本发明涉及一种新型的适于胃肠道外和粘膜给药的抗原组合物，它包含在 水性介质中的抗原和糖类，其中的糖类呈现其具有酸性部分的衍生物形式，优 选以羧酸衍生物的形式存在。抗原组合物呈现稳定的固体形式，在加入液体赋 形剂和佐剂进行重建后，经过胃肠道外和粘膜给药，可在体液中快速溶解，从 而释放重建的疫苗进入人体。特别地，冻干制剂由含有抗原的粉末或饼状物组 成，优选呈现无定形物状态(玻璃状)，通过干燥或升化，优选通过冷冻干燥 来升化液体溶液或悬浮液而得到这种制剂。

当前，在制药领域中，人们对能确保加工和贮藏时期蛋白质稳定性的制剂 很关注。含水液体制剂是在制造过程中最容易也是最经济和易于操作的，也很 方便的适于最终用户使用。可是，在液体制剂中发生化学或物理降解是普遍发 生的现象，导致蛋白质的破坏，例如化学变性和降解，而这经常是不可逆的。

这些问题可以通过稳定的蛋白质混合物的干燥固体，尤其是(但不是唯一 的)稳定的冻干蛋白质混合物来克服。稳定的冻干制剂及其在制备过程中已经 出现的问题已有所描述(Carpenter，J.1997，Pharmaceutical Res.14，969-975)。 这种制剂必须是能保证蛋白质的稳定性、所属产品的构型、产品强度(特别是 对于胃肠道外给药)，和呈现优美的饼状物结构。相似的考虑也适于其他固体 制剂，例如真空干燥的或喷雾干燥的粉末。必须重视几个必要条件，其中重要 的一个是保证等渗性，这对于用于胃肠道外给药是关键的，特别是蛋白质质量 较低时，以疫苗制剂为例，每瓶包含大约50μg的蛋白质，总量大约15mg。盐 特别是NaCl，用于调节混合物的等渗性，但是因为其降低了溶液的凝固点， 使制剂变得很难凝固(由于很低的凝固点)，同时增加升华时去除水分的时间。 多元醇和糖类，例如甘露醇或乳糖已被成功地用于获得等渗性混合物的饼状物 (M.C.Lai和E.M.Topp，J.of Pharm.Sci.，1999，88，489-500)。

当混合物含有高浓度的盐时，在冻干过程中出现了一个重要问题，例如在 高浓度盐溶液中纯化蛋白质时。另外，在一些情况下，蛋白质也需要高盐浓度 以保持在溶液中和/或避免出现聚结和沉淀现象。当盐是NaCl时更容易出现 这些问题，这是因为溶液中的NaCl使共晶熔点降低和使制剂难于完全冻干。

一些方案被推荐使用，但不是都很满意。糖类浓度的增加与以下几方面相 关，i)渗透压增加，ii)与胃肠道外给药的不相容性，和iii)自身重建的问题， 例如当重建液体自身已是等渗的时。其他可选择的，向制剂中加入少量的甘露 醇使结晶变得容易，使制剂成坚固的结晶网状的饼状物(Kim，A.等 J.Pharmaceutical Sc.1998，87，931-935)。不能适用于很高浓度的盐溶液中，例 如高于15mM到大约30mM的NaCl。向制剂中加入高分子量的非生物降解性 聚合物质(如Taylor，L.和Zographi，G.，在J.Pharmaceutical Sc.1998，87，1615-1621 中所描述的)，要考虑到与药物组合物的不相容性或疫苗的安全性问题。

本发明为这些制剂提供了一种选择，它没有上面所说的缺点。本发明在于 发现了可在高盐浓度下贮存的具有稳定固体形式的抗原组合物，而高浓度的盐 通常会妨碍具有可接受结构的干燥粉末或冻干饼状物的形成。具体而言，本发 明在于发现了可与含有高浓度NaCl(尤其高于30mM)的抗体组合物的干燥 或冻干物相配伍的适宜赋形剂(即填充剂)。尽管本发明所用的赋形剂或填充 剂带有离子电荷，但仍是有利的，在高浓度的盐存在下，它们有助于增强填充 剂分子之间的分子间作用，从而形成饼状制剂并长时间保持稳定。

本发明更进一步地提供了固体形式的抗原组合物，例如冻干的、喷雾干燥 的或喷雾冷冻干燥的或真空干燥形式和重建的液体形式。依照本发明，更进一 步地提供了制备本发明的组合物的工艺包括混合组合物的成分，和冷冻这些成 分和干燥冷冻后的混合物，或将混合物喷雾(例如在热空气中)，或将混合物 真空干燥，或喷雾冷冻干燥。

在一个实施方案中，本发明的固体制剂是冻干的多孔形式，称为“饼状物”， 或其磨碎形式，该制剂在处理和贮存过程中是稳定的，与胃肠道外给药相容并 只有很少的残留水分。本发明的疫苗饼状物是通过升华疫苗的水溶液或悬浮液 而形成的，在本发明的优选方式中升华是通过冷冻干燥进行的。

在另一个实施方案中，本发明的固体制剂是干燥的粉末，特别是喷雾干燥 或喷雾冷冻干燥或真空干燥的粉末，其中含有较低的残留水分。

相应地，本发明的一个目的是提供新的适合冷冻干燥、喷雾干燥或真空干 燥的抗原组合物，其中含有在水性介质中的抗原、糖类或其具有酸性部分 (moiety)的衍生物和任选的防腐剂。在一个优选的实方案中，水溶性抗原介 质包含浓度至少为15mM，优选至少30mM的NaCl。代表性的水溶性抗原溶 液或悬浮液将是经缓冲的，或pH值被调节到与胃肠道外或粘膜给药相一致的 pH。优选的固体制剂包括至少一种抗原，其含量按重量计为约0.00001％到约 5％。更优选抗原的量按重量计为约0.001％到约1％。还更优选抗原的量按重 量计为约0.01％到约0.05％。典型地，溶液中NaCl的浓度范围为约15mM到 约150mM。优选NaCl的浓度至少为20mM，更优选至少为约30mM。填充 材料(bulking material)按重量计为约50％到约99.99999％，优选为从60％到 约90％。

本发明的填充剂在高浓度的NaCl存在下可保持饼状物的化学和物理的稳 定性，防止饼状物萎缩。也提供对于抗原的保护。填充剂是糖类或它们的衍生 物，优选为无定形或结晶态，更优选无定形。依照本发明，优选的糖类是糖类 或其具有很高分子间相互作用力的衍生物(糖类的熔点越高，晶体的分子间相 互作用力越大)，从而可以获得固体形式，特别是饼状物结构，来对抗在冷冻 干燥过程中出现的坍塌现象。优选使用高分子量的糖类。

糖类衍生物优选具有反应性官能团，例如氨基部分或酸性部分。因此，本 发明优选使用具有酸性部分，也就是作为质子供体的部分的糖类衍生物。酸性 部分可以是单酸或多酸。可以提到的特别的酸性部分包括：-O-P(O)(OH)2(磷 酸酯)、-O-P(O)-O-P(O)(OH)2(二磷酸酯)、-O-P(O)-O-P(O)-O-P(O)(OH)2(三 磷酸酯)、-SO4H(硫酸酯)和-CO2H(羧酸)。优选的酸性部分是羧酸。糖类 衍生物可任选与糖类例如蔗糖联合使用。

糖类或糖类衍生物可任选地是一水化合物或多水化合物(二水化合物、三 水化合物等)。在一个更优选的实施方案中，所用的糖类是其羧酸衍生物的形 式。优选地，是以其羧酸盐的衍生物的形式来使用。因此，本发明的一方面提 供了适于冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾冷冻干燥或真空干燥的抗原组合物，其中 包括在水性介质中的抗原、糖类和任选的防腐剂，其中糖类是以其羧酸衍生物 形式存在。

更优选所使用的糖类衍生物是其盐形式，优选钙或钠盐，更优选为钠盐。

适于本发明的糖类的非限制性例子包括下面物质的羧酸衍生物：蔗糖，麦 芽糖，海藻糖，棉子糖，乳糖，果糖，半乳糖，甘露糖，麦芽酮糖，异麦芽酮 糖，半乳糖果糖，或右旋糖。优选的填充剂是：乳糖醇，山梨糖醇，葡萄糖， 半乳糖和半乳糖醇即乳糖酸，葡糖酸，葡糖醛酸，半乳糖醛酸，和半乳糖二酸 的羧酸衍生物。可以是它们的无水或水合形式(见表1)。甚至更优选的，可优 选使用乳糖酸(如图1所示)、葡糖醛酸、葡糖酸和乳糖酸，更优选地，是有 利于形成糖-糖分子间相互作用的盐形式。钠或钙盐是优选的。最优选的填充 剂是乳糖醛酸钠。典型地，所使用的糖类衍生物的浓度大约为80mM或更高 (冷冻干燥之前的液体混合物)。这样就可提供可接受的饼状物结构并使其长 期保持稳定。

表1.糖类及其羧酸及盐类衍生物

表1显示，与相应的非离子型分子相比，在离子型分子的晶状固体晶畴中， 分子和分子间的相互作用力较高(由很高的熔点来证明)。

糖类和衍生物   特征  熔点 乳糖醇   4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-山梨糖醇  146℃ 乳糖酸   4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-葡糖酸   乳糖醇结构中山梨糖醇部分的伯醇被羧酸代替；   从而为离子键相互作用创造了机会  195℃ 山梨糖醇或D-山梨糖醇   1，2，3，4，5，6-己六醇  110℃ 葡糖酸   2，3，4，5，6-五羟基-己酸   山梨糖醇结构中的伯醇被羧酸代替；从而形成离子键相互作用  131℃ 葡萄糖酸铵   葡糖酸的铵盐  154℃ 葡萄糖   α-D-吡喃葡萄糖  α：146℃  β：148℃ 葡糖醛酸   葡萄糖的伯醇被羧酸代替；从而形成离子键相互作用  165℃ 半乳糖—水合物   α-D-吡喃半乳糖  118℃ 半乳糖醛酸—水合物   半乳糖的伯醇被羧酸代替；从而形成离子键相互作用  α：159℃  β：166℃ 半乳糖醇   1，2，3，4，5，6-己六醇  188℃ 半乳糖二酸   半乳糖醇的两个伯醇被两个羧酸代替；从而形成离子键相互作用  225℃

任何可接受的饼状物结构是指符合任何，优选符合所有的下列标准：

-饼状物的体积与冷冻干燥步骤前的初始液体体积相似；

-饼状物的大小(size)与冷冻干燥之前的液体相似。换句话说，与冷冻干 燥之前最初的液体相比饼状物仅出现尽可能少量的收缩。

-饼状物的外观呈均质性(homogeous)。

饼状物的尺寸和体积的测量依照下面实施例部分第3.2段所描述的方法进 行。

此外，可接受的饼状物结构也可理解为经过一星期37℃的加速稳定试验 后其形状、尺寸和颜色没有变化的团块，或者经过至少六个月的实时稳定性试 验(优选至少一年，理想的是至少两年)其形状、尺寸和颜色无任何变化的团 块。

防腐剂选自抗氧化剂、自由基清除剂和还原剂。优选为抗氧化剂，例如没 食子酸烷基酯，丁基化的羟基茴香醚，丁基化的羟基甲苯，去甲二氢愈创木酸 和生育酚，抗坏血酸，异抗坏血酸，亚硫酸的钾和钠盐，甲醛合次硫酸钠，柠 檬酸，乙二胺四乙酸和它的盐，卵磷脂，酒石酸，硫二丙酸。

可以使用制药领域中任何普通的冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥、喷雾冷 冻干燥技术来制备本发明的抗原组合物。例如，冷冻干燥技术和其他合适的赋 形剂的详细资料，可参见Cameron等，″Good Pharmaceutical freeza-drying Practice″，Interpharm，Buffalo Grove(1997)。相应地，本发明另一方面提供在 此所定义的抗原组合物的制备方法，包括混合含有NaCl抗原的溶液、填充剂 和任选的缓冲溶液和防腐剂，然后冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥、喷雾冷冻 干燥所得的混合物。尽管本发明方法包括在环境温度下的蒸发作用，依照本发 明的优选方法是玻瓶冷冻干燥方法。例如，在一个工艺中，包括将无菌过滤的 抗原组合物无菌填充到无菌玻瓶中，接着通过冷冻干燥进行升华。将无菌的冷 冻干燥用的橡皮塞部分插入玻瓶中，然后，将玻瓶冷冻，举例来说，温度从-195.8 ℃到-5℃，优选在-80℃到-10℃之间，然后在冷冻状态下进行真空干燥。在干 燥之后，在从冷冻干燥装置取出玻瓶之前，完全插入塞子。

依照本发明的一个优选方法是喷雾干燥方法，采用或不采用同轴加压空气 (或惰气)，通过喷雾喷嘴用泵输送液体组合物来获得很小的组合物液滴。这 样的液滴在大量通气的区域形成(温度在+20℃到+250℃之间)，这样通过蒸 发作用获得快速干燥，在通过旋风分离器分离后获得干燥的粉末。

依照本发明的另一个优选方法是喷雾冷冻干燥方法，采用或不采用同轴加 压空气(或惰气)，通过喷雾喷嘴用泵输送液体组合物来获得很小的组合物液 滴。这样的液滴在很冷的室中形成(温度在-5℃到-195.8℃之间)，这样获得对 液滴的快速冷冻，在随后的标准冷冻干燥过程后获得干燥的冷冻物。

依照本发明的另一个优选方法是真空干燥方法。这一方法包括将组合物的 无菌滤过溶液无菌填充到无菌玻瓶中。将无菌的冷冻干燥用的橡皮塞部分插入 玻瓶，然后对玻瓶施加受控的真空进行蒸发，一直到最后干燥。在从冷冻干燥 设备取出玻瓶之前，完全插入塞子。

对冷冻干燥或烘干过程加以控制，以保证饼状物中的残留水分的浓度小于 3％，优选小于2％，更优选为大约1％或更低。包封于其中的抗原在给药中保 持生物学的活性，也就是说能够诱导宿主的免疫反应。可以预见的是，本发明 的组合物可用于配制来源广泛的抗原的疫苗。例如，抗原可以包括：人、细菌、 或病毒的核酸，病原体衍生的抗原或抗原制品，肿瘤来源的抗原或抗原制品， 宿主衍生的抗原，包括GnRH和IgE肽，重组产生的蛋白质或肽，和嵌合体融 合蛋白。

优选地，本发明疫苗制剂包含能引起抗人病原体的免疫反应的抗原或抗原 组合物，所说的抗原或抗原组合物源自HIV-1(例如Tat、nef、gp120或gp160)， 人类疱疹病毒例如gD或它的衍生物或即刻早期蛋白(例如来自HSVl或HSV2 的ICP27)，巨细胞病毒((尤其是人类)(例如gB或它的衍生物)，EB病毒(例 如gp350或它的衍生物)，水痘-带状疱疹病毒(例如gpI、II和IE63)，或者来 自于肝炎病毒例如乙型肝炎病毒(例如乙型肝炎表面抗原或它的衍生物)，甲 型肝炎病毒，丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒，或来自其他的病毒病原体例如副 粘病毒：呼吸道合胞病毒(例如F和G蛋白或它的衍生物)，副流感病毒，麻 疹病毒，腮腺炎病毒，人乳头瘤病毒(例如HPV6、11、16、18，..)，虫媒病 毒(例如黄热病病毒、登革热病毒、蜱传播的脑炎病毒、日本脑炎病毒)或流 感病毒(全部存活或灭活的病毒，裂解流感病毒，生长在鸡蛋或MDCK细胞 中，或Vero细胞或全流感病毒体(例如R.Gluck，Vaccine，1992，10，915-920 所描述的)或纯化或其重组蛋白，例如HA、NP、NA、或M蛋白，或它们的 组合)，或衍生于细菌性病原体例如奈瑟氏菌属，包括淋病奈瑟氏菌和髓膜炎 奈瑟氏菌(例如荚膜多糖和它的轭合物，转铁蛋白结合蛋白，乳铁蛋白结合蛋 白，Pilc，粘附素)；致热螺旋体(例如M蛋白或其片段，C5A蛋白酶，脂磷 壁酸)，S.agalactiae，S.mutans；H.ducreyi；莫拉氏菌属，包括粘膜炎莫拉氏菌， 也已知为卡他布兰汉氏球菌(例如高和低分子量的细菌细胞表面配基和玻璃酸 酶)；博德特氏菌属，包括百日咳博德特氏菌(例如百日咳杆菌粘附素，百日 咳毒素或它们的衍生物，如丝状的红血球凝聚素，腺苷酸环化酶，噬菌体伞毛)， 副百日咳博德特氏菌和支气管脓毒素博德特氏菌；分枝杆菌属，包括结核病分 枝杆菌(例如ESAT6，抗原85A，-B或-C)，牛分枝杆菌，麻风分枝杆菌， M.avium，副结核分枝杆菌，齿垢分枝杆菌；军团杆菌属，包括嗜肺军团菌； 埃希氏杆菌属，包括肠源性结肠埃希氏杆菌属(例如定居因子，不耐热毒素或 它们的衍生物，耐热毒素或它的衍生物)，肠出血性大肠杆菌，致病性大肠杆 菌(例如志贺样毒素或它的衍生物)；弧菌属，包括霍乱弧菌例如霍乱毒素或 它的衍生物)；志贺氏菌属，包括索氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、弗氏志贺氏 菌；耶尔森菌属，包括结肠耶尔菌素(例如Yop蛋白)，黑死病耶尔菌素，伪 肺结核耶尔菌素；弯曲杆菌属，包括空肠弯曲杆菌(例如毒素、粘附素和透明 质酸酶)和结肠弯曲杆菌；沙门氏菌属，包括伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、 猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌，李斯特菌属，包括产单核细胞李斯特菌；螺 杆菌属，包括幽门螺杆菌(例如尿素酶，过氧化物酶，形成空泡的毒素)；假 单胞菌属，包括铜绿假单胞菌；葡萄球菌属，包括金黄色葡萄球菌，上皮葡萄 球菌；肠道球菌属，包括粪肠球菌、屎肠球菌；梭菌属，包括破伤风梭菌(例 如破伤风毒素和它的衍生物)，肉毒梭菌(例如肉毒杆菌毒素和它的衍生物)， 艰难梭菌(例如梭菌毒素A或B和它们的衍生物)；杆菌属，包括炭疽杆菌(例 如肉毒杆菌毒素和它的衍生物)；棒状杆菌属，包括白喉棒杆菌(例如白喉毒 素和它的衍生物)；包柔氏螺旋体属，包括布氏疏螺旋体(例如OspA、OspC、 ObpA、DbpB)，嘎氏疏螺旋体(例如OspA、OspC、ObpA、DbpB)，安德森 疏螺旋体(例如OspA、OspC、ObpA、DbpB)，赫氏蜱疏螺旋体；埃里希氏 体属，包括马埃利希氏体和人类细胞性埃利希体病试剂；立克次体，包括立氏 立克次体；衣原体属，包括砂眼衣原体(例如MOMP，肝素结合蛋白)，肺炎 衣原体(例如MOMP，肝素结合蛋白)，鹦鹉热衣原体；细螺旋体属，包括问 号钩端螺旋体；密螺旋体属，包括苍白密螺旋体(例如罕见外膜蛋白)，齿垢 密螺旋体，猪痢疾密螺旋体；或者衍生自寄生虫例如原形体，包括恶性疟原虫； 弓形体属，包括Tgondii(例如SAG2，SAG3，Tg34)；内变形虫属，包括痢 疾阿米巴；巴贝虫属，包括B.microti；锥虫属，包括T.cruzi；贾第虫属，包括 贾第虫属；Leshmania spp.，包括L.major；肺囊虫，包括P.carinii；毛滴虫属， 包括T.vaginalis；Schisostoma spp.，包括S.mansoni，或衍生自酵母例如假丝酵 母属，包括白体假丝酵母；隐球菌属，包括新型细球菌隐球菌，在本发明一个 优选方面，用于口服给药的快速溶解的疫苗饼状物不包含轮状病毒。

优选的细菌性疫苗包括衍生自链球菌属，包括肺炎链球菌的抗原(例如荚 膜多糖和它的轭合物PsaA、PspA，链球菌溶血素，胆碱结合蛋白)和蛋白抗 原肺炎球菌溶血素(Biochem Biophys Acta，1989，67，1007；Rubins等，Microbial Pathogenesis，25，337-342)，及其突变去毒的衍生物(WO90/06951； WO99/03884)。其他优选的细菌性疫苗包括衍生自嗜血杆菌属的抗原，该嗜血 杆菌包括流感嗜血杆菌型B(例如PRP和它的轭合物)，非可分型(non- typeable)的流感嗜血杆菌，例如OMP26，高分子量的细菌细胞表面配基，P5， P6，蛋白质D和脂蛋白D，和丝束蛋白和丝束蛋白衍生肽(US 5,843,464)或 多备份(multiple copy)形式变异体或其融合蛋白。其他优选的细菌性疫苗包 括衍生自粘膜炎莫拉氏菌(包括它的外膜囊泡，和OMP106(W097/41731))和 脑膜炎奈瑟氏球菌B(包括它的外膜囊泡，和NspA(WO 96/29412)的抗原。

乙型肝炎表面抗原的衍生物是本领域熟知的，包括尤其是那些在欧洲专利 申请EP-A-414374；EP-A-0304578，和EP 198-474中描述的PreS1、PreS2 S抗 原。在本发明的另一个优选方面中，疫苗制剂包含HIV-1抗原、gpl20，特别 是在CHO细胞中表达的抗原。在更进一步的实施方案中，本发明的疫苗制剂 是包含如上文所述的gD2t。

在本发明的一个优选的实施方案中，疫苗包含源于人乳头瘤病毒(HPV)的 抗原，它被认为是负责生殖器疣(HPV 6或HPV 11等)，和HPV病子宫颈癌 的病毒(HPV16、HPV18等)。

特别优选的预防或治疗生殖器疣的疫苗形式包括LI微粒或衣壳体，和一 种或多种选自HPV6和HPV 11蛋白质E6、E7、LI和L2的抗原的融合蛋白。 最优选的融合蛋白形式是：L2E7，例如在WO 96/26277披露的，和在GB 9717953.5(PCT/EP98/05285)中披露的蛋白质D(1/3)-E7。

优选的用于预防和治疗HPV子宫颈感染或癌的疫苗组合物包含HPV 16 或18抗原。例如，L1或L2抗原单体，或病毒样微粒(VLP)形式的LI或L2抗 原或者单独出现在VLP或病毒衣壳体结构中的L1独自蛋白。这样的抗原、微 粒样病毒和病毒衣壳体是已知的。例如可以参见WO94/00152、WO94/20137、 WO94/05792和WO93/02184。也可以包括单独或作为融合蛋白形式的早期蛋白 质，例如优选自E7、E2或E5；特别优选的示例包括包含L1E7融合蛋白的VLP (WO96/11272)。

特别优选的HPV16抗原包含早期蛋白E6或E7，所述E6或E7与来自 HPV16的蛋白质D载体融合形成蛋白质D-E6或E7或它们的组合；或L2与 E6或E7的组合(WO 96/26277)。另外，HPV 16或18早期蛋白E6和E7可 呈单一分子的形式，优选的是蛋白质D-E6/E7融合体。这样的疫苗可任选地包 含来自HPV18的E6和/或E7蛋白，优选地以蛋白质D-E6或蛋白质D-E7 融合蛋白或蛋白质D E6/E7融合蛋白的形式。

本发明的疫苗还可以包含来自于其他HPV株的抗原，优选来自于HPV 6、 11、31、33或45株。

本发明的疫苗更进一步包含来自可引起疟疾的寄生虫抗原。例如，优选的 抗原来自镰刀状疟原虫包括RTS、S和TRAP。RTS是杂合体蛋白质，其基本 上包括镰刀状疟原虫的环孢(CS)蛋白的所有C-端部分，所述C-端部分通过 乙型肝炎表面抗原上preS2部分的4个氨基酸与乙型肝炎病毒的表面(S)抗 原结合。它的完整结构在国际专利申请PCT/EP92/02591中被披露，(WO 93/10152享有UK专利申请9124390.7的优先权)。在酵母中表达时，RTS以 脂蛋白微粒形式生成，当与来自HBV的S抗原共同表达时，形成已知的RTS、 S的混合颗粒。TRAP在国际专利申请PCT/GB89/00895中被描述，公开于WO 90/01496。本发明一个优选的实施方案是疟疾疫苗，其中的抗原制品包含RTS、 S和TRAP抗原的组合。可能作为多级疟疾疫苗的候选成分的其他疟原虫抗体， 包括镰刀状疟原虫MSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、 钳合蛋白、PfEMP1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、 Pfs28、PFS27/25、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230及其疟原虫类似物。

所述制剂也可以包含抗癌抗原，并可用于治疗癌症的免疫疗法中。例如， 这种佐剂制剂被发现可与肿瘤排异抗原一起应用，所述肿瘤例如前列腺癌、乳 癌、结肠直肠的癌、肺癌，胰癌、肾脏癌或黑素瘤癌。示例抗原包括MAGE1和 MAGE3或者用于治疗黑素瘤的其他MAGE抗原，PRAME，BAGE或GAGE (Robbins和Kawakami，1996，Current Opinions in Immunology 8，628-636页； Van den Eynde等，International Journal of Clinical & Laboratory Research(1997 发表)；Correale等(1997)，Journal of the National Cancer Institute 89，p293。 确实，这些抗原在许多肿瘤类型(例如黑素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌)中被表 达。其他的肿瘤特异性抗原包括但不限于：前列腺特异性抗原(PSA)或Her- 2/neu，KSA(GA733)，MUC-1，PRAME，癌胚抗原(CEA)，PSCA(PNAS 95 (4)1735-17401998)，PSMA，P501S(Wo98/37814中的113序列号IO)即 已知为PS108或前列腺蛋白(WO 98/50567)。另一个肿瘤抗原是前列腺特异 性丝氨酸蛋白酶(前列腺酶，胰蛋白酶样)披露在Ferguson，等(Proc.Natl.Acad. Sci.USA 1999，96，3114-3119)和国际专利申请WO 98/12302(相应的已授权 专利US 5,955,306)、WO98/20117(相应的已授权专利US 5,840,871和US 5,786,148)(前列腺特异性激肽释放酶)和WO00/04149(P703P)。其他前列腺 特异性抗原已知来自Wo98/37418，和WO/004149。另一个抗原是STEAP PNAS 96 14523 145287-121999。用于本发明中的其他与肿瘤相关的抗原包括：Plu-1， J Biol.Chem 274(22)15633-15645，1999；HASH-2(WO01/62778)，cripto (Salomon等Bioessays 199，21 61-70，US5654140)Criptin美国专利5 981 215。 其他与治疗癌症疫苗特别相关的抗原还包括酪氨酸酶和生存素。

其他适合本发明使用的肿瘤特异性抗原包括但不限于肿瘤特异性神经节苷 脂例如GM2和GM3或其载体蛋白共轭物；或所说的抗原是自身肽激素例如 完整长度的促性腺激素释放激素(GnRH，WO 95/20600)，短的10个氨基酸 肽，用于治疗多种癌症，或用于免疫去势(immunocastration)。

可以预见的是，本发明的组合物可用于配制含有来源于疏螺旋体属的抗原 的疫苗。例如，抗原可以包括核酸、病原体衍生的抗原或抗原制品、重组形成 的蛋白质或肽和嵌合体融合蛋白。特别的抗原是OspA。OspA可以是脂质化 (lipidated)形式的具有宿主细胞(E.Coli)优点的完全成熟的蛋白，被称为 (Lipo-OspA)或者是未脂质化的衍生物。这样的未脂质化的衍生物包括未脂 质化的NS1-OspA融合蛋白，其具有流感病毒上非结构蛋白(NS1)和完整OspA 蛋白的第一个81-N端氨基酸，而另一种MDP-OspA是非脂质化形式的携带3 个额外N-氨基末端氨基酸的OspA。

本发明的疫苗可以用于预防或治疗变态反应。这样的疫苗将包含变应原特 异性(例如Der pl)和变应原非特异性抗原(例如源于人IgE的肽，包括但不 限于stanworth十肽(EP 0 477 231B1))。

在使用过程中但是在给药前，一般可在药学上可接受的稀释剂或载体中重 建本发明的组合物。药学上可接受的稀释剂的例子包括水和盐水。优选在给患 者服药前对组合物或疫苗进行重建。优选溶解饼状物的时间小于10秒，更优 选小于5秒，优选小于3秒，最优选小于1秒。

在本发明的一些实施方案中，抗原可用药学上的载体进行配制。本发明的 疫苗可使用的药用载体包括本领域已知适合口服给药的、特别适合于婴儿的载 体。

本发明的病毒也可配制于基于脂质的载体中，例如病毒体或脂质体、水包 油乳液或载体微粒中。

有利地，其他免疫兴奋剂包括皂角苷衍生物，例如QS21和单磷酸类脂A， 尤其是3-去-O-酰化单磷酸类脂A(3D-MPL)。作为佐剂的纯化皂角苷在WO 98/56415中有所描述。皂角苷和单磷酸类脂A可单独或结合应用(举例来说可 见于WO 94/00153中)，也可与其他试剂一起配置在佐剂系统中。3D-MPL是 由Ribi Iinmunochem(Montana)生产的佐剂，其生产工艺在GB 2122204有所 描述。

氢氧化铝是本发明疫苗组合物中特别优选的成分。

本发明的抗原组合物溶液和在重建后获得的溶液是等渗溶液。在一个优选 的实施方案中，本发明组合物的pH值从大约6到大约10，优选从大约7到大 约9。本发明的抗原组合物可在经粘膜或胃肠道外，优选胃肠道外，最优选经 静脉、皮下或肌肉注射给药时重建。不管用什么方法，如果需要的话可以是其 他适当的剂型(例如鼻腔喷雾和其他粘膜制剂)。

当供非肠道给药时，本发明的组合物可被包装在合适的药用装置，例如注 射器、玻瓶或安瓿中，这样加入稀释剂或载体就可原位配制含有活性组分的适 宜立即给予患者的水溶液形式。这样的装置形成了本发明的一个方面。在粘膜 给药时，冻干的或干燥的制剂可以以密封于药用泡罩包装中的片剂形式提供。

本发明的另一方面提供包含减毒的活细菌或病毒、或活的病毒或细菌载体 的组合物，其中组合物是本发明的冻干固体或干燥固体，可在给药时快速溶解。

可采用已知技术配制和使用本发明疫苗，其中使用适量的活病毒有效地抗 感染并且对接受疫苗者没有明显的不良反应。活病毒的合适用量通常是每剂量 104到107ffu。疫苗的典型剂量可以是每剂量包含105到106ffu，也可以在一段 时间给若干剂量，例如间隔两个月给予2个剂量。然而，可以给予2个以上的 剂量，例如3或4个剂量的方法，尤其是在发展中国家。剂量的间隔期可以多 于或少于两个月。可以通过对抗体滴度的标准研究和其他对受试者有影响的反 应，来确定单/多剂量方案的最佳活病毒量、最佳给药次数。

可对每一疫苗剂量中的蛋白质量加以选择，该量应能诱导典型的接受疫苗 者的免疫保护性反应，但没有明显的不良反应。这取决于所用的特定免疫原及 其表现。一般地，每剂量预期包含1-1000μg的蛋白质，优选1-500μg，更优 选1-100μg，最优选1到50μg。可采用观察接受疫苗者出现适当免疫反应的 标准试验，来确定具体疫苗的最佳用量。在最初的接种疫苗之后，受试者需要 一个或多个间隔开的促升免疫。

本发明通过下列实施例进行详细说明。

实施例I

最大浓度的PO4-NaCl缓冲溶液获得可接受的冻干饼状物，使用标准的冷 冻干燥糖类

1.1.导言

在一个标准的冻干循环中采用多种浓度的磷酸盐(PO4)/NaCl缓冲溶液。

磷酸盐-NaCl缓冲溶液可相当于简单的磷酸盐缓冲液(无NaCl)。

在配制过程中，为了使每种缓冲剂经类似稀释后具有相当的渗透压(包括 糖类贡献的渗透压)，应对浓度加以调节。在从此以后呈现的本发明的表格中， 存在于最终制剂中的浓度是恰好在冷冻干燥步骤之前得到的。

    PO4/NaCl     8/120mM     6/90mM     4/60mM     2/30mM     1/15mM     PO4     120mM     90mM     60mM     30mM     15mM

1.2.结果

依照实施例3.2.中列出的标准来评定饼状物的外观

1.2.1蔗糖(3.15％)组合物   PO4/NaCl  mOsm/Kg 饼状物 t＝0 饼状物 t＝1周37℃ 饼状物 t＝2周37℃ 结果   8-120mM     297 无饼状物 无饼状物 无饼状物 不合格   6-90mM     268 无饼状物 无饼状物 无饼状物 不合格   4-60mM     204 收缩 收缩 收缩 不合格   2-30mM     153 轻微收缩 轻微收缩 轻微收缩 合格   1-15mM     124 轻微收缩 轻微收缩 轻微收缩 合格   PO4   mOsm 饼状物   饼状物   饼状物   结果   /Kg t＝0   t＝1周37℃   t＝2周37℃   120mM   352 轻微收缩   收缩   收缩   不合格   90mM   299 轻微收缩   轻微收缩   轻微收缩   合格   60mM   218 轻微收缩   轻微收缩   轻微收缩   合格   30mM   160 轻微收缩   轻微收缩   轻微收缩   合格   15mM   127 轻微收缩   轻微收缩   轻微收缩   合格

1.2.2麦芽糖(3.15％)组合物 PO4-NaCl  mOsm   饼状物   饼状物   饼状物 结果  /Kg   t＝0   t＝1周37℃   t＝2周37℃ 8-120mM  299   无饼状物   无饼状物   无饼状物 不合格 6-90mM  267   收缩   收缩   收缩 不合格 4-60mM  206   收缩   收缩   收缩 不合格 2-30mM  145   轻微收缩   轻微收缩   轻微收缩 合格 1-15mM  113   轻微收缩   轻微收缩   轻微收缩 合格 PO4  mOsm   饼状物   饼状物   饼状物 结果  /Kg   t＝0   t＝1周37℃   t＝2周37℃ 120mM  334   轻微收缩   收缩   收缩 不合格 90mM  272   轻微收缩   收缩   收缩 不合格 60mM  215   轻微收缩   轻微收缩   轻微收缩 合格 30mM  153   轻微收缩   轻微收缩   轻微收缩 合格 15mM  117   外观好的饼状物   轻微收缩   轻微收缩 合格

1.2.3海藻糖(3.15％)组合物 PO4-NaCl  mOsm   饼状物   饼状物   饼状物   结果  /Kg   t＝0   t＝1周37℃   t＝2周37℃ 8-120mM  312   无饼状物   无饼状物   无饼状物   不合格 6-90mM  265   无饼状物   无饼状物   无饼状物   不合格 4-60mM  204   收缩   收缩   收缩   不合格 2-30mM  142   轻微收缩   轻微收缩   轻微收缩   合格 1-15mM  112   轻微收缩   轻微收缩   轻微收缩   合格

  PO4   mOsm   饼状物   饼状物   饼状物 结果   /Kg   t＝0   t＝1周37℃   t＝2周37℃   120mM   326   收缩   收缩   收缩 不合格   90mM   293   收缩   收缩   收缩 不合格   60mM   215   轻微收缩   轻微收缩   轻微收缩 合格   30mM   146   轻微收缩   轻微收缩   轻微收缩 合格   15mM   111   轻微收缩   轻微收缩   轻微收缩 合格

1.2.4棉子糖(3.15％)组合物   PO4-NaCl   mOsm   饼状物   饼状物   饼状物   结果   /Kg   t＝0   t＝1周37℃   t＝2周37℃   8-120mM   288   无饼状物   无饼状物   无饼状物   不合格   6-90mM   232   收缩   收缩   收缩   不合格   4-60mM   168   轻微收缩   收缩   收缩   不合格   2-30mM   111   轻微收缩   轻微收缩   轻微收缩   合格   1-15mM   70   轻微收缩   轻微收缩   轻微收缩   合格   PO4   mOsm   饼状物   饼状物   饼状物   结果   /Kg   t＝0   t＝1周37℃   t＝2周37℃   120mM   289   轻微收缩   轻微收缩   轻微收缩   合格   90mM   231   轻微收缩   轻微收缩   轻微收缩   合格   60mM   173   轻微收缩   轻微收缩   轻微收缩   合格   30mM   118   轻微收缩   轻微收缩   轻微收缩   合格   15mM   80   轻微收缩   轻微收缩   轻微收缩   合格

1.2.5结论

制剂中的磷酸盐(PO4)/NaCl与冷冻干燥不相容。确实，在浓度超过2mM PO4/30mMNaCl时，所得的饼状物结构是不可接受的。当采用PO4/NaCl缓 冲液时，蔗糖、麦芽糖、海藻糖和棉子糖得到相同的结果。

很清楚NaCl对冷冻干燥中不好的结果负责任。确实，使用PO4(无NaCl) 的缓冲液会达到高得多浓度：

-最高达120mM PO4，对于棉子糖

-最高达90mM PO4，在蔗糖中

-最高达60mM PO4，对于麦芽糖和海藻糖

1.3.蔗糖分子排列有美感的外观

图2显示在无NaCl存在时无定形蔗糖分子排列有美感的外观。没有显示 残留的水分子。

冻干的饼状物结构基本上是基于“糖-糖”分子相互作用构建的。所述分 子间的相互作用是分子定向、分子构象和成分原子的原子半径的结果。

无定形结构(分子间的高度无序(deorder))的分子间相互作用比晶体结 构(分子间的高度有序)要弱。

比较起来，图3显示了在有60mMNaCl存在时，90mM蔗糖的无定形分 子排列有美感的外观。没有显示残留水分子。

氯化钠的离子相互作用干扰了“糖-糖”分子间相互作用。实施例I中的 结果显示，NaCl的存在减弱了“糖-糖”分子间相互作用。

实施例II

在给定的固定PO4(4mM)-NaCl(60mM)浓度下，对能形成可接受的 冻干饼状物的几种糖类(或赋形剂)进行评价。

这些试验的目标值设定在一定的PO4(6mM)-NaCl(60mM)浓度下， 如实施例I所示，该NaCl浓度导致不可接受的冻干饼状物结构，通常在纯化 后在最终的抗原溶液中达到这个结构。

试验1

除了常规蔗糖以外，采用具有羧酸官能团的糖类分子固结饼状物结构。 乳糖酸如图一所示。

蔗糖 PO4/NaCl   糖类衍生物 mM 饼状物 饼状物1周37℃ 结果 2.08％ 4mM/60mM   乳糖酸钙 9.6mM 轻微收缩 轻微收缩 合格

试验2

使用具有羧酸官能团的糖类分子来固结饼状物的结构(在没有蔗糖的情况 下)。

这样，在乳糖酸系列中，它们的盐(Na、Ca、或Tris抗衡离子)的性质 在“糖-糖”分子间的相互作用中扮演重要角色。Tris分子较大(相对于Na)， 所以将“糖类”分子彼此推开，减弱了“糖-糖”相互作用(相对于Na)。

在固定的NaCl浓度时：

  PO4/NaCl   糖类衍生物   糖类mM   饼状物   T＝0   饼状物   1周37℃   结果   4mM/60mM   乳糖酸钠   87   好   好   合格   4mM/60mM   乳糖酸钙   87   轻微收缩   轻微收缩   合格

在递降的NaCl浓度时：

  PO4/NaCl 糖类 衍生物   糖类mM     mOsm/Kg 饼状物 T＝0  饼状物1周37℃   结果   4mM/60mM 乳糖酸钠     87     242 轻微收缩  轻微收缩   合格   4mM/60mM 乳糖酸钠     80     251 轻微收缩  轻微收缩   合格   0.8mM/12mM 乳糖酸钠     70     143 良好饼状物  良好饼状物   合格   1.6mM/24mM 乳糖酸钠     70     175 轻微收缩  轻微收缩   合格   2.4mM/36mM 乳糖酸钠     70     197 轻微收缩  轻微收缩   合格   3.2mM/48mM 乳糖酸钠     70     219 轻微收缩  轻微收缩   合格：界线

试验3

使用具有羧酸官能团的糖类分子来固结饼状物的结构，采用糖类的不同羧 酸的衍生物。

PO4/NaCl 糖类衍生物 糖类Na 盐mM   mOsm/Kg 饼状物 T＝0 饼状物1 周37℃   结果 4mM/60mM 半乳糖醛酸 90mM     272 轻微收缩 轻微收缩   合格 4mM/60mM 半乳糖醛酸 85mM     265 轻微收缩 轻微收缩   合格 4mM/60mM 半乳糖醛酸 80mM     254 轻微收缩 轻微收缩   界线 4mM/60mM 半乳糖醛酸 80mM     254 轻微收缩 轻微收缩   合格 4mM/60mM 乳糖酸 100mM     280 轻微收缩 轻微收缩   合格 4mM/60mM 乳糖酸 95mM     268 轻微收缩 轻微收缩   合格 4mM/60mM 乳糖酸 90mM     263 轻微收缩 轻微收缩   界线 4mM/60mM 乳糖醛酸钠 92mM     277 轻微收缩 轻微收缩   合格 4mM/60mM 半乳糖醛酸钠 92mM     247 轻微收缩 轻微收缩   合格

实施例III

原料和方法

1.抗原组合物的制备

通过无菌操作，逐步地依次加入并混合正确定量的无菌水、无菌的浓缩的 糖类溶液、无菌的浓缩的缓冲液、无菌的浓缩的盐溶液和无菌的浓缩的抗原溶 液，制得配方的大量混合物。

将配制好的大量混合物分装入适于冷冻干燥的小玻瓶中(典型地在3ml有 机硅玻璃小瓶中装有0.5ml所述混合物)。

将冷冻干燥橡皮塞放置在小瓶上(部分密封的)。

2.冷冻干燥

将含有0.5ml配制好的疫苗的小瓶放置在预冷(-69℃)冷冻的干燥器 (Martin-Christ或Usifroid)中，同时监测和调节冷冻干燥条件，以尽可能遵 循下述时间—温度曲线：

在真空操作结束时，通过推压塞子将小瓶完全密封。

然后用铝制瓶帽密封塞子。

在分析或使用前，将冻干的玻璃瓶放置在+4℃储存。

3.对饼状物的外观检查

3.1.在37℃下加速的稳定性

将含有制剂的十个冻干玻瓶放置在通风橱(37℃)中一个星期，然后储藏 在+4℃。然后检查饼状物。

3.2.饼状物检查

在对冻干的饼状物进行冷冻干燥和加速的稳定性试验(在37℃7天)后， 进行目检。

测量饼状物的尺寸来评估收缩百分率，然后依照不同类别进行分类：

-收缩 意思是指饼状物的最初尺寸(高度或直径)至少减少20％

-轻微收缩 意思是指饼状物的最初尺寸(高度或直径)至多减少20％

-合格 意思是指在冻干后和在37℃一周后饼状物的最初尺寸(高度或直 径)至多减少20％，同时在37℃下一星期后也没有发生颜色改变

-不合格 意思是指仅仅在冻干后或者在37℃下一周后饼状物的最初尺寸 (高度或直径)至少减少了20％，或者在37℃下一星期后发生颜色改变

将刻度尺置于玻瓶底面，并通过玻璃观测饼状物直径(或高度)来测量饼 的侧面。

4.缓冲剂

选用磷酸盐-NaCl缓冲剂(在室内也称为“磷酸盐10-150”)，因为大多数 抗原是在这样的缓冲溶液中纯化的。需要指出的是，我们使用NaH2PO4+K2HPO4 的组合。通过称量准确的NaH2PO4/K2HPO4的比例，以获得所需pH值。这 样，不用HCl或NaOH来调节缓冲剂的pH值。

逐渐减少的数量：在配制过程中使用0.4、0.3、0.2、0.1和0.05ml的缓冲 剂。最终的填充体积总是0.5ml。

不含NaCl的选择磷酸盐缓冲剂，使其与磷酸盐-NaCl缓冲剂相当。开始 是150mM的溶液，在配制过程中使用逐渐减少的数量：0.4、0.3、0.2、0.1和 0.05ml。

渗透压

通过Friske型1/10渗压计来进行测量。