技术领域
[0001] 本
发明属于再生医学领域，具体涉及一种含有再生组织基质的组合物、及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 微整形(Micro-surgery)是一种高科技的医疗技术，其不需开刀，具有短时间就能变美、变年轻的特性，逐渐取代了过去的整形外科手术，具有安全、没有伤口、恢复期短的优点。微整形的出现让整形如同美容
皮肤护理一样简单，同时整形效果和传统整形完全一样。微整形包括的项目类别很多，其主要实施方法有A型肉毒素除皱和瘦脸、填充剂注射、自体脂肪移植充填、面部吸脂、激光
治疗、注射玻尿酸和美白针等，操作便捷，手术时间通常1～2个h左右。基于微整形因效果好，不用开刀，很多求美者认为其安全性比较高，微创注射技术在再生医学领域的应用迅猛发展，在除去面部静态纹、消除动态纹、缺损的填补中具有广阔的应用前景。
[0003] 玻尿酸、
胶原蛋白融入于真皮层中并如同人体自身胶原蛋白一样被自然吸收，只能维持12个月左右的时间，不继续的话患者可能接受不了再凹回去的形象，长期频次注射导致患者痛苦，而且带来巨大的经济负担。肉毒毒素毒杀神经细胞而让面部松弛，长期使用导致面部表情僵化。自体脂肪移植充填，脂肪组织对缺血及机械损伤耐受性差，易吸收。异种的胶原蛋白，易产生
抗原性等缺点。异体真皮微粒注射入
机体之后会部分降解，再生成为机体的有机部分，可以长时间有效维持。但是再生组织基质微粒颗粒进行复
水分散后不能有效的进行复水，吸入注射内再推送注射的过程中容易团聚，堵塞针头，为了解决这一的问题，发明一种可以维持疗效时间长且又可以使用方便的介质作为注射填充剂成了一个急需解决的问题。
发明内容
[0004] 本发明为解决上述技术问题，提供了一种用于微整形的再生组织基质组合物。
[0005] 本发明还提出所述含再生组织基质微粉的关节修复组合物的制备方法。
[0006] 本发明进一步提出所述含再生组织基质微粉的关节修复组合物的应用。
[0007] 实现本发明上述目的技术方案为：
[0008] 一种用于微整形的再生组织基质组合物，包括再生组织基质微粒、羟乙基
淀粉和羧甲基
纤维素；所述再生组织基质微粒含微粒状态的细胞外基质，所述再生组织基质微粒是能通过100目、不能通过400目筛的微粒。
[0009] 其中，所述的再生组织基质微粒5重量份，羟乙基淀粉0.005～0.1重量份；羧甲基
纤维素为0.02～0.35重量份。
[0010] 其中若
羧甲基纤维素用量过大则会造成颗粒太硬，血运重建迟缓；若是用量太小，制粒后容易松散。在此提出本发明的一种优选技术方案为，
[0011] 其中所述的再生组织基质微粒5重量份，羟乙基淀粉为0.01～0.06重量份；羧甲基纤维素为0.04～0.2重量份。
[0012] 本发明还提出所述含再生组织基质微粒的关节修复组合物的制备方法。
[0013] 所述的再生组织基质组合物的制备方法，包括步骤：
[0014] a)将羧甲基纤维素溶解在水中，将再生组织基质微粒和羟乙基淀粉加入含有羧甲基纤维素的水溶液中去，混匀，制成湿粒；
[0015] b)将湿粒进行
冷冻干燥、灌装、辐照灭菌得到产品。
[0016] 其中，步骤a)所制的羧甲基纤维素水溶液浓度为2～5％，优选所述的羟乙基淀粉的粒径是过100目且不能通过400目。
[0017] 其中，所述的步骤b)中将湿粒在-20℃以下，进行冷冻干燥2～6h。
[0018] 其中，所述再生组织基质微粒的制备方法为：
[0019] 1)将异体皮原料投入
碱的甘油溶液中，浸泡振荡处理，得半成品A；
[0020] 2)将半成品A去除表皮后，投入
表面活性剂溶液中，超声浸泡处理，得半成品B；
[0021] 3)将半成品B剪裁成小皮片，以沉浸的方式浸入到液氮中3～10min，取出为半成品C；
[0022] 4)在高速旋转离心
力的作用下，用转刀对半成品C进行切割，得到半成品D；
[0023] 5)将半成品D置于D-
氨基
酸溶液中浸泡，固液分离得到半成品E；所述的D-氨基酸溶液选自天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸中的一种或几种。
[0024] 其中，步骤1)中所述碱为氢
氧化钠和/或氢氧化
钾，所述碱的浓度为0.5～5％；进一步优选碱液的浓度是1～3％；
[0025] 和/或，所述的异体皮原料投入碱的甘油溶液中，在25～35℃下浸泡1～10h并振荡处理。
[0026] 其中，步骤2)所述的表面活性剂是SDS或者Triton X-100；所述表面活性剂溶液的浓度为0.1～0.3g/L；
[0027] 超声浸泡条件为：20～45KHz，
温度为1～20℃，超声1～5min，浸泡1～4h，优选重复超声和浸泡处理2-6次，重复前换新的表面活性剂溶液。
[0028] 其中，步骤4)中所述的半成品D由进料口进入速度是50～100g/min，优选50～80g/min；
[0029] 步骤5)中优选由天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸的浓度分别为0.8～1.4，1.2～1.8，0.4～0.6，4～10.8μmol/L组成的氨基酸水溶液，按体积比例为1:(0.8～1.2):(0.8～
1.2):(0.8～1.2)配制。
[0030] 本发明所述的再生组织基质组合物在制备治疗面部微整形材料上的应用。
[0031] 本发明的有益效果在于：
[0032] (1)本发明提出的再生组织基质组合物，保留了再生组织基质的三维
框架结构，更易于细胞粘附和迁入，有利于毛细血管的生长，使被填充部位重建血运，恢复生机；可修复因多次注射玻尿酸、取出
假体后造成的组织损伤，具备优良的填充效果。。
[0033] (2)本发明提供的制备再生组织基质微粒采用超离心
研磨法制成，有利于再生组织基质进行
粉碎过程中粒径大小的均一、且损失率较低，保持了再生组织基质的结构，维持对再生组织基质纤维的原态，不影响机
体细胞的粘附和再生；
[0034] (3)本发明提供的再生组织基质组合物微粒，可降低炎性反应，肿痛不明显，注射效果立竿见影。
具体实施方式
[0035] 以下
实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中涉及的操作如无特殊说明，均为本领域常规技术操作。
[0036] 实施例中涉及的参数测定方法如下：
[0037] 1.成型率测定：
[0038] 称取颗粒，依次通过14号筛与20号筛。
[0039] 成型率(％)＝合格颗粒
质量/样品颗粒质量×100％
[0040] 2.再生组织基质微粒收率：
[0041] 称取微粒，依次通过200号筛
[0042] 微粒收率(％)＝合格微粒质量/样品质量×100％
[0043] 3.吸湿性：
[0044] 吸湿性的测定是在25℃，湿度为75％时的吸湿率。
[0045] 4.颗粒度：
[0046] 照粒度和粒度分布测定法按照2015药典通则0982第二法双筛分法进行测定。
[0047] 5.孔隙率的测定：
[0048] 胶原基质
支架必须有足够大的孔隙率有利于细胞的植入和生长，孔径必须连通，孔径过大或者过小都会影响细胞在支架上的迁入和粘附。本发明中孔隙率测定的方法：将干重W1的支架材料浸入盛满水后重W2的称量瓶中；待支架材料浸水充分后，将称量瓶注满水称重，记为W3；取出浸水充分的支架材料称重，记为W4。则孔隙率ε表示为式：
[0049] ε＝(W4-W1)/[(W1+W2-W3)+(W4-W1)]×100％
[0050] 实施例1
[0051] 1)异体皮原料投入0.5～5％的碱的甘油溶液中，在35℃浸泡10h振荡处理，得半成品A；
[0052] 2)将半成品A去除表皮后，用无菌纯水冲洗5min，投入0.3g/L的SDS的表面活性剂溶液中，在超声
频率45KHz，超声温度为20℃，超声5min，浸泡3h，换新的表面活性剂溶液，重复处理3次，得半成品B。
[0053] 3)将半成品B用无菌纯水冲洗5min，投入到0.6％的京尼平pH为6.5的水溶中交联24h，用无菌纯水冲洗5min。
[0054] 4)将步骤3)处理后的半成品B剪裁成的小皮片的大小是(0.3～1)×(0.3～1)cm2，以沉浸式方式浸入到液氮中10min，得到半成品C。
[0055] 5)将半成品C由进料口进入速度是100g/min，在转刀以15000转/min的转速高速旋转
离心力的作用下，转刀对半成品C进行切割，得到粒径小于环筛孔径2mm的微粒经过环筛被收集在收集器里得到半成品D。
[0056] 6)将半成品D置于谷氨酸浓度分别为0.5μmol/L溶液中浸泡10min，离心200×g，离心10min得到半成品E；
[0057] a)取羧甲基纤维素用
乙醇分散后溶于水中，配制成2～5％的水溶液；将羟乙基淀粉0.1g预先进行粉碎，过200目筛子，取5g半成品E混合均匀，加入到1mL的羧甲基纤维素水溶液中去，混合制得软材，取软材
挤压过16目筛，制湿粒。
[0058] b)将湿粒进行冷冻-20℃条件下，干燥2h得到干粒、灌装、用Co60辐照灭菌即得。
[0059] 实施例2-5
[0060] 步骤同实施例1，具体参数见表1。
[0061] 表1实施例1-5试验步骤中各参数
[0062]
[0063]
[0064] 说明：能通过14号和20号筛是指的成品的粒径。
[0065] 应用实施例1
[0066] 以隆鼻为例，取用本发明的再生组织基质组合物微粒预装
注射器，吸入注射用水复溶。
[0067] 50人按随机数字表法分为2组，每组25人，分别记为对照组和观察组，将给予实施例4再生组织基质微粒为观察组，给予对比例2中制备的样品为对照组，术后每天观察并记录各组植入后炎性反应情况，由非实验参与人员和志愿者自述痛感按五分标准对炎性反应和随访从注射后到炎性消失的时间进行评价；炎性反应的症状分为红热肿痛四个，炎性反应情况评分为1-5分，5分为红、热、肿、痛等级最高，1分为红、热、肿、痛等级最低或无。取用2
炎性反应最高值进行统计，采用χ分析，P<0.05为有统计学意义。试验结果如下表2所示。
[0068] 表2两组志愿者术后状况比较
[0069] 红 热 肿 痛 术后时间
观察组 1 1 1 1 3天
对照组 3 2 3 2 7天
[0070] 从表2数据结果显示经用本发明的产品后，两组志愿者中微整形术后炎性反应红热肿痛观察组较对照组明显减少，说明本发明的产品能缩小炎性反应的修复时间，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。
[0071] 检测上述50例对照组和观察组试验者以及另外的25例健康正常人为空白组外周血
炎症指标[
白细胞计数(WBC)、血小板计数(PLT)、血红蛋白(Hb)、血沉(ESR)、C反应蛋白(CRP)、清蛋白(Alb)]，结果对照组试验者WBC、PLT、CRP和ESR均明显高于观察组，差异有统计学意义(P<0.05)；而观察组和空白组无明显差异，差异无统计学意义(P>0.05)。本发明治疗可以降低皮肤填充注射后的炎性反应效果显著。
[0072] 对比例1
[0073] 其他非本发明的再生组织基质微粒组合物，与本技术的差别在于所述的组合物不同，组合物1含有再生组织基质微粒和羧甲基纤维素(质量比5:0.2)，不含羟乙基淀粉，组合物2含有再生组织基质微粒和羟乙基淀粉(质量比5:0.5)，不含羧甲基纤维素。
[0074] 将本发明实施例1-5制备的5种产品和组合物1久置1年后，于水中复溶，摇匀，吸入注射器中，比对复溶情况，肉眼可见，久置后组合物1的复溶情况远不如本发明产品的复溶情况。
[0075] 组合物2形成的颗粒不能进行有效的揉制，终产品粒径分布范围比较宽，形成颗粒大小不一，不能有效地揉制形成想要的颗粒大小。
[0076] 对比例2
[0077] 其他非本发明的再生组织基质组合物，与本技术的差别在于步骤4)、步骤5)中处理方案的技术参数不同，设置2个不同参数分别为对比样品A和对比样品B，具体实施步骤方案参数见表3。
[0078] 表3
[0079]
[0080] 说明：成品的颗粒度使用14号筛和20号筛确定。
[0081] 从表3可以看出，采用本发明的技术方案相比较对比样品A、B能够更好的获得再生组织基质组合物，成型率也比较高，颗粒更均一，粒径分布窄；而超越的本发明
专利的制备方法得到的微粒粒径范围比较宽，均一度差。证明本发明所主张的制备方法中，通过各条件参数的控制可达到理想水平。
[0082] 从表3可以看出，采用本发明的技术方案相比较对比例B能够更好的获得再生组织基质组合物微粒，孔隙率更高，能够在工艺过程中较好的保持再生组织基质的支架结构，使得较适宜细胞的迁入和生长。
[0083] 以上的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的
权利要求书确定的保护范围内。
