一种疫苗组合物及其制备方法和应用
阅读：232发布：2023-03-06
专利汇可以提供一种疫苗组合物及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 关于一种 疫苗 组合物，其含有 猪瘟 病毒 抗原 、猪 圆环病毒 2型抗原、猪 肺 炎支原体抗原和疫苗佐剂。本发明还提供一种制备疫苗组合物的方法，采用 水 溶性疫苗佐剂配制含 猪圆环病毒 2型抗原和猪肺炎支原体抗原的混合物，将所述混合物作为稀释剂稀释 猪瘟病毒 抗原。本发明的疫苗组合物，制备方法简单，疫苗的效价含量高，免疫方便快捷，仅免疫1次就能够同时 预防 或 治疗 猪瘟、猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体三种病原感染，降低了免疫成本，节约了免疫程序，更加经济可靠。，下面是一种疫苗组合物及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种疫苗组合物，其特征在于，含有猪瘟病毒抗原、猪圆环病毒2型抗原和猪肺炎支原体抗原；
所述猪瘟病毒抗原为活病毒抗原，所述猪瘟病毒为由中国兽医药品监察所保藏，保藏号AV1412的猪瘟病毒兔化弱毒株；
所述猪圆环病毒2型抗原为灭活的PCV2全病毒抗原；所述猪圆环病毒2型为在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期：2008年3月4日，保藏号为CGMCC NO：2389的猪圆环病毒2型SH株；
所述猪肺炎支原体抗原为灭活的全细胞菌体；所述猪肺炎支原体为保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年6月13日，保藏编号为：CCTCC NO：M2012230的猪肺炎支原体HN0613株；
所述猪瘟病毒含量为104.0～106.0TCID50/头份，所述猪肺炎支原体含量为107.0～1010.0
4.0 6.0
MHDCE/头份，所述猪圆环病毒2型含量为10 ～10 TCID50/头份。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物还包括疫苗佐剂，所述疫苗佐剂为Gel 01、氢氧化铝胶、卡波姆、蜂胶、ISA206或ISA760VG中的一种或几种的组合。
3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物还包括冻干保护剂，所述冻干保护剂为2wt%明胶水溶液与15wt%乳糖水溶液以1:1的体积比例混合所得的混合物。
4.一种制备疫苗组合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用疫苗佐剂配制含猪圆环病毒2型抗原和猪肺炎支原体抗原的混合物，将猪瘟病毒抗原与冻干保护剂混合制备含猪瘟病毒抗原的组合物，然后用所述混合物稀释所述含猪瘟病毒抗原的组合物；
所述猪瘟病毒抗原为活病毒抗原，所述猪瘟病毒为由中国兽医药品监察所保藏，保藏号AV1412的猪瘟病毒兔化弱毒株全病毒抗原；
所述猪圆环病毒2型抗原为灭活的PCV2全病毒抗原；所述猪圆环病毒2型为在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期：2008年3月4日，保藏号为CGMCC NO：2389的猪圆环病毒2型SH株；
所述猪肺炎支原体抗原为灭活的全细胞菌体；所述猪肺炎支原体为保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年6月13日，保藏编号为：CCTCC NO：M2012230的猪肺炎支原体HN0613株；
所述猪瘟病毒含量为104.0～106.0TCID50/头份，所述猪肺炎支原体含量为107.0～1010.0 MHDCE/头份，所述猪圆环病毒2型含量为104.0～106.0 TCID50/头份。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述猪圆环病毒2型抗原和猪肺炎支原体抗原的混合物为二联灭活疫苗，所述含猪瘟病毒抗原的组合物为冻干活疫苗。
6.权利要求1~3中任一项所述的疫苗组合物在制备预防和/或控制猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体混合感染的药品中的应用。
一种疫苗组合物及其制备方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 猪瘟是猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，主要特征是高温、微血管变性而引起全身出血、坏死、梗塞。早年又称猪霍乱，对猪危害极为严重，给养猪业造成重大损失,但由于混合感染以及一些免疫抑制病原体的影响，造成了单用猪瘟疫苗防治效果的下降，猪瘟总有零星爆发。
[0003] 猪圆环病毒2型（Porcine circovirus，缩写：PCV）是迄今发现的一种最小的动物病毒。现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1为非致病性的病毒。PCV2为致病性的病毒，它是断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS）的主要病原，最早发现于加拿大（1991），很快在欧美及亚洲一些国家包括我国发生和流行，除PMWS外，PDNS（猪皮炎与肾病综合征）、PNP（增生性坏死性肺炎）、PRDC（猪呼吸道疾病综合征）、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦与PCV2感染有重要关联。PCV2及其相关的猪病，死亡率10%～30%不等，较严重的猪场在暴发本病时死淘率高达40%，给养猪业造成严重的经济损失。现已被世界各国的兽医与养猪业者公认为是继猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）之后新发现的引起猪免疫障碍的重要传染病。猪圆环病毒产生免疫抑制，容易发生烈性传染病。
[0004] 猪支原体性肺炎是由猪肺炎支原体引发的一种慢性肺炎，又称猪地方流行性肺炎。长期以来，本病一直被认为是对养猪业造成重大经济损失、最常发生、流行最广、最难净化的重要疫病之一。本病虽为老病，但近年来由于经常和PRRSV、圆环病毒、猪瘟病毒等其它病原混合感染，造成重大的经济损失而突显出了其重要性。猪肺炎支原体是条件性致病菌，可使机体抵抗力降低，极易继发感染链球菌病等，使病情加重和病死率升高，极易继发感染猪瘟病毒、猪圆环病毒2型等，使病情加重和病死率升高。
[0005] 本领域需要能产生保护性免疫应答以同时抵抗猪肺炎支原体和猪圆环病毒2型及猪瘟病毒感染的疫苗，减少所述混合感染的发生率和/或减轻所述感染的严重性，或预防与所述感染有关的临床表现，并且减少注射次数，降低动物的应激反应，有效控制猪瘟。
发明内容
[0006] 本发明的目的正是要发明一种安全且有效的疫苗组合物，用于同时预防猪瘟、猪圆环病毒2型病及猪支原体肺炎三种病原的混合感染引起的猪瘟防治效果下降，具体来说，本发明提供一种猪瘟、猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体的三联疫苗组合物，其包含猪瘟病毒抗原、猪圆环病毒2型抗原和猪肺炎支原体抗原。
[0007] 优选地，所述三联疫苗组合物，包含猪瘟活病毒抗原、猪圆环病毒2型灭活抗原和猪肺炎支原体灭活抗原。
[0008] 猪瘟活病毒抗原是指，包含至少一种在对猪给药后能诱导、刺激或增强抗猪瘟病毒感染的免疫应答的抗原的任何组合物。优选地，本发明疫苗组合物中，所述猪瘟病毒为减毒形式的全病毒抗原，可以是选自细胞源猪瘟病毒、兔源猪瘟病毒、脾淋源猪瘟病毒中的一种或几种。
[0009] 优选所述猪瘟病毒抗原为猪瘟病毒兔化弱毒株全病毒抗原。所述猪瘟兔化弱毒株由中国兽医药品监察所保藏，保藏号AV1412。
[0010] 优选地，本发明疫苗组合物中，所述的猪瘟病毒的含量为104.0～106.0TCID50/头份，5.0
更优选地10 TCID50/头份。
更优选地10 TCID50/头份。
[0011] 猪圆环病毒2型灭活抗原为选自猪圆环病毒2型全病毒抗原，含有猪圆环病毒2型免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何至少含有猪圆环病毒2型免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分中一种或几种。优选所述猪圆环病毒2型抗原为灭活的PCV2全病毒抗原和/或含有PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成份。
[0012] 本发明中，所述抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗PCV2感染的免疫应答。优选地，本发明疫苗组合物中，所述猪圆环病毒2型抗原为灭活形式的全病毒抗原，可以是江苏南农高科猪圆环病毒2型灭活疫苗的SH株、成都天邦和福州大北农猪圆环病毒2型灭活疫苗的DBN-SX07株、哈尔滨维科猪圆环病毒2型灭活疫苗的LG株、武汉科前猪圆环病毒2型灭活疫苗的WH株中的一种或几种。
[0013] 优选地，本发明疫苗组合物，猪圆环病毒2型抗原为灭活形式的猪圆环病毒2型SH株全病毒。所述猪圆环病毒2型SH株（Porcine Circovirus Type 2，strain SH），在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期：2008年3月4日，保藏号为CGMCCNO：2389。
[0014] 优选地，本发明疫苗组合物中，所述的灭活的猪圆环病毒2型灭活前含量为104.0～106.0TCID50/头份，更优选地105.0TCID50/头份。
[0015] 猪肺炎支原体抗原是指，包含至少一种在对猪给药后能诱导、刺激或增强抗猪肺炎支原体感染的免疫应答的抗原的任何组合物。优选地，所述猪肺炎支原体抗原是猪肺炎支原体全细胞菌苗，优选灭活形式的猪肺炎支原体细菌，含有至少猪肺炎支原体的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何其它含至少猪肺炎支原体的免疫原性氨基酸序列的多肽或成分。优选地猪肺炎支原体抗原是灭活形式的J株或猪肺炎支原体HN0613株全细胞菌体。最优选地，猪肺炎支原体抗原是灭活形式的猪肺炎支原体HN0613株全细胞菌体。所述猪肺炎支原体HN0613（Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613）的保藏编号为：CCTCC NO：M2012230，保藏于中国典型培养物保藏中心（简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学）。保藏日期为2012年6月13日。
[0016] 猪支原体肺炎抗原还可以包含以下疫苗组合物中的任一种抗原如勃林格殷格翰公司的猪支原体肺炎灭活疫苗和西班牙海博莱生物大药厂的喜可舒的J株、美国先灵葆雅公司的猪支原体肺炎灭活疫苗（ ）、美国普泰克公司的MycoGard、美国辉瑞公司的RespiFend 的MH P-5722-3株、梅里亚动物保健公司的猪克喘的BQ14株、南京天邦猪肺炎支原体的168株、普莱柯猪肺炎支原体HN0613株中的一种或几种。
[0017] 优选地，本发明疫苗组合物中，所述的灭活的猪肺炎支原体灭活前含量为107.0～1010.0MHDCE/头份，更优选地108.0～109.0MHDCE/头份，更优选地109.0MHDCE/头份。
[0018] 优选地，所述疫苗组合物还包括疫苗佐剂，所述疫苗佐剂为Gel01（法国SEPPIC）、氢氧化铝胶、卡波姆（Carbomer）（商品名Carbopol）、蜂胶、ISA206（法国SEPPIC）或ISA760VG（法国SEPPIC）中的一种或几种的组合。本发明所用的疫苗佐剂优选水溶性疫苗佐剂，例如Gel 01佐剂。
[0019] 优选地，所述疫苗组合物还包括冻干保护剂，所述冻干保护剂优选为2wt%明胶水溶液与15wt%乳糖水溶液以1:1(v/v)比例混合所得的混合物。
[0020] 本发明提供了一种制备所述疫苗组合物的方法，包括如下步骤：采用疫苗佐剂配制含猪圆环病毒2型抗原和猪肺炎支原体抗原的混合物，将猪瘟病毒抗原与冻干保护剂混合制备含猪瘟病毒抗原的组合物，然后用所述混合物稀释所述含猪瘟病毒抗原的组合物，得含猪圆环病毒2型抗原、猪肺炎支原体抗原和猪瘟病毒抗原的三联疫苗组合物。
[0021] 优选地，先将猪肺炎支原体菌液和猪圆环病毒2型病毒液分别进行灭活，然后将灭活检验合格的猪肺炎支原体抗原和猪圆环病毒2型抗原分别进行浓缩，配苗，制备得到灭活苗部分；猪瘟病毒液加入冻干保护剂，制备得到活苗部分，用所述灭活苗部分稀释所述活苗部分，即得所述含有圆环病毒抗原、猪肺炎支原体抗原和猪瘟病毒抗原的三联疫苗组合物。
[0022] 优选地，所述灭活苗部分包含猪圆环病毒抗原、猪肺炎支原体抗原和Gel 01佐剂，4.0 6.0 7.0
猪圆环病毒抗原含量为10 ～10 TCID50/头份，猪肺炎支原体抗原含量为10 ～
1010.0MHDCE/头份，Gel01佐剂，基于所述灭活苗部分含量为12%（V/V）；所述活苗部分中猪瘟病毒含量为104.0～106.0TCID50/头份，用所述灭活苗部分稀释所述猪瘟活苗部分，优选1:1（头份/头份），制成三联混合疫苗。
猪圆环病毒抗原含量为10 ～10 TCID50/头份，猪肺炎支原体抗原含量为10 ～
1010.0MHDCE/头份，Gel01佐剂，基于所述灭活苗部分含量为12%（V/V）；所述活苗部分中猪瘟病毒含量为104.0～106.0TCID50/头份，用所述灭活苗部分稀释所述猪瘟活苗部分，优选1:1（头份/头份），制成三联混合疫苗。
[0023] 本发明还提供一种所述疫苗组合物在制备预防或治疗猪瘟、猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎的药品中的用途。
[0024] 本发明提供的三联用疫苗组合物与单一疫苗相比，联合疫苗可以减少疫苗的接种次数，避免因漏种而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、储存乃至全部使用过程均需在较低温度下进行，即所谓的“冷链”，这种环环相扣的冷链运作，费用极高，使疫苗成本居高不下，而使用联合疫苗，则可以大大降低冷链运作的费用，因此具有显著的优越性。
[0025] 本发明的猪瘟、猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体抗原组合物及使用该组合物制备的预防和治疗猪瘟、猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体感染三联疫苗，不会产生抗原成份的相互免疫干扰或影响。预防和治疗猪瘟、猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体感染的三联疫苗与猪瘟、猪圆环病毒2型或猪肺炎支原体的单疫苗的效力相比，在对猪注射免疫过程中，猪体的应激反应出人预料地小，因此，本发明的三联疫苗安全性更佳，可以避免多次接种免疫出现的不良反应。
[0026] 此外，本发明提供的三联疫苗组合物，制备方法简单，疫苗的效价含量高，免疫方便快捷，与现有技术中的多次免疫，至少需要打2针或3针才能防治以上三种疾病的疫苗及其免疫方法相比，本发明仅免疫1次就能够预防猪瘟、猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体三种病原感染，降低了免疫成本，节约了免疫程序，更加经济可靠。
具体实施方式
[0027] 以下配合本发明的优选实施例，进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段。
[0028] 本发明所述“每头份”或“/头份”是指每头猪每次用疫苗量。未作特别说明之处，在本发明的实施方式中所述“每头份”或“/头份”为2ml。本发明所述疫苗佐剂包括但不限于：Gel01（法国SEPPIC）、氢氧化铝胶、卡波姆（Carbomer）（商品名Carbopol）、蜂胶、ISA206（法国SEPPIC）或ISA760VG（法国SEPPIC），优选水溶性疫苗佐剂，例如Gel01（法国SEPPIC）。
[0029] 本发明所述冻干保护剂的例子，包括但不限于：明胶水溶液、乳糖水溶液及其混合物，优选2wt%明胶水溶液与15wt%乳糖水溶液以1:1(v/v)比例混合所得的混合物。
[0030] 实施例1 猪圆环病毒2型抗原和猪肺炎支原体抗原的制备
[0031] 1 菌株来源
[0032] 制造及检验本品用的猪圆环病毒2型毒株为PCV-2毒株SH株，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期：2008年3月4日，保藏号为CGMCCNO：2389。
[0033] 制造及检验本品用的猪肺炎支原体菌株为猪肺炎支原体HN0613株，在中国典型培养物保藏中心（简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学）进行保藏，保藏日期：2012年6月13日，保藏编号：CCTCC NO：M2012230。
[0034] 制造及检验本品用的猪瘟病毒毒株为猪瘟兔化弱毒株（中国兽医药品监察所保藏，保藏号AV1412）。
[0035] 2 疫苗半成品的制备及检验
[0037] 2.1.1 猪肺炎支原体：
[0038] 一级种子的繁殖：冻干菌种（猪肺炎支原体HN0613株，保藏编号为CCTCC NO：M2012230），用液体培养基稀释，划线接种于固体培养基平皿上，置37℃培养7d，选择生长良好的菌落，接种于固体培养基斜面上，37℃培养7d，作为一级种子。
[0039] 二级种子的繁殖：取少量液体培养基洗一级种子的斜面培养物，接种于液体培养基大管中，置37℃培养7d，经检验纯粹后作为二级种子。
[0040] 2.1.2猪圆环病毒2型：将毒种用MEM液体培养基作1:9稀释，然后按细胞培养液体积的5％（V/V）接种于PK15细胞（购自中国兽药监察所）培养，37℃吸附30分钟，加入含4%（V/V）体积犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞维持液，37℃培养4日，冻融2～3次，收获病毒，作为生产用毒种。
[0041] 2.1.3 猪瘟病毒：用细胞维持液，将新鲜脾毒制成0.3%（V/V）～0.5%（V/V）的病毒悬液，接种生长良好的ST细胞，置36～37℃继续培养。每隔4～5天收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液，经安全性、纯净性和特异性检验合格后，作为生产用毒种。在-15℃以下保存，不超过6个月。
[0042] 2.2 制苗用菌液和病毒液的制备
[0043] 2.2.1 猪肺炎支原体菌液的制备：将液体培养基培养的猪肺炎支原体二级种子液以1:10（v/v）接种于液体培养基中。37℃下培养3～6日，培养物下降0.5个pH值以上，纯粹检验合格后，再以同样的方式扩大培养（继代次不超过6代）。培养结束后，取样，进行纯粹检验应纯粹。
[0044] 2.2.2 猪圆环病毒2型液的制备：用转瓶细胞培养法。将长满单层的PK15细胞（购自ATCC），倒去细胞培养液，将毒种液按细胞培养液体积5%的接种量接种于PK15细胞上，轻轻旋转细胞瓶2周，37℃吸附30分钟，加入细胞维持液，置37℃旋转（10～12转/小时）培养。每日观察1～2次，细胞生长良好，37℃培养4日收获细胞和细胞液，冻融3次，置-20℃以下保存，应不超过2个月。
[0045] 2.2.3 猪瘟病毒液的制备：取已形成良好单层的ST细胞培养瓶，弃去营养液，接种含3%（V/V）～5%（V/V）生产用细胞毒种的维持液，置36～37℃后继续培养。接毒后5天作第一次收获换液，以后每隔4天收获换液1次。各收次病毒培养液分别取样检验，应符合无菌检验和外源病毒检验标准规定。收获的病毒液置-15℃以下保存，应不超过3个月。
[0046] 2.3 含量测定
[0047] 2.3.1 猪肺炎支原体菌体含量测定：用PCR方法对培养物进行计数。10倍系列稀释所检培养物，然后做PCR，PCR检出的最低限量为3×10-3μg（相当于1000个左右的菌体），按稀释的倍数计数菌体数（沈青春，谭青松，王琴等人，PCR方法测定Mhp培养物菌数[J]，中国预防兽医学报，2006，28（1）：55～57）。培养物含量应为1～2×109MHDCE/ml。(MHDCE=猪肺炎支原体DNA细胞等同物，即1MHDCE相当于1个猪肺炎支原体)。
[0048] 2.3.2 猪圆环病毒2型含量测定：将病毒液用MEM维持液做10倍系列稀释，取10-5、-6 -710 、10 3个稀释度，每个稀释度分别接种96孔培养板PK15细胞单层4孔，每孔0.1ml，同时设立阴性对照，在37℃含5％（V/V）CO2的温箱中继续培养24小时，换含2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM维持液，继续培养24小时；用冷丙酮固定细胞，用间接免疫荧光试验（IFA）测定每个稀释度含有PCV-2阳性细胞（呈绿色）的孔数，根据Karber氏法计算病毒TCID50。每ml病毒含量应≥105.5TCID50。
[0049] 2.3.3猪瘟病毒含量测定：各收次病毒培养液分别采用间接免疫荧光法进行TCID50测定。每ml病毒含量应≥106.5TCID50。
[0050] 2.4 灭活
[0051] 2.4.1 猪圆环病毒2型液的灭活：将检验合格病毒液，按病毒液总量加入终浓度为0.2％的甲醛溶液（V/V），随即充分摇匀升温，当温度升至37℃时开始计时，保持18小时灭活完毕，加入0.2wt%的焦亚硫酸钠终止灭活，取样进行灭活检验。
[0052] 2.4.2 猪肺炎支原体菌液的灭活：将检验合格的猪肺炎支原体菌液，按菌液体积总量缓慢加入终浓度为0.2%的甲醛溶液（V/V），放37℃灭活，其间每隔4小时搅拌一次，24小时后取出，进行灭活检验。
[0053] 2.5 浓缩
[0054] 将灭活检验合格的猪肺炎支原体菌液和猪圆环病毒2型液分别采用超滤浓缩技术进行浓缩，浓缩后抗原含量分别为1011MHDCE/ml，107.0TCID50/ml。
[0055] 实施例2 猪瘟、猪圆环和猪肺炎支原体三联混合疫苗组合物的制备
[0056] 1 猪圆环和猪肺炎支原体二联灭活疫苗制备
[0057] 1.1 防腐剂的配制
[0058] 1%（w/v）的硫柳汞水溶液：1g硫柳汞溶解于100ml纯化水，121℃高压灭菌30min备用。
[0059] 1.2 稀释剂的配制
[0061] 1.3 疫苗佐剂处理
[0062] Gel01（法国SEPPIC）佐剂灭菌：将Gel01（法国SEPPIC）佐剂转入可灭菌容器内，121℃高压灭菌30min备用。
[0063] 1.4 配苗
[0064] 通过无菌操作，将实施例1中制备的浓缩猪圆环和猪肺炎支原体抗原与佐剂、稀释剂等按照不同配比混合后，用乳化机低速，例如在转速为10～12转/h下搅拌30min。灭活疫4.0 6.0 7.0
苗部分猪圆环病毒抗原含量为10 ～10 TCID50/头份，猪肺炎支原体抗原含量为10 ～
1010.0MHDCE/头份，Gel01佐剂，基于所述灭活苗部分含量为12%（V/V）。
苗部分猪圆环病毒抗原含量为10 ～10 TCID50/头份，猪肺炎支原体抗原含量为10 ～
1010.0MHDCE/头份，Gel01佐剂，基于所述灭活苗部分含量为12%（V/V）。
[0065] 2 猪瘟疫苗的制备
[0066] 将检验合格的猪瘟各收次病毒液，混合于同一容器，分别取适量混匀的病毒液进行浓缩和稀释，加入冻干保护剂（2wt%明胶水溶液与15wt%乳糖水溶液以1:1(v/v)比例配制）以1:1(v/v)比例混合后充分混匀，定量分装，迅速进行冷冻真空干燥，制成每头份病毒含量分别为104.0TCID50、105.0TCID50和106.0TCID50的活疫苗部分。
[0067] 3 三联苗的制备
[0068] 将实施例1中所制备的浓缩抗原按照表1的配比进行疫苗配制。使用前取灭活苗部分稀释活苗部分。
[0069] 表1疫苗配比具体实施案例
[0070]
[0071]
[0072] 实施例3 不同抗原含量的猪瘟、猪圆环和猪肺炎支原体三联混合疫苗效力检验[0073] 1 试验材料
[0074] 实施例2中制备的疫苗1（猪肺炎支原体107MHDCE/头份、猪圆环病毒2型104.0TCID50/头份）、疫苗2（猪肺炎支原体108MHDCE/头份、猪圆环病毒2型105.0TCID50/头份）、疫苗3（猪肺炎支原体109MHDCE/头份、猪圆环病毒2型106.0TCID50/头份）、疫苗4（猪肺炎支原体1010MHDCE/头份、猪圆环病毒2型2×106.0TCID50/头份）和疫苗5（猪肺炎支原体2×
1010MHDCE/头份、猪圆环病毒2型2×106.0TCID50/头份）。
1010MHDCE/头份、猪圆环病毒2型2×106.0TCID50/头份）。
[0075] 3～4周龄，无猪瘟、猪圆环和猪肺炎支原体抗体的断奶仔猪。
[0076] 2 试验方法
[0077] 2.1 安全试验
[0078] 选3～4周龄，无猪瘟、猪圆环和猪肺炎支原体抗体的断奶仔猪30只，随机分为6组，其中5组分别颈部肌肉注射两头份（4ml）疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4和疫苗5，剩余做为对照，观察两周，疫苗接种猪应无明显体温变化，精神食欲正常，无其他可见临床反应出现。
[0079] 2.2 效力检验
[0080] 选3～4周龄，无猪瘟、猪圆环和猪肺炎支原体抗体的断奶仔猪60头，随机分为12组，第1、2组免疫1头份疫苗1，第3、4组免疫1头份疫苗2，第5、6组免疫1头份疫苗3，第7、8组免疫1头份疫苗4，第9、10组免疫1头份疫苗5，间隔14d后，加强免疫1次。第11、12组为对照攻6.0
毒组。首免后35天，第1、3、5、7、9、11组用PCV-2SH株进行攻毒，肌肉注射2ml（含10 TCID50/ml），连续观察25天，进行剖检，记录发病数（包括死亡数），判定保护情况；第2、4、6、8、10、12组用猪肺炎支原体强毒株（CVCC354株）进行气管注射，5ml/头（2×109MHDCE/ml），30天后剖检统计肺病变，判定保护情况。
毒组。首免后35天，第1、3、5、7、9、11组用PCV-2SH株进行攻毒，肌肉注射2ml（含10 TCID50/ml），连续观察25天，进行剖检，记录发病数（包括死亡数），判定保护情况；第2、4、6、8、10、12组用猪肺炎支原体强毒株（CVCC354株）进行气管注射，5ml/头（2×109MHDCE/ml），30天后剖检统计肺病变，判定保护情况。
[0081] 3 试验结果
[0082] 3.1 安全试验结果
[0083] 对仔猪双倍剂量注射疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4和疫苗5，注射后观察体温、食欲、精神状态，有无可见临床反应和死亡情况，疫苗注射局部有无肿胀等炎症反应，连续观察2周，三周后剖杀，进行病理变化观察，观察结果见表2。
[0084] 表2疫苗安全试验观察结果
[0085]
[0086] 安全检验结果显示：注射疫苗4和疫苗5后有个别猪体温持续2天达到40.5℃，其中疫苗5有1只猪注射部位出现肿胀，疫苗4和疫苗5中抗原含量较其他疫苗高，可能是由于抗原含量高导致应激反应更加明显。
[0087] 3.2效力检验结果
[0088] 攻毒保护结果见表3。
[0089] 表3不同抗原含量疫苗效力检验
[0090]
[0091]
[0092] 攻毒保护的结果显示：对猪支原体肺炎的保护率疫苗1为60%，疫苗2和疫苗5为80%，疫苗3和疫苗4为100%；对猪圆环病的保护率疫苗1为80%，疫苗2和疫苗3为100%，疫苗4为60%，疫苗5仅为40%。疫苗3对猪支原体肺炎和猪圆环的保护率均为100%。结果令人意外：
猪瘟和猪圆环二联疫苗在一定抗原范围内，均能对相应抗原产生较好的保护作用，且抗原含量越高，产生的保护作用越强；但是当猪圆环抗原的含量为2×106.0TCID50/头份，猪肺炎支原体抗原的含量为1010.0MHDCE/头份时发现猪圆环的保护率下降到60%，甚至当猪肺炎支原体抗原的含量达到2×1010.0MHDCE/头份时，猪圆环的保护率只有40%。说明当猪肺炎支原体抗原的含量过高时，会干扰猪圆环抗原的免疫保护。
猪瘟和猪圆环二联疫苗在一定抗原范围内，均能对相应抗原产生较好的保护作用，且抗原含量越高，产生的保护作用越强；但是当猪圆环抗原的含量为2×106.0TCID50/头份，猪肺炎支原体抗原的含量为1010.0MHDCE/头份时发现猪圆环的保护率下降到60%，甚至当猪肺炎支原体抗原的含量达到2×1010.0MHDCE/头份时，猪圆环的保护率只有40%。说明当猪肺炎支原体抗原的含量过高时，会干扰猪圆环抗原的免疫保护。
[0093] 实施例4 1/2剂量的猪瘟、猪圆环和猪肺炎支原体三联混合苗与单剂量单苗的免疫效果比较
[0094] 1 试验材料
[0095] 实施例2中制备的疫苗6（猪肺炎支原体109MHDCE/头份、猪圆环病毒2型106.0TCID50/头份、猪瘟病毒104.0TCID50/头份）、疫苗7（猪肺炎支原体109.0MHDCE/头份、猪圆环病毒2型106.0TCID50/头份、猪瘟病毒105.0TCID50/头份）、疫苗8（猪肺炎支原体109.0MHDCE/头份、猪圆环病毒2型106.0TCID50/头份、猪瘟病毒106.0TCID50/头份）、疫苗9（猪肺炎支原体
9.0 6.0
10 MHDCE/头份）、疫苗10（猪圆环病毒2型10 TCID50/头份）和疫苗11（猪瘟病毒
106.0TCID50/头份）。
9.0 6.0
10 MHDCE/头份）、疫苗10（猪圆环病毒2型10 TCID50/头份）和疫苗11（猪瘟病毒
106.0TCID50/头份）。
[0096] 3～4周龄，无猪瘟、猪圆环和猪肺炎支原体抗体的断奶仔猪。
[0097] 2 试验方法
[0098] 2.1 疫苗效力检测
[0099] 选取3～4周龄断奶仔猪75头，分为12个免疫组和3个对照组，第1、2、3组免疫1/2头份（1ml）疫苗6，第4、5、6组免疫1/2头份（1ml）疫苗7，第7、8、9组免疫1/2头份（1ml）疫苗8，第10组免疫1头份（2ml）疫苗9，第11组免疫1头份（2ml）疫苗10，第12组免疫1头份（2ml）疫苗
11；间隔14d后，各组加强免疫1次。首免后35天，第1、4、7、10、13组用PCV-2SH株进行攻毒，肌
6.0
肉注射2ml/头（10 TCID50/ml），连续观察25天，进行剖检，记录发病数（包括死亡数），判定保护情况；首免后130天，第2、5、8、11、14组用猪肺炎支原体强毒株（CVCC354株）进行气管注射，5ml/头（2×109MHDCE/ml），30天后剖检统计肺病变，判定保护情况；首免后第35天，第3、
6、9、12、15组注射猪瘟石门系血毒1ml/头（105MLD），连续观察16天，记录发病和死亡情况，判定保护情况。
11；间隔14d后，各组加强免疫1次。首免后35天，第1、4、7、10、13组用PCV-2SH株进行攻毒，肌
6.0
肉注射2ml/头（10 TCID50/ml），连续观察25天，进行剖检，记录发病数（包括死亡数），判定保护情况；首免后130天，第2、5、8、11、14组用猪肺炎支原体强毒株（CVCC354株）进行气管注射，5ml/头（2×109MHDCE/ml），30天后剖检统计肺病变，判定保护情况；首免后第35天，第3、
6、9、12、15组注射猪瘟石门系血毒1ml/头（105MLD），连续观察16天，记录发病和死亡情况，判定保护情况。
[0100] 表4疫苗免疫及攻毒分组情况
[0101]
[0102] 2.2血清学测定
[0103] 2.2.1 猪圆环抗体
[0104] 第1、4、7、10、13组分别于一免当天（免疫前）、一免后14天、一免后21天和一免后35天对各组猪进行采血，并分离血清。采用ELISA方法分别检测血清中猪圆环抗体水平。
[0105] ELISA抗体检测：用大肠杆菌表达的PCV-2-ORF2蛋白作为抗原，通过方阵滴定试验确定抗原的最佳包被浓度。将抗原稀释到最佳包被浓度后包被酶标板，100μl/孔，后4℃包被过夜；洗涤3次，每次3～5min；每孔加200μl的0.15%BSA封闭液封闭板子，37℃作用2h；洗涤；将待检血清用PBS倍比稀释，每个样品一行，每孔加100μl，37℃作用1h；洗涤；然后加入酶标的SPA（1:10000倍稀释），100μl/孔，37℃作用1h；洗涤；加底物液TMB显色，最后用2mol/L的H2SO4终止反应。结果判定：待检血清OD450值/阴性血清OD450值≥2.1为阳性。
[0106] 2.2.2 猪肺炎支原体抗体
[0107] 第2、5、8、11、14组，分别于一免当天（免疫前）、一免后14天、一免后21天、一免后35天、一免后130天和160天采血分离血清。使用竞争性ELISA试剂盒（由IDEXX制造）检测抗猪肺炎支原体的血清抗体。
[0108] 2.2.3 猪瘟抗体
[0109] 第3、6、9、12、15组分别于一免当天（免疫前）、一免后14天、一免后21天和一免后35天对各组猪进行采血，并分离血清。猪瘟抗体的检测采用阻断ELISA方法，所用试剂为CIVTESTTM suis HC/PPC（海博莱生物大药厂生产）。
[0110] 3 试验结果
[0111] 3.1 效力检验结果见表5、表6和表7。
[0112] 表5猪圆环攻毒保护结果
[0113]
[0114] 注：PCV攻毒后符合以下三项中的任何2项即判为发病。临床症状：仔猪体温升高（≥40℃），应至少持续3日，出现明显食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓；病理变化：腹股沟和气管淋巴结水肿、肺脏轻度水肿，肾脏发黄或有点状坏死。组织学病变为淋巴结有明显淋巴细胞侵入，或有多核巨细胞；病毒检测：用PCR检测淋巴结组织，检测到PCV2。
[0115] 表6猪瘟攻毒保护结果
[0116]
[0117] 表7猪肺炎支原体攻毒组肺病变评分结果
[0118]组别 分组 肺病变评分（%） 保护率
2 疫苗6 3.6a 5/5
5 疫苗7 4.2a 5/5
8 疫苗8 3.8a 5/5
a
11 疫苗10 4 5/5
14 对照组 14.6b /
2 疫苗6 3.6a 5/5
5 疫苗7 4.2a 5/5
8 疫苗8 3.8a 5/5
a
11 疫苗10 4 5/5
14 对照组 14.6b /
[0119] 注：组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著（P＜0.05）。
[0120] 效力检验结果显示，1/2头份的猪瘟、猪圆环和猪肺炎支原体联苗对猪圆环和猪肺炎支原体的保护率均能达到100%，与1头份的单苗的保护水平相当。1/2头份的猪瘟、猪圆环和猪肺炎支原体联苗在一定抗原范围内对猪瘟保护率达到60～100%，且抗原含量越高，产生的保护作用越强；令人意外地，在相同抗原含量的情况下，1/2头份的猪瘟、猪圆环和猪肺炎支原体联苗甚至超过1头份单苗的保护水平。说明猪瘟、猪圆环和猪肺炎支原体的三联混合疫苗能很好得抵抗猪瘟、猪圆环和猪肺炎支原体的感染，而且猪圆环抗原和/或猪肺炎支原体抗原可以提高猪瘟的免疫保护水平。
[0121] 3.2 血清型学测定
[0122] 3.2.1 猪圆环抗体水平见表8。
[0123] 表8免疫不同时期猪圆环抗体水平
[0124]
[0125] 首免后14d，免疫组均能检测到PCV2抗体，首免后35d，免疫组ELISA抗体效价达到1:3200，表明疫苗6、疫苗7、疫苗8、疫苗9免疫动物后能够刺激机体产生PCV2特异性抵抗力，效果确实。
[0126] 3.2.2 猪肺炎支原体抗体检测结果见表9。
[0127] 表9免疫不同时期猪肺炎支原体抗体检测结果
[0128]
[0129] 所有猪在接种时都是血清学阴性，对照组的所有猪在攻毒前保持血清学阴性，免疫组在攻毒前80%保持血清学阳性，免疫组内所有的猪和攻毒对照组内60%猪在攻毒后都转化为对猪肺炎支原体呈血清学阳性，这表明所有猪都对猪肺炎支原体敏感。
[0130] 这表明疫苗6、疫苗7、疫苗8、疫苗10能刺激动物体产生抗猪肺炎支原体特异性抗体，与攻毒保护水平呈正相关，效力肯定。
[0131] 3.2.3 猪瘟抗体水平检测结果见表10。
[0132] 表10免疫不同时期猪瘟抗体检测结果
[0133]
[0134]
[0135] 对照组猪和免疫组猪免疫前抗体检测均为阴性，首免后14天免疫组抗体检测即为阳性，免疫后21天和35天抗体阻断率逐渐增高，说明抗体水平逐渐增高，并且发现在不同时期疫苗8免疫组抗体平均阻断率均明显高于疫苗6和疫苗7的平均阻断率，这与疫苗6的保护率为60%、疫苗7的保护率为80%，而疫苗8的保护率为100%是一致的。同时发现，疫苗8还比疫苗11的平均阻断率高，这与1/2头份联苗猪瘟保护率为100%，1头份单苗的猪瘟保护率为80%
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