CKAP4抗原表位肽、抗原、单克隆抗体及其应用和CKAP4检测试纸条
阅读：1039发布：2020-06-25
专利汇可以提供CKAP4抗原表位肽、抗原、单克隆抗体及其应用和CKAP4检测试纸条专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及免疫组学和 蛋白质 组学技术领域，具体涉及CKAP4 抗原 表位肽、抗原、单克隆 抗体 及其应用和CKAP4检测 试纸 条。CKAP4抗原表位肽为多肽A或多肽B，多肽A的 氨 基酸序列为RSHQDFSRQREEL，多肽B的氨基酸序列为DSHGPKEDGG。分别以多肽A和多肽B为来源制备了相应的抗原和单克隆抗体，均可特异性地与CKAP4结合，所得到的单克隆抗体也可用于CKAP4的检测，并制作了CKAP4检测试纸条，可实现血清中CKAP4的快速检测。，下面是CKAP4抗原表位肽、抗原、单克隆抗体及其应用和CKAP4检测试纸条专利的具体信息内容。
1.一种CKAP4抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽为多肽A或多肽B，所述多肽A的氨基酸序列为RSHQDFSRQREEL，所述多肽B的氨基酸序列为DSHGPKEDGG。
2.一种CKAP4抗原，其特征在于，所述CKAP4抗原为CKAP4-A抗原，所述CKAP4-A抗原通过使如权利要求1所述的多肽A和载体偶联制备而成。
3.一种CKAP4抗原，其特征在于，所述CKAP4抗原为CKAP4-B抗原，所述CKAP4-B抗原通过使如权利要求1所述的多肽B和载体蛋白偶联制备而成。
4.一种CKAP4单克隆抗体，其特征在于，所述CKAP4单克隆抗体是由权利要求2所述的CKAP4抗原制备而成的单克隆抗体。
5.一种CKAP4单克隆抗体，其特征在于，所述CKAP4单克隆抗体是由权利要求3所述的CKAP4抗原制备而成的单克隆抗体。
6.如权利要求5或6所述的单克隆抗体在制备CKAP4诊断试剂盒中的应用。
7.如权利要求5或6所述的单克隆抗体在制备CKAP4检测试纸条中的应用。
8.一种CKAP4检测试纸条，所述试纸条的标记抗体和包被抗体为来源于CKAP4不同抗原表位肽的单克隆抗体，其特征在于，所述试纸条的标记抗体为权利要求4或5所述的单克隆抗体。
9.一种CKAP4检测试纸条，所述试纸条的标记抗体和包被抗体为来源于CKAP4不同抗原表位肽的单克隆抗体，其特征在于，所述试纸条的包被抗体为权利要求4或5所述的单克隆抗体。
CKAP4抗原表位肽、抗原、单克隆抗体及其应用和CKAP4检测试
纸条
技术领域
背景技术
[0002] 肺癌发病率在男性恶性肿瘤中已居首位，在女性发病率也迅速增高，肺癌成为危害生命健康的一种主要疾病。多数患者确诊时病情已发展至中晚期，错过疾病的治疗的最佳时期，治疗难度进一步加大。因此，寻找有效的肿瘤标志物用于癌变的机理研究、疾病的早期诊断及高危人群的筛查成为肺癌研究的当务之急。
[0003] 目前临床上常用的早期诊断肺癌的方法主要有传统的X线胸片、痰脱落细胞及纤维支气管镜等检查方法，其应用于肺癌的筛查(尤其在高危人群中)并没有降低被筛选人群肺癌的死亡率，同时由于检测敏感性差、过程痛苦、患者耐受性差、不能早期动态监测等而受到限制。
[0004] 肺癌标志物是在肿瘤发生、发展过程中由肿瘤细胞表达、分布在组织、血液和体液中的大分子物质，具有组织特异性，其分布的类型及浓度变化与发病个体的肿瘤起源和生长密切相关，因其具有可以从分子生物学方向对肺癌进行分子诊断、分型分期等优点，近年来被临床上广泛应用于肺癌早期诊断、临床分型和预后评判。因此研究和发现肺癌的特异性标志物，建立经济、更适合早期诊断的检测方法，对肺癌的防治工作无疑将起到极大的作用。
[0005] CKAP4，又称P63、细胞骨架相关膜蛋白4(CKAP4)，分子量63KD，是一种II型跨膜蛋白，连接于内质网与微管之间。最新研究表明，在肺癌的Ⅰ-Ⅳ期，血清中血清癌胚胎抗原，细胞角蛋白19片段和SCC抗原的敏感性分别为30％-52％、17％-82％和24％-39％。研究指出，血清中CKAP4的敏感性在训练组为81％，在验证组为69％，均高于目前临床应用的血清诊断标志物的敏感性。
[0006] 目前，CKAP4快速诊断试剂盒的研制处于起步阶段，其中获得抗CKAP4的特异性多肽或抗体、并采用合适的方法将其应用于检测是制备CKAP4快速诊断试剂盒的关键技术。抗原表位，又称抗原决定簇，是抗原分子抗原性的基础。因此，CKAP4抗原表位的发现是其单克隆抗体和快速诊断试剂盒的研发的重要基础，目前尚未见有研究CKAP4抗原表位相关的文献公开。
[0007] 虽然，目前抗原表位可以利用生物信息学软件来预测，然而，越来越多的研究表明，软件预测抗原表位的错误概率较高，且软件对抗原表位的预测只针对目的抗原蛋白的全长，真正应用的过程中往往存在着特异性的问题，需要实验证实。
发明内容
[0008] 本发明对CKAP4的抗原表位进行研究，发现了2个抗原表位肽；
[0009] 此外，本发明还在上述抗原表位肽的基础上制备了CKAP4抗原；
[0010] 本发明还制备得到了可特异性识别上述抗原表位多肽与载体偶联制备得到的抗原的单克隆抗体；
[0011] 本发明的另一目的在于，明确了上述单克隆抗体可用于制备检测CKAP4试剂盒/试纸条；
[0012] 最后，本发明还在上述单克隆抗体的基础上建立了可快速检测CKAP4的检测试纸条。
[0013] 本发明的CKAP4抗原表位肽采用如下技术方案：一种CKAP4抗原表位肽，所述抗原表位肽为多肽A或多肽B，所述多肽A的氨基酸序列为RSHQDFSRQREEL，所述多肽B的氨基酸序列为DSHGPKEDGG。
[0014] 一种CKAP4抗原，所述CKAP4抗原为CKAP4-A抗原，所述CKAP4-A抗原是通过使多肽A(氨基酸序列为：RSHQDFSRQREEL)和载体蛋白偶联制备而成。载体蛋白可选自KLH(钥孔血蓝蛋白)、BSA(牛血清白蛋白)、卵清蛋白OVA等。优选的，所述CKAP4-A抗原的载体蛋白为BSA。
[0015] 一种CKAP4抗原，所述CKAP4抗原为CKAP4-B抗原，所述CKAP4-B抗原是通过使多肽B(氨基酸序列为：DSHGPKEDGG)和载体蛋白偶联制备而成。优选的，所述CKAP4-B抗原的载体蛋白为BSA。
[0016] 一种CKAP4单克隆抗体，所述CKAP4单克隆抗体是由上所述的CKAP4-A抗原制备而成的单克隆抗体(来源于多肽A)。
[0017] 一种CKAP4单克隆抗体，所述CKAP4单克隆抗体是由如上所述的CKAP4-B抗原制备而成的单克隆抗体(来源于多肽B)。
[0018] 如上所述的两种单克隆抗体在制备CKAP4诊断试剂盒中的应用。
[0019] 如上所述的两种单克隆抗体在制备CKAP4检测试纸条的应用。
[0020] 一种CKAP4检测试纸条，所述试纸条的标记抗体和包被抗体为来源于CKAP4不同抗原表位肽的单克隆抗体，所述试纸条的标记抗体为上述两种单克隆抗体中的任意一种(即来源于多肽A或多肽B)。
[0021] 一种CKAP4检测试纸条，所述试纸条的标记抗体和包被抗体为来源于CKAP4不同抗原表位肽的单克隆抗体，所述试纸条的包被抗体为上述两种单克隆抗体中的任意一种(即来源于多肽A或多肽B)。
[0022] 其中，上述试纸条的标记抗体是指与荧光微球/胶体金/纳米磁珠/量子点等标志物(优选时间分辨荧光微球，如Eu-羧基荧光微球)结合的抗体；包被抗体是指包被于硝酸纤维素膜或其他固体介质上作为检测线的抗体。优选的，所述CKAP4检测试纸条的标记抗体为来源于多肽A的单克隆抗体，包被抗体为来源于多肽B的单克隆抗体；或所述标记抗体为来源于多肽B的单克隆抗体，所述包被抗体为来源于多肽A的单克隆抗体，以保证所述试纸条的检测结果的特异性、准确度和有效性。
[0023] 本发明的有益效果是：本发明的抗原表位肽多肽A和多肽B均具有良好的抗原性，分别将多肽A和多肽B与载体蛋白偶联制备得到的抗原用于免疫动物均能够给产生特异性好的单克隆抗体，进而用于制备检测CKAP4的试剂盒/试纸条。
[0024] 本发明提供了一种可快速(5min)检测血清中CKAP4的试纸条，检测效率更高，线性范围5-100ng/ml，相对于现有技术中的CKAP4单克隆抗体有更宽的线性范围，特异性好，能够迅速及时地帮助诊断病情，监测预后。本发明的CKAP4检测试纸条与免疫组化法相关性好，检测效果可靠。附图说明
[0025] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0026] 图1为本发明的CKAP4试纸条的结构示意图；
[0027] 图2为所述CKAP4试纸条定性检测的结果示意图；
[0028] 图3为试纸条1的标准曲线图
具体实施方式
[0030] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0031] 实施例一
[0032] 1.抗原表位的筛选：
[0033] NCBI查阅获得人CKAP4氨基酸序列，用DNAssist、DNA STAR、BcePred Prediction Server等软件分析CKAP4蛋白B细胞表位。在进行抗原表位分析时将经软件分析得到的抗原表位肽与表皮生长因子受体EGFR进行对接，选取打分函数大于130分的多肽作为候选抗原表位肽，并进一步通过实验进行筛选。经大量实验验证，最终筛选到两个CKAP4抗原表位多肽：
[0034] 多肽A的氨基酸序列：RSHQDFSRQREEL
[0035] 多肽B的氨基酸序列：DSHGPKEDGG
[0036] 多肽A和多肽B可采用化学合成法制备，如固相合成法等。此处不再赘述。
[0037] 2.CKAP4抗原的制备与鉴定：
[0038] 2.1 CKAP4抗原的制备，具体步骤如下:
[0039] (1)称量BSA固体4mg，置于400μL MES缓冲液(0.1M，pH 5.0)溶解，制备10mg/mL BSA溶液；
[0040] (2)称量多肽A(由上海强耀生物科技有限公司按照提供的氨基酸序列合成多肽)、多肽B(由上海强耀生物科技有限公司按照提供的氨基酸序列合成多肽)各2mg，分别溶解于500μL MES缓冲液(0.1M，pH 5.0)中，制成CKAP4(A)、CKAP4(B)溶液；分别取步骤(1)所得到的BSA溶液200μL置于4mg/mL的CKAP4(A)、CKAP4(B)溶液，漩涡混匀；
[0041] (3)将EDC平衡室温，称量EDC 20mg，溶解于2mL纯化水中，制备10mg/mL的EDC溶液；
[0042] (4)将上述配制的EDC溶液取100μL，即刻分别置于CKAP4(A)与BSA、CKAP4(B)与BSA的混合液中，25℃摇床振荡2h，最终制备CKAP4-A(CKAP4(A)-BSA)、CKAP4-B(CKAP4(B)-BSA)两种完全抗原，-20℃保存；
[0044] 2.2对所得到的抗原进行检测
[0045] 2.2.1微量紫外分光光度计下分别对CKAP4(A)、CKAP4(B)、CKAP4-A、CKAP4-B和BSA,进行紫外光谱扫描，比较偶联前、偶联后的扫描图谱变化，初步判定多肽A或多肽B与载体蛋白(BSA)是否偶联。选取多肽A或多肽B与载体偶联的样品进行SDS-PAGE凝胶电泳。
[0046] 2.2.2 SDS-PAGE电泳鉴定(5％的浓缩胶、8％分离胶)，具体步骤如下：
[0047] (1)准备好SDS-PAGE实验所需的相关试剂与仪器设备；
[0048] (2)纯化水冲洗电泳板，板夹夹紧电泳板，利用纯化水检漏；无水浸出后，倒出纯化水，长条吸水纸清除残余纯化水；
[0049] (3)按照配方制备分离胶(依据样品分子大小选择)，沿电泳板一侧缝隙将其缓慢注入底端，预防分离胶中存在气泡，室温条件下，纯化水水封约1h；
[0050] (4)待上述胶凝固后，倒液封纯化水，吸水纸紧靠一侧清除纯化水；
[0051] (5)制备5％浓缩胶，紧靠一侧缝隙缓慢注入分离胶顶端，为避免梳齿下端气泡存在，保持梳子清洁，缓慢插入浓缩胶(深度约1cm)，待凝固后待用；
[0052] (6)缓慢拔出梳子，组装电泳设备上，灌入1×电泳缓冲溶液，利用自制的细长枪头加样，点样量6μL/孔；
[0054] (8)取出电泳板，去掉板夹，将电泳板打开，标记样品孔位后，缓慢取出凝胶，纯化水三次冲洗除杂，浸于染色液中，脱色摇床染色约40min；
[0055] (9)染色结束后，纯化水冲洗染色凝胶，再置于脱色液中，用脱色摇床脱色2h，按时替换旧脱色液，观察凝胶背景，若其变透明则清洗干净，将其平躺于灯箱拍照。
[0056] 3.小鼠免疫程序
[0057] 取BALB/c雌性小鼠6只，约6～8周龄，其中CKAP4–A、CKAP4–B各免疫3只，采用皮下多点免疫注射。按照如下方案进行免疫：
[0058] 首免采用弗氏完全佐剂(FCA)与CKAP4–A/CKAP4–B等体积混合；
[0059] 二免、三免采用弗氏不完全佐剂(FIA)与CKAP4–A/CKAP4–B等体积混合；
[0060] 三免后若小鼠血清抗体效价＜1:104，则免疫继续进行，直至抗体效价＞1:104；
[0061] 融合前3天，进行加强免疫，不添加佐剂。
[0062] 按照上述方案对小鼠免疫CKAP4–A/CKAP4–B。选取两个免疫小组中最高效价的小鼠继续进行下一步实验。
[0063] 具体免疫方案如下表1所示：
[0064] 表1
[0065]
[0066] 4.CKAP4单克隆抗体制备
[0067] 为获得特异性识别CKAP4抗原、无限增殖的杂交瘤细胞，先进行细胞融合，随后进行细胞克隆化。经2-4次克隆化，运用间接ELISA测定后最终筛选到稳定分泌CKAP4抗体的单克隆细胞株，采用小鼠腹腔接种诱生法制备单克隆抗体。采用正辛酸---硫酸按沉淀法纯化腹水单克隆抗体。
[0068] 4.1细胞融合
[0069] 按1：6比例将脾脏细胞和SP 2/0(骨髓瘤细胞系)溶液混合，旋涡均匀，1600rpm离心细胞5min，吸水纸清除水份，轻微摇晃将沉淀分散。37℃水浴条件下，滴加1mL预热的PEG2000(操作需约1min内完成)，计时1min促进融合反应。即刻加入预热的1640培养液，将融合细胞低转速离心，弃废液，洗涤2次，用HAT培养液轻微吹散细胞。准备好铺有饲养层细胞的96孔板，滴加吹散的融合细胞，100μL/孔，放入CO2培养箱培养，培养期间根据时间换液。
[0070] 4.2.1阳性单克隆细胞筛选及克隆化
[0071] 为获得特异性识别CKAP4抗原、无限增殖的杂交瘤细胞，经融合后，需进一步细胞克隆化。间接ELISA法初检的阳性杂交瘤细胞，经培养后，也会因细胞突变等因素，造成细胞丧失分泌CKAP4抗体的能力，通常需经2～4次克隆化、间接ELISA测定后，最终筛选到稳定分泌CKAP4抗体的单克隆细胞株。本研究采用有限稀释法进行阳性细胞克隆化，约10d后，将单克隆孔上清采用间接ELISA法测定，从中选取高OD值的孔再进行克隆化(分别检测免疫前血清(N)和免疫后血清(P)的OD450值，以含抗体血清最大稀释倍数的倒数为评价指标。当免疫前血清的OD值(N)/免疫后血清的OD值(P)≦2.1(效价为1:64000)时结果为阳性，具体数据参见下表2)，重复2～3次，挑选数次克隆均为阳性的单克隆细胞株做备选细胞株。将筛选出的细胞株进行扩大培养，并且及时传代和冻存，分别冻存15d，30d，60d，90d后复苏，通过对细胞台盼蓝染色、细胞计数检测细胞活力，用间接ELISA方法检测细胞分泌特异性抗体的能力，从而判断筛选出的细胞株的稳定性。最终筛选到8株细胞株，其编号分别为：2A2、3C2、4D5、4E2、5C4、6E1、7F2、8D5，备用。
[0072] 表2间接ELISA法测定血清抗体
[0073]
[0074] 4.2.2单克隆细胞株亚型测定
[0075] 对稳定细胞株分泌的上清分别进行鉴定，主要操作如下：
[0076] (1)移取试剂盒内各组分，放置30min，平衡至室温。
[0077] (2)将浓缩洗液稀释至所需浓度，取出酶标板，用样本稀释液分别将每株单抗稀释，100μL/孔，样品稀释液作为对照，酶标板上详细标记，黏紧封板膜，37℃反应30min。
[0078] (3)准备6种HRP酶标二抗，包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM，稀释后分别100μL/孔，酶标板上详细标记，黏紧封板膜，37℃反应30min。
[0079] 单抗亚型测定结果，见下表3所示：
[0080] 表3
[0081]抗体编号 2A2 3C2 4D5 4E2 5C4 6E1 7F2 8D5
亚型类型 IgG2a IgG1 IgG1 IgG1 IgG2b IgG1 IgG1 IgG1
亚型类型 IgG2a IgG1 IgG1 IgG1 IgG2b IgG1 IgG1 IgG1
[0082] 通过测定8株杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的亚型可知，2A2是IgG2a，5C4是IgG2b，其他6株均为IgG1，6株IgG1的单抗可作为下步配对筛选的原材料。
[0083] 4.3单克隆抗体腹水制备
[0084] 采用小鼠腹腔接种诱生法制备单克隆抗体，具体步骤如下：
[0085] (1)在小鼠腹腔内注射液体石蜡，0.5mL/只，使雄性小鼠(约12周龄)致敏，诱生腹水。
[0086] (2)将阳性杂交瘤细胞株(处于对数期)进行收集，分别对小鼠腹腔注射，3只小鼠/每株，0.2mL/只。
[0087] (3)7-10d后，筛选出腹部明显凸起的小鼠并处死，用注射器收集腹水。4℃腹水静置6h以上，4000rpm离心5min，去除上层油脂，慢慢吸出中间澄清部分即为腹水。
[0088] 4.4单克隆抗体的纯化及性能检测：
[0089] 4.4.1采用正辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水单克隆抗体。将各单抗用微量紫外分光光度计测定浓度，然后通过SDS-PAGE电泳法测定纯化后各单抗纯度。经处理后的样品6μL/孔，3μL/孔Marker，采用8％分离胶、5％浓缩胶进行电泳，经染色、脱色后观察，分装标记，﹣20℃保存，纯化后测定6株单抗的蛋白浓度，抗体浓度均超过5mg/ml，满足方法建立对测定浓度的要求。具体数据如下表4所示：
[0090] 表4
[0091]抗体编号 3C2 4D5 4E2 6E1 7F2 8D5
浓度(mg/ml) 6.23 5.31 5.34 7.42 8.68 9.07
浓度(mg/ml) 6.23 5.31 5.34 7.42 8.68 9.07
[0092] 4.4.2采用8％分离胶、5％浓缩胶，对纯化后的单克隆抗体进行SDS-PAGE鉴定。结果显示，6株单克隆抗体条带都在150到170KD附近，分子量与预期大小一致，且纯度较好。
[0093] 4.5单克隆抗体特异性鉴定
[0094] 4.5.1将CKAP4(A)-BSA,CKAP4(B)-BSA,BSA分别作为包被抗原，对从6株杂交瘤细胞(3C2、4D5、4E2、6E1、7F2和8D5)纯化出的单克隆抗体分别采用间接ELISA方法进行鉴定，平行检测3次，同时设置空白对照和阴性对照。
[0095] 单克隆抗体与蛋白载体的交叉反应如下表5所示：
[0096] 表5
[0097]
[0098] 注：+、－分别为阳性、阴性，OD值>0.105为阳性，反之为阴性。
[0099] 结论：从上表可知，包被BSA的孔均为阴性，而包被CKAP4(A)-BSA的孔与3C2、6E1和7F2的单克隆抗体呈阳性反应，与4D5、4E2和8D5呈阴性反应；包被CKAP4(B)-BSA的孔与4D5、
4E2和8D5呈阳性反应，与3C2、6E1和7F2的单克隆抗体呈阴性反应，说明所获单抗是针对CKAP4的特异性抗体，而不是针对载体BSA的抗体；其中3C2、6E1、7F2是针对CKAP4-A完全抗原的特异性抗体，4D5、4E2和8D5为CKAP4-B完全抗原的特异性抗体。
4E2和8D5呈阳性反应，与3C2、6E1和7F2的单克隆抗体呈阴性反应，说明所获单抗是针对CKAP4的特异性抗体，而不是针对载体BSA的抗体；其中3C2、6E1、7F2是针对CKAP4-A完全抗原的特异性抗体，4D5、4E2和8D5为CKAP4-B完全抗原的特异性抗体。
[0100] 4.5.2验证6株CKAP4单克隆抗体是否有非特异性反应：
[0101] 运用纯化出来的抗体与CEA抗原和CA125抗原血清进行免疫反应，结果表明纯化单抗具有特异性，证明所筛选CKAP4抗原表位肽(多肽A和多肽B)具有潜在的抗原决定簇特性。具体结果见下表6：
[0102] 表6
[0103]结论：6株单抗对干扰抗原(CEA抗原、CA125抗原)无特异反应，效果较好。
[0104] 4.6 ELISA方法筛选配对单抗
[0105] 将制备的CKAP4单克隆抗体，采用改良的过碘酸钠法对所得单克隆抗体进行HRP标记。采用双抗体夹心ELISA检测的方法，参考本实验室检测系统，以制备的标准品为待检样本，对所获单抗和HRP标记单抗进行配对筛选(去除自身配对)，通过测定的OD值高低判断抗体是否配对，选择OD值高的作为较优配对。主要步骤如下：
[0106] (1)采用CKAP4单抗作为包被，包被量：500ng/孔，样本量：20μL/孔；
[0107] (2)用酶标稀释液将HRP标记抗体1/2000稀释，50μL/孔；
[0108] 所筛选的较优配对见下表7所示：
[0109] 表7
[0110]
[0112] 1.1结合垫2的制备
[0113] 1.1.1 CKAP4标记抗体-荧光微球复合物的制备
[0114] (1)取荧光微球15uL，加入600uL 50mmol/L硼酸缓冲液中，旋涡混匀；
[0115] (2)加入100ug的EDC，25-30℃摇床振荡30min，14000r/min，离心20min；
[0116] (3)沉淀重悬于硼酸缓冲液，清洗1次，离心同步骤(2)；
[0117] (4)利用1mL 50mmol/L硼酸缓冲液重悬沉淀，加入100ug标记抗体(与荧光微球形成复合物的抗体，可为单克隆抗体或多克隆抗体)，旋涡混匀；
[0118] (5)加入50uL 10％BSA(可起到防止荧光微球与标记抗体分离开的作用)，25-30℃振荡封闭1h，14000r/min，离心15min；沉淀用1mL保护液(0.05M pH＝8.0的Tris-Hcl、0.5％(体积分数)TWEEN-20和0.1％BSA，上述各组分的浓度均为终浓度，BSA的浓度为质量百分数)吹散，超声30s，4℃保存备用；
[0119] (6)25-30℃振荡偶联2h，离心同步骤(2)，加入50uL 10％BSA，25-30℃振荡1h，14000r/min，离心15min；沉淀用1mL保护液(0.05M pH＝8.0的Tris-Hcl、0.5％(体积分数)TWEEN-20和0.1％BSA，上述各组分的浓度均为终浓度，BSA的浓度为质量百分数)吹散，超声
30s，4℃保存备用。保护液的具体配制方法如下：取pH＝8.0 0.2M Tris-Hcl 25mL、TWEEN-
20 0.5mL、BSA 0.1g、纯化水75mL混合均匀。
30s，4℃保存备用。保护液的具体配制方法如下：取pH＝8.0 0.2M Tris-Hcl 25mL、TWEEN-
20 0.5mL、BSA 0.1g、纯化水75mL混合均匀。
[0120] 1.1.2将CKAP4标记抗体-荧光微球复合物固定于玻璃纤维膜制成结合垫2[0121] 将玻璃纤维膜(长10cm，宽7mm)利用处理液(0.01M pH＝8.0 Tris-Hcl、0.1％(体积分数)TWEEN-20、0.1％(质量分数)BSA和0.1％(质量分数)蔗糖，上述各组分的浓度均为终浓度)处理，37℃烘干，然后将制备好的CKAP4标记抗体一荧光微球溶液((40uL/cm)涂于玻璃纤维膜，要求溶液均匀充满玻璃纤维膜，37℃烘干，制成结合垫2，4℃铝箔袋(含干燥剂)密封备用。处理液的具体配制方法如下：取pH＝8.0 0.2M Tris-Hcl 10mL、TWEEN-20 0.1mL、BSA 0.1g、蔗糖5g、纯化水75mL混合均匀。
[0122] 1.2在硝酸纤维素膜上包被T线和C线
[0123] 揭去底板7(PVC板)中间粘性贴纸，NC膜(硝酸纤维素膜3)紧贴上端贴纸的下端。划线前，调整XYZ三维点膜喷金仪的划线位置(X、Y、Z)、划样量等，调整完毕后，模拟划线，使质控线C线5和检测线T线4在NC膜3中间位置后，将羊抗鼠IgG(1mg/mL)作为质控线C线5，将包被抗体(1.5mg/mL，包被抗体是指包被于硝酸纤维素膜上作为检测线T线的抗体，可为单克隆抗体或多克隆抗体)作为检测线T线4，在NC膜3均匀划线，划线结束后，37℃烘干2h，密封在自封袋中备用。
[0124] 1.3试纸条的组装
[0125] 揭去底板7(PVC板)上端一条和下端两条粘性纸贴，将吸水垫6、已铺CKAP4标记抗体一荧光微球的结合垫2、样品垫1依次搭接组装，各重叠区域均为1mm将微电脑自动斩切机的机盖掀起，把组装好的包被板放入物料放置平台，斩切为宽3.9mm的试纸条，4℃铝箔袋密封保存(组装好的试纸条的结构参见说明书附图图1)。
[0126] 1.4试纸条的使用方法
[0127] 待试纸条恢复室温后，在加样孔位置加入待检样本(血清样本)，70uL/孔，计时5min；
[0128] 1.4.1定量检测：试纸条移至荧光免疫层析读数仪中检测，记录T线和C线荧光值，根据预先设置于荧光免疫层析读数仪中的标准曲线进行计算，即可直接读出所测样本中CKAP4的浓度。
[0129] 1.4.2定性检测：试纸条移至紫外灯下观察，可直接判读结果：C线有或无荧光亮度出现，T线无荧光亮度，判定结果无效；C和T线均显示荧光亮度，判定结果为阳性；C线无荧光亮度出现，T线有荧光亮度，判定试纸条结果为阴性(参见说明书附图图2)。
[0130] 实施例三本发明所制得的试纸条的性能验证
[0131] 1.1标准曲线的建立：
[0132] 配置一系列浓度梯度的CKAP4标准液：0、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、150、200、300、400(ng/ml)，取70uL滴加到免疫层析试纸条上，5min后用荧光免疫层析读数仪读取T线和C线的荧光强度，分别将T/C的荧光强度及对应的CKAP4标准液浓度做拟合曲线，得到荧光强度与浓度对应的公式。
[0133] 1.2精密性检测
[0134] 1.2.1批内精密性检测：同批次50条CKAP4检测试纸条重复检测中值质控品(50ng/mL)，采用T线荧光强度的变异系数 计算得出批内精密性。
[0135] 1.2.2批间精密性：采用按照相同方法制备的3个批次(每批20条)的CKAP4检测试纸条检测中值质控品(50ng/mL)，采用T线荧光强度的变异系数 计算得出批间精密性。
[0136] 2.用于进行上述测试(1.1-1.3)的试纸条：
[0137] 试纸条1：该试纸条制作时所采用的标记抗体为实施例一所制得的单克隆抗体6E1，包被抗体为实施例一所制得的单克隆抗体4D5，参见表6(表6中的其他单克隆抗体也可用于制作试纸条，且包被抗体和标记抗体可以互换)，其余制作步骤同实施例二(试纸条1的标准曲线图参见说明书附图图3)；
[0138] 试纸条2：以上海硕博生物科技有限公司提供的两种CKAP4抗体样品(从中选择配对最好的抗体)分别作为标记抗体和包被抗体，其余制作步骤同实施例二；
[0139] 3.检测结果：具体检测结果见下表8
[0140] 表8
[0141]试纸条 批内精密性 批间精密性 线性范围(梯度稀释质控品) R2
试纸条1 CV＝14.12 CV＝14.88 5-100ng/ml 0.9877
试纸条2 CV＝10.37 CV＝12.69 10-95ng/ml 0.9631
试纸条1 CV＝14.12 CV＝14.88 5-100ng/ml 0.9877
试纸条2 CV＝10.37 CV＝12.69 10-95ng/ml 0.9631
[0142] 实施例四方法学比对
[0143] 本方法(采用试纸条1进行检测)和郑大一附院免疫组化法平行检测45份肺癌患者临床血浆样本，符合率达91％，具体结果详见下表9
[0144] 表9
[0145]
[0146] 由上表9可知，本发明的检测方法和免疫组化法具有良好的相关性，检测结果可靠，可用于CKAP4的快速检测。
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