OVA：分泌OVA的乳酸乳球菌和LL-pT1NX的混合细菌悬液； LL-OVA+LL-mIL10：分泌OVA的乳酸乳球菌和分泌小鼠IL-10的乳酸 乳球菌的混合细菌悬液]6次，或者在第-7天饲喂20mg的OVA单剂量 [阳性对照1]，或者在乳酸乳球菌喂饲的同一天饲喂1μg OVA的多次剂 量[阳性对照2]。对照小鼠不进行经口处理。在第0天，用完全弗氏佐 剂中的OVA皮下免疫小鼠，在第11天评估PLN/ILN细胞的OVA特异 性增殖。LL-IL-10的加入显著增强了针对OVA的耐受诱导，因为 PLN/ILN细胞的OVA特异性增殖性应答(图1)在 LL-OVA[全]+LL-mIL-10组中比对照和LL-ova组显著降低。
实施例A2：LL-IL10加强经口耐受与应答于Ova的促炎症细胞因 子产生降低相关。
为了研究经口耐受的诱导，如上所述(实施例1)对小鼠经口喂饲GM 乳酸乳球菌或OVA，然后用弗氏完全佐剂中的OVA皮下免疫小鼠。免 疫11天后，使用小鼠炎症试剂盒通过流式细胞珠测定来定量MLN和 PLN/ILN中应答于OVA的细胞因子产生。在MLN中，与观察到这些 促炎症细胞因子强烈产生的LL-ova组相比，LL-ova+LL-mIL-10组中促 炎症细胞因子IL-12、TNF-α、IFN-γ和IL-6的产生检测不到，或者显著 降低(图2A)。在PLN中，与LL-ova组相比，LL-ova+LI-mIL-10组中 促炎症细胞因子TNF-α、IFN-γ、MCP-1和IL-6的产生显著降低，在此 组中，TNF-α、MCP-1和IL-6的水平低于对照组中所观察到的水平(图 2B)。
实施例A3：LL-IL10通过CD4+T细胞增强经口耐受。
为了评估经口耐受的诱导是否通过CD4+[全]T细胞介导，在MLN和 PLN/ILN中研究了OVA特异性的增殖性CD4T细胞应答。因此，在如 上所述的日子(实施例1)对小鼠经口喂饲GM乳酸乳球菌或OVA。在 第0天用弗氏完全佐剂中的OVA皮下免疫小鼠，11天后从MLN和 PLN/ILN中纯化CD4T细胞，然后在载有OVA的丝裂霉素C处理的 脾细胞存在下培养。相比于LL-ova组和对照组，在LL-ova+LL-mIL-10 组中OVA特异性CD4T细胞应答显著降低(图3)。
实施例B：在经口施用分泌凝血因子VIII和因子IX的乳酸乳球菌 与原位递送的IL-10组合之后诱导对所述因子的耐受。
引言
多种治疗性(重组)蛋白质，例如干扰素、因子VIII/IX和抗体 (Remicade)在长治疗时期中以高剂量施用。但是，与其应用相关的并 发症是发生蛋白质特异性免疫应答，例如抗体。这些抗体(Ab)(也称 为抑制剂)使得所述治疗性蛋白质有效性降低。实例包括形成以下物质 的抑制剂：血友病中的因子VIII/IX、接受慢性肾衰竭治疗的患者中的 促红细胞生成素(Epo)，以及接受多发性硬化治疗的患者中的IFN-β。 本文中，我们证明了经口递送因子VIII(以及因子IX)与产生IL-10 的乳酸乳球菌的组合通过诱导抗原特异性CD4+调节性T细胞而抑制了 所述因子抑制剂的生成。
该实施例的材料和方法
细菌和质粒
在本研究中始终使用乳酸乳球菌菌株MG1363。细菌培养于GM17 培养基中，即补充了0.5％葡萄糖的M17(Difco Laboratories，Detroit， MI)。所有菌株的保藏悬液均在-20℃下保存于GM17中的50％甘油中。 对于胃内接种，将保藏悬液在新鲜GM17中稀释200倍，在30℃孵育。 它们在16小时内达到每毫升2×109个菌落形成单位(CFU)的饱和浓 度。在此研究中始终使用混合细菌悬液。因此，通过离心收获必须混合 的细菌，将两种细菌培养物的沉淀均在BM9培养基中浓缩10倍(Schotte， Steidler等，2000)。对于治疗，每只小鼠通过胃内导管接受100μl此悬 液。
扩增人FVIII和FIX cDNA或cDNA片段(代表FVIII和FIX特异 性的CD4+T细胞表位)，与红霉素抗性pT1NX载体中乳球菌P1启动 子下游的Usp45分泌信号融合。
用携带小鼠IL-10、FVIII(和/或表位片段)、FIX(和/或表位片段) 的质粒转化的MG1363菌株命名为分泌IL10的乳酸乳球菌LL-IL10、 LL-FVIII、LL-FIX。LL-pT1NX(含有空载体pT1NX的MG1363)作 为对照。
FVIII和FIX的定量
使用前述(Chuah等，2003)的人FVIII和FIX特异性酶联免疫吸 附测定(ELISA)对来自LL-FVIII和LL-IX的FVIII或FIX进行测定。 还通过Western印迹分析以及COATest和aPTT测定对所述重组蛋白 进行分析，如(Chuah等，2003；VandenDriessche等，1999)所述。 通过自动化Edman降解来确定此蛋白质的NH2端。因为FVIII和FIX 在肝脏中正常表达，在其中它们经受了广泛的翻译后修饰，所以从改造 乳酸乳球菌中产生的所述凝血因子可能是无生物活性。但是，这些翻译 后差异可能对这些乳酸乳球菌产生的重组蛋白诱导免疫耐受的能力没 有影响。事实上，大多数迄今已详细表征的抑制剂通常识别氨基酸残基 (Villard等，2003)，而不是糖基化部分。
动物
在实验室中育种血友病A或B小鼠，所述小鼠通过在ES细胞中使用同 源重组敲除小鼠的FVIII或FIX基因来获得，如(Bi等，1995和Wang 等，1997)所述。当在CFA存在下使用纯化的重组FVIII或FIX抗原 攻击这些小鼠时，这些受者小鼠产生中和抗体(Mingozzi等，2003)。 可使用Bethesda测定或抗FVIII/抗FIX特异性ELISA随时间监测抑制 剂状态。用FVIII或FIX(+CFA)攻击的受者小鼠通常在抗原攻击后 2-3周后产生抑制剂。
实验情况
作为阴性对照、与LL-IL10或IL-10蛋白(1或10μg)组合或者不组 合地使4-6周龄小鼠接受LL-FVIII、LL-FIX或LL-pT1NX或LL-OVA (无关抗原)。作为耐受诱导的阳性对照，我们用由肝细胞特异性启动 子表达FIX的腺相关病毒载体(AAV)注射小鼠。受者动物产生FIX 特异性免疫耐受，其阻止其后的FIX+CFA攻击诱导抗FIX的抗体。
在预防性情况中，使用胃导管将LL-FVIII、LL-FIX单独或者与 LL-IL10或IL10一起对血友病A或B小鼠经口施用，其中使用不同的 治疗间隔和剂量。然后用纯化的重组FVIII或FIX抗原在CFA存在下 攻击这些受者小鼠(Mingozzi等，2003)。对照动物接触LL-pT1NX和 LL-OVA。通过眶后取血收集血浆。使用Bethesda测定(Kasper等， 1975)或者使用改良的抗FVIII或抗FIX特异性ELISA (VandenDriessche等，1999)以不同时间间隔评估抗FVIII或FIX抗 体的产生。
在治疗性情况中，首先用FVIII或FIX免疫血友病A或B小鼠， 如(Mingozzi等，2003)所述。可使用Bethesda测定或抗FVIII/抗FIX 特异性ELISA随时间监测抑制剂状态。然后，使用不同的处理间隔和 剂量，用单独或者与LL-IL10或IL10一起的LL-FVIII、LL-FIX对低 或高抑制剂效价的小鼠进行处理，并随时间测定抑制剂效价。通过用无 关抗原(破伤风毒素或Ova)攻击接受单独或与LL-IL10一起的 LL-FVIII、LL-FIX的小鼠来评估可能的免疫耐受的特异性。作为阳性 对照，小鼠经口接触纯化的FVIII或FIX。
细胞培养、增殖和细胞因子测定
通过使细胞穿过70μm细胞滤器(Becton/Dickinson Labware)来 制备脾和淋巴结的单细胞悬液。通过与红细胞裂解缓冲液孵育从脾细胞 悬液中除去红细胞。
总脾细胞群的增殖测定，将2×105个细胞培养在96孔U形底培养 板中，其中是总体积200μl的单独的或者带有纯化FVIII或FIX的完 全培养基，其带有或不带抗IL-10或抗TGF-β中和单克隆抗体。以1 至100μg/ml的浓度加入FVIII和FIX。以1、0.1和0.01μg/ml加入所 述中和抗体。对于CD4+T细胞和CD4+CD25-T细胞群的增殖测定，将 0.2×105个CD4+T细胞或CD4+CD25-T细胞与1×105个经辐射的CD4- 细胞(作为抗原呈递细胞)以及FVIII或FIX(0或100μg/ml)一起培 养于96孔U形底培养板中总体积200μl的带有或不带中和抗体的完全 培养基中。在37℃5％CO2加湿培养箱中72小时之后，通过加入1μCi/ 孔的[3H]-胸苷来评估增殖。16-18小时后在玻璃纤维过滤器(Perkin Elmer，Boston，USA)上收集DNA结合的放射性，在闪烁计数器(Perkin Elmer)上测定胸苷掺入。
对于细胞因子测量，在培养的第24、48和72小时收集用于不同增 殖测定的细胞培养物的上清液，冷冻于-20℃直至进行细胞因子测定。 使用小鼠炎症流式细胞珠测定(BD Biosciences，Mountain View，CA， USA)对细胞因子产生进行定量。
体内T调节活性测定
为了测试小鼠中对抗体形成的主动抑制，将分离自不同实验性乳酸 乳球菌治疗组的脾细胞、珠纯化的CD4+T细胞、CD4+CD25-T细胞或 CD4+CD25+T细胞过继转移(adoptively transfer)到幼稚C3H/HeJ小 鼠中。使用未处理小鼠作为对照。对于全脾细胞、去除亚群的脾细胞或 者正选择的CD4+T细胞和CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+T细胞，所 转移的细胞数是107。过继转移36小时后，受者小鼠(每个实验组n＝4-5) 皮下注射cFA中的5μg hF.IX。免疫后2.5周测量血浆中的抗hF.IX IgG 效价。
实施例BI：LL-IL10在血友病A或B小鼠中显著增强LL-FVIII 和LL-IX的耐受诱导能力。
为了研究经口耐受的诱导，如上所述(实验性情况)经口喂饲小鼠。 LL-IL10的添加显著增强了对FVIII和FIX的耐受诱导，因为相比于对 照和LL-FVIII/IX组，在LL-FVIII/FIX+LL-mIL-10组中脾细胞的因子 特异性增殖应答显著降低。
实施例B2：LL-IL10加强经口耐受与应答于所述因子的FVIII和FIX 特异性效价和IFN-γ降低以及更多的IL10和TGF-β产生相关。
为了研究经口耐受的诱导，如上所述(实验性情况)经口喂饲小鼠。 如上所述定量在脾细胞和淋巴结中应答于所述因子的FVIII和FIX特异性 抗体以及细胞因子产生。相比于对照和LL-FVIII/IX组，在 LL-FVIII/FIX+LL-mIL-10组中，抑制剂形成和促炎症细胞因子IFN-γ 的产生显著下降，免疫抑制细胞因子IL-10和TGF-β显著增加。
实施例B3：LL-IL10通过CD4+T细胞增强经口耐受。
为了评估CD4+T细胞是否介导经口耐受的诱导，在脾细胞和淋巴 结中研究了因子特异性的增殖性CD4+T细胞应答。因此，如上所述(实 验性情况)经口喂饲小鼠，如细胞培养、增殖和细胞因子测定中所述测 定因子特异性的CD4+T细胞增殖。相比于对照和LL-FVIII/IX组，在 LL-FVIII/FIX+LL-mIL-10组中，因子特异性的CD4T细胞应答显著降 低。
实施例B4：IL-10在加强经口耐受上的效力低于LL-IL10
为了评估LL-IL10是否与IL10一样有效，如上所述(实验性情况) 经口喂饲小鼠。在脾细胞和淋巴结中研究因子特异性的增殖性CD4T细胞 应答。相比于LL-FVIII/IX+IL-10组，在LL-FVIII/FIX+LL-mIL-10组 中，因子特异性的CD4T细胞应答显著降低。
实施例B5：LL-FVIII/FIX-LL-IL10组合治疗后抗原诱导的T调 节性细胞可在体内传递保护免于形成抑制剂
为了测试在经口耐受方案处理的小鼠中抗体形成的主动抑制，我们 如上所述(体内T调节活性测定)过继转移来自不同治疗组的脾细胞。相 比于对照和LL-FVIII/IX组，在LL-FVIII/FIX+LL-mIL-10组中，抗因 子IgG的形成显著降低，表明在我们的组合经口耐受方案中调节性 CD4+T细胞的活化。
实施例C：在经口施用分泌变应原(Der p 1)的乳酸乳球菌与原 位递送的IL-10的组合之后对所述变应原耐受的诱导
引言
变应性哮喘是气道的慢性炎性疾病。它的特征是可逆的呼吸道阻 塞、变应原特异性免疫球蛋白E的血清水平升高、粘液分泌过多以及对 支气管刺激的气道高应答性(airway hyperresponsiveness，AHR)。接 触患者已经致敏的变应原(例如树、草以及野草的花粉、灰尘和尘螨、 真菌、动物毛屑)使其症状恶化。2型T辅助(Th2)淋巴细胞在所述 疾病的起始、发展和持续中起重要作用。目前的数据表明，Th2对变应 原的应答通常被调节性T细胞抑制。另外，此亚群的抑制在变应性个体 中降低。本文中，我们证明经口递送变应原与产生IL-10的乳酸乳球菌 的组合通过诱导抗原特异性CD4+调节性T细胞抑制哮喘样应答。
该实施例的材料和方法
模拟人类疾病的两个变应性哮喘的小鼠模型是Ova变应原模型和 人源化SCID模型。
Ova变应原模型
用OVA气雾剂通过吸入攻击OVA致敏小鼠，导致Th2细胞因子 依赖型嗜酸性粒细胞增多性气道炎症、支气管高反应性以及IgE产生， 这些发现具有高度的人变应性哮喘特征(Brusselle，1994，Clin Exp Allergy 24：73；Kips等1996，Am J Respir Crit Care Med 153：535； Brusselle等1995，Am J Respir Cell Mol Biol 12：254)。
细菌
在本研究中始终使用乳酸乳球菌菌株MG1363。细菌培养于 GM17培养基中，即补充了0.5％葡萄糖的M17(Difco Laboratories， Detroit，MI)。所有菌株的保藏悬液均在-20℃下保存于GM17中的50％ 甘油中。对于胃内接种，将保藏悬液在新鲜GM17中稀释200倍，在 30℃孵育。它们在16小时内达到每毫升2×109个菌落形成单位(CFU) 的饱和浓度。通过离心收获细菌，并在BM9培养基中浓缩10倍。对于 治疗，每只小鼠通过胃内导管接受100μl此悬液。
质粒
编码原鸡(Gallus gallus)卵白蛋白的mRNA序列取自Genbank (登录号AY223553)。从鸡子宫中分离总RNA，并使用25μl体积中的 2μg总RNA、2μM寡聚dT引物(Promega Corporation Benelux， Leiden，The Netherlands)、0.01mM DTT(Sigma-Aldrich，Zwijndrecht， The Netherlands)、0.5mM dNTP(Invitrogen，Merelbeke，Belgium)、 20U Rnasin(Promega Incorporation Benelux)和100U superscript II 逆转录酶(Invitrogen)合成cDNA。使用下列条件，通过聚合酶链式 反应(PCR)扩增OVA cDNA片段：94℃2分钟，然后是94℃45秒、 62℃30秒和72℃90秒的30个循环，使用下列正向和反向引物
5’-GGCTCCATCGGTGCAGCAAGCATGGAATT-3’和
5’-ACTAGTTAAGGGGAAAC-ACATCTGCCAAAGAAGAGAA-3’。
将扩增的片段与红霉素抗性的pT1NX载体中乳球菌P1启动子下游的 Usp45分泌信号融合。
用携带小鼠IL-10和OVA cDNA的质粒转化的MG1363菌株命名 为LL-IL10和LL-OVA。LL-pT1NX(含有空载体pT1NX的MG1363) 作为对照。
OVA定量
使用自行开发的OVA特异性酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定 来自LL-OVA的OVA。还通过Western印迹分析评估所述重组蛋白的 产生。
OVA变应原模型
小鼠
BALB/c小鼠(6-8周龄)购自Charles River Laboratories(Calco， Italy)。在无特异性病原的条件下保持所述小鼠。
免疫小鼠
腹膜内注射2mg氢氧化铝(alum)中的2μg OVA(V级； Sigma-Aldrich)来免疫小鼠。10天间隔后重复这一免疫(在第0天和 第10天)。对照小鼠接受盐水注射而不是OVA/alum溶液。免疫后7天， 致敏小鼠吸入溶解于PBS的3％OVA雾化溶液10分钟。OVA吸入连续 进行3天(第18、19和20天)。对照小鼠在与实验组相同的条件下仅 吸入PBS。
诱导经口耐受
小鼠接受单独的或与IL-10(1或10μg)或LL-IL10组合的 LL-OVA、单独的LL-IL10、单独的IL-10(1或10μg)、LL-pT1NX或 水(无喂饲对照)。在预防性情况下，小鼠在第一次腹膜内免疫之前使 用2个不同的方案喂饲。喂饲方案1和2由4和6个循环的每日施用5 天所组成，分别间隔两天的非施用期。作为经口耐受诱导的阳性对照， 从第一次免疫前10天至2天每隔一天(总共5次喂饲)通过胃导管以 降低支气管嗜酸性粒细胞增多以及呼吸道过度反应性的1mg(低剂量) 或30mg(高剂量)的OVA喂饲小鼠，高剂量喂饲比低剂量喂饲更为 有效。
在治疗性情况下，用与预防性背景所述相同的乳酸乳球菌每天喂 饲小鼠，只是从第一次免疫开始时至免疫后8天。
作为经口耐受诱导的阳性对照，用30mg的OVA喂饲小鼠。
呼吸道高反应性(AHR)的测定
最终吸入(第21天)后第24小时，通过乙酰甲胆碱诱导的气流 阻塞来评估气道的高反应性。所述小鼠接触雾状生理盐水(Otsuka Pharmaceutical)2.5分钟，然后是递增剂量(1-30mg/ml)的雾状乙酰 甲胆碱。喷雾作用后，这些小鼠被置于全身体积描记器中2.5分钟，使 用Biosystem XA WBP系统(Buxco Electronics)测定增强的停顿 (enhanced pause，Penh)。“Penh”代表肺气流阻塞，用下式进行计算： Penh＝((Te-Tr)/(Tr×PEF/PIF))，其中Penh＝增强的停顿(无量纲)，Te＝ 呼气时间(秒)，Tr＝松弛时间(秒)，PEF＝峰值呼出气流(毫升/秒)， PIF＝峰值吸入气流(毫升/秒)。平均约每5秒测定Penh，对累计值求 平均数作为每个时间点的Penh值。气道高反应性表示为PC200Mch (200％刺激性浓度的乙酰甲胆碱)，乙酰甲胆碱的浓度是基线Penh值 的两倍。
分析支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)
在测量气道高反应性之后，获得支气管肺泡灌洗样品。通过腹膜 内注射100mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪来麻醉小鼠，然后用0.5 ml的盐水灌洗肺四次。离心灌洗液，将细胞重悬于含1％BSA的1ml 盐水中。使用血细胞计数器对总细胞数进行计数。通过在300rpm离心 所述悬液5分钟制备细胞离心样品(Cytospin sample)。为了清楚地区 分嗜酸性粒细胞与嗜中性粒细胞，应用了三种不同的染料：Diff-Quick， May-Grünwald-Giemsa和Hansel(伊红)染料。基于标准形态学标准， 通过光学显微镜区分出至少300个白细胞。按照生产商的说明，通过流 式细胞珠测定(BD Biosciences，Mountain View，CA，USA)来测定 BALF中IL-13、IL-4和IL-5的水平。
测量血清总IgE和OVA特异性Ig
在第21天，在麻醉情况下从后眶窦中获得血样。血样完全凝结后， 离心，收集血清保存于-80℃待用。根据生产商的说明，使用成对Ab(BD Pharmingen)通过ELISA测定总IgE。为了测量血清中的OVA特异性 IgE、IgG1和IgG2a，用2μg/ml OVA包被微量滴定板(Maxisorp，Nunc， VWR International，Haasrode，Belgium)。然后，用PBS中0.1％酪蛋 白封闭孔，之后将平板与含有0.1％酪蛋白和0.05％吐温20的PBS中 (PBS-CT)1∶10至1∶20480稀释的小鼠血清样品一起孵育，其中还含 有山羊抗小鼠IgG2a-HRP[Southern Biotechnology Associates(SBA)， Imtec ITK Diagnostics，Antwerpen，Belgium，1∶5000稀释]、山羊抗 小鼠IgG1-HRP或山羊抗小鼠IgE-HRP(SBA，1∶5000稀释)。洗涤 之后，将底物[3，3’，5，5’四甲基联苯胺(TMB)底物试剂，Pharmingen， Becton Dickinson，Erembodegem，Belgium]加到每个孔中。最后，通 过向孔中加入1M H2SO4来中止反应。在450nm读取吸光度。ELISA 结果以效价来表示，它是OD450仍高于计算截止值的最高稀释度的倒数。 截止值计算为5只非免疫小鼠的平均OD450加3倍SD。
肺组织的组织学检查
获得支气管肺泡灌流液样品之后，用生理盐水灌注肺，然后从小 鼠中摘除。将肺用中性缓冲的甲醛固定，并包埋在石蜡中。用H&E或 过碘酸-希夫(periodic acid-Schiff，PAS)染色切片(3μm厚)。用四 级得分(0，无炎症；1，轻微/轻度；2，中度；和3，重度)评价肺中 组织学变化，所述评分是基于以下所见的分布和强度：1)上皮脱落或 支气管上皮细胞核的波动，2)杯状细胞数量增加，3)炎症细胞从管浸 润到支气管和支气管周间质的粘膜和粘膜下区域，以及4)平滑肌细胞 层的肥大和增厚。
用于分析肺中细胞因子和趋化因子基因表达的RT-PCR
用生理盐水灌注后摘除肺，根据生产商的说明使用ISOGEN (Nippon Gene)提取总RNA。使用寡聚(dT)15引物(Promega)和 Superscript II RNase H-逆转录酶(Invitrogen Life Technologies)在42℃ 下将总RNA(10μg)逆转录2小时。为了保证每个样品中含有相同的 cDNA量，首先使用β-肌动蛋白特异性引物测定每个样品中的β-肌动蛋 白cDNA浓度。以合适的循环数扩增这些样品，以使PCR产物的量保 持在扩增曲线的线性部分。将PCR产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，通过 溴化乙锭染色显影。使用下列特异性引物组测定IL-13、嗜酸性粒细胞 活化趋化因子(eotaxin)、IL-10、IFN-γ和TGF-β的水平。
β-肌动蛋白的有义引物5’-ACGACATGGAGAAGATCTGG-3’，和
反义引物5’-TCGTAGATGGGCACAGTGTG-3’。
IL-13的有义引物5’-TCTTGCTTGCCTTGGTGGTCTCGC-3’，和
反义引物5’-GATGGCATTGCAATTGGAGATGTTG-3’。
嗜酸性粒细胞活化趋化因子的有义引物5’-GGGCAGTAACTTCCATCTGTCTCC-3’和
反义引物5’-CACTTCTTCTTGGGGTCAGC-3’。
IL-10的有义引物5’-TACCTGGTAGGAGTGATGCC-3’，和
反义引物5’-GCATAGAAGCATACATGATG-3’。
IFN-γ的有义引物5’-CATAGATGTGGAAGAAAAGA-3’，和
反义引物5’-TTGCTGAAGAAG GTAGTAAT-3’。
TGF-β的有义引物5’-CTTTAGGAAGGACCTGGGTT-3’，和
反义引物5’-CAGGAGCGCACAATCATGTT-3’。
细胞培养、增殖和细胞因子测定
在最终吸入(第21天)后一天，通过使细胞穿过70μm细胞滤 器(Becton/Dickinson Labware)来制备脾和淋巴结的单细胞悬液。通 过与红细胞裂解缓冲液孵育从脾细胞悬液中除去红细胞。分别使用 CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Germany)或CD4+CD25+ 调节性T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Germany)和MACS柱 (midiMACS；Miltenyi Biotec)富集CD4+T细胞和CD4+CD25-T细 胞。
大量脾细胞和LN细胞群的增殖测定，将2×105个细胞单独或与 纯化OVA一起，在96孔U形底培养板中总体积200μl的有或没有抗 IL-10或抗TGF-β中和单克隆抗体的完全培养基中进行培养。OVA以1 至100μg/ml的浓度加入。中和抗体以1、0.1和0.01μg/ml加入。对于 CD4+T细胞和CD4+CD25-T细胞群的增殖测定，将2×105个细胞的 CD4+T细胞或CD4+CD25-T细胞与载有1mg/ml OVA的经丝裂霉素处 理的脾细胞(作为抗原呈递细胞)一起，在96孔U形底培养板中总体 积200μl的有或没有中和抗体的完全培养基中培养16小时，CD4+T 细胞或CD4+CD25-T细胞/APC的比例是1/1、I/0.3、I/0.1、I/0.03、I/0。 在37℃5％CO2加湿培养箱中72小时之后，通过加入1μCi/孔的[3H]-胸 苷来评估增殖。18小时后在玻璃纤维过滤器(Perkin Elmer，Boston， USA)上收集DNA结合的放射性，在闪烁计数器(Perkin Elmer)上 测定胸苷掺入。
对于细胞因子测量，在培养的第24、48和72小时收集用于不同 增殖测定的细胞培养物上清液，冷冻于-80℃直至进行细胞因子测定。 使用小鼠炎症流式细胞珠测定(BD Biosciences，Mountain View，CA， USA)对细胞因子产生进行定量。
体内T调节活性测定
在最终吸入(第21天)后一天，在37℃下用0.1％胶原酶 (Sigma-Aldrich)消化所处理小鼠的脾20分钟。在一些实验中，制备 全脾细胞的单细胞悬液，并与Con A(2μg/ml；Sigma-Aldrich)一起培 养48小时。收集细胞，将107个细胞静脉内过继转移至幼稚BALB/c 小鼠。对于负选择，根据生产商的说明，使用生物素化的抗小鼠CD4、 CD8、CD11c、CD19和CD11b mAb(BD Pharmingen)的磁珠(MACS； Miltenyi Biotec)从全脾细胞中去除CD4+，CD8+，CD11c+，CD19+，或 CD11b+细胞。通过流式细胞术检测去除的效率(＞99％)。使用CD4+细胞 分离试剂盒纯化CD4+、CD4+CD25-细胞。按照生产商的说明使用调节 性T细胞分离试剂盒。使用流式细胞术检查正选择细胞的纯度。对于细 胞移植实验，恰在其第一次OVA/alum免疫之前或第二次免疫之后将细 胞从尾静脉转移进BALB/c小鼠。对于全脾细胞、去除亚群的脾细胞或 者正选择的CD4+细胞和CD4+CD25-细胞，所转移的细胞数是107。
在人源化SCID(hu-SCID)模型中(如Duez等，2000；Hammad等， 2000所述)
在此模型中，可研究对屋尘螨(house dust mite，HDM)变应原Der p1的变应性免疫应答。这种使用来自HDM变应性患者的PBMC腹膜内 注射重建、然后接触HDM气雾剂的hu-SCID小鼠产生人IgE、产生由活 化T细胞和DC组成的肺渗入物，并表现出应答于支气管收缩剂的AHR (Pestel等1994，J Immunol，153：3804；Duez等，Am J Respir Crit Care Med，vol 161，ppp 200-206，2000)。
细菌
在本研究中始终使用乳酸乳球菌菌株MG1363。细菌培养于 GM17培养基中，即补充了0.5％葡萄糖的M17(Difco Laboratories， Detroit，MI)。所有菌株的保藏悬液均在-20℃下保存于GM17中的50％ 甘油中。对于胃内接种，将保藏悬液在新鲜GM17中稀释200倍，在 30℃孵育。它们在16小时内达到每毫升2×109个菌落形成单位(CFU) 的饱和浓度。通过离心收获细菌，并在BM9培养基中浓缩10倍。对于 治疗，每只小鼠通过胃内导管接受100μl此悬液。
质粒
Der p 1(222个氨基酸残基的球形糖蛋白)是来自屋尘螨 (Dermatophagoides pteronyssinus)(Dpt)的一种主要变应原。合成具有 最佳乳酸乳球菌密码子使用的编码Der p 1蛋白的DNA序列，扩增并与 红霉素抗性pT1NX载体中乳球菌P1启动子下游的Usp45分泌信号融 合。用携带小鼠IL10、Der p 1、Der p 1氨基酸52-71和Der p 1氨基 酸117-133cDNA的质粒转化的MG1363菌株命名为LL-IL10、 LL-Derp1、LL-Derp1aa52-71和LL-Derp1aa117-133。LL-pT1NX(含 有空载体pT1NX的MG1363)作为对照。
Der p 1的定量
使用自行开发的Der p 1特异性酶联免疫吸附测定(ELISA)来 测定来自LL-Derp1的Der p 1。还通过Western印迹分析评估所述重组 蛋白的产生。
患者
血液收集自对屋尘螨敏感或不敏感的供体。变应性患者表现屋尘螨 致敏的通常特征。针对屋尘螨(Dpt)变应原(Stallergènes，Fresnes，France) 的皮肤点刺试验(直径≥10mm)为阳性，所有患者均具有血清特异性IgE 抗体。总IgE浓度大于150IU/ml(150-1600IU/ml)。测试健康供体作为 阴性对照(总IgE水平低于150IU/ml，并且它们对于常见吸入变应原的 皮肤点刺试验为阴性)。
人外周血单个核细胞制备物
离心(120×g，15分钟)获得富集血小板的血浆，将其弃去。然后 在RPMI 1640中稀释血细胞(Life Technologies，Paisley，Scotland)(体积/ 体积)，在Ficoll梯度(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上分层。离心(400×g， 30分钟)后，收集界面处的PBMC，转移前在无菌RPMI培养基中洗三 次。
小鼠
C.B.-17SCID小鼠(6-8周龄)保持在特定动物设施中的具有无菌垫 层的隔离装置中。通过ELISA定期检查SCID群体中小鼠血清免疫球蛋白 的缺乏。
外周血单个核细胞转移进SCID小鼠：PBMC hu-SCID小鼠
细胞转移时，SCID小鼠为6-8周龄。所述小鼠通过用23号针腹膜 内注射400μl RPMI中来自变应性患者或健康供体的10×106个单核细胞来 进行重建。在同一天，它们接受腹腔内注射2反应指标(index reactivity) [IR]单位的Dpt。细胞重建后四天，连续四天(第0天至第4天)使SCID 小鼠每天接触含100IR单位Dpt(100IR单位等同于Dpt提取物中所含 的约200μg蛋白质)变应原气雾剂。对照组不接触Dpt。气道应答测定前 一天(第35天和第60天)，使hu-SCID小鼠接触另一个100IR单位Dpt 溶液的气雾剂。
实验性情况
小鼠接受组合或未组合LL-IL10或IL-10蛋白(1或10μg)的改造 成表达Der p 1或无关抗原(OVA)(作为阴性对照)的乳酸乳球菌。 经改造的乳酸乳球菌使用胃导管经口施用给SCID小鼠，其中使用开始 于PBMC重建后一天不同的治疗间隔和剂量。通过测量人血清IgE抗 体、分析肺浸润、测量AHR以及分析BALF中的细胞群和细胞因子产 生来评估对经口耐受的诱导。另外，通过分析增殖性T细胞对Der p 1 的应答来评估对耐受的诱导。
气道应答(AHR)的评估
如Duez等2000所述，在第35天或第60天测量气道应答(表达为 造成肺阻力增加50％的卡巴胆碱激发剂量)。
人IgE测定
移植人细胞后数天，在醚麻醉的情况下从后眶窦对小鼠取血。通过 两位点免疫放射测定法(two-site immuno-radiometric method)使用两种 不同的ε链特异性小鼠mAb(Immunotech International，Luminy，France) 研究总人IgE。在一式两份的测定中至少使用20μl血清。所述方法的灵 敏度允许检测0.1IUiml(0.24ng/ml)。
通过ELISA定量针对Dpt变应原的特异性IgE Ab。简言之，在4℃ 下用0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中的Dpt变应原(pH9.6)过夜包被 塑料管(Maxisorb Startube，Nunc，Denmark)，在室温用0.1M PBS 中的1％BSA(pH 7.4)使所述塑料管饱和2小时。洗涤后，管在室温 下与含有BSA(1％)和吐温(0.01％)的PBS中稀释的Hu-SCID小鼠 血清孵育2小时，然后在4℃过夜。彻底洗涤之后，加入HRP标记的 抗人IgE Ab。洗涤之后，将底物[3，3’，5，5’四甲基联苯胺(TMB)底物 试剂，Pharmingen，Becton Dickinson，Erembodegem，Belgium]加到 每个孔中。最后，向孔中加入1M H2SO4中止反应。在450nm读取吸 光度值。
肺的组织学检测
在第35天切除肺，在多聚甲醛中固定，加工用于石蜡包埋。对石蜡 组织切片染色以检测人CD45+细胞，之后通过如Duez等2000所述的组织 学得分对小鼠肺切片上的人细胞进行定量。
分析支气管肺泡灌洗液(BALF)
如OVA变应原模型所述分析BALF。
细胞培养、增殖和细胞因子测定：
通过使细胞穿过70μm细胞滤器(Becton/Dickinson Labware) 制备脾的单细胞悬液。通过与红细胞裂解缓冲液孵育从脾细胞悬液中除 去红细胞。分别使用CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec， Germany)或人CD4+CD25+调节性T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec， Germany)和MACS柱(midiMACS；Miltenyi Biotec)富集CD4+T 细胞和CD4+CD25-T细胞。
大量脾细胞的增殖测定，将2×105个细胞单独或与纯化Der p 1一 起，在96孔U形底培养板中总体积200μl的有或没有抗IL-10或抗 TGF-β中和单克隆抗体的完全培养基中进行培养。Der p 1以1至100 μg/ml的浓度加入。中和抗体以1、0.1和0.01μg/ml加入。对于CD4+T 细胞和CD4+CD25-T细胞群的增殖测定，将2×105个细胞的CD4+T细 胞或CD4+CD25-T细胞与载有1mg/ml Der p 1的经丝裂霉素处理的人 PBMC一起，在96孔U形底培养板中总体积200μl的有或没有中和抗 体的完全培养基中培养16小时，CD4+T细胞或CD4+CD25-T细胞/APC 的比例是1/1、1/0.3、1/0.1、1/0.03、1/0。在37℃5％CO2加湿培养箱中 72小时之后，通过加入1μCi/孔的[3H]-胸苷来评估增殖。18小时后在玻 璃纤维过滤器(Perkin Elmer，Boston，USA)上收集DNA结合的放 射性，在闪烁计数器(Perkin Elmer)上测定胸苷掺入。
对于细胞因子测量，在培养的第24、48和72小时收集用于不同 增殖测定的细胞培养物上清液，冷冻于-80℃直至进行细胞因子测定。 使用小鼠炎症流式细胞珠测定(BD Biosciences，Mountain View，CA， USA)对细胞因子产生进行定量。
实施例C1：LL-IL10分别在OVA和哮喘的huSCID小鼠模型中 显著增强LL-OVA和LL-Der p 1的耐受诱导能力。
为了研究经口耐受的诱导，如上所述(实验性情况)经口喂饲小鼠。 LL-IL10的添加显著增强对OVA/Derp1的耐受诱导，因为相比于对照 和LL-OVA/Derp1组，在LL-OVA/Derp1+LL-mIL-10组中脾细胞的变 应原特异性的增殖应答显著降低。
实施例C2：LL-IL10加强经口耐受与应答于所述变应原的AHR、 嗜酸性粒细胞浸润、血清IgE水平的降低和IL-13、IL-4和IL-5细胞因子 的产生降低相关。
为了研究经口耐受的诱导，如上所述(实验性情况)经口喂饲小鼠。如上 所述测定应答于所述因子的AHR、嗜酸性粒细胞BALF浸润、IgE效价以 及细胞因子的产生。相比于对照和LL-OVA/Derp1组，在 LL-OVA/Derp1+LL-mIL-10组中，AHR、嗜酸性粒细胞BALF浸润、IgE 效价显著降低，并且IL-13、IL-4和IL-5显著减少。
实施例C3：LL-IL10通过CD4+T细胞增强经口耐受。
为了评估CD4+T细胞是否介导经口耐受的诱导，在脾细胞和淋巴结中研 究了变应原特异性的增殖性CD4T细胞应答。因此，如上所述(实验性情 况)经口喂饲小鼠，如细胞培养、增殖和细胞因子测定中所述测定所述 变应原特异性的CD4+T细胞增殖。相比于对照和LL-OVA/Derp1组，在 LL-OVA/Derp1+LL-mIL-10组中，所述变应原特异性的CD4T细胞应答 显著降低。
实施例C4：相比LL-IL10，IL-10在加强经口耐受上有效性较低
为了评估LL-IL10是否与IL10一样有效，如上所述(实验性情况)经 口喂饲小鼠。在脾细胞和淋巴结中研究变应原特异性的增殖性CD4T细胞 应答。相比于LL-OVA/Derp1+IL-10组，在LL-OVA/Derp1+LL-mIL-10 组中，变应原特异性的CD4T细胞应答显著降低。
实施例C5：LL-OVA-LL-IL10组合治疗后抗原诱导的T调节性细 胞可在体内传递对哮喘样应答的保护
为了测试在经口耐受方案处理的小鼠中对哮喘样应答的主动抑制，我们如 上所述(体内T调节活性测定)过继转移来自不同治疗组的脾细胞。相比 于对照和LL-OVA组，在LL-OVA+LL-mIL-10组中哮喘样应答显著降 低，表明在我们的组合经口耐受方案中的调节性CD4+T细胞的活化。
实施例D：在经口施用分泌α麦醇溶蛋白的乳酸乳球菌与原位递送 IL-10的组合后诱导对所述变应原的耐受
引言
乳糜泻也称为口炎性腹泻或者麸质敏感性肠病，是由于对含有麸质 的特定食用谷物的免疫应答而发生的一种慢性炎性疾病。乳糜泻是复杂的 多基因疾病，与编码人白细胞抗原变体HLA-DQ2或HLA-DQ8的基因密 切相关。乳糜泻的发病机制中最重要方面之一是1型T辅助细胞免疫应答 的活化。这在表达HLA-DQ2/DQ8分子的抗原呈递细胞将毒性免疫肽呈递 给CD4(+)T细胞时发生。两类麸质蛋白(麦醇溶蛋白和麦谷蛋白)都含有 结合DQ2和DQ8的肽。一般公认，免疫应答(例如麸质特异性T细胞产 生IFN-γ)触发乳糜泻患者小肠中粘膜的破坏。因此，在乳糜泻患者的肠 内活化有害的免疫T细胞应答看来是该疾病发生和发展的关键。
本文中，我们证明经口递送麦醇溶蛋白与产生IL-10的乳酸乳球菌 的组合通过诱导抗原特异性CD4+调节性T细胞而抑制麦醇溶蛋白特异性 免疫应答。
本实施例的材料和方法
细菌
在本研究中始终使用乳酸乳球菌菌株MG1363。细菌培养于 GM17培养基中，即补充了0.5％葡萄糖的M17(Difco Laboratories， Detroit，MI)。所有菌株的保藏悬液均在-20℃下保存于GM17中的50％ 甘油中。对于胃内接种，将保藏悬液在新鲜GM17中稀释200倍，在 30℃孵育。它们在16小时内达到每毫升2×109个菌落形成单位(CFU) 的饱和浓度。通过离心收获细菌，并在BM9培养基中浓缩10倍。对于 治疗，每只小鼠通过胃内导管接受100μl此悬液。
质粒
合成具有最佳乳酸乳球菌密码子使用的DNA序列，扩增并与红霉 素抗性的pT1NX载体中乳球菌P1启动子下游的Usp45分泌信号融合， 所述DNA序列编码α-麦醇溶蛋白(基于小麦(Triticum aestivum)的序列， AJ133612)、HLA-DQ8(对应于UniProtKB/TrEMBL登记号Q9M4L6的 203-220残基，序列QYPSGQGSFQPSQQNPQA)和HLA-DQ8脱酰胺基 形式(对应于UniProtKB/TrEMBL登记号Q9M4L6的203-220残基，序 列QYPSGEGSFQPSQENPQA)的麦醇溶蛋白。
使用带有小鼠IL-10、α-麦醇溶蛋白、HLA-DQ8和HLA-DQ8脱酰 胺基形式的MG1363质粒转化的菌株命名为LL-IL10、LL-HLA/DQ8、 LL-HLA/DQ8d。LL-pT1NX(含有空载体pT1NX的MG1363)作为对照。 HLA-DQ8和DQ8d的定量
使用自行开发的ELISA测定来自LL-HLA/DQ8、LL-HLA/DQ8d 的HLA-DQ8和HLA-DQ8d。还通过Western印迹分析评估重组蛋白的产 生。
小鼠
HLA-DQ8转基因小鼠(Senger等2003)在特定的无病原条件下采 取无麸质喂饲进行维持，在8-14周龄时使用。通过足垫内注射50μl CFA (Difco；BD)中的50μg粗制麸质(Sigma-Aldrich)来免疫小鼠。 诱导经口耐受
对于致耐受实验，使用不同的治疗间隔和剂量，在免疫之前和之后 施用LL-HLA/DQ8、单独的或与IL-10(1或10μg)或LL-IL10组合的 LL-HLA/DQ8d、单独的LL-IL10、单独的IL-10(1或10μg)、LL-pT1NX 或水(无喂饲对照)。作为经口耐受诱导的阳性对照，在免疫(第0天)前 第-7、-6、-5、-4天用保存溶液溶于水中的50mg剂量麦醇溶蛋白或重组α- 麦醇溶蛋白喂饲小鼠。
血清麦醇溶蛋白特异性Ig的测量
以10mg/ml将粗制麦醇溶蛋白(Sigma-Aldrich)重悬于甲醇，然 后以1μg/ml的浓度稀释到无水乙醇中。将100μl 1μg/ml的麦醇溶蛋白乙 醇溶液置于Immulon 2板的每个孔中(Fisher Scientific International Inc.)，然后使其在通风罩中干燥。接着在37℃下用4％BSA/PBS将板封闭 2小时。用1×PBS、0.05％吐温20洗涤板。将样品血清以1∶200、1∶400和 1∶800稀释到0.1％BSA/PBS中，37℃孵育1小时。检测抗体是生物素化 大鼠抗小鼠IgA(来自Accurate Chemical&Scientific Corp.)以及生物素 化抗小鼠IgG(来自Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)。酶缀 合物是链霉抗生物素蛋白-HRP，底物是TMB。
细胞培养、增殖和细胞因子测定
通过使细胞穿过70μm细胞滤器(Becton/Dickinson Labware) 制备脾和纵隔淋巴结的单细胞悬液。通过与红细胞裂解缓冲液孵育从脾 细胞悬液中除去红细胞。分别使用CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Germany)或CD4+CD25+调节性T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Germany)和MACS柱(midiMACS；Miltenyi Biotec)富集 CD4+T细胞和CD4+CD25-T细胞。
大量脾细胞和LN群的增殖测定，将2×105个细胞单独或与粗制 麦醇溶蛋白或合成HLA-DQ8/DQ8d一起，在96孔U形底培养板中总 体积200μl的有或没有抗IL-10或抗TGF-β中和单克隆抗体的完全培 养基中进行培养。抗原以1至100μg/ml的浓度加入。中和抗体以1、 0.1和0.01μg/ml加入。对于CD4+T细胞和CD4+CD25-T细胞群的增 殖测定，将2×105个细胞的CD4+T细胞或CD4+CD25-T细胞与载有1 mg/ml粗制麦醇溶蛋白或合成HLA-DQ8/DQ8d的经丝裂霉素处理的脾 细胞(作为抗原呈递细胞)一起，在96孔U形底培养板中总体积200μl 的有或没有中和抗体的完全培养基中培养16小时，CD4+T细胞或 CD4+CD25-T细胞/APC的比例是1/1、1/0.3、1/0.1、1/0.03、1/0。在 37℃5％CO2加湿培养箱中72小时之后，通过加入1μCi/孔的[3H]-胸苷 来评估增殖。18小时后在玻璃纤维过滤器(Perkin Elmer，Boston，USA) 上收集DNA结合的放射性，在闪烁计数器(Perkin Elmer)上测定胸 苷掺入。
对于细胞因子测量，在培养的第24、48和72小时收集用于不同 增殖测定的细胞培养物上清液，冷冻于-80℃直至进行细胞因子测定。 使用小鼠炎症流式细胞珠测定(BD Biosciences，Mountain View，CA， USA)对细胞因子产生进行定量。
实施例D1：LL-IL10显著增强LL-HLA/DQ8d的耐受诱导能力。
为了研究经口耐受的诱导，如上所述(诱导经口耐受)经口喂饲小鼠。 LL-IL10的添加显著增强对HLA-DQ8d的耐受诱导，因为相比于对照 和LL-HLA-DQ8d组，在LL-HLA-DQ8d+LL-mIL-10组中脾细胞的变 应原特异性的增殖应答显著降低。
实施例D2：LL-IL10加强经口耐受与应答于所述变应原的INF-γ产 生降低相关。
为了研究经口耐受的诱导，如上所述(诱导经口耐受)经口喂饲小鼠。如 上所述(细胞培养、增殖和细胞因子测定)定量应答于HLA-DQ8d的细 胞因子产生。相比于对照和LL-HLA-DQ8d 组，在 LL-HLA-DQ8d+LL-mIL-10组中，脾细胞和淋巴结中促炎症细胞因子 INF-γ的产生显著减少。
实施例D3：LL-IL10通过CD4+T细胞增强经口耐受。
为了评估CD4+T细胞是否介导经口耐受的诱导，在脾细胞和淋巴结中研 究了DQ8特异性的增殖性CD4T细胞应答。因此，如上所述(实验性情 况)经口喂饲小鼠，如细胞培养、增殖和细胞因子测定中所述测定DQ8 特异性的CD4+T细胞增殖。相比于对照和LL-HLA/DQ8d组，在 LL-HLA/DQ8d+LL-mIL-10组中，DQ8特异性的CD4T细胞应答显著 降低。
实施例D4：相比LL-IL10，IL-10在加强经口耐受上有效性较低
为了评估LL-IL10是否与IL10一样有效，如上所述(诱导经口耐受) 经口喂饲小鼠。在脾细胞和淋巴结中研究DQ8特异性的增殖性CD4T细 胞应答。相比于LL-HLA/DQ8d+IL-10组，在 LL-HLA/DQ8d+LL-mIL-10组中，DQ8特异性的CD4T细胞应答显著 降低。
实施例E：在经口施用分泌BLG食物变应原的乳酸乳球菌与原位递 送IL-10的组合之后诱导对所述变应原的耐受。
引言
食物变态反应是一种影响约2％至5％人群的疾病。在人类中，升高 的IgE抗体以及存在产生IL-4的抗原特异性T淋巴细胞的提示了Th2偏 向性机制。
本文中，我们证明经口施用食物变应原与产生IL-10的乳酸乳球菌的组合 通过诱导抗原特异性CD4+调节性T细胞而抑制变应原特异性免疫应答。
本实施例的材料和方法
细菌和质粒
在本研究中始终使用乳酸乳球菌菌株MG1363。细菌培养于 GM17培养基中，即补充了0.5％葡萄糖的M17(Difco Laboratories， Detroit，MI)。所有菌株的保藏悬液均在-20℃下保存于GM17中的50％ 甘油中。对于胃内接种，将保藏悬液在新鲜GM17中稀释200倍，在 30℃孵育。它们在16小时内达到每毫升2×109个菌落形成单位(CFU) 的饱和浓度。通过离心收获细菌，并在BM9培养基中浓缩10倍。对于 治疗，每只小鼠通过胃内导管接受100μl此悬液。
扩增牛β-乳球蛋白cDNA并与红霉素抗性的pT1NX载体中乳球菌P1 启动子下游的Usp45分泌信号融合。
使用带有小鼠IL-10或BLG的质粒转化的MG1363菌株命名为LL-IL10 和LL-BLG。LL-pT1NX(含有空载体pT1NX的MG1363)作为对照。
牛β-乳球蛋白(BLG)的定量
使用自行开发的BLG特异性酶联免疫吸附测定(ELISA)和Western 印迹分析来自LL-BLG的BLG。
实验性情况
用于研究乳酸乳球菌保护性作用的食物变态反应小鼠模型是食物诱 导IgE型应答的小鼠模型，如Frossard等(J Allergy Clin Immunol 113： 958-964，2004)所述。小鼠接受组合或未组合LL-IL10或重组IL-10(1 或10μg)的LL-BLG或作为阴性对照的无关抗原(OVA)。作为阳性对照， 小鼠在饮用水中接受高剂量的BLG，以防止用BLG经口攻击时产生的变 应性反应。
在预防性情况中，使用不同的治疗间隔和剂量，用胃导管对小鼠经 口施用经改造的产生BLG的乳酸乳球菌。然后，在霍乱毒素存在下，使 用纯化的BLG抗原经口攻击这些受者小鼠。对照动物接触用对照载体改 造得到的不表达BLG(而是表达OVA)乳酸乳球菌。通过分析胃内抗原 攻击后的过敏反应、测量血清和粪便中BLG特异性IgG1、IgG2a和IgE 效价，测定脾和PP中抗体分泌细胞的数目，分析MLN、PP和脾中的T 细胞增殖和细胞因子产生来评估耐受诱导。
为了研究针对BLG的免疫耐受诱导是否可被IL-10增强，将 LL-BLG和LL-IL10一起施用于小鼠。
BLG的经口致敏
在第0、7、14和21天，通过胃内填饲使用0.2mol/L NaHCO3中20 mg BLG(Sigma)和10μg CTX(购自List Biological Laboratories)攻击 4至5周龄雌性C3H/HeOuJ小鼠(Charles River)。阳性对照组(耐受小 鼠)4周中在饮用水中随意接受0.8mg/ml BLG。给出的蛋白质总量(22.4 mg)与致敏小鼠中给出的BLG总量相似。为了证明致耐受过程还持久活 化外周免疫系统，而不仅是活化粘膜免疫系统，在第28和42天对一组耐 受的小鼠两次注射吸附于1mg氢氧化铝的80μg BLG。
抗原攻击
在第28天，通过胃内填饲使用0.4ml 0.2mol的NaHCO3中的100 mg BLG攻击所有小鼠。观察过敏反应并使用反应得分进行分级(0无反 应至3重度反应或死亡)，所述反应得分在别处有详细描述(Frosssard等， 2001)。攻击前和填饲后30分钟，通过红外在耳朵处测定体核温度。处死 动物，通过心脏穿刺收集血液到含有EDTA的管中，获得血浆以用于通过 商品ELISA试剂盒(Immunotech，Marseille，France)进行组胺测定。
细胞培养、增殖和细胞因子测定
如Frossard等(2004)所述制备脾、纵隔淋巴结和PP的单细胞 悬液。分别使用CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Germany) 或CD4+CD25+调节性T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Germany) 和MACS柱(midiMACS；Miltenyi Biotec)富集CD4+T细胞和 CD4+CD25-T细胞。
大量脾细胞和LN群的增殖测定，将2×105个细胞单独或与纯化BLG一 起，在96孔U形底培养板中总体积200μl的有或没有抗IL-10或抗 TGF-β中和单克隆抗体的完全培养基中进行培养。BLG以1至100 μg/ml的浓度加入。中和抗体以1、0.1和0.01μg/ml加入。对于CD4+T 细胞和CD4+CD25-T细胞群的增殖测定，将2×105个细胞的CD4+T细 胞或CD4+CD25-T细胞与载有1mg/ml BLG的经丝裂霉素处理的脾细 胞(作为抗原呈递细胞)一起，在96孔U形底培养板中总体积200μl 的有或没有中和抗体的完全培养基中培养16小时，CD4+T细胞或 CD4+CD25-T细胞/APC的比例是1/1、1/0.3、1/0.1、1/0.03、1/0。在 37℃5％CO2加湿培养箱中72小时之后，通过加入1μCi/孔的[3H]-胸苷 来评估增殖。18小时后在玻璃纤维过滤器(Perkin Elmer，Boston，USA) 上收集DNA结合的放射性，在闪烁计数器(Perkin Elmer)上测定胸 苷掺入。
对于细胞因子测量，在培养的第24、48和72小时收集用于不同 增殖测定的细胞培养物上清液，冷冻于-80℃直至进行细胞因子测定。 使用小鼠炎症流式细胞珠测定(BD Biosciences，Mountain View，CA， USA)对细胞因子产生进行定量。
体内T调节活性测定
为了测试小鼠中对抗体形成的主动抑制，将分离自不同实验性乳 酸乳球菌治疗组的脾细胞、珠纯化的CD4+T细胞、CD4+CD25-T细胞 或CD4+CD25+T细胞过继转移(adoptively transfer)到幼稚C3H/HeouJ 小鼠中。使用未处理小鼠作为对照。对于全脾细胞、去除亚群的脾细胞 或者正选择的CD4+细胞和CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+T细胞，所 转移的细胞数是107。如果涉及Treg，那么接下来用BLG抗原对这些 小鼠的攻击应抑制诱导针对BLG的体液免疫应答以及过敏反应。
对于BLG特异性血清和粪便抗体的酶联免疫测定
在第0、7、14、21和28天从尾静脉取血获得血清。在相同时间获 得粪便，并以0.1mg/ml重悬于PBS加补充了1∶1000胃酶抑素(Fluka) 的1％FCS(Life technologies)。机械分散所述样品并涡旋2分钟，然后在 4℃下以14000rpm进行两次20分钟的离心。
通过修改自Adel-Patient等(2000，J.Immunol Methods)的方法 测定血清和粪便的BLG特异性IgE、IgG1、IgG2a和/或IgA抗体水平。 简言之，在室温下用250ng/孔的链霉抗生物素蛋白(Fluka)包被MaxiSorp 微量滴定板(Nunc)18小时，然后用300μl聚乙烯吡咯烷酮K25(Fluka) 溶液处理过夜。将1微克生物素化BLG孵育3小时，在0.5μg/ml山羊抗 小鼠IgA、大鼠抗小鼠IgG1或抗小鼠IgG2a过氧化物酶标记的抗体 (Southern Biotechnologies)存在下，一式两份地加入PBS加10％马血清 中稀释的血清(对于IgG1是1∶6666和1∶2222，对于IgG2a是1∶666和1∶222， 对于IgE是1∶66和1∶22)或粪便(1∶3、1∶10和1∶33)，保持2小时。对于 IgE测量，加入单克隆大鼠抗小鼠IgE抗体(克隆R35-72，BD Pharmingen)，然后加入过氧化物酶偶联的抗大鼠抗体(Caltag)。在490nm 处测定吸光度。结果以任意单位表示，使用来自BLG加氢氧化铝免疫的 小鼠的合并血清作为参照血清。
通过ELISPOT测量抗原特异性抗体的产生
从肠道上机械剪下派伊尔氏淋巴结(Peyer’s patch，PP)，将其在补充有5 mmol EDTA(Life Technologies)的HBSS培养基中孵育30分钟。类似地， 轻轻粉碎派伊尔氏淋巴结和肠系膜淋巴结，穿过70μm尼龙滤膜进行过滤。 脾细胞在Tris缓冲的NH4Cl中预孵育5分钟，以除去红细胞。在Percoll 60％/66％梯度下(Amersham)分离淋巴细胞。
对于BLG特异性IgG1、IgG2a和IgA抗体的测量，在37℃下用链 霉抗生物素蛋白过夜包被ELISPOT板(Millipore)，然后加入1μg生物 素化BLG保持3小时。将在Percoll 60％/66％梯度下分离的淋巴细胞以两 个不同浓度(1和2×106)重悬于Iscove改良的Dulbecco培养基中，所述 培养基中补充有青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺、庆大霉素、多粘菌素B和 5％FCS，在37℃保持24小时，然后在4℃下与抗IgA、抗IgG1和抗IgG2a 抗体(Southern Biotechnology)一起过夜孵育。以100μl孔加入氨基-乙 基-咔唑，保持10分钟，然后通过使用KS ELISPOT 4.2.1软件(Zeiss) 对点进行自动计数，表达为每106个细胞中的细胞形成单位(cell-forming unit，CFU)。
实施例E1：LL-IL10在食物变态反应小鼠模型中显著增强 LL-BLG的耐受诱导能力。
为了研究经口耐受的诱导，如上所述(实验性情况)经口喂饲小鼠。 LL-IL10的添加显著增强对BLG的耐受诱导，因为相比于对照和 LL-BLG组，在LL-BLG+LL-mIL-10组中脾细胞的变应原特异性的增 殖应答显著降低。
实施例E2：LL-IL10加强经口耐受与应答于所述变应原的BLG特 异性抗体应答降低和IL-4细胞因子的产生降低相关。
为了研究经口耐受的诱导，如上所述(实验性情况)经口喂饲小鼠。如上 所述测定应答于所述因子的BLG特异性抗体应答和细胞因子的产生。相 比于对照和LL-BLG组，在LL-BLG+LL-mIL-10组中，BLG特异性抗 体水平和IL-4显著降低。
实施例E3：LL-IL10通过CD4+T细胞增强经口耐受。
为了评估CD4+T细胞是否介导经口耐受的诱导，在脾细胞和淋巴结中研 究了变应原特异性的增殖性CD4T细胞应答。因此，如上所述(实验性情 况)经口喂饲小鼠，如细胞培养、增殖和细胞因子测定中所述测定所述 变应原特异性的CD4+T细胞增殖。相比于对照和LL-BLG组，在 LL-BLG+LL-mIL-10组中，变应原特异性的CD4T细胞应答显著降低。
实施例E4：相比LL-IL10，IL-10在加强经口耐受上有效性较低
为了评估LL-IL10是否与IL10一样有效，如上所述(实验性情况)经 口喂饲小鼠。在脾细胞和淋巴结中研究变应原特异性的增殖性CD4T细胞 应答。相比于LL-BLG+IL-10组，在LL-BLG+LL-mIL-10组中，变应 原特异性的CD4T细胞应答显著降低。
实施例E5：LL-BLG-LL-IL10组合治疗后抗原诱导的T调节性细 胞可在体内传递对哮喘样应答的保护
为了测试在经口耐受方案处理的小鼠中对哮喘样应答的主动抑制，我们如 上所述(体内T调节活性测定)过继转移来自不同治疗组的脾细胞。相比 于对照和LL-BLG组，在LL-BLG+LL-mIL-10组中哮喘样应答显著降 低，表明在我们的组合经口耐受方案中的调节性CD4+T细胞的活化。
实施例F：在经口施用分泌胰岛素的乳酸乳球菌与原位递送IL-10 的组合之后诱导对胰岛素的耐受。
简介
自身免疫的特征为自发的炎性性组织损伤，以及丧失自身抗原耐受 所导致的生理功能的破坏。它与免疫系统的部分过度反应有关，其特征为 T辅助(Th)细胞的过剩。难以对易感因素(例如易感基因和环境因素) 施加影响，因此最近开发免疫疗法的尝试均着眼于通过清除病原效应细胞 和/或增强免疫调节性T细胞来重建二者之间的功能平衡。胰岛β细胞的自 身免疫破坏是I型糖尿病(Type 1diabetes mellitus，T1D)的主要原因。 这种破坏与对一些β细胞自身抗原的细胞及体液免疫应答有关，这两种应 答引起临床发病。
在本文中，我们证明经口递送自身抗原与产生IL-10的乳酸乳杆菌的组合 通过诱导抗原特异性CD4+调节性T细胞来抑制糖尿病特异性免疫应答。
本实施例的材料和方法
细菌和质粒
在本研究中始终使用乳酸乳球菌菌株MG1363。细菌培养于 GM17培养基中，即补充了0.5％葡萄糖的M17(Difco Laboratories， Detroit，MI)。所有菌株的保藏悬液均在-20℃下保存于GM17中的50％ 甘油中。对于胃内接种，将保藏悬液在新鲜GM17中稀释200倍，在 30℃孵育。它们在16小时内达到每毫升2×109个菌落形成单位(CFU) 的饱和浓度。通过离心收获细菌，并在BM9培养基中浓缩10倍。对于 治疗，每只小鼠通过胃内导管接受100μl此悬液。
合成具有最佳乳酸乳球菌密码子使用的DNA序列，扩增并与红霉素抗性 的pT1NX载体中乳球菌P1启动子下游的Usp45分泌信号融合，所述 DNA序列编码人胰岛素原1I B24-C36肽(hpIIp)、猪胰岛素和免疫显 性肽InsB9-23(B9-23在许多物种人、大鼠和小鼠之间基本相同)。
使用带有小鼠IL-10、hpIIp、胰岛素、InsB9-23的质粒转化的MG1363 菌株命名为LL-IL10、LL-hpIIp、LL-胰岛素、LL-InsB9-23。LL-pT1NX (含有空载体pT1NX的MG1363)作为对照。使用抗原特异性ELISA和 Western印迹分析测定这些蛋白质的表达。
小鼠
非肥胖雌性及雄性糖尿病(NOD)小鼠和NOD-重度联合免疫缺陷 (severe combined immunodeficient，SCID)(Balb/c背景)小鼠购自 Jackson Laboratory。Balb/c野生型(WT)小鼠购自Charles River Italy。 在特定的无病原中央动物设施中保持小鼠。按照制度规定处理和使用小 鼠。
实验性情况
在预防性情况下，从21天龄(断奶)开始对NOD小鼠经口施用单 独的或与LL-IL10或重组小鼠IL-10(1-10μg)一起的LL-hpIIp、LL-胰 岛素、LL-InsB9-23经口施用给NOD小鼠，并且使用最佳喂饲方案或者直 至100日龄(当大部分小鼠发生糖尿病时)。另外，LL-pT1NX作为阴性 对照经口施用。对于阳性(致耐受)对照组，在2或4周中每周三次对3 周龄NOD小鼠经口使用0.8mg人胰岛素。糖尿病的发生通过每周三次连 续监测尿糖水平来确定，在糖尿的情况下监测血糖水平。在12-23周以及 在实验的结束时(35周)收集胰腺，用苏木精/伊红对连续切片进行染色， 以对单个核细胞的浸润进行评分，或者通过免疫组化来分析T细胞浸润。 在治疗性情况下，对显示稳定糖尿和高血糖的糖尿病NOD雌性小鼠(12-23 周)经口施用单独的或与LL-IL10或重组小鼠IL-10一起的LL-hpIIp、 LL-胰岛素、LL-InsB9-23。另外，LL-pT1NX作为阴性对照经口施用。对 于阳性(致耐受)对照组，如Bresson等2006所述治疗糖尿病NOD小鼠。 完全好转定义为糖尿消失以及血糖恢复正常。
在使用特异性自身抗原再次攻击所述NOD小鼠之后，通过将T细胞过继 转移进NOD SCID小鼠来分析耐受诱导的确切机制。
糖尿病的检测：
葡萄糖监测：使用Diastix(Miles)测定尿糖，通过使用血糖监测系 统OneTouch Ultra(LifeScan Inc.)的血糖测定进行确认。糖尿病定义为 2个连续血糖值高于250mg/dl。
胰岛炎：通过CO2窒息处死小鼠，胰腺在10％甲醛中固定过夜，包 埋在石蜡中，使用苏木精和伊红对连续5μm切片进行染色。通过显微镜对 10-15个胰岛/小鼠中的细胞浸润程度进行如下分级来确定胰岛炎得分(平 均值±SD)：0，无胰岛浸润的可见体征；1，周围胰岛浸润；2，＜50％浸润； 3，＞50％浸润。
免疫组织化学
为了检测胰腺β细胞中胰岛素、CD4和CD8的表达，对冰冻组织切 片使用第一抗体(豚鼠抗猪胰岛素，来自Dako[稀释度1∶300]，抗CD4 RM4.5和抗CD8a IHC，来自BD Biosciences[稀释度1∶50])，如Christen 等2004所述。
体外增殖测定
制备脾脏、肠系膜LN(MLN)和PLN的单细胞悬液。总脾细胞群 的增殖测定，将2×105个细胞单独或与分级浓度(1-100μg/ml)的纯化 人胰岛素或者对CD4T细胞(InsB9-23，H-2d或g限制性)或CD8T细胞 (InsB15-23，Kd限制性)具有特异性的肽(Sigma)一起，在96孔U形 底培养板中总体积200μl的有或没有抗IL-10或抗TGF-β中和单克隆 抗体的完全培养基中进行培养。中和抗体以1、0.1和0.01μg/ml加入。 对于总CD3+T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞和CD4+CD25-T细胞 群的增殖测定，将0.2×105个细胞的T细胞与载有胰岛素或GAD65或 对CD4+或CD8+T细胞具有特异性的肽的1×105个经辐射的WT Balb/c 小鼠脾细胞一起，在96孔U形底培养板中总体积200μl的有或没有中 和抗体的完全培养基中培养。在37℃5％CO2加湿培养箱中72小时之后， 通过加入1μCi/孔的[3H]]-胸苷来评估增殖。16至18小时后在玻璃纤维 过滤器(Perkin Elmer，Boston，USA)上收集DNA结合的放射性， 在闪烁计数器(Perkin Elmer)上测定胸苷掺入。通过使用CD3+、CD4+ 或CD8+分离试剂盒(MACS；Milteny Biotec，Auburn，CA)的磁珠 分离，通过负选择从PLN或脾脏中纯化T细胞。使用CD4+T细胞作 为总细胞，或者使用CD25+分离试剂盒(Milteny Biotec)，通过MACS 进一步分成CD25+或CD25-。通过流式细胞分析确定细胞群的纯度 (＞90％)。
对于细胞因子测量，在培养72小时后收集用于不同增殖测定(抗 原特异性刺激)的细胞培养物上清液，冷冻于-80℃直至进行细胞因子 测定。使用小鼠炎症流式细胞珠测定(BD Biosciences，Mountain View， CA，USA)定量细胞因子产生。培养纯化的CD3+T细胞、CD4+T细胞 或CD8+T细胞并使用抗CD3/抗CD28混合物(每个1μg/ml)刺激24 小时，或者它们作为对照而不进行刺激。收获上清液，使用FCAP阵列 软件(BD Biosciences)，使用BD FACSArray Bioanalyzer上的BDTM 流式细胞珠阵列Flex Set分析IL-10、IL-4、IL-5和IFNγ的产生。使用 Quantikine试剂盒(R&D Systems)，使用捕获ELISA实验测定TGF-β。
体外T细胞增殖抑制测定
将分离自近期糖尿病雌性NOD(8-12周)的2×104个纯化的总脾 CD4+CD25-T细胞与多种数量的分离自不同实验组的脾、MLN或PLN的 CD8+T细胞、CD4+T细胞和CD4+CD25-T细胞群一起共培养，所述培 养中存在2×104个来自WT Balb/c小鼠的已清除T细胞的脾细胞，所述脾 细胞经过辐射，并载有胰岛素或肽。在37℃5％CO2加湿培养箱中72小 时之后，通过加入1μCi/孔的[3H]-胸苷来评估增殖。16-18小时后在玻 璃纤维过滤器(Perkin Elmer，Boston，USA)上收集DNA结合的放射 性，在闪烁计数器(Perkin Elmer)上测定胸苷掺入。
体外细胞毒性测定
所使用的淋巴母细胞靶标是来自BALB/c小鼠的Con A活化的脾细 胞。在37℃下，用100μCi51Cr(Amersham International， Buckinghamshire，U.K)将106个靶细胞标记90分钟，洗涤三次，然后 在37℃下与1μg/ml肽(InsB15-23或无关肽)一起孵育1小时。洗涤靶 细胞两次，并以104个细胞/孔接种。以不同的效应子：靶标比例(E∶T) 将分离自脾、MLN或PLN的CD8+T细胞一式三份加入每个孔中。将 平板以500rpm离心2分钟，并在37℃孵育4小时。孵育后，收集上 清液以测定51Cr释放[裂解％＝100×(测试cpm-自发cpm)/(总cpm- 自发cpm)]。对于间接杀伤测定，在与效应子一起孵育前，先将CD8+ T细胞与5μg/ml抗CD3抗体(克隆145-2C11，Pharmingen)一起孵 育。
糖尿病的过继转移
对8-10周龄的NOD-SCID小鼠静脉注射2×107个或腹膜内注射 5×106个分离自糖尿病雌性NOD小鼠(6周、12周和18周)的脾细胞， 所述脾细胞与分离自不同实验乳酸乳球菌治疗组的分级数量的珠纯化 CD3+T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、CD4+CD25-T细胞或 CD4+CD25+T细胞组合，或者不进行组合。使用未治疗小鼠作为对照。糖 尿病的发生通过每周三次连续监测血糖水平来确定。
实施例F1：LL-IL10在非肥胖糖尿病小鼠中显著增强LL-hpIIp、 LL-胰岛素、LL-InsB9-23的耐受诱导能力。
为了研究经口耐受的诱导，如上所述(实验性情况)经口喂饲小鼠。 LL-IL10的添加显著增强对自身抗原的耐受诱导，因为相比于对照和 LL-hpIIp/胰岛素/InsB9-23组，在LL-hpIIp/胰岛素/InsB9-23+LL-mIL-10 组中脾细胞的自身抗原特异性的增殖应答显著降低。
实施例F2：LL-IL10加强经口耐受与胰岛炎减少、β细胞破坏率降 低和脾细胞的IL-10产生提高相关。
为了研究经口耐受的诱导，如上所述(实验性情况)经口喂饲小鼠。如上 所述测定应答于所述自身抗原的胰岛炎存在情况、β细胞破坏率和细胞因 子产生。组织学分析显示，相比于对照和LL-hpIIp/胰岛素/InsB9-23组， 在LL-hpIIp/胰岛素/InsB9-23+LL-mIL-10组中胰岛炎和β细胞破坏的水 平显著降低，IL-10产生提高。
实施例F3：LL-IL10通过CD4+T细胞增强经口耐受。
为了评估CD4+T细胞是否介导经口耐受的诱导，在脾细胞和淋巴结中研 究了自身抗原特异性的增殖性CD4T细胞应答。因此，如上所述(实验性 情况)经口喂饲小鼠，接着如所述(体外增殖测定)测定所述自身抗原特 异性的CD4+T细胞增殖。相比于对照和LL-hpIIp/胰岛素/InsB9-23组， 在LL-hpIIp/胰岛素/InsB9-23+LL-mIL-10组中，自身抗原特异性的CD4T 细胞应答显著降低。
实施例F4：相比LL-IL10，IL-10在加强经口耐受上有效性较低
为了评估LL-IL10是否与IL10一样有效，如上所述(实验性情况)经 口喂饲小鼠。在脾细胞和淋巴结中研究自身抗原特异性的增殖性CD4T细 胞应答。相比于LL-hpIIp/胰岛素/InsB9-23+IL-10组，在LL-hpIIp/胰岛 素/InsB9-23+LL-mIL-10组中，自身抗原特异性的CD4T细胞应答显著降 低。
实施例F5：LL-InsB15-23-LL-IL10组合治疗后NOD小鼠中的自 身攻击性CD8+应答被抑制
为了测试我们的组合方法是否诱导能通过旁观者机制调节糖尿病的抑制 性CD4+T细胞，我们分析了对自身攻击性CD8+T细胞的影响。组合治 疗后，抗原特异性自身攻击性CD8+细胞的百分比和/或活性显著降低。
实施例F6：LL-InsB15-23-LL-IL10组合治疗后抗原诱导的T调节 性细胞可在体内传递对糖尿病样应答的保护
为了测试在经口耐受方案处理的小鼠中对糖尿病样应答的主动抑制，我们 如上所述(糖尿病的继转移)过继转移来自不同治疗组的脾细胞。相比 于对照和LL-hpIIp/InsB9-23组，在LL-hpIIp/InsB9-23+LL-mIL-10组中 糖尿病样应答显著降低，表明在我们的组合经口耐受方案中调节性 CD4+T细胞的活化。
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<213>小麦
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Gln Ala
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