生长和分化因子8(GDF-8)的用途
阅读：350发布：2023-02-28
专利汇可以提供生长和分化因子8(GDF-8)的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及生长和分化因子8(GDF-8)在体外或体内用于减小细胞例如特别地间充质干细胞(MSC)、组织或材料的免疫原性或被排斥的 风 险的用途。本发明还涉及，使用FGF-2和GDF-8将MSC在体外或离体地分化为骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群的方法。此外，本发明涉及，可通过此类方法获得的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群，和用于 治疗 肌骨骼 疾病 的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群。，下面是生长和分化因子8(GDF-8)的用途专利的具体信息内容。
1.生长和分化因子8(GDF-8)用于体外减少细胞的免疫原性的用途，其中所述细胞选自间充质干细胞(MSC)、通过MSC的分化获得的细胞、骨细胞谱系的细胞、软骨细胞谱系的细胞、脂肪细胞谱系的细胞、肌细胞谱系的细胞、腱细胞谱系的细胞、成纤维细胞谱系的细胞和基质源性谱系的细胞。
2.权利要求1的用途，其中所述骨细胞谱系的细胞、软骨细胞谱系的细胞、脂肪细胞谱系的细胞、肌细胞谱系的细胞、腱细胞谱系的细胞、成纤维细胞谱系的细胞或基质源性谱系的细胞通过MSC的分化获得。
3.权利要求1或2的任一项的用途，其中所述细胞是MSC、骨祖细胞、成骨细胞、骨细胞、成软骨细胞、软骨细胞、成脂肪细胞、脂肪细胞、成肌细胞或肌细胞，优选其中所述细胞是MSC、骨祖细胞、成骨细胞、成软骨细胞或软骨细胞。
4.权利要求1的用途，其中所述细胞是MSC。
5.权利要求1或2的任一项的用途，其中所述细胞是骨祖细胞或成骨细胞。
6.权利要求1至5的任一项的用途，其中所述细胞是哺乳动物细胞例如人细胞或非人哺乳动物细胞，优选人细胞。
7.权利要求1至6的任一项的用途，其中GDF-8减少所述细胞上的MHC II类细胞表面受体复合物，和任选地减少所述细胞上的一种或多种共刺激因子。
8.权利要求7的用途，其中在人细胞上所述MHC II类细胞表面受体是人白细胞抗原DR(HLA-DR)。
9.权利要求1至8的任一项的用途，其中所述细胞包含在植入物或移植物中，优选骨和/或关节组织植入物或移植物中，或药物制剂中。
10.GDF-8，其用于减小细胞的免疫原性的方法中，其中将体内施用GDF-8，并且其中所述细胞选自MSC、通过MSC的分化获得的细胞、骨细胞谱系的细胞、软骨细胞谱系的细胞、脂肪细胞谱系的细胞、肌细胞谱系的细胞、腱细胞谱系的细胞、成纤维细胞谱系的细胞和基质源性谱系的细胞。
11.根据权利要求10的GDF-8，其中将GDF-8与所述细胞组合进行体内施用。
12.根据权利要求10或11的任一项的GDF-8，其中所述细胞如权利要求2至6的任一项中所定义。
13.根据权利要求10至12的任一项的GDF-8，其中所述细胞对于它们所施用至的受试者是同种异体的。
14.GDF-8和细胞的组合，其用作药物，优选用于治疗肌骨骼疾病，更优选其中所述肌骨骼疾病是骨疾病或骨关节疾病，其中所述细胞选自MSC、通过MSC的分化获得的细胞、骨细胞谱系的细胞、软骨细胞谱系的细胞、脂肪细胞谱系的细胞、肌细胞谱系的细胞、腱细胞谱系的细胞、成纤维细胞谱系的细胞和基质源性谱系的细胞。
15.根据权利要求14的GDF-8和细胞的组合，其中所述细胞如权利要求2至6的任一项中所定义。
16.根据权利要求14或15的任一项的GDF-8和细胞的组合，其中所述组合用于治疗肌骨骼疾病，优选其中所述肌骨骼疾病是骨疾病或骨关节疾病，并且其中所述细胞选自MSC、骨细胞谱系的细胞、软骨细胞谱系的细胞、肌细胞谱系的细胞和腱细胞谱系的细胞，优选其中所述细胞是MSC、骨祖细胞、成骨细胞、骨细胞、成软骨细胞、软骨细胞、成肌细胞或肌细胞。
17.根据权利要求14至16的任一项的GDF-8和细胞的组合，其中所述细胞对于它们所施用至的受试者是同种异体的。
18.GDF-8，其用于减小施用至、植入或移植入受试者的材料被所述受试者排斥的风险的方法中。
19.根据权利要求18的GDF-8，其中所述材料包含骨组织和/或关节组织。
20.一种药物组合物，其包含待施用至、植入或移植入受试者的材料和GDF-8，以及任选地还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
21.权利要求20的药物组合物，其中所述材料包含选自下述的细胞：MSC、通过MSC的分化获得的细胞、骨细胞谱系的细胞、软骨细胞谱系的细胞、脂肪细胞谱系的细胞、肌细胞谱系的细胞、腱细胞谱系的细胞、成纤维细胞谱系的细胞和基质源性谱系的细胞。
22.权利要求20的药物组合物，其中所述材料包含骨组织和/或关节组织。
生长和分化因子8(GDF-8)的用途
[0001] 领域
[0002] 本发明涉及生长和分化因子8(GDF-8)在体外或体内用于改变细胞例如特别地间充质干细胞(MSC)、组织或材料的性质的用途。本发明还涉及，用于将MSC体外或离体地分化为骨祖细胞(osteoprogenitor)(包括早期和晚期骨祖细胞)或成骨细胞(包括前成骨细胞，成骨细胞和骨细胞)或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群的方法。此外，本发明涉及，可通过所述方法获得的骨祖细胞或成骨细胞或包含此类骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群，以及用于治疗肌骨骼(musculoskeletal)疾病的所述骨祖细胞或成骨细胞(例如同种异体骨祖细胞或同种异体成骨细胞)或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群。
[0003] 背景
[0004] 肌骨骼疾病或障碍可影响骨、肌肉、关节、软骨、腱、韧带以及支持组织和器官并将组织与器官结合在一起的其它结缔组织。这些疾病可随时间的过去而发展，或可以例如因肌肉骨骼系统的过度使用或因创伤而引起。肌骨骼疾病可以因肌肉骨骼系统与其它内部系统的密切关系而难以诊断和/或治疗。
[0005] 用于治疗肌骨骼疾病，特别地治疗骨疾病的可能的和有前景的方法是，能够经历成骨分化的间充质干细胞(MSC)或被定向至成骨细胞谱系的细胞的移植。
[0006] MSC先前已被用于治疗骨障碍(Gangji等人，Expert Opin Biol Ther,2005,第5卷,437-42)。然而，尽管这样的相对未分化的干细胞可被移植，但它们未被定向至成骨细胞谱系，从而相当大部分的所移植的干细胞最终可能对期望的组织的形成没有贡献。此外，可从任何可能的来源组织获得的此类干细胞的量通常不令人满意。
[0007] WO2007/093431公开了，目标在于实现足够程度的分离的MSC的体外扩增和产生显示成骨细胞表型的细胞的方法。在所述方法中，特别地在血清或血浆和碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)存在的情况下培养人MSC。
[0008] WO2009/087213描述了用于特别地使用人血浆或血清、FGF-2和TGFβ-1进行人MSC的成骨分化的方法。
[0009] 然而，存在对用于从MSC产生有用的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群的其它和/或改进的可靠方法的需要。
[0011] 概述
[0012] 如实验部分中举例说明的，本发明人认识到，生长和分化因子8(GDF-8)有利地减小在GDF-8存在的情况下培养的或分化的(例如分化为间充质细胞谱系的细胞，例如特别地分化为骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群)细胞例如间充质干细胞(MSC)的免疫原性。
[0013] 通过对上述发现的扩展，本发明人认识到，GDF-8减小细胞的免疫原性的能力。因此，本发明的一个方面涉及，生长和分化因子8(GDF-8)用于体外减小细胞的免疫原性的用途。这样的用途是有利的，因为其允许细胞的移植，例如移植至同种异体受试者。具体的实施方案提供了，GDF-8用于体外减小细胞的免疫原性的用途，其中所述细胞选自间充质干细胞(MSC)、通过MSC的分化获得的细胞、骨细胞谱系的细胞、软骨细胞谱系的细胞、脂肪细胞谱系的细胞、肌细胞谱系的细胞、腱细胞(tendonocytic)谱系的细胞、成纤维细胞谱系的细胞以及基质源性(stromogenic)谱系的细胞。骨细胞谱系、软骨细胞谱系、脂肪细胞谱系、肌细胞谱系、腱细胞谱系、成纤维细胞谱系或基质源性谱系的细胞可被认为属于间充质细胞谱系的类别，由此凸显了GDF-8用于减小此类细胞的免疫原性的有用性。
[0014] 在某些实施方案中，骨细胞谱系的细胞、软骨细胞谱系的细胞、脂肪细胞谱系的细胞、肌细胞谱系的细胞、腱细胞谱系的细胞、成纤维细胞谱系的细胞或基质源性谱系的细胞可通过MSC的分化获得，更具体地，细胞可通过MSC的体外或离体分化获得。MSC的分化可包括，在能够诱导MSC朝向期望的细胞类型分化的条件下培养MSC，更常见地，在包含一种或多种能够诱导MSC朝向期望的细胞类型分化的因子(例如生长因子)的培养基中培养MSC。用于MSC分化的方案本身是已知的(参见，特别地，WO2007/093431；和另外地REGER,R.L.等人，‘Differentiation and Characterization of Human MSCs’.In:Mesenchymal Stem Cells:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)，由D.J.Prockop等人编辑，Humana Press，2008,第449卷,p.93-107；VERMURI,M.C.等人(Eds.)，Mesenchymal Stem Cell Assays and Applications(Methods in Molecular Biology).Humana Press,2011,第698卷，特别地第201至352页)。
[0015] 为了减小通过MSC的体外或离体分化获得的细胞的免疫原性，可在已通过MSC的分化获得期望的细胞后，将细胞暴露于GDF-8(即，与GDF-8接触或在含GDF-8的培养基中培养)，和/或可将(MSC)细胞暴露于GDF-8，作为将MSC分化成期望的细胞的各自方法或方案的一个或多个步骤的部分。例如，如在本说明书中其它地方论述的，可通过这样的方法将MSC分化为骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群，所述方法包括，在包含血浆或血清、GDF-8和成纤维细胞生长因子2(FGF-2)的培养基中培养MSC的步骤，由此所得细胞的免疫原性减小。
[0016] 相反地，通过MSC的分化获得的细胞从而可以特别地是指，骨细胞谱系的细胞、软骨细胞谱系的细胞、脂肪细胞谱系的细胞、肌细胞谱系的细胞、腱细胞谱系的细胞、成纤维细胞谱系的细胞或基质源性谱系的细胞。
[0017] 在其它实施方案中，细胞可以是MSC、骨祖细胞、成骨细胞、骨细胞、成软骨细胞、软骨细胞、成脂肪细胞、脂肪细胞、成肌细胞或肌细胞。甚至更优选地，细胞可以是MSC、骨祖细胞、成骨细胞、成软骨细胞或软骨细胞。甚至更优选地，细胞可以是MSC。同样特别优选地，细胞可以是骨祖细胞或成骨细胞。在此类细胞类型中，GDF-8减少细胞的免疫原性的有利作用倾向于是特别明显的。
[0018] 因此，在一些实施方案中，细胞可以是MSC，优选地成人MSC。可将此类MSC细胞适当地但不限于培养在包含血清或血浆和任选地FGF-2的培养基中。特别地，当期望MSC分化为骨细胞谱系的细胞例如骨祖细胞或成骨细胞时，可包含FGF-2。细胞可被期望用于自体或同种异体用途，优选地，细胞可被期望用于同种异体用途。在其它实施方案中，细胞可以是骨祖细胞或成骨细胞。可将此类骨祖细胞或成骨细胞适当地但不限于培养在包含血清或血浆和任选地FGF-2的培养基中。细胞可被期望用于自体或同种异体用途，优选地，细胞可被期望用于同种异体用途。
[0020] 在一些实施方案中，本发明涉及GDF-8用于体外减小细胞的免疫原性的用途，其中GDF-8减少细胞上的MHC II类细胞表面受体复合物，和任选地减小所述细胞上的一种或多种共刺激因子。
[0021] 如本文中所用，表述“减少细胞上的MHC II类细胞表面受体复合物”是指，减少细胞上的MHC II类细胞表面受体复合物的量和/或可用性(例如用于进行其生物学活性的可用性)。该减少的量和/或可用性包括，细胞上的减少的MHC II类细胞表面受体复合物的量和/或细胞群中表达MHC II类细胞表面受体复合物的细胞的减少的比率(fraction)。例如，在人细胞上，MHC II类细胞表面受体复合物可以是由HLA复合物例如HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP、HLA-DO或HLA-DM编码的MHC II类细胞表面受体复合物。优选地，在人细胞上，MHC II类细胞表面受体复合物可以是HLA-DR。因此，本文中还公开的是，GDF-8用于体外减小人细胞的免疫原性的用途，其中GDF-8减少人细胞上的HLA-DR。
[0022] 如本文中所用，表述“减少细胞上的一种或多种共刺激因子”是指，减少的细胞上的一种或多种共刺激因子的量和/或可用性(例如用于进行它们的生物学活性的可用性)。该减少的量和/或可用性包括，细胞上的一种或多种共刺激因子的减少的量和/或细胞群中表达一种或多种共刺激因子的细胞的减少的比率。
[0023] 此外，但非限制性地，本发明的该方面特别地提供如下所述的(i)至(viii)的任一项和所有项：
[0024] (i)GDF-8用于体外减小细胞的免疫原性的用途；
[0025] (ii)上述(i)中所示的用途，其中GDF-8减少所述细胞上的MHCII类细胞表面受体复合物和任选地减少所述细胞上的一种或多种共刺激因子；
[0026] (iii)上述(i)或(ii)中所示的用途，其中所述细胞是动物细胞，优选哺乳动物细胞例如人细胞或非人哺乳动物细胞；
[0027] (iv)上述(ii)或(iii)中所示的用途，其中在人细胞上，所述MHCII类细胞表面受体是人白细胞抗原DR(HLA-DR)；
[0028] (v)上述(i)至(iv)的任一项中所示的用途，其中所述细胞是MSC，优选成人MSC；
[0029] (vi)上述(i)至(iv)的任一项中所示的用途，其中所述细胞是骨祖细胞或成骨细胞。
[0030] 在某些实施方案中，可将上文中指定的细胞包含在待给受试者施用的材料中，例如优选在植入物或移植物中(更优选在骨和/或关节组织植入物或移植物(例如骨髓组织或骨组织植入物或移植物)中)或药物制剂中。通过减小所述材料例如植入物、移植物或药物制剂中包含的细胞的免疫原性，可减小此类治疗相关产品或组合物被它们所施用至的受试者排斥的风险。
[0031] 本发明的其它方面涉及GDF-8，其用于减少细胞的免疫原性，其中将体内施用GDF-8。可以局部地施用GDF-8，例如通过注射，例如在肌骨骼损伤部位。可单独施用GDF-8或可将其与细胞例如干细胞，优选MSC，优选与成人MSC和/或与细胞例如骨祖细胞或成骨细胞或与包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群组合施用，优选其中任何此类细胞可以是人的细胞。优选地，可将GDF-8与MSC，更优选与成人MSC组合施用。因此，还提供了用于减小细胞的免疫原性的GDF-8，其中将GDF-8与MSC，优选与成人MSC一起体内施用。还可将GDF-8(任选地与上述细胞组合)与FGF-2共施用。优选地，待进行所述施用的受试者可以是人。优选地，待施用的细胞或细胞群对于所述受试者可以是自体的或同种异体的。可将GDF-8与各个细胞或细胞群例如MSC同时体内施用，或可将它们以任意顺序相继地体内施用，例如，可体内施用各个细胞或细胞群例如MSC，随后体内施用GDF-8，或可体内施用GDF-8，随后可体内施用各个细胞或细胞群例如MSC。因此，还公开的是，GDF-8用于制造用于减小细胞的免疫原性的药物的用途，其中将体内施用GDF-8；还公开的是，用于减小细胞在有此需要的受试者中的免疫原性的方法，其包括给所述受试者施用GDF-8。
[0032] 本发明的另一个方面提供了用作药物，优选用于治疗肌骨骼疾病包括骨疾病和骨关节疾病的GDF-8。因此，还提供的是GDF-8用于制造用于治疗肌骨骼疾病包括骨疾病和骨关节疾病的药物的用途。还提供了，用于治疗需要此类治疗的受试者的肌骨骼疾病包括骨疾病和骨关节疾病的方法，其包括给所述受试者施用GDF-8。特别期望的是，用于治疗需要此类治疗的受试者的肌骨骼疾病的方法，其包括给所述受试者施用治疗上或预防上有效的量的GDF-8。当用作药物时，可单独施用GDF-8或可将其与细胞例如干细胞，优选MSC，优选与成人MSC和/或与细胞例如骨祖细胞或成骨细胞或与包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群组合施用，优选地其中任何此类细胞可以是人的细胞。优选地，可将GDF-8与MSC，更优选成人MSC组合施用。因此，特别地公开的是用作药物，优选用于治疗肌骨骼疾病包括骨疾病和骨关节疾病的GDF-8，其中将GDF-8与MSC，优选与成人MSC一起体内施用。还可将GDF-8(任选地与上述细胞组合)与FGF-2共施用。还提供了用于治疗需要此类治疗的受试者的肌骨骼疾病包括骨疾病和骨关节疾病的方法，其包括将GDF-8与MSC，优选与成人MSC一起施用至所述受试者。优选地，待进行所述施用的受试者可以是人。优选地，待施用的细胞或细胞群对于所述受试者可以是自体或同种异体的。
[0033] 本发明的一个方面从而提供了GDF-8，其用于减小细胞的免疫原性的方法中，其中将体内施用GDF-8，并且其中细胞选自MSC、通过MSC的分化获得的细胞、骨细胞谱系的细胞、软骨细胞谱系的细胞、脂肪细胞谱系的细胞、肌细胞谱系的细胞、腱细胞谱系的细胞、成纤维细胞谱系的细胞和基质源性谱系的细胞。优选地，细胞可以如对于GDF-8的体外用途(见上文)所更详细地描述的。该方面还包括的是，GDF-8用于制造用于减小细胞的免疫原性的药物的用途，其中将体内施用GDF-8，并且其中细胞选自MSC、通过MSC的分化获得的细胞、骨细胞谱系的细胞、软骨细胞谱系的细胞、脂肪细胞谱系的细胞、肌细胞谱系的细胞、腱细胞谱系的细胞、成纤维细胞谱系的细胞和基质源性谱系的细胞；以及用于减小细胞在有此需要的受试者中的免疫原性的方法，其包括给所述受试者施用GDF-8，其中所述细胞选自MSC、通过MSC的分化获得的细胞、骨细胞谱系的细胞、软骨细胞谱系的细胞、脂肪细胞谱系的细胞、肌细胞谱系的细胞、腱细胞谱系的细胞、成纤维细胞谱系的细胞和基质源性谱系的细胞。某些实施方案提供了，用于减小上文所示细胞的免疫原性的方法中的GDF-8(或对应的方法或用途)，其中将GDF-8与细胞组合地进行体内施用。此类实施方案有利地允许减小给受试者施用的细胞的免疫原性和所述细胞被排斥的风险。虽然GDF-8的这些作用可在使用对于所述受试者来说是自体的、同种异体的或甚至异种的(更常见地自体的或同种异体的)细胞的细胞疗法中具有价值，但所述作用可特别地有利于同种异体细胞的施用，因为预期减小同种异体细胞的免疫原性可显著降低它们被受试者排斥的风险，并且可允许避免或减少当给予同种异体细胞材料时受试者通常接受的免疫抑制疗法。因此，一些实施方案提供了用于减少上文中所示的细胞的免疫原性的方法中的GDF-8(或对应的方法或用途)，其中所述细胞对于它们所施用至的受试者来说是同种异体的。
[0034] 应当理解，可将GDF-8与细胞同时体内施用，或可以以任意顺序相继地体内施用，例如可体内施用细胞，随后可体内施用GDF-8，或可体内施用GDF-8，随后可体内施用细胞。在一个实例中，当在受试者中检测到抗细胞的免疫反应或细胞的排斥的征兆时，可给先前接受所述细胞的受试者开具施用GDF-8的处方。在其它实例中，当存在受试者将显示抗细胞的免疫反应或细胞的排斥(例如较差的HLA匹配)的增加的可能性时，可给先前接受，正在接受或以后将接受所述细胞的受试者开具施用GDF-8的处方。在其它实例中，可给先前接受，正在接受或以后将接受细胞的受试者开具施用GDF-8的处方，无论抗所述细胞的免疫反应或所述细胞的排斥的任何实际观察结果或其预期增加的可能性。
[0035] 在某些实施方案中，可全身性施用GDF-8，而无论细胞是局部还是全身性施用。在其它实施方案中，可局部施用GDF-8。例如，当局部(例如骨内或骨周，或关节内或关节周，例如当期望细胞用于骨或关节组织修复时)施用细胞时，可优选地也局部地，更具体地靠近细胞(例如同样骨内或骨周地，或关节内或关节周地，视情况而定)施用GDF-8。适当地，可在其施用部位上将GDF-8配制于持续释放制剂中，以延长其对细胞的作用。
[0036] 在某些实施方案中，可将细胞包含在给受试者施用的材料中，例如优选在植入物或移植物中(更优选在骨组织和/或关节组织植入物或移植物(例如骨髓组织或骨组织植入物或移植物)中)，或药物制剂中。通过减小包含在所述材料例如植入物、移植物或药物制剂中的细胞的免疫原性，可减小此类治疗相关产品或组合物被它们所施用至的受试者排斥的风险。
[0037] 本发明的其它方面从而提供了GDF-8与细胞的组合，其用作药物，优选用于治疗肌骨骼疾病(即，用于治疗肌骨骼疾病的方法中)，更优选其中肌骨骼疾病是骨疾病或骨关节疾病，其中所述细胞选自MSC、通过MSC的分化获得的细胞、骨细胞谱系的细胞、软骨细胞谱系的细胞、脂肪细胞谱系的细胞、肌细胞谱系的细胞、腱细胞谱系的细胞、成纤维细胞谱系的细胞和基质源性谱系的细胞。该方面还包括的是，GDF-8与细胞的组合用于制造用于治疗肌骨骼疾病的药物的用途，更优选其中肌骨骼疾病是骨疾病或骨关节疾病，其中所述细胞选自MSC、通过MSC的分化获得的细胞、骨细胞谱系的细胞、软骨细胞谱系的细胞、脂肪细胞谱系的细胞、肌细胞谱系的细胞、腱细胞谱系的细胞、成纤维细胞谱系的细胞和基质源性谱系的细胞；以及用于治疗需要所述治疗的受试者的肌骨骼疾病的方法，更优选其中肌骨骼疾病是骨疾病或骨关节疾病，所述方法包括给所述受试者施用GDF-8与细胞的组合(特别地治疗上或预防上有效的量的所述组合)，其中所述细胞选自MSC、通过MSC的分化获得的细胞、骨细胞谱系的细胞、软骨细胞谱系的细胞、脂肪细胞谱系的细胞、肌细胞谱系的细胞、腱细胞谱系的细胞、成纤维细胞谱系的细胞和基质源性谱系的细胞。优选地，细胞可以如对于GDF-8的体外用途所更详细地描述的(见上文)。某些实施方案提供了，用于治疗肌骨骼疾病的GDF-8与细胞的组合(或对应的方法或用途)，优选其中肌骨骼疾病是骨疾病或骨关节疾病，其中所述细胞选自MSC、骨细胞谱系的细胞、软骨细胞谱系的细胞、肌细胞谱系的细胞和腱细胞谱系的细胞，更优选其中细胞是MSC、骨祖细胞、成骨细胞、骨细胞、成软骨细胞、软骨细胞、成肌细胞或肌细胞，更优选其中细胞是MSC、骨祖细胞、成骨细胞、成软骨细胞或软骨细胞，更优选其中细胞是MSC或其中细胞是骨祖细胞或成骨细胞。
[0038] 先前段落中所示的GDF-8与细胞的组合可有利地允许减小作为药物给受试者施用(优选为了治疗肌骨骼疾病的目的)的细胞的免疫原性和所述细胞被排斥的风险。虽然所述组合中的GDF-8的这些作用在使用细胞的细胞疗法中具有价值，所述细胞对于所述受试者来说是自体的、同种异体或甚至异种的，更常见地自体或同种异体的，但所述作用可特别地有利于同种异体细胞的施用，因为预期减小同种异体细胞的免疫原性可显著降低它们被受试者排斥的风险，并且可允许避免或减少当给予同种异体细胞材料时受试者通常接受的免疫抑制疗法。因此，某些实施方案提供了，如上文中所示的用作药物(优选用于治疗肌骨骼疾病)的GDF-8与细胞的组合(或对应的方法或用途)，其中细胞对于它们所施用至的受试者来说是同种异体的。
[0039] 应当理解，可将组合中包含的GDF-8与细胞同时体内施用，或可以以任意顺序相继地体内施用，例如可体内施用细胞，随后可体内施用GDF-8，或可体内施用GDF-8，随后可体内施用细胞。在一个实例中，当在受试者中检测到抗细胞的免疫反应或对细胞的排斥的征兆时，可给先前接受所述细胞的受试者开具施用GDF-8的处方。在其它实例中，当存在受试者将显示抗细胞的免疫反应或对细胞的排斥(例如较差的HLA匹配)的增加的可能性时，可给先前接受，正在接受或以后将接受所述细胞的受试者开具施用GDF-8的处方。在其它实例中，可给先前接受，正在接受或以后将接受细胞的受试者开具GDF-8施用的处方，无论抗所述细胞的免疫反应或对所述细胞的排斥的任何实际观察结果或其预期增加的可能性。
[0040] 在某些实施方案中，可全身性施用GDF-8，而无论细胞是局部还是全身性施用。在其它实施方案中，可局部施用GDF-8。例如，当局部(例如骨内或骨周，或关节内或关节周，例如当期望细胞用于骨或关节组织修复时)施用细胞时，可优选地也局部地，更具体地靠近细胞(例如同样骨内或骨周地，或关节内或关节周地，视情况而定)施用GDF-8。适当地，可在其施用部位上将GDF-8配制于持续释放制剂中，以延长其对细胞的作用。
[0041] 在某些实施方案中，可将GDF-8与细胞的组合中的细胞包含在给受试者施用的材料中，例如优选在植入物或移植物中(更优选在骨组织和/或关节组织植入物或移植物(例如骨髓或骨组织植入物或移植物)中)，或药物制剂中。通过减小所述材料例如植入物、移植物或药物制剂中包含的细胞的免疫原性，可减少此类治疗相关产品或组合物被它们所施用至的的受试者排斥的风险。
[0042] 根据GDF-8调节免疫原性和免疫排斥的能力的观察结果，本发明的其它方面提供了GDF-8，其用于减小施用、植入或移植至受试者的材料被受试者排斥的风险。该方面还包括的是，GDF-8用于制造药物的用途，所述药物用于减小施用、植入或移植入受试者的材料被受试者排斥的风险；以及用于减小施用、植入或移植入受试者的材料被受试者排斥的风险的方法，其包括给所述受试者施用GDF-8。在本方面和前述的方面和实施方案中，(待)施用至受试者的材料意欲广泛地包括任何材料，所述材料当给受试者施用时，可具有益处，例如但不限于，其在受试者中可以具有治疗性或预防性益处(例如其可用于治疗受试者的肌骨骼疾病，更优选其中肌骨骼疾病是骨疾病或骨关节疾病)。某些实施方案提供了用于所述用途的GDF-8(或对应的方法或用途)，其中所述材料包含骨和/或关节组织(例如骨髓或骨组织)。
[0043] 在某些实施方案中，材料可包含选自MSC、通过MSC的分化获得的细胞、骨细胞谱系的细胞、软骨细胞谱系的细胞、脂肪细胞谱系的细胞、肌细胞谱系的细胞、腱细胞谱系的细胞、成纤维细胞谱系的细胞和基质源性谱系的细胞的细胞。优选地，细胞可以如对于GDF-8的体外用途(见上文)所更详细地描述的。优选地，当期望材料用于治疗肌骨骼疾病(优选其中肌骨骼疾病是骨疾病或骨关节疾病)，并且材料包含细胞时，所述细胞选自MSC、骨细胞谱系的细胞、软骨细胞谱系的细胞、肌细胞谱系的细胞和腱细胞谱系的细胞，更优选选自MSC、骨祖细胞、成骨细胞、骨细胞、成软骨细胞、软骨细胞、成肌细胞或肌细胞，甚至更优选选自MSC、骨祖细胞、成骨细胞、成软骨细胞或软骨细胞，更优选选自MSC或选自骨祖细胞或成骨细胞。
[0044] 在某些实施方案中，当材料具有显著的排斥的风险时，例如当材料包含一种或多种组分例如组织、细胞、生物分子或其它物质(所述组分对于受试者来说是同种异体或甚至异种的，更常见地同种异体的)时，GDF-8对减少材料被受试者排斥的风险的作用可以是特别显著的。
[0045] 应当理解，可将GDF-8与材料同时体内施用，或可以以任意顺序相继地体内施用，例如可体内施用材料，随后可体内施用GDF-8，或可体内施用GDF-8，随后可体内施用材料。在一个实例中，当在受试者中检测到材料被排斥的征兆时，可给先前接受所述材料的受试者开具施用GDF-8的处方。在其它实例中，当存在受试者将显示对材料的排斥(例如较差的HLA匹配)的增加的可能性时，可给先前接受，正在接受或以后将接受所述材料的受试者开具施用GDF-8的处方。在其它实施方案中，可给先前接受，正在接受或以后将接受材料的受试者开具施用GDF-8的处方，无论对所述材料的排斥的任何实际观察结果或其预期增加的可能性。
[0046] 在某些实施方案中，可全身性施用GDF-8，而无论材料是局部还是全身性施用。在其它实施方案中，可局部施用GDF-8。例如，当局部(例如骨内或骨周，或关节内或关节周，例如当期望细胞用于骨或关节组织修复时)施用材料时，可优选地也局部地，更具体地靠近材料(例如同样骨内或骨周地，或关节内或关节周地，视情况而定)施用GDF-8。适当地，可在其施用部位上将GDF-8配制于持续释放制剂中，以延长其对材料的作用。
[0047] 因此，本发明的其它方面提供，包含待施用至、植入或移植入受试者的材料和GDF-8以及任选地还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。优选地提供了药物组合物，所述组合物包含选自MSC、通过MSC的分化获得的细胞、骨细胞谱系的细胞、软骨细胞谱系的细胞、脂肪细胞谱系的细胞、肌细胞谱系的细胞、腱细胞谱系的细胞、成纤维细胞谱系的细胞和基质源性谱系的细胞的细胞，和GDF-8，以及任选地还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂(换句话说，可以认为，待施用至、植入或移植入受试者的材料包含所述细胞)。优选地，细胞可以如对于GDF-8的体外用途(见上文)所更详细地描述的。还优选地提供了药物组合物，所述组合物包含骨和/或关节组织(例如骨髓-或骨组织)和GDF-8，以及任选地还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂(换句话说，可以认为，待施用至、植入或移植入受试者的材料包含所述骨和/或关节组织)。
[0048] 在整个本说明书中，体现本发明的原理的产品、方法和用途可优选地使用动物细胞，更优选温血动物细胞，更优选哺乳动物细胞，例如人细胞或非人哺乳动物细胞，更优选人细胞。
[0049] 此外，在整个本说明书中，体现本发明的原理的产品、方法和用途可用于动物受试者，更优选温血动物受试者，更优选哺乳动物受试者，例如人受试者或非人哺乳动物受试者，更优选人受试者。
[0050] 还应理解，通常可将源自某一物种(例如给定的哺乳动物物种或人)的细胞、组织或其它材料给来自相同物种的受试者施用，即自体或同种异体施用。
[0051] 本发明人现还发现了，用于分化间充质干细胞(MSC)的、解决现有技术中的一个或多个上述问题的方法。
[0052] 因此，本发明的另外的方面涉及，用于将成体MSC体外地或离体地分化为骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群的方法，所述方法包括在包含血浆或血清、生长和分化因子8(GDF-8)和成纤维细胞生长因子2(FGF-2)的培养基中培养所述MSC的步骤。应用本发明的原理的方法有利地允许获得具有减小的免疫原性的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群。
[0053] 例如，本发明的方法提供了具有减少的MHC II类细胞表面受体表达，例如具有减少的HLA-DR表达的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群。此类减小的免疫原性有利地允许细胞移植，例如至同种异体受试者的移植。
[0054] 此外，本发明人发现，本发明的方法刺激细胞增殖。此类方法从而具有以满足或改善细胞移植的量产生适合于移植的细胞的有利方面。这还允许减少需要从受试者采集以获得起始MSC的组织的量。
[0055] 因此，本发明的方法有利地为骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群提供改善的移植潜能。
[0056] 本发明人证实，本发明的方法保持了获得的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群的期望的成骨细胞表型。这是尤其预料不到的，因为，特别地，先前已在GDF-8缺陷型小鼠中记录到MSC的成骨分化的增加(Hamrick等人,Bone,2007,第40卷(6),1544-53)。
[0057] 在一个实施方案中，本发明的方法可包括步骤：(a)允许从受试者的生物样品中回收的并且包含MSC的细胞粘附至基质表面；和(b)在包含血浆或血清、GDF-8和FGF-2的培养基中培养粘附细胞，例如以允许将MSC体外地或离体地分化为骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群。
[0058] 在体现本发明的原理的某些方法中，可将细胞在如步骤(b)中定义的培养基中培养约10至约18天的时期。此类时期允许产生特别地满足细胞移植的量的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群。
[0059] 根据本发明的一些方法还可包括，在如(b)中定义的培养基中，将来自步骤(b)的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群传代(例如传代一次或多次)，和进一步培养所述细胞的步骤(c)。例如但不限于，可将细胞在步骤(c)中培养约3至约18天的时期，以允许产生特别地满足细胞疗法的量的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群。
[0060] 在其它实施方案中，本发明的方法可包括步骤：(a)允许从受试者的生物样品回收的并且包含MSC的细胞附着至基质表面；(b')将粘附细胞培养在包含血浆或血清和FGF-2的培养基中；和(b”)进一步将粘附细胞培养在包含血浆或血清、GDF-8和FGF-2的培养基中，例如以允许MSC体外或离体地分化为骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群。在一些实施方案中，本发明的方法还可在步骤(b')与(b”)之间包括，将细胞传代和使细胞粘附至基质表面的步骤(c')。
[0061] 应当理解，体现本发明原理的方法还可包括，一个或多个将细胞传代的步骤，即传代例如1、2、3、4或更多代。在优选实施方案中，所述方法还可包括1、2或3次传代，更优选地，1或2次传代，更优选1次传代。
[0062] 在该方面，如本文中所用，术语“原代培养(primary culture)”、“继代培养(secondary culture)”和“第三代培养(tertiary culture)”分别地是指，从受试者的生物样品回收的并且包含MSC的细胞，所述细胞在本方法的过程中未经历任何传代，已经历一次传代或已经历两次传代。在本发明的方法中，在包含血浆或血清、GDF-8和FGF-2的培养基中培养MSC可以通常但不限于，从原代培养，例如从原代培养起始时(或开始时)或从原代培养期间来进行；从继代培养，例如从继代培养起始时(或开始时)或从继代培养期间来进行；或从第三代培养，例如从第三代培养起始时(或开始时)或从第三代培养期间来进行。优选地，在包含血浆或血清、GDF-8和FGF-2的培养基中培养MSC可从原代培养，例如从原代培养开始时或从原代培养期间，优选从原代培养起始时来进行。
[0063] 如实施例中所举例说明的，从原代培养起始时来在包含血浆或血清、GDF-8和FGF-2的培养基中培养MSC，允许获得具有特别地减小的免疫原性，更具体地具有减少的MHC II类细胞表面受体表达的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群。如实施例中进一步举例说明的，从原代培养起始时在包含血浆或血清、GDF-8和FGF-2的培养基中培养MSC还特别地刺激细胞增殖。此类举例说明本发明的方法从而特别有利，因为它们获得了更大程度的细胞扩增，并且可产生特别适合用于移植的、具有减小的免疫原性的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群，例如在同种异体受试者中引起更少的排斥的细胞。
[0064] 在其它实施方案中，本文中教导的方法可包括，将所得的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群与具有成骨、骨诱导性(osteo-inductive)和/或骨传导性(osteo-conductive)性质的组分接触(例如混在一起或混合)的步骤。此类步骤可特别地允许制备适合用于移植例如给同种异体受试者移植的药物组合物。
[0065] 本文中期望的方法和用途可以特别优选地用于动物细胞，优选用于温血动物细胞，更优选哺乳动物细胞，例如人细胞或非人哺乳动物细胞，最优选人细胞。本发明的另一个方面提供了，可通过本发明的任何方法获得的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群。具体公开的是，可通过上文定义的、用于体外或离体地分化成体MSC的方法获得的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群，所述方法包括在包含血浆或血清、GDF-8和FGF-2的培养基中培养MSC的步骤。应当理解，本发明的方法通常可产生包含实质部分，例如大部分的骨祖细胞或成骨细胞的细胞群。此类细胞群还可包括其它细胞类型。
[0066] 本发明的一个方面还提供了药物组合物，所述组合物包含本文中教导的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群，并且还适当地包含赋形剂，优选地其中所述赋形剂的至少一种是具有成骨、骨诱导性和/或骨传导性性质的组分。
[0067] 本发明的其它方面提供了,如本文中教导的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群或如上文中定义的药物组合物，其用作药物，优选用于治疗(在整个本说明书中，包括治疗性和/或预防性措施)肌骨骼疾病。优选地，所述肌骨骼疾病可以是骨疾病或骨关节疾病。因此，优选地期望的是，可通过本发明的方法获得的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群，其用于治疗肌骨骼疾病，例如但不限于骨疾病和/或骨关节疾病。
[0068] 所述骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群在肌骨骼疾病的治疗中的用途是有利的，例如因为它们由于此类细胞或细胞群的减小的免疫原性而允许移植至同种异体受试者。
[0069] 根据本发明，还提供的是，本文中教导的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群用于制造药物的用途，所述药物用于治疗肌骨骼疾病，包括特别地，骨疾病和骨关节疾病。因此，特别期望的是，可通过本发明的方法获得的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群用于制造药物的用途，所述药物用于治疗肌骨骼疾病，例如但不限于骨疾病和/或骨关节疾病。
[0070] 根据本发明，还提供的是，用于治疗需要此类治疗的受试者的肌骨骼疾病，包括特别地骨疾病和骨关节疾病的方法，其包括给所述受试者施用如本文中教导的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群或如上文中定义的药物组合物。特别期望的是，用于治疗需要此类治疗的受试者的肌骨骼疾病的方法，其包括给所述受试者施用治疗上或预防上有效的量的、可通过本发明的方法获得的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群。
[0071] 因此，但非限制性地，本发明的该方面提供了下文所述的(i')至(viii')的任一项或所有项：
[0072] (i')用于将成体间充质干细胞(MSC)体外地或离体地分化为骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群的方法，所述方法包括在包含血浆或血清、生长和分化因子8(GDF-8)和成纤维细胞生长因子2(FGF-2)的培养基中培养所述MSC的步骤；
[0073] (ii')上文(i')中所示的方法，包括步骤：
[0074] (a)允许从受试者的生物样品回收的并且包含MSC的细胞粘附至基质表面；和[0075] (b)在包含血浆或血清,GDF-8和FGF-2的培养基中培养粘附细胞，例如以允许将MSC体外或离体地分化为骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群；
[0076] (iii')上文(ii')中所示的方法，其还包括，在(b)中定义的培养基中，将来自步骤(b)的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群传代和将其进一步培养的步骤(c)；
[0077] (iv')上文(i')中所示的方法，包括步骤：
[0078] (a)允许从受试者的生物样品回收的并且包含MSC的细胞粘附至基质表面；
[0079] (b')在包含血浆或血清和FGF-2的培养基中培养粘附细胞；和
[0080] (b”)在包含血浆或血清、GDF-8和FGF-2的培养基中进一步培养粘附细胞，例如以允许将MSC体外地或离体地分化为骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群；
[0081] (v')上文(iv')中所示的方法，其还在步骤(b')与(b”)之间包括，将细胞传代和允许其粘附至基质表面的步骤(c')；
[0082] (vi')上文(i')至(v')的任一项中所示的方法，其还包括，将所述骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群与具有成骨、骨诱导性和/或骨传导性性质的组分接触的步骤；
[0083] (vii')可通过上文(i')至(vi')任一项的方法获得的骨祖细胞或成骨细胞或包含所述骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群，或包含其的药物组合物；
[0084] (viii')如上文(vii')中定义的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群或上文(vii)中定义的药物组合物，其用作药物，优选用于治疗肌骨骼疾病，更优选地其中肌骨骼疾病是骨疾病或骨关节疾病。
[0087] 图1表示举例说明在包含(1)血清和FGF-2(对照)、(2)血清、FGF-2和TGF-β1以及(3)血清、FGF-2和GDF-8的培养基中培养的细胞的平均总体产率(%)的图。
[0088] 图2表示举例说明从原代培养开始时在包含(1)血清和FGF-2(对照)、(2)血清、FGF-2和TGFβ1或(3)血清、FGF-2和GDF-8的培养基中培养的细胞的HLA-DR表达(%)的图。
[0089] 图3表示举例说明从原代培养开始时在包含(1)血清和FGF-2、(2)血清、FGF-2和TGFβ1或(3)血清、FGF-2和GDF-8的培养基中培养的细胞的碱性磷酸酶(ALP)的表达(%)的图。
[0090] 图4表示举例说明从原代培养开始时分别在包含(1)血清和FGF-2(对照)、(2)血清、FGF-2和TGFβ1或(3)血清、FGF-2和GDF-8的培养基中培养的细胞的上清液中(4)IL6、(5)VEGF、(6)核心蛋白聚糖和(7)骨保护素的浓度(以pg/ml表示)的图。
[0091] 图5表示举例说明从原代培养开始时在包含血清和FGF-2(FGF-2)；血清、FGF-2和TGFβ1(TGFβ1)；或血清、FGF-2和GDF-8(GDF-8)的培养基中培养的细胞的继代培养后的矿化作用的测定。C：对照培养基，M:成骨培养基。
[0092] 图6表示举例说明在包含(6)血清和FGF-2(对照)、(7)血清、FGF-2和TGFβ1或(8)血清、FGF-2和GDF-8的培养基中培养来自第三代培养物的细胞之前和培养细胞4天之后阳性细胞(5)的百分比的图。1:CD45，2:CD105，3:HLA-DR。
[0093] 图7表示举例说明在包含(1)血清和FGF-2(对照)、(2)血清、FGF-2和1ng/ml TGFβ1、(3)血清、FGF-2和50ng/ml GDF-8、(4)血清、FGF-2和100ng/ml GDF-8或(5)血清、FGF-2和200ng/ml GDF-8的培养基中培养来自第三代培养物的细胞6天之后，细胞的HLA-DR表达(%)的图。
[0094] 图8表示举例说明来自从原代培养开始时在包含(1)血清、FGF-2和GDF-8和(2)血清和GDF-8的培养基中培养的一个批次的细胞的原代培养和继代培养的总体产率(%)的图。
[0095] 图9表示举例说明来自从原代培养开始时在包含(1)血清和FGF-2、(2)血清、FGF-2和GDF-8或(3)血清和GDF-8的培养基中培养的一个批次的细胞的碱性磷酸酶(ALP)的表达(%)的图。
[0096] 图10表示举例说明来自从原代培养开始时在包含(1)血清和FGF-2、(2)血清、FGF-2和GDF-8或(3)血清和GDF-8的培养基中培养的一个批次的细胞的HLA-DR表达(%)的图。
[0097] 发明详述
[0098] 如本文中所用，除非上下文明确地另有所指，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括单数和复数所指物。
[0099] 如本文中所用，术语“包含”、“包括”和“含有”同义，并且是包括在内的或开放性的，并且不排除另外的未引述的成员、元素或方法步骤。所述术语还包括“由……组成”和“基本上由……组成”。
[0100] 通过端点限定的数值范围包括，包含在各自范围内的所有数值和部分以及所述的端点。
[0101] 如本文中所用，术语“约”，当指可测量值例如参数、量、持续时间等时，意欲包括相对于指定的值的变化，具体地相对于指定的值的+/-10%或更少，优选+/-5%或更少，更优选+/-1%或更少，以及更优选+/-0.1%或更少的变化，只要此类变化适合于在公开的发明中进行。应理解，修饰词“约”所涉及的值本身也是明确并优选地公开的。
[0102] 术语“一个/一种或多个/多种”，例如一组成员中的一个或多个成员，本身是明确的，例如，该术语特别地包括，对所述成员的任一个的引用，或对所述成员的任意两个或更多个的引用，例如对所述成员的任意≥3、≥4、≥5、≥6或≥7个等直至所有所述成员的引用。
[0103] 本说明书中引用的所有文献通过引用整体并入本文。
[0104] 除非另有所指，否则用于公开本发明的所有术语，包括技术和科学术语，具有与本发明所属领域内的技术人员通常理解的含义相同的含义。根据进一步的指导，术语的定义可用于更好地理解本发明的教导。
[0105] 细胞培养和培养基使用的一般方法特别地概述于，大规模哺乳动物细胞培养(Hu等 人1997.Curr Opin Biotechnol8:148)；无 血 清 培养 基 (K.Kitano.1991.Biotechnology17:73)；或大规模哺乳动物细胞培养(Curr Opin Biotechnol2:375,1991)中。
[0106] 如所指出的，根据本发明的一个方面，本发明人发现了，用于将成体间充质干细胞(MSC)体外地或离体地分化为骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群方法，其包括在包含血浆或血清、生长和分化因子8(GDF-8)和成纤维细胞生长因子2(FGF-2)的培养基中培养所述MSC的步骤。
[0107] 通过对这些发现进行扩展，本发明人还认识到，GDF-8减小细胞的免疫原性的能力，并且在本发明的某些方面提供了，使用GDF-8体外或体内减小细胞的免疫原性的用途、方法和产品。在本发明的相关方面，本发明人提出了，使用GDF-8减小被施用至、植入或移植入受试者的材料被受试者排斥的风险的用途、方法和产品。
[0108] 如本文中所用，术语“免疫原性”是指，特定物质例如细胞在人或动物的体内激起免疫应答的能力。该能力取决于存在于细胞上的免疫原例如抗原或表位。此类免疫原可以是例如但不限于，任何主要组织相容性复合物(MHC)II类细胞表面受体复合物，例如任何人白细胞抗原(HLA)，优选HLA-DR。如本文中所用，术语“HLA-DR”本身是公知的，并且特别地指由染色体6区域6p21.31上的人白细胞抗原复合物编码的MHC II类细胞表面受体复合物。免疫原性还可依赖于在免疫应答中提供共刺激信号的共刺激因子。此类共刺激因子可以是例如但不限于分化抗原簇80(CD80或B7-1)或分化抗原簇86(CD86或B7-2)的一个或多个。
[0109] 因此，在其它方面，本发明提供了GDF-8用于体外减小细胞的免疫原性的用途。减小的免疫原性可包括，相较于代表在GDF-8不存在的情况下培养的细胞中的MHC II类细胞表面受体复合物的参照值，减少的MHC II类细胞表面受体复合物。例如，在人细胞上，减小的免疫原性可包括，相较于代表在GDF-8不存在的情况下培养的细胞中的HLAMHC II类细胞表面受体复合物的参照值，减少的HLA MHC II类细胞表面受体复合物。优选地，减小的免疫原性包括，相较于代表在GDF-8不存在的情况下培养的细胞中的HLA-DR的参照值，减少的HLA-DR。术语“减小”、“减少”、“消减”或“降低”在本文中可互换使用。
[0110] 表述“减少的MHC II类细胞表面受体复合物”、“减少的HLA MHCII类细胞表面受体复合物”或“减少的HLA-DR”分别指，细胞上MHCII类细胞表面受体复合物、HLA MHC II类细胞表面受体复合物或HLA-DR的减少的量和/或可用性(例如，用于进行其生物学活性的可用性)。
[0111] 如本文中所用，表述“减少细胞上的HLA-DR”是指，细胞上HLA-DR的减少的量和/或可用性(例如，用于进行其生物学活性的可用性)。该减少的量和/或可用性包括，细胞上减少的HLA-DR的量和/或细胞群中减少的表达HLA-DR的细胞的比率。
[0112] 例如但不限于，当减少的量和/或可用性包括，相较于代表在GDF-8不存在的情况下培养的细胞中的HLA-DR的各自参照值，细胞群中表达HLA-DR的细胞的减少的比率时，少于25%的细胞，优选少于20%的细胞，和更优选少于15%的细胞可表达HLA-DR。
[0113] 本发明的其它方面涉及，用于减小细胞的免疫原性的GDF-8，其中将体内施用GDF-8。可以局部施用GDF-8，例如通过注射，例如在肌骨骼损伤部位。可单独施用GDF-8或可将其与细胞例如干细胞优选MSC，优选与成人MSC和/或与细胞例如骨祖细胞或成骨细胞或与包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群组合施用，优选地其中任何此类细胞可以是人细胞。优选地，可将GDF-8与MSC，更优选成人MSC组合施用。因此，还提供了用于减小细胞的免疫原性的GDF-8，其中将GDF-8与MSC，优选与成人MSC一起体内施用。还可将GDF-8(任选地与上述细胞组合)与FGF-2共施用。优选地，将在其中进行所述施用的受试者可以是人。优选地，待施用的细胞或细胞群对于所述受试者可以是自体的或同种异体的。可将GDF-8与各个细胞或细胞群例如MSC同时体内施用，或可以以任意顺序相继地体内施用，例如，可体内施用各个细胞或细胞群例如MSC，随后可体内施用GDF-8，或可体内施用GDF-8，随后可体内施用各个细胞或细胞群例如MSC。因此，还公开了GDF-8用于制造用于减小细胞的免疫原性的药物的用途，其中将体内施用GDF-8；还公开了用于在有此需要的受试者中减小细胞的免疫原性的方法，其包括给所述受试者施用GDF-8。
[0114] 本发明的另一个方面提供了用作药物的GDF-8，其优选用于治疗肌骨骼疾病包括骨疾病和骨关节疾病。因此，还提供了GDF-8用于制造用于治疗肌骨骼疾病包括骨疾病和骨关节疾病的药物的用途。还提供了用于治疗需要此类治疗的受试者的肌骨骼疾病包括骨疾病和骨关节疾病的方法，其包括给所述受试者施用GDF-8。特别期望的是，用于治疗需要此类治疗的受试者的肌骨骼疾病的方法，其包括给所述受试者施用治疗上或预防上有效的量的GDF-8。当用作药物时，可单独施用GDF-8或可将其与细胞例如干细胞，优选MSC，优选与成人MSC和/或与细胞例如骨祖细胞或成骨细胞或与包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群组合施用，优选地其中任何此类细胞可以是人细胞。优选地，可将GDF-8与MSC，更优选成人MSC组合施用。因此，具体地公开了用作药物的GDF-8，其优选用于治疗肌骨骼疾病包括骨疾病和骨关节疾病，其中将GDF-8与MSC，优选与成人MSC一起进行体内施用。还可将GDF-8(任选地与上述细胞组合)与FGF-2共施用。还提供了用于治疗需要此类治疗的受试者的肌骨骼疾病包括骨疾病和骨关节疾病的方法，其包括将GDF-8与MSC，优选与成人MSC一起施用给所述受试者。优选地，将在其中进行所述施用的受试者可以是人。优选地，待施用的细胞或细胞群对于所述受试者可以是自体的或同种异体的。
[0115] 如上文中提及的，本发明在一个方面涉及，用于将成体间充质干细胞(MSC)体外地或离体地分化为骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群的方法。本发明还涉及，GDF-8用于在体外或体内减小细胞的免疫原性的应用，特别地其中细胞选自MSC、通过MSC的分化获得的细胞、骨细胞谱系的细胞、软骨细胞谱系的细胞、脂肪细胞谱系的细胞、肌细胞谱系的细胞、腱细胞谱系的细胞、成纤维细胞谱系的细胞和基质源性谱系的细胞。
[0116] 如本文中所用，表述“包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群”是指，包含任一种或两种所述细胞类型和任选地还包含其它未引述的细胞类型的细胞群。
[0117] 如本文中所用，“骨祖细胞”可特别地包括早期和晚期骨祖细胞。“成骨细胞”可特别地包括前成骨细胞、成骨细胞和骨细胞。所有这些术语本身是公知的，并且如本文中所用，通常可指具有成骨表型的细胞，和可促成骨材料或骨基质的形成的细胞，或能够发育成可促成骨材料或骨基质形成的细胞的细胞。具体地，本发明的方法导致有利地可用于移植或用于治疗肌骨骼疾病(例如用于在治疗背景中恢复骨形成)的细胞或细胞群。因此，术语“骨祖细胞”(包括早期和晚期骨祖细胞)和“成骨细胞”(包括前成骨细胞、成骨细胞和骨细胞)应当被解释为希望包括，由应用本发明原理的方法所产生的任何此类有用的成骨谱系的细胞。有用的成骨谱系的细胞从而可包括处于朝向成熟的骨形成细胞的成骨分化的任何阶段的细胞。
[0118] 例如但非限制性地，骨祖细胞和成骨细胞以及包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群可展示下列特征：
[0119] a)所述细胞包含Runx2的表达，Runx2是一种调节成骨细胞分化和在成骨细胞分化过程中调节许多细胞外基质蛋白基因的表达的多功能转录因子；
[0120] b)所述细胞包含至少一种下列蛋白的表达：碱性磷酸酶(ALP)，更具体地骨-肝-肾类型的ALP；和更优选还包含一种或多种另外的骨标志物例如骨钙素(OCN)、前胶原1型氨基末端前肽(P1NP)、骨结合素(ON)、骨桥蛋白(OP)和/或骨唾液蛋白(BSP)的表达，和/或一种或多种其它骨基质蛋白例如核心蛋白聚糖和/或骨保护素(OPG)的表达；
[0121] c)所述细胞大体上不表达CD45(例如少于约10%，优选少于约5%，更优选少于约2%的细胞可表达CD45)；
[0122] d)所述细胞显示使外部环境矿化或合成含钙的细胞外基质的能力的证据(例如当暴露于成骨培养基时；参见Jaiswal等人J CellBiochem,1997,第64卷,295-312)。细胞内部的钙积累和基质蛋白质中的钙沉积可以例如通过如下方法来常规地测量：在
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Ca 中培养，洗涤和再培养，随后测定存在于细胞内部或沉积在细胞外基质中的任何放射性(US5,972,703)，或使用基于茜素红的矿化测定(参见，例如Gregory等人Analytical Biochemistry,2004,第329卷,77-84)；
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Ca 中培养，洗涤和再培养，随后测定存在于细胞内部或沉积在细胞外基质中的任何放射性(US5,972,703)，或使用基于茜素红的矿化测定(参见，例如Gregory等人Analytical Biochemistry,2004,第329卷,77-84)；
[0123] e)所述细胞大体上不朝向脂肪细胞谱系(例如脂肪细胞)和软骨细胞谱系(例如软骨细胞)的细胞分化。可使用本领域建立的标准分化诱导条件(例如参见Pittenger等人Science,1999,第284卷,143-7)和测定法(例如当诱导时，脂肪细胞通常用显示脂质积累的油红O染色；软骨细胞通常用阿辛蓝或番红O染色)来测试朝向此类细胞谱系的分化的不存在。大体上缺乏朝向脂肪形成和/或软骨形成分化的倾向性可通常意指，当用于各自测试时，少于20%，或少于10%，或少于5%，或少于1%的测试细胞将显示脂肪形成或软骨形成分化的征兆。
[0124] 所述细胞还可包含一种或多种细胞招募因子例如VEGF的表达。细胞还可包含IL6的表达。
[0125] 分类为构成或属于骨细胞(骨)谱系、软骨细胞(软骨)谱系、脂肪细胞(脂肪)谱系、肌细胞(肌)谱系、腱细胞(腱)谱系、成纤维细胞(结缔组织)谱系或基质源性(间质)谱系的细胞对于本领域技术人员来说是公知的。它们包括具有各自表型的细胞，所述细胞可促进各自组织类型的形成或能够发育成可促成各自组织类型的形成的细胞。例如，骨细胞谱系的细胞包括：骨祖细胞，例如早期和晚期骨祖细胞,前成骨细胞,成骨细胞和骨细胞；软骨细胞谱系的细胞包括成软骨细胞和软骨细胞，后者还包括肥大软骨细胞；脂肪细胞谱系的细胞包括成脂肪细胞(或前脂肪细胞)和脂肪细胞；肌细胞谱系的细胞包括卫星细胞、成肌细胞和肌细胞(涉及任何类型的肌肉组织即心脏、骨骼和平滑肌组织的细胞，更优选骨骼肌组织的细胞)；腱细胞谱系的细胞包括成肌腱细胞和肌腱细胞；成纤维细胞谱系的细胞包括纤维细胞和成纤维细胞；基质源性谱系的细胞包括间质细胞，例如具体地骨髓间质细胞。
[0126] 当细胞被认为对于特定标志物是阳性的(或表达所述标志物或包含其表达)时，这意指当进行适当的测量时，本领域技术人员可确定，相较于适当的对照，该标志物的独特信号(例如可检测的抗体或通过逆转录聚合酶链式反应进行的检测)的存在或证据。当方法允许标志物的定量评价时，阳性细胞可平均产生与对照显著不同的信号，例如但不限于，与对照细胞产生的此类信号相比，至少1.5倍，例如至少2倍、至少4倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍或更多倍更高。
[0127] 上述细胞特异性标志物的表达可使用本领域已知的任何适当的免疫学技术(例如免疫细胞化学或亲和吸附、Western印迹分析、FACS、ELISA等)，或通过酶活性的任何适当的生物化学测定(例如对于ALP)，或通过测量标志物mRNA的量的任何适当的技术(例如Northern印迹、半定量或定量RT-PCR等)来检测。本公开内容中所列的标志物的序列数据是已知的，并且可获自公共数据库，例如GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
[0128] 如所提及的，本发明还涉及，包含骨祖细胞或成骨细胞的细胞群。示例性细胞群可包含至少10%，优选至少30%，更优选至少50%，例如至少60%，更优选至少70%，例如至少80%，更优选至少90%，例如至少95%的如本文中教导的骨祖细胞和/或成骨细胞。例如，细胞群可包含少于50%，优选地少于40%，更优选少于30%，更优选地少于20%，更优选少于10%，例如少于7%，少于5%或少于2%的如本文中定义的骨祖细胞和成骨细胞之外的细胞类型。
[0129] 术语“干细胞”通常是指未特化的或相对较少特化的并且具有增殖能力的细胞，其能够自我更新，即可增殖而不分化，并且其或其后代可产生至少一个相对更特化的细胞类型。该术语包括能够基本上无限地自我更新的干细胞，即，其中干细胞的后代或至少其部分大体上保持母干细胞的未特化或相对较少特化的表型以及其分化潜能和增殖能力，并且包括显示有限自我更新的干细胞，即，其中后代或其部分进一步增殖和/或分化的能力相较于母细胞明确地下降。例如但不限于，干细胞可产生后代，所述后代可沿着一个或多个谱系分化以产生不断增进地相对更特化的细胞，其中此类后代和/或不断增进地相对更特化的细胞本身可以是本文中定义的干细胞，或甚至产生终末分化的细胞，即完全特化的细胞，其可以是有丝分裂后的。
[0130] 如本文中所用，术语“成体干细胞”是指存在于胎儿期的或出生后(例如在达到成年后)的生物体中的或从所述生物体获得的(例如，从其分离的)干细胞。
[0131] 根据本发明的优选干细胞具有产生至少成骨(骨)谱系的细胞，例如成骨细胞和/或骨祖细胞和/或前成骨细胞和/或成骨细胞和/或骨细胞等的潜能。
[0132] 优选地，至少一些根据本发明的干细胞还可具有产生包含在由本发明的方法而产生的细胞群中的另外的细胞(例如内皮谱系的细胞，例如内皮祖细胞和/或内皮细胞)的潜能。
[0133] 如本文中所用，术语“间充质干细胞”或“MSC”是指成体、中胚层来源的干细胞，其能够产生间充质细胞谱系，通常两个或更多个间充质细胞谱系的细胞，例如骨细胞(骨)、软骨细胞(软骨)、肌细胞(肌)、腱细胞(腱)、成纤维细胞(结缔组织)、脂肪细胞(脂肪)和基质源性(骨髓基质)谱系的细胞。MSC可从例如骨髓、小梁骨、血液、脐带血、胎盘、胎儿卵黄囊、皮肤(真皮)，特别地胎儿和青少年皮肤、骨膜和脂肪组织分离而来。人MSC、它们的分离、体外扩增和分化已描述于例如美国专利No.5,486,359；美国专利No.5,811,094；美国专利No.5,736,396；美国专利No.5,837,539；或美国专利No.5,827,740中。本领域中描述的和通过本领域描述的任何方法分离的任何MSC可适合用于本发明的方法，只要此类MSC能够产生至少骨细胞(骨)谱系的细胞。
[0134] 术语MSC还包括MSC的后代，例如通过获自动物或人受试者的生物样品的MSC的体外或离体繁殖获得的后代。
[0135] 潜在地，但非限制性地，至少一些MSC还能够产生包含在由本发明的方法产生的细胞群中的另外的细胞。
[0136] 如实施例中所示，本发明的某些方面的方法可要求，选择在指定的培养条件下粘附至基质表面的那些骨髓干细胞(BMSC)。本领域中已知，可通过选择可粘附至基质表面例如塑料表面的那些(单核)细胞来从骨髓(或其它来源)分离MSC。因此，优选地，如本文中所用，MSC可从骨髓分离而来。骨髓的样品(BMSC)可以例如从受试者的髂嵴、股骨、胫骨、脊骨、肋骨或其它髓空间获得。
[0137] 术语“分离”，当涉及特定组分时，是指将该组分与从其分离所述组分的组合物的至少一种其它组分分开。如本文中所用，与任何细胞类型或细胞群相关的术语“分离的”还表示，此类细胞群不形成动物或人体的部分。
[0138] MSC可被包含在生物样品中，例如在包含BMSC的样品中，或可至少部分地从本领域中已知的生物样品分离而来。此外，MSC可以至少部分地从骨髓或从除骨髓外的包含MSC的任何适当来源(例如血液、脐带、胎盘、胎儿卵黄囊、皮肤(真皮)，特别地胎儿和青少年皮肤、骨膜和脂肪组织)分离而来。
[0139] 术语“体外”通常是指动物或人体外面或外部。术语“离体”通常是指，从动物或人体取出并且在体外例如在培养容器中维持或繁殖的组织或细胞。如本文中所用，术语“体外”应当理解为包括“离体”。术语“体内”通常指在动物或人体里面、其上或内部。
[0140] 在一个实施方案中，本文涉及的MSC或其它细胞类型可获自受试者的生物样品。
[0141] 术语“受试者”或“患者”可互换使用，并且是指动物，优选温血动物，更优选脊椎动物，更优选哺乳动物，特别地包括人和非人哺乳动物，所述动物为处理/治疗、观察或实验的目标。术语“哺乳动物”包括任何如此分类的动物，包括但不限于人、家养动物和农场动物、动物园动物、运动动物、宠物动物、伴侣动物和实验动物例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、狗、猫、豚鼠、牛、奶牛、绵羊、马、猪和灵长类动物，例如猴和猿。特别优选的是人受试者，包括两个性别及其所有年龄分类。
[0142] 因此，还提供了将成人MSC体外地或离体地分化为骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群的方法，所述方法包括在包含人血浆或血清、GDF-8和FGF-2的培养基中培养所述MSC的步骤。
[0143] 非人动物受试者还可包括动物的出生前形式，例如胚胎或胎儿。人受试者还可包括胎儿，但优选不包括胚胎。
[0144] 如本文中所用，术语“生物样品”或“样品”通常是指从生物来源，例如从生物体、器官、组织或细胞培养物等获得的样品。动物或人受试者的生物样品是指从动物或人受试者取出并且包含其细胞的样品。动物或人受试者的生物样品可包含一种或多种组织类型以及一种或多种组织类型的细胞。获得动物或人受试者的生物样品的方法在本领域内是公知的，例如组织活检或抽血。
[0145] 有用的受试者的生物样品包含其MSC或本文中提及的受试者的其它细胞类型。包含MSC的样品通常可从骨髓，例如从受试者的髂嵴、股骨、胫骨、脊骨、肋骨或其它髓空间获得。包含MSC的另一种有用的生物样品可来源于例如受试者的血液、脐带、胎盘、胎儿卵黄囊、皮肤(真皮)，特别地胎儿和青少年皮肤、骨膜、小梁骨或脂肪组织。本文中论述的其它细胞类型可使用可获得的方案从它们所存在的对应组织分离，例如来自骨组织的骨细胞谱系细胞、来自软骨组织的软骨细胞谱系细胞、来自脂肪组织的脂肪细胞谱系细胞、来自平滑肌、心肌或骨骼肌(优选骨骼肌)组织的肌细胞谱系细胞、来自腱组织的腱细胞谱系细胞、来自结缔组织的成纤维细胞谱系细胞或来自基质组织例如骨髓基质的基质源性谱系细胞。或者，此类细胞类型可使用本身已知的方案从MSC分化而来。
[0146] 在一个实施方案中，MSC可获自健康受试者，这可帮助确保骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群或本文提及的从所述MSC分化而来的其它细胞类型的功能性。在其它实施方案中，MSC或本文提及的其它细胞类型可获自健康受试者，这可帮助确保此类细胞的功能性。
[0147] 在另一个实施方案中，MSC可获自这样的受试者，所述受试者处于发生肌骨骼疾病例如骨疾病的风险中或患有所述疾病，从而可特别地从骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群(所述细胞按照本发明的方法从所述MSC分化而来)的施用获得益处。
[0148] 在其它实施方案中，MSC或本文提及的其它细胞类型可获自这样的受试者，所述受试者处于发生不利地影响组织的疾病的风险中或患有所述疾病，其可从MSC或本文提及的一种或多种其它细胞类型的施用获得益处。
[0149] 如本文中所用，术语“肌骨骼疾病”是指任何类型的骨疾病、肌病、骨关节疾病或软骨营养障碍，所述疾病的治疗可从成骨谱系细胞，例如骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群至患有所述疾病的受试者的施用获得益处。具体地，此类疾病可以例如通过减少的骨形成或过多的骨吸收，通过减少的存在于骨中的成骨细胞或骨细胞的数目、活力或功能，减少的受试者的骨量，骨的变细，减弱的骨强度或弹性等来表征。
[0150] 可从如本文中教导的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群的施用受益的肌骨骼疾病的非限定性实例可包括，局部或系统性障碍，例如任何类型的骨质疏松症或骨质减少(例如原发性的、绝经后的、衰老的、肾上腺皮质激素诱发的、双磷酸盐诱发的和放射疗法诱发的)；任何继发性骨坏死、单部位或多部位骨坏死；任何类型的骨折例如骨不连接、畸形愈合、延迟愈合骨折或挤压、需要骨融合(例如脊柱融合术和重建)的病况、颌面骨折、先天性骨质缺损、骨重建(例如在创伤或癌症手术后)，以及颅面骨重建；创伤性关节炎、局灶性软骨和/或关节缺损、局灶性退行性关节炎；骨关节炎、退行性关节炎、膝关节病和髋关节变性病；成骨不全；溶骨性骨癌；佩吉特病、内分泌障碍、低磷血症、低钙血症、肾性骨营养障碍、骨软化、动力缺失性骨疾病、甲状旁腺功能亢进、原发性甲状旁腺功能亢进症、继发性甲状旁腺功能亢进症；牙周病；高-斯病和麦-奥二氏综合征；类风湿关节；脊椎关节病，包括强直性脊柱炎、牛皮癣关节炎、肠病性关节病和未分化脊椎关节炎和反应性关节炎；系统性红斑狼疮和相关综合征；硬皮病和相关障碍；Sjogren's综合征；系统性脉管炎、包括巨细胞动脉炎(Horton's病)、Takayasu's动脉炎、风湿性多肌痛、ANCA相关脉管炎(例如Wegener's肉芽肿病、显微镜下多脉管炎和Churg-Strauss综合征)、Behcet's综合征和其它多动脉炎和相关障碍(例如结节性多发性动脉炎、Cogan's综合征和Buerger's病)；伴随其它全身性炎性疾病的关节炎，包括淀粉样变性病和肉瘤样病；结晶性关节病包括痛风、焦磷酸钙二水化物疾病、与磷酸钙或草酸钙结晶的关节沉着相关的障碍或综合征；软骨钙质沉着症和神经病性关节病；Felty's综合征和Reiter's综合征；莱姆病和风湿热。
[0151] 应用本发明原理的方法和用途可涉及，在本身已知的细胞或组织培养基存在的情况下培养(例如维持、繁殖和/或分化)细胞或细胞群，例如使用液体或半固体(例如胶状的)，优选使用液体细胞或组织培养基。此类培养基可期望地支持细胞或细胞群的维持(例如存活、基因型、表型和/或功能稳定性)和繁殖。
[0152] 具体地，体现本发明原理的方法可包括，在包含血浆或血清和GDF-8和FGF-2的培养基中培养MSC的步骤。因此，一般来说，可通过将它们包含在培养基中来将细胞培养在包含一种或多种试剂，例如生长因子和血浆或血清的培养基中。
[0153] 本领域技术人员将理解，血浆和血清是复杂的生物组合物，其可包含一种或多种生长因子、细胞因子或激素。因此，期望将所述的生长因子，特别地GDF-8和FGF-2，额外地，即外源地或补充地提供于所述血浆或血清中。
[0154] 还提供了用于将成体间充质干细胞(MSC)体外地或离体地分化为骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群的方法，所述方法包括在基本上由基础培养基、血浆或血清、GDF-8和FGF-2组成或由所述成分组成的培养基中培养所述MSC的步骤。
[0155] 因此，在一个实施方案中，GDF-8和FGF-2可以是添加至培养基的唯一生长因子。
[0156] 在其它实施方案中，除了GDF-8和FGF-2以外，还可用一种或多种另外的、外源地添加的除GDF-8和FGF-2外的生长因子培养MSC。
[0157] 在优选实施方案中，本发明方法中使用的任一种或多种或所有生长因子(如本文中所用，对生长因子的一般性引述特别地包括GDF-8和FGF-2生长因子，以及任选地一种或多种其它生长因子)是人生长因子。如本文中所用，术语“人生长因子”是指，大体上与天然存在的人生长因子相同的生长因子。例如，当生长因子是蛋白质性质的实体时，其组成肽或多肽可具有与天然存在的人生长因子相同的一级氨基酸序列。人生长因子的使用是优选的，因为此类生长因子预期引发期望的对人细胞功能的作用。
[0158] 术语“天然存在的”用于描述，可天然发现的、与由人类人工生产的不同的物体或实体。例如，存在于生物体中的多肽序列是天然存在的，其可从天然来源分离，并且未曾在实验室中被人有意地进行修饰。当提及特定实体，例如提及多肽或蛋白质时，该术语包括其天然存在的所有形式和变体(例如因物种和个体之间正常的变化而天然产生的)。例如，当提及蛋白质性质的生长因子时，术语“天然存在的”包括，在它们的组成肽或多肽的一级序列上具有差异(因物种之间的遗传趋异和个体之间的正常等位基因变异而导致的)的生长因子。
[0159] FGF-2或成纤维细胞生长因子2通常也称为碱性成纤维细胞生长因子、FGFb、bFGF、prostatropin或肝素结合生长因子2前体(HBGF-2)。示例性人FGF-2包括但不限于，具有如在Uniprot/Swissprot登录号P09038(http://www.uniprot.org/uniprot/)下注释的一级氨基酸序列的FGF-2。本领域技术人员可理解，所述序列是前体FGF-2的序列，并且可包括从成熟FGF-2加工除去的部分。示例性人FGF-2蛋白序列可以是如在NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)登录号NP_001997.5下注释的。示例性人FGF-2也已特别地由Abraham等人1986(EMBO J5:2523-8)和Kurokawa等人1987(FEBS Lett213:189-94)进行了描述。
[0160] GDF-8或生长和分化因子8通常也称为肌骨素(MSTN)。示例性人GDF-8包括但不限于,具有如在Uniprot/Swissprot登录号O14793下注释的一级氨基酸序列的GDF-8。示例性人GDF-8蛋白前体序列可以是如在NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)登录号NP_005250.1下注释的。示例性鼠GDF-8也特别地由McPherron等人
1997(Nature387(6628):83-90)进行了描述。
1997(Nature387(6628):83-90)进行了描述。
[0161] 可将GDF-8和FGF-2以足以诱导MSC分化为骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群的浓度包含在本文中定义的培养基中。通常地，可将FGF-2以0.1至100ng/ml，优选地0.5至20ng/ml，例如以约19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7或6ng/ml或以约5ng/ml或更低，例如以约4、3、2、1或0.5ng/ml的浓度包含在培养基中。通常地，可将GDF-8以0.1至1000ng/ml，例如1-500ng/ml，例如以约450、400、350、300、250或
200ng/ml，或以约150ng/ml或更低，例如以约100、75、50、25或10ng/ml，或优选以约5ng/ml或更低，例如以约4、3、2、1、0.75、0.5或0.25ng/ml的浓度包含在培养基中。所述值意欲指，外源地补充至培养基中的各自生长因子的浓度。
200ng/ml，或以约150ng/ml或更低，例如以约100、75、50、25或10ng/ml，或优选以约5ng/ml或更低，例如以约4、3、2、1、0.75、0.5或0.25ng/ml的浓度包含在培养基中。所述值意欲指，外源地补充至培养基中的各自生长因子的浓度。
[0162] 本文中对任何蛋白质、多肽或肽例如任何生长因子包括GDF-8和FGF-2的引用还可包括其片段。术语蛋白质、多肽或肽的“片段”通常是指，所述蛋白质、多肽或肽的N末端和/或C末端缺失或截断的形式。不受限制地，核酸、蛋白质、多肽或肽的片段可代表至少约5%，或至少约10%，例如≥20%、≥30%或≥40%，例如优选≥50%，例如≥60%，≥70%或≥80%，或更优选≥90%或≥95%的所述核酸的核苷酸序列或所述蛋白质、多肽或肽的氨基酸序列。
[0163] 本文中对任何蛋白质、多肽或肽例如任何生长因子包括GDF-8和FGF-2的引用还包括其变体。术语核酸、蛋白质、多肽或肽的“变体”是指，其序列(即，分别地核苷酸序列或氨基酸序列)与所引述的核酸、蛋白质或多肽的序列具有大体上的同一性(即，很大程度上但非完全同一)，例如至少约80%的同一性或至少约85%的同一性，例如优选至少约90%的同一性，例如至少91%的同一性，92%的同一性，更优选至少约93%的同一性，例如至少94%的同一性，更优选至少约95%的同一性，例如至少96%的同一性，更优选至少约97%的同一性，例如至少98%的同一性，和最优选至少99%的同一性的核酸、蛋白质、多肽或肽。优选地，当在序列比对中查询引述的核酸、蛋白质、多肽或肽的完整序列(即，整体序列同一性)时，变体可显示此类程度的与引述的核酸、蛋白质、多肽或肽的同一性。在核酸、蛋白质、多肽或肽的片段和变体当中，还包括所述核酸、蛋白质、多肽或肽与另一种(通常无关的)核酸、蛋白质、多肽或肽的融合产物。
[0164] 序列同一性可使用本身已知的用于进行序列比对和序列同一性测定的适当算法来测定。示例性但非限定性算法包括，基于最初由Altschul等人1990(J Mol Biol215:403-10)描述的基本局部比对搜索工具(BLAST)的算法，例如由Tatusova和Madden1999(FEMSMicrobiol Lett174:247-250)描述的“Blast2序列”算法，例如其使用公开的缺省设置或其它适当的设置(例如，例如对于BLASTN算法：开放缺口罚分=5，延伸缺口罚分=2，错配罚分=-2，匹配奖励=1，缺口x_dropoff=50，期望值=10.0，字长=28；或对于BLASTP算法：矩阵=Blosum62，开放缺口罚分=11，延伸缺口罚分=1，期望值=10.0，字长=3)。
[0165] 蛋白质、多肽或肽的变体可以是所述蛋白质、多肽或肽的同源物(例如直系同源物或旁系同源物)。如本文中所用，术语“同源性”通常是指，来自相同或不同分类群的两个大分子之间，特别地两个蛋白质或多肽之间的结构相似性，其中所述相似性归因于共有祖先。
[0166] 当本说明书提及或涉及蛋白质、多肽或肽的片段和/或变体时，这优选表示“功能性”的变体和/或片段，即，至少部分保留各自蛋白质、多肽或肽的生物学活性或期望的功能性的变体和/或片段。例如但不限于，GDF-8或FGF-2的功能性片段和/或变体应当分别至少部分地保留GDF-8或FGF-2的生物学活性。例如，其可保留GDF-8或FGF-2的生物学活性的一个或多个方面，例如结合一个或多个同源受体的能力，参与一个或多个细胞途径的能力等。优选地，功能性片段和/或变体相较于对应的蛋白质、多肽或肽可保留至少约20%，例如至少30%，或至少约40%，或至少约50%，例如至少60%，更优选至少约70%，例如至少
80%，更优选至少约85%，更优选至少约90%，最优选至少约95%或约100%或更高的期望生物学活性或功能性。特别地，在本发明的方法或用途中，功能性片段或变体保留至少一定程度的刺激MSC细胞的成骨分化的能力。
80%，更优选至少约85%，更优选至少约90%，最优选至少约95%或约100%或更高的期望生物学活性或功能性。特别地，在本发明的方法或用途中，功能性片段或变体保留至少一定程度的刺激MSC细胞的成骨分化的能力。
[0167] 当蛋白质、多肽或肽例如生长因子通过与其同源受体结合来发挥其作用时，蛋白质、多肽或肽的功能性片段和/或变体可保留至少约20%，例如至少30%，或至少约40%，或至少约50%，例如至少60%，更优选至少约70%，例如至少80%，更优选至少约85%，更优选至少约90%，最优选至少约95%或甚至约100%或更高的各自蛋白质、多肽或肽的对该受体结合的亲和力和/或特异性。上述结合参数可由本领域技术人员使用本身已知的体外或细胞测定来容易地测定。
[0168] 当给定的蛋白质、多肽或肽例如给定的生长因子的活性可在已建立的测定，例如体外或细胞测定中容易地测量(例如，测量细胞培养物中的促有丝分裂活性)时，蛋白质、多肽或肽的功能性片段和/或变体可在此类测定中显示活性，所述活性为至少约20%，例如至少30%，或至少约40%，或至少约50%，例如至少60%，更优选至少约70%，例如至少80%，更优选至少约85%，更优选至少约90%，最优选至少约95%或甚至约100%或更高的各自蛋白质、多肽或肽的活性。
[0169] 蛋白质、多肽或肽例如生长因子的“活性”通常可包括，蛋白质、多肽或肽的生物学活性的任一个或多个方面，例如但不限于，其例如在细胞、组织、器官或生物体内的生物化学活性、酶促活性、信号转导活性、相互作用活性、配体活性和/或结构活性的任一个或多个方面。例如但不限于，GDF-8或FGF-2的活性可以具体地指，它们作为配体的活性，即它们结合一种或多种同源受体的能力，和/或它们作为信号转导分子的活性，即它们参与一个或多个细胞信号转导途径的能力等。
[0170] 本文中对任何蛋白质、多肽或肽例如任何生长因子包括GDF-8和FGF-2的引用还可包括其衍生物。术语蛋白质、多肽或肽的“衍生物”通常是指，通过一个或多个氨基酸残基的化学改变和/或一个或多个氨基酸残基上的一个或多个部分的添加(例如通过糖基化、磷酸化、酰化、乙酰化、硫酸化、脂化、烷化等)而衍生的蛋白质、多肽或肽。通常地，可对少于50%，例如少于40%，优选地少于30%，例如少于20%，更优选少于15%，例如少于10%或少于5%，例如少于4%，3%，2%或1%的蛋白质、多肽或肽中的氨基酸进行衍生化。蛋白质性质的衍生物可包含一个或多个蛋白质、多肽或肽，所述蛋白质、多肽或肽中的至少一个可在至少一个氨基酸残基上进行衍生化。当本说明书提及或涉及蛋白质、多肽或肽的衍生物时，这优选指功能性的衍生物。
[0171] 在优选实施方案中，生长因子可以是重组体，即，由宿主生物体通过已被引入宿主生物体(例如细菌，例如但不限于大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(S.tymphimurium)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；酵母，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；培养的植物细胞，例如，特别地，拟南芥(Arabidopsis thaliana)和烟草(Nicotiana tobaccum)细胞；动物细胞，例如哺乳动物和昆虫细胞；或多细胞生物，例如植物或动物)或其祖先、并且包含编码生长因子的序列的重组核酸分子的表达而产生。重组表达生长因子的使用降低了致病体传播的风险。
[0172] 术语“血浆”是如常规定义的。血浆通常获自被提供以抗凝剂(例如，肝素、柠檬酸盐、草酸盐或EDTA)或与所述抗凝剂接触的全血的样品。随后，通过适当的技术，通常通过离心，将血液样品的细胞组分与液体组分(血浆)分离。术语“血浆”从而是指不形成人或动物身体的部分的组合物。
[0173] 术语“血清”是如常规定义的。血清通常可这样从全血样品获得：首先使凝固在样品中发生，随后通过适当的技术，通常通过离心，将所形成的凝块和血液样品的细胞组分与液体组分(血清)分离。凝固可通过惰性催化剂例如玻璃珠或粉末来促进。或者，可通过除去抗凝剂和血纤蛋白来从血浆获得血清。术语“血清”从而是指不形成人或动物身体的部分的组合物。
[0174] 分离的血浆或血清可直接用于本发明的方法。还可将它们适当地贮存以待日后使用(例如，贮存较短的时期，例如在高于血浆或血清的各自凝固点但低于环境温度的情况下，直至约1-2周，该温度通常为约4℃至5℃；或通过冷冻贮存更长的时间，通常在约-70℃至约-80℃下)。
[0175] 分离的血浆或血清可被加热灭活(如本领域中已知的)，特别地以除去补体。当本发明的方法使用对于在其存在下培养的细胞是自体的血浆或血清时，可以不必加热灭活血浆或血清。当血浆或血清对于培养的细胞是至少部分同种异体的时，可有利地加热灭活血浆或血清。
[0177] 本发明的方法可使用对于与其接触的MSC或其它细胞类型是自体的血浆或血清。术语“自体的”，当提及血浆或血清时，是指血浆或血清与待和血浆或血清接触的MSC或其它细胞类型获自相同的受试者。本发明的方法还可使用对于与其接触的MSC或其它细胞类型是“同源的”或“同种异体的”血浆或血清，即，其从除MSC或其它细胞类型所获自的受试者外的一个或多个(混合的)受试者获得。本发明的方法还可使用如上定义的自体和同源(同种异体)血浆或血清的混合物。
[0178] 本发明还公开了，用于将成体MSC体外地或离体地分化为骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群的方法，所述方法包括，在包含血浆或血清和GDF-8的培养基中培养所述MSC的步骤。如实施例部分所举例说明的，包括在包含血浆或血清和GDF-8的培养基中培养MSC的步骤的方法至少部分实现了，利用本发明的方法(其包括在包含血浆或血清以及GDF-8和FGF-2的培养基中培养所述MSC的步骤)所获得的有利效果。
[0179] 在一个实施方案中，本发明的方法包括步骤：(a)允许从受试者的生物样品回收的并且包含MSC的细胞粘附至基质表面；和(b)在包含血浆或血清、GDF-8和FGF-2的培养基中培养粘附细胞。
[0180] 本发明的任一个方法可任选地包括步骤：在从受试者的生物样品回收的并且包含MSC的细胞中分离出单核细胞，随后使所分离的单核细胞粘附至基质表面。单核细胞的分离可使用常规方法例如密度梯度离心来进行。
[0181] 在培养基(通常液体细胞培养基)存在的情况下进行细胞(例如特别地粘附细胞)的培养。通常地，培养基可包含本领域内已知的基础培养基制剂。许
多基础培养基制剂(可以例如从美国典型培养物保藏中心，ATCC获得；或可从
Invitrogen,Carlsbad,California获得)可用于培养本文中的细胞，包括但不限于，可从Invitrogen或Cambrex(New Jersey)获得的Eagle's最低基础培养基(MEM)、Dulbecco's改良Eagle's培养基(DMEM)、α改良的最低基础培养基(α-MEM)、基础必需培养基(BME)、BGJb、F-12营养培养基(Ham)、Iscove's改良Dulbecco's培养基(IMDM)及其改良形式和/或组合。上述基础培养基的组成在本领域通常是已知的，并且根据培养的细胞的需要改良或调整培养基和/或培养基补充剂的浓度在本领域技术人员的能力范围之内。
多基础培养基制剂(可以例如从美国典型培养物保藏中心，ATCC获得；或可从
Invitrogen,Carlsbad,California获得)可用于培养本文中的细胞，包括但不限于，可从Invitrogen或Cambrex(New Jersey)获得的Eagle's最低基础培养基(MEM)、Dulbecco's改良Eagle's培养基(DMEM)、α改良的最低基础培养基(α-MEM)、基础必需培养基(BME)、BGJb、F-12营养培养基(Ham)、Iscove's改良Dulbecco's培养基(IMDM)及其改良形式和/或组合。上述基础培养基的组成在本领域通常是已知的，并且根据培养的细胞的需要改良或调整培养基和/或培养基补充剂的浓度在本领域技术人员的能力范围之内。
[0182] 可如本文中期望的，在所述培养基存在的情况下将细胞粘附至基质表面。
[0183] 此类基础培养基制剂包含哺乳动物细胞发育所必需的成分，所述成分本身是已知的。例如但非限制性地，这些成分可包括无机盐(具体地包含Na、K、Mg、Ca、Cl、P和可能地Cu、Fe、Se和Zn的盐)、生理缓冲剂(例如HEPES、碳酸氢盐)、核苷酸、核苷和/或核酸碱基、核糖、脱氧核糖、氨基酸、维生素、抗氧化剂(例如谷胱甘肽)和碳源(例如葡萄糖、丙酮酸钠、醋酸钠)等。
[0184] 为了用于培养，基础培养基可补充以一种或多种其它组分。例如，可将另外的补充剂用于给细胞提供必需微量元素和物质以获得最佳生长和扩增。此外，还可添加抗氧化补充剂例如β-巯基乙醇。虽然许多基础培养基已包含氨基酸，但可在之后补充一些氨基酸，例如已知在溶液中时不太稳定的L-谷氨酰胺。还可给培养基提供抗生素和/或抗霉菌化合物，例如，通常青霉素和链霉素的混合物，和/或其它化合物，例如但不限于两性霉素、氨苄西林、庆大霉素、博来霉素(bleomycin)、潮霉素、卡那霉素、丝裂霉素、霉酚酸、萘啶酸、新霉素、制霉菌素、巴龙霉素、多粘菌素、嘌呤霉素、利福平、壮观霉素、四环素、泰洛星和博来霉素(zeocin)。
[0185] 还可将脂质和脂质载体用于补充细胞培养基。此类脂质和载体可包括但不限于环糊精、胆固醇、缀合至白蛋白的亚油酸、缀合至白蛋白的亚油酸和油酸、未缀合的亚油酸、缀合至白蛋白的亚油酰基-油酰基-花生四烯酸、未缀合至和缀合至白蛋白的油酸等等。白蛋白可类似地用于无脂肪酸制剂。
[0186] 还可将血浆或血清以约0.5%至约30%，优选地约1%至约15%的比例(血浆或血清的体积/培养基的体积)包含在所述培养基中。本发明的方法可利用相对低的量的血浆或血清令人满意地进行，例如约5或10%的体积百分比或更低，例如约1、约2、约3或约4%的体积百分比来进行，这有利地降低成本或允许减少需要获得以培养MSC的血浆或血清的体积。
[0187] 在本发明的一个实施方案中，可将细胞(特别地(a)的细胞)以5x102至5x107个2 3 5 2
细胞/cm，优选地5x10 至5x10 个细胞/cm 涂板以进行粘附。
细胞/cm，优选地5x10 至5x10 个细胞/cm 涂板以进行粘附。
[0188] 培养容器可提供塑料表面以使细胞能够粘附。表面可以是玻璃表面或可涂覆有助于细胞的粘附和生长的适当材料，例如Matrigel(R)、层粘连蛋白或胶原。
[0189] 可将细胞在如(b)中定义的培养基中培养约10至约18天的时期。例如，可在步骤(b)中或步骤(a)和(b)中培养细胞，进行约10至约16天，通常约12-14天的时期。另外地，可在步骤(b)中或步骤(a)和(b)中培养细胞直至其汇合度达到约60%或更多，或约80%或更多，或约90%或更多，或甚至达到100%。
[0190] 在一个实施方案中，在步骤(b)后，所述方法可包括收集所获得的细胞或细胞群。
[0191] 在另一个实施方案中，在步骤(b)后，可将获得的细胞传代1次或多次，例如1、2、3、4或更多次，优选地，可将细胞传代1、2或3次，更优选，1或2次，更优选，可将细胞传代1次。传代次数是指将细胞从培养容器取出并且经历继代培养即传代的次数。例如，传代通常可包括，使用二价离子螯合剂(例如EDTA或EGTA)和/或胰蛋白酶或适当的蛋白酶使细胞脱离；重悬浮脱离的细胞；和将细胞以期望的细胞密度再涂板在相同的或新的培养容器中。
[0192] 在优选实施方案中，在步骤(b)之后，所述方法从而还包括，在(b)中定义的培养基中，将来自步骤(b)的细胞或细胞群传代(特别地1次)并且进行进一步培养的步骤(c)。在进行此类步骤(c)后，可收集细胞或细胞群。
[0193] 在传代步骤(c)中，优选地将细胞以5x101至5x106个细胞/cm2，优选地5x102至4 2 3 2
5x10 个细胞/cm，更通常地以约5x10 个细胞/cm 涂板以进一步培养。
5x10 个细胞/cm，更通常地以约5x10 个细胞/cm 涂板以进一步培养。
[0194] 通常地，将细胞在步骤(c)中进一步培养约3至约18天的时期。该时期提供令人满意的细胞扩增。
[0195] 在其它实施方案中，本发明的方法包括步骤：(a)允许从受试者的生物样品回收的并且包含MSC的细胞粘附至基质表面；(b')在包含血浆或血清和FGF-2的培养基中培养粘附细胞；和(b”)在包含血浆或血清、GDF-8和FGF-2的培养基中进一步培养粘附细胞。
[0196] 可将细胞在(b')中或步骤(a)和(b')中定义的培养基中培养约10至约24天的时期。例如，可将细胞在步骤(b')中或步骤(a)和(b')中培养约10至约22天，通常约14-21天的时期。另外地，可将细胞在步骤(b')中或步骤(a)和(b')中培养直至它们的汇合度达到约60%或更多，或约80%或更多，或约90%或更多，或甚至达到100%。
[0197] 可将细胞在如(b”)中定义的培养基中培养约1天至约10天的时期。例如，可将细胞在步骤(b”)中培养约2天至约8天，通常地约4-6天的时期。另外地，可将细胞在步骤(b”)中培养直至它们的汇合度达到约60%或更多，或约80%或更多，或约90%或更多，或甚至达到100%。
[0198] 在另一个实施方案中，本发明的方法还在步骤(b')与步骤(b”)之间包括，将细胞传代并且使细胞粘附至基质表面的步骤(c')。在步骤(c')中，可将细胞传代1或多次，例如1、2或3次，优选地，可将细胞传代1或2次。
[0199] 在传代步骤(c')中，优选以5x101至5x106个细胞/cm2，优选地5x102至5x104个2 3 2
细胞/cm，更常见地以约5x10 个细胞/cm 将细胞涂板以进行进一步培养。
细胞/cm，更常见地以约5x10 个细胞/cm 将细胞涂板以进行进一步培养。
[0200] 在另一个实施方案中，在步骤(b”)后，根据本发明的方法可包括收集所获得的细胞或细胞群。
[0201] 本发明的方法产生具有优良特征(例如特别高的扩增率和低MHCII类细胞表面受体复合物表达)的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群，所述细胞和细胞群适合用于预防性或治疗性治疗例如用于移植。
[0202] 因此，在其它方面，本发明涉及，可使用如上所述的本发明方法获得或直接获得的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群。
[0203] 还提供了，可使用如上所述的本发明方法获得或直接获得的包含骨祖细胞或成骨细胞的分离的细胞群或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群。
[0204] 体现本发明原理的上文中定义的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群显示优良的特征，例如特别高的扩增率和低MHC II类细胞表面受体复合物表达，所述细胞和细胞群适合用于预防性或治疗性移植。
[0205] 因此，本文中教导的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群可用于给具有肌骨骼疾病(例如如本说明书中其它地方定义的)的受试者自体或同种异体施用。优选地，可将人骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群给人受试者施用以治疗肌骨骼疾病。
[0206] 如本文中所用，短语例如“需要治疗的受试者”包括，从给定的病况特别地肌骨骼疾病的治疗中获得益处的受试者。此类受试者可包括但不限于，已经诊断患有所述病况的受试者，易于感染或发生所述病况的受试者，和/或待预防所述病况的受试者。
[0207] 术语“治疗”或“疗法”包括已发生的疾病或病况的治疗性治疗，例如已发生的肌骨骼疾病的疗法，以及预防性或防治性措施，其中目的是防止或减小不期望的受累的发生机会，例如防止肌骨骼疾病的发生、发展和进展。有益或期望的临床结果可包括但不限于，一个或多个症状或一个或多个生物标志物的缓解，疾病程度的减轻，稳定的(即，未恶化的)疾病状态，疾病进展的延迟或减慢，疾病状态的改善或减轻等。“治疗”还可意指，与未接受治疗时预期的存活相比，延长的存活。
[0208] 术语“预防上有效的量”是活性化合物或药物试剂的抑制或延迟受试者的障碍发作的量(如研究人员、兽医、医学博士或其它临床医生所确定的)。如本文中所用，术语“治疗上有效的量”是指活性化合物或药物试剂的引发受试者的生物或医学应答的量(其由研究人员、兽医、医学博士或其它临床医生所确定)，所述生物或医学应答可特别地包括，待治疗的疾病或病况的症状的缓解。用于测定本发明的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群的治疗上和预防上有效的量的方法在本领域中是已知的。
[0209] 在本发明的一个实施方案中，骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群，或本文中提及的其它细胞类型，可从将向其中引入骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群或本文中提及的其它细胞类型的受试者的MSC分化而来(即，自体细胞)。根据另一个实施方案(所述实施方案特别地因本发明的细胞的低MHC II类细胞表面受体复合物表达而在本文中是可行的)，骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群，或本文中提及的其它细胞类型，可从一个或多个受试者(其不是将向其中引入骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群或本文中提及的其它细胞类型的受试者)的MSC分化而来(即，同种异体细胞)。
[0210] 根据本发明的其它方面，可将本文中定义的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群配制成药物组合物，并且以药物组合物形式施用。
[0211] 根据本发明的其它方面，可将GDF-8配制成药物组合物并且以药物组合物形式施用。当其免疫原性将通过GDF-8的体内施用而减小的细胞也将被施用至受试者时，可将此类细胞适当地配制成药物组合物并且以药物组合物的形式施用。在某些实施方案中，相同的药物组合物可包含GDF-8和细胞，然而在其它实施方案中，可将GDF-8和细胞包含在分开的药物组合物中。此外，可将其被排斥的风险有待通过体内施用GDF-8而减小的任何材料适当地配制成药物组合物并且以药物组合物的形式施用。在某些实施方案中，相同药物组合物可包含GDF-8和所述材料，然而在其它实施方案中，可将GDF-8和材料包含在分开的药物组合物中。
[0212] 药物组合物通常将包含一个或多个活性成分(例如GDF-8、细胞和/或材料)和一种或多种药学上可接受的载体/赋形剂。例如，药物组合物通常可包含本文中公开的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群(作为活性成分)，以及一种或多种药学上可接受的载体/赋形剂。如本文中所用，“载体”或“赋形剂”包括任何和所有溶剂、稀释剂、缓冲剂(例如，中性缓冲盐溶液或磷酸缓冲盐溶液)、增溶剂、胶体、分散介质、媒介物、填充剂、螯合剂(例如，EDTA或谷胱甘肽)、氨基酸(例如，甘氨酸)、蛋白质、崩解剂、粘合剂、润滑剂、湿润剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、调味剂、增香剂、增稠剂、用于实现储存作用的试剂、包衣、抗真菌剂、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂、张力控制剂、吸收延迟剂等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域是公知的。此类材料应当是无毒性的并且不应当干扰细胞的活性。
[0213] 载体或其它材料的精确性质将取决于施用途径。例如，组合物可以以胃肠外可接受的水溶液形式存在，其不含热原并且具有适当的pH、等渗性和稳定性。关于药物配制的一般原则，读者可参考Handbook of Pharmaceutical Excipients第6 版，2009,eds.Rowe 等 人；Remington's Pharmaceutical Sciences, 第 18 版 ,Mack Publishing Co.,Easton,PA(1990)；Cell Therapy:Stem Cell Transplantation,Gene Therapy,and Cellular Immunotherapy, 由 G.Morstyn&W.Sheridan 编 辑 ,Cambridge University Press,1996；和Hematopoietic Stem Cell Therapy,E.D.Ball,J.Lister&P.Law,Churchill Livingstone,2000。
[0214] 此类药物组合物可包含确保其中的细胞的活力的其它组分。例如，组合物可包含适当的缓冲系统(例如磷酸盐或碳酸盐缓冲系统)来获得期望的pH，更常见地近中性pH，并且可包含充足量的盐来确保细胞的等渗条件以防止渗透性应激。例如，用于这些目的适当溶液可以是磷酸缓冲盐溶液(PBS)、氯化钠溶液、林格氏注射液或乳酸林格氏注射液，如本领域中已知的。此外，组合物可包含载体蛋白例如白蛋白，其可增加细胞的活力。
[0215] 根据本发明的药物组合物还可包括，具有成骨(凭借自身力量形成骨)、骨诱导性和/或骨传导性性质的其它组分。
[0216] 术语“骨诱导性”是指，组分例如肽生长因子招募未成熟细胞例如干细胞、MSC并且刺激这些细胞分化为前成骨细胞和成熟成骨细胞，从而形成骨组织的能力。药物组合物还可包含具有骨诱导性性质的组分，例如骨诱导蛋白或肽，例如骨形态发生蛋白，例如BMP-2、BMP-7或BMP-4；水凝胶或生物聚合物例如胶原、透明质酸或其衍生物、骨结合素、血纤蛋白原或骨钙素。优选地，药物组合物还可包含透明质酸或其衍生物、胶原或血纤蛋白原。
[0217] 术语“骨传导性”是指，组分用作骨细胞可在其上附着、迁移、生长和产生新的骨的支架的能力。药物组合物还可包含具有骨传导性性质的组分，例如，骨传导性支架或基质或表面例如但不限于磷酸三钙、羟基磷灰石、羟基磷灰石/磷酸三钙颗粒的组合(HA/TCP)、明胶、聚乳酸、聚乳酸乙醇酸、透明质酸、壳聚糖、聚L-赖氨酸或胶原。
[0218] 如上文中所述，根据本发明的药物组合物可包含用于修复骨损伤和缺陷的组分。药物组合物可包含具有骨传导性性质的支架或基质。可将骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群与脱矿物质骨基质(DBM)或其它基质组合，以使复合物具有成骨性质以及骨传导性性质和骨诱导性性质。使用自体骨髓细胞和同种异体DBM的相似方法已产生良好的结果(Connolly等人1995.Clin Orthop313:8-18)。
[0219] 根据本发明的药物组合物还可包含补充的生物活性因子或骨诱导蛋白例如骨形态发生蛋白，例如BMP-2、BMP-7或BMP-4或任何其它生长因子，或可与所述因子或蛋白共施用。其它可能的伴随组分包括适合于帮助骨再生的钙或磷酸盐的无机来源(WO00/07639)。必要时，可在载体基质或材料上施用细胞制剂以提供改善的组织再生。例如，材料可以是水凝胶，或生物聚合物例如明胶、胶原、透明质酸或其衍生物、骨结合素、血纤蛋白原或骨钙素。可按照标准技术(例如Mikos等人,Biomaterials14:323,1993；Mikos等人,Polymer35:1068,1994；Cook等人,J.Biomed.Mater.Res.35:513,1997)合成生物材料。
[0220] 非限定性地，取决于疾病的类型和严重度，GDF-8的常用日剂量可在约1ng/kg至100mg/kg的体重或更高的范围内变化。对于在数天或更长时间内的重复施用，取决于病况，持续治疗直至期望的疾病症状的抑制发生。GDF-8的优选剂量可在约10ng/kg至约10mg/kg的体重的范围内。因此，可给患者施用约10ng/kg、100ng/kg、500ng/kg、1mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的一个或多个剂量。可间歇地例如每周一次或每两周一次或每三周一次施用此类剂量。
[0221] 非限定性地，例如待施用的细胞组合物的常用剂量可在约0.05x106个细胞至9 6 9
5x10 个细胞/注射的范围内变化。例如，待施用的剂量可在约0.5x10 个细胞至1x10 个
6 6
细胞/注射的范围内变化。优选地，待施用的剂量在约4x10 个细胞至约250x10 个细胞/注射的范围内变化。
5x10 个细胞/注射的范围内变化。例如，待施用的剂量可在约0.5x10 个细胞至1x10 个
6 6
细胞/注射的范围内变化。优选地，待施用的剂量在约4x10 个细胞至约250x10 个细胞/注射的范围内变化。
[0222] 如本文中所用，术语“植入物”广义地指，被制造来替代失去的生物结构、支持或补充受损的生物结构，或增强现有生物结构的医学装置。本文中期望的植入物可包含生物学组分，例如细胞和/或组织。示例性医学植入物包括例如针、杆体、螺丝、平板以及骨手术和骨愈合中使用的其它结构。
[0223] 术语“移植物”广义地指，移植的生物医学组织，例如包括器官、组织或细胞。
[0224] 可选择地或此外，可在给受试者施用之前，利用目标核酸稳定地或瞬时转化MSC细胞或本发明的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群或本文中提及的其它细胞类型。目标核酸序列包括但不限于，编码基因产物的核酸序列，所述基因产物进一步增强成骨细胞群的生长、分化和/或矿化。例如，为了治疗非愈合骨折或骨质疏松症的目的，可以以稳定或瞬时的方式将BMP-2的表达系统引入MSC。MSC和骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群的转化方法对于本领域技术人员来说是已知的。
[0225] 还提供了产生所述药物组合物的方法，所述方法通过将本发明的细胞或其它药物活性成分与上述一种或多种另外的组分以及与一种或多种上述药物赋形剂混合来进行。
[0226] 还公开了部件的排列或试剂盒，其包含用于将如本文中教导的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群或其它细胞类型，或如本文中定义的药物组合物给受试者施用，例如全身性或局部施用，例如在肌骨骼损伤的部位施用，例如通过注射施用的外科器械或装置，并且还包含如本文中教导的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群或其它细胞类型，或如本文中定义的药物组合物。
[0227] 例如但不限于，此类部件的排列或试剂盒可包括：具有可通过本发明的方法获得的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群或其它细胞类型的小瓶，或包含如本文中期望的骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群或其它细胞类型的小瓶；和装置，其用于将所述骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群或其它细胞类型递送至受试者，并且具有用于贮存所述骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群或其它细胞类型的储液池工具，可沿着储液池的纵轴移动以分配所述骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群或其它细胞类型的柱塞工具，和安装在所述储液池工具上用于将所述骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群或其它细胞类型递送至受试者的空心针。
[0228] 可以以允许它们移植或迁移至期望的组织部位并且重建或再生功能缺陷区域的方式，施用骨祖细胞或成骨细胞或包含骨祖细胞和/或成骨细胞的细胞群或其它细胞类型。组合物施用将取决于待修复的肌骨骼部位。例如，可按照重塑组织或插入裂片(split)或假器官装置(例如髋关节置换)的手术方法来促进骨生成。在其它情况下，不需要侵入性手术，并且组合物可通过注射或使用可引导的内窥镜(例如用于脊柱的修复)来施用。
[0229] 在一个实施方案中，可以以液体或粘稠组合物的形式施用上文中定义的药物细胞制剂。在一个实施方案中，可全身性地，局部地或在损伤部位施用细胞或包含此类细胞的药物组合物。
[0230] 在另一个实施方案中，可将细胞或细胞群转移至和/或培养在适当的基质上以提供给植入物。可将细胞施用至其上和在其上培养的基质可以是金属例如钛、钴/铬合金或不锈钢、生物活性表面例如磷酸钙、聚合物表面例如聚乙烯等。虽然不太优选，但含硅材料例如玻璃陶瓷也可用作基质。最优选的是金属例如钛，以及磷酸钙，虽然磷酸钙不是基质的必不可少的组分。基质可以是多孔的或无孔的。
[0231] 例如，必要时，可将已在培养皿中增殖或分化的细胞转移至三维固体支持物上来使它们繁殖和/或继续分化过程(通过在本发明的液体营养培养基中温育固体支持物)。可以例如通过用包含所述细胞的液体悬浮物浸渍支持物来将细胞转移至三维固体支持物。
可将以该方式获得的浸渍的支持物植入人受试者。在最终植入之前，还可通过将它们浸没于液体培养基中来再培养此类浸渍的支持物。
可将以该方式获得的浸渍的支持物植入人受试者。在最终植入之前，还可通过将它们浸没于液体培养基中来再培养此类浸渍的支持物。
[0232] 三维固体支持物必需是生物相容性的，以使其能够被植入人体中。其可具有任何适当的形状例如圆柱形、球形、平板形或任意形状的部分。在适合用于生物相容性三维固体支持物的材料中，特别地提及：碳酸钙，特别地文石，特别地以珊瑚骨架的形式，基于铝、基于锆、基于磷酸三钙的多孔陶瓷制品，和/或羟基磷灰石，通过使得碳酸钙能被转化成羟基磷灰石的水热交换获得的模拟珊瑚骨架，或另外地磷灰石-钙硅石玻璃陶瓷、生物活性玻璃陶瓷例如Bioglass(TM)玻璃。
[0233] 虽然已结合特定实施方案描述了本发明，但很明显的是，根据前述描述的许多改变、变动和变化对于本领域技术人员来说是很显然的。因此，意欲将所有此类改变、变动和变化包括在所附权利要求的精神和范围内。
[0234] 上述方面和实施方案得到下列非限定性实施例的进一步支持。实施例
[0235] 实施例1:培养来自受试者的细胞
[0236] 从人健康供体的髂嵴收获骨髓。将肝素化骨髓在密度梯度溶液(FicollTM plate Premium,GE Healthcare)上经历分级分离。密度梯度溶液允许纯化单核细胞(MNC)。随后3 5 2
将MNC以5x10 至5x10 个细胞/cm 的密度涂板。在血清和FGF-2存在的情况下将细胞培养在培养基中。将原代培养物维持培养10至18天，在第1天与第5天之间完全更换培养基，之后定期更换。在原代培养过程中，通过培养基更换撤出非粘附造血细胞，间充质衍生细胞获得成纤维细胞样形态学。在原代培养后，通过胰蛋白酶处理收获间充质衍生细胞，将其再涂板以进行继代细胞培养。继代培养进行3天至18天的时期。
将MNC以5x10 至5x10 个细胞/cm 的密度涂板。在血清和FGF-2存在的情况下将细胞培养在培养基中。将原代培养物维持培养10至18天，在第1天与第5天之间完全更换培养基，之后定期更换。在原代培养过程中，通过培养基更换撤出非粘附造血细胞，间充质衍生细胞获得成纤维细胞样形态学。在原代培养后，通过胰蛋白酶处理收获间充质衍生细胞，将其再涂板以进行继代细胞培养。继代培养进行3天至18天的时期。
[0237] 实施例2:在包含血清、GDF-8和FGF-2的培养基中培养来自原代细胞培养物的细胞
[0238] 在Ficoll后，如实施例1中所述在原代培养过程中培养MNC细胞，但在GDF-8(重组人肌骨素，Peprotech)存在的情况下或在GDF-8不存在(对照)的情况下进行培养。当汇合时，将原代培养的细胞进行传代，以不同的密度重新涂板以进行继代培养，并且在GDF-8(GDF-8)存在的情况下或在GDF-8不存在(对照)的情况下进行培养。使用的GDF-8的浓度为1至100ng/ml。
[0239] 在培养结束时，通过它们的增殖、表型(FACS)、蛋白质分泌(IL6,VEGF,核心蛋白聚糖,骨保护素)、矿化能力和酶促ALP活性来表征细胞。
[0240] 对培养产率的作用
[0241] 为了评价在包含血清、FGF-2和GDF-8的培养基中培养来自原代培养物的细胞对细胞生长的影响，测定在GDF-8存在的情况下(GDF-8)或在GDF-8不存在的情况下(对照)培养的细胞的原代和继代培养的总体培养产率。
[0242] 如下测定培养产率：将在培养或生长因子处理结束时收获的细胞数目除以被涂板以进行培养的细胞的数目。细胞活力通过台盼蓝拒染法来评价，细胞数目通过计数Bürker室中的细胞悬浮物来测定。
[0243] 原代和继代培养产率分别代表原代和继代细胞培养过程中的细胞增殖。
[0244] 平均数据示于表1和图1中。培养产率显示，在包含血清、FGF-2和GDF-8的培养基中培养细胞，相较于在不含GDF-8的此类培养基中培养细胞，增加了细胞增殖(表1,图1)。
[0245] 表1:在GDF-8存在的情况下(GDF-8)，在GDF-8不存在的情况下(对照)或在TGFβ1存在的情况下(TGFβ1)培养细胞后的平均细胞培养产率(%)
[0246]
[0247] 通过FACS测定HLA-DR和ALP的表达
[0248] 为了表征细胞，在细胞脱离后使用FACS分析测定细胞表型。测量的标志物是CD45(造血干细胞标志物)、CD105(间充质标志物)、ALP(成骨标志物)和HLA-DR(免疫原性标志物)。
[0249] 使用偶联有异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)或别藻蓝蛋白(APC)的抗CD45、CD105、ALP和HLA-DR的抗体(来自BD Biosciences(抗-CD45、抗-CD105、抗-HLA-DR)和R&D Systems(抗-ALP))通过FACS分析测定细胞表型。利用BD FACS Canto II流式细胞仪(Becton Dickinson)分析细胞。标志物的表达以百分比给出，即，表达标志物的细胞数目除以通过FACS分选的细胞的数目。
[0250] 平均数据示于表2以及图2和3中。数据显示，在GDF-8存在的情况下培养细胞，相较于对照，减少HLA-DR表达(表2和图2)。结果还显示，在GDF-8存在的情况下培养细胞维持高水平的ALP表达，与在TGFβ1存在的情况下培养细胞不同(表2和图3)。
[0251] 结果还显示，在GDF-8存在的情况下培养细胞，相较于在GDF-8不存在的情况下培养的对照细胞，维持造血标志物CD45(表2)、间充质标志物CD105(表2)和其它免疫原性标志物CD28/CD80/CD83/CD86(结果未显示)的相似表达。
[0252] 表2:在GDF-8存在的情况下(GDF-8)、在GDF-8不存在的情况下(对照)或在TGFβ1存在的情况下(TGFβ1)培养细胞后标志物的表达(%)
[0253]
[0254] 标志物在上清液中的分泌
[0255] 研究蛋白质分泌以评估细胞的成骨细胞定型以及它们招募参与骨修复的细胞的能力。蛋白质分泌通过ELISA来研究。更具体地，在培养后收获培养上清液以评价IL6和VEGF(细胞招募)、核心蛋白聚糖和骨保护素(骨基质蛋白和骨因子)的产量。
[0256] 评价在每一次培养基改变时收集的培养上清中的IL6、VEGF、核心蛋白聚糖和骨保护素的分泌。按照制造商的说明书(R&D Systems Human IL6ELISA试剂盒#DY206,R&D Systems Human VEGF ELISA试剂盒#DY293b,R&D Systems Human Decorin ELISA试剂盒#DY143,R&D Systems Human Osteoprotegerin ELISA试剂盒#DY805)进行测定。利用Multiskan板读数器在450nm处测量吸光度。
[0257] 平均数据示于表3和图4中。GDF-8培养物中的IL6、VEGF、核心蛋白聚糖和骨保护素(OPG)水平与对照的所述水平或TGFβ1培养物的所述水平相似(表3和图4)。
[0258] 表3:在GDF-8存在的情况下(GDF-8)，在GDF-8不存在的情况下(对照)或在TGFβ1存在的情况下(TGFβ1)培养细胞后上清液中的蛋白质分泌
[0259]
[0260]
[0261] 继代培养与第三代培养的矿化3
[0262] 矿化用于评价细胞形成矿化基质的能力。为此，在继代培养结束时将细胞以5x104 2
至5x10 个细胞/cm 的密度涂板在24孔板中，并且在包含血清、FGF-2和GDF-8的培养基(FGF-2/GDF-8)中或在不含GDF-8的此类培养基(FGF-2)中或在包含血清、FGF-2和TGFβ1的培养基(FGF-2/TGFβ1)中进行培养。第二天，通过用成骨培养基(即补充有15%FBS,1%青霉素/链霉素,β-甘油磷酸酯(10mM),抗坏血酸(维生素C)(50μg/ml)和地塞米松-8
(10 M)的α-MEM)替换培养基来诱导矿化。对照培养基由补充有15%FBS和1%青霉素/链霉素的α-MEM组成。在3周的培养后，将细胞在4%多聚甲醛/PBS中固定，利用对无机钙沉着物染色的茜素红Ｓ进行染色。最后，通过在0(对于任何观察到的矿化)至2.5(对于观察到的最大矿化)的范围内的半定量评分来评价矿化能力。
至5x10 个细胞/cm 的密度涂板在24孔板中，并且在包含血清、FGF-2和GDF-8的培养基(FGF-2/GDF-8)中或在不含GDF-8的此类培养基(FGF-2)中或在包含血清、FGF-2和TGFβ1的培养基(FGF-2/TGFβ1)中进行培养。第二天，通过用成骨培养基(即补充有15%FBS,1%青霉素/链霉素,β-甘油磷酸酯(10mM),抗坏血酸(维生素C)(50μg/ml)和地塞米松-8
(10 M)的α-MEM)替换培养基来诱导矿化。对照培养基由补充有15%FBS和1%青霉素/链霉素的α-MEM组成。在3周的培养后，将细胞在4%多聚甲醛/PBS中固定，利用对无机钙沉着物染色的茜素红Ｓ进行染色。最后，通过在0(对于任何观察到的矿化)至2.5(对于观察到的最大矿化)的范围内的半定量评分来评价矿化能力。
[0263] 相较于不含GDF-8的条件(FGF-2)，在包括血清、FGF-2和GDF-8(FGF-2/GDF-8)或FGF-2和TGFβ-1(FGF-2/TGFβ1)的所有培养条件下观察到矿化(表4和图5)。因此，GDF-8似乎不减损利用本发明的方法培养的细胞的矿化能力。
[0264] 表4:在GDF-8存在的情况下(GDF-8)、在GDF-8不存在的情况下(对照)或在TGFβ1存在的情况下(TGFβ1)培养细胞后矿化的半定量评分
[0265]
[0266] 碱性磷酸酶活性
[0267] 通过生物化学测定(其基于合成底物对-硝基苯基磷酸盐(pNPP)的磷酸基团的水解和反应产物在415nm处的检测)来测定碱性磷酸酶(骨基质形成中的至关重要的酶)的活性。通过与基于纯化的小牛肠碱性磷酸酶活性的标准曲线进行比较，来测定细胞的ALP酶促活性。ALP活性以ALP的单位/mg蛋白质来报告。利用Bradford测定法来测定蛋白质含量。1个单位的ALP在37℃每分钟水解1μmol的pNPP。
[0268] 在GDF-8存在的情况下培养的细胞似乎具有更高的ALP活性(表5)。这些结果确证了FACS分析(表2)。
[0269] 表5:在GDF-8存在的情况下(GDF-8)、在GDF-8不存在的情况下(对照)或在TGFβ1存在的情况下(TGFβ1)培养细胞后碱性磷酸酶(ALP)的酶促活性
[0270]处理 mU/mg原液
对照 323.49
GDF-8 438.13
TGFβ1 203.69
对照 323.49
GDF-8 438.13
TGFβ1 203.69
[0271] 可获得下列非限定性观察结果：
[0272] 在包含血清、FGF-2和GDF-8的培养基中培养来自原代培养物的细胞，相较于在不含GDF-8的此类培养基中培养细胞，刺激细胞增殖。
[0273] 在包含血清、FGF-2和GDF-8的培养基中培养来自原代培养物的细胞减少HLA-DR的表达。因此，GDF-8减小细胞的免疫原性。
[0274] 在包含血清、FGF-2和GDF-8的培养基中培养的细胞显示与在不含GDF-8的此类培养基中培养的对照细胞相似的成骨表型。在包含血清、FGF-2和GDF-8的培养基中培养细胞似乎在培养过程中不影响ALP表达。此外，在包含血清、FGF-2和GDF-8的培养基中培养细胞不影响骨基质蛋白例如核心蛋白聚糖和骨保护素以及参与细胞招募的蛋白质例如VEGF的分泌。此外，在包含血清、FGF-2和GDF-8的培养基中培养的细胞能够合成矿化基质。
[0275] 实施例3:在包含血清、GDF-8和FGF-2的培养基中培养来自第三代培养物的细胞[0276] 为了探究在包含血清、FGF-2和GDF-8的培养基中培养细胞对在如实施例1中所示利用FGF-2进行的原代和继代培养过程中培养的细胞的作用，将细胞涂板在6孔板中以进行第三代培养，进行24小时以允许粘附至基质表面。第2天，在GDF-8存在的情况下(GDF-8)或在GDF-8不存在的情况下(对照)，将细胞在包含血清和FGF-2的培养基中进行培养。
[0277] 4天的培养后的细胞表型
[0278] 如本文中所述，利用FACS测量在包含血清、FGF-2和GDF-8的培养基中培养4天的来自第三代培养物的细胞的表型。标志物的表达表示为阳性细胞的百分比，即表示为表达标志物的细胞数目除以被涂板以进行培养的细胞总数。造血干细胞标志物CD45与间充质标志物CD105的表达在所有条件下都是相似的(表6和图6)。如表6和图6中所示，相较于在包含血清、FGF-2和TGFβ1的培养基中培养来自第三代培养物的细胞4天，在包含血清、FGF-2和GDF-8的培养基中培养来自第三代培养物的细胞4天后，HLA-DR的表达更低。总之，使用本发明的方法可有利地改善获得的细胞或细胞群的特征。
[0279] 表6:在GDF-8存在的情况下(GDF-8)，在GDF-8不存在的情况下(对照)或在TGFβ1存在的情况下(TGFβ1)在培养细胞之前和在培养细胞4天之后的标志物的表达(%)
[0280]处理 CD45CD105HLA-DR
培养前对照 399.362.2
对照《4天》 5.296.851.7
GDF-8100ng/ml《4天》 2.299.620.8
TGFβ1《4天》 3.195.343.5
培养前对照 399.362.2
对照《4天》 5.296.851.7
GDF-8100ng/ml《4天》 2.299.620.8
TGFβ1《4天》 3.195.343.5
[0281] 利用不同浓度的GDF-8进行6天的培养后细胞的表型
[0282] 还将来自第三代培养物的细胞在包含血清、FGF-2和GDF-8的培养基中培养6天，其中GDF-8以50ng/ml、100ng/ml或200ng/ml的递增浓度存在于培养基中。
[0283] 如本文中所述，利用FACS分析在包含血清、FGF-2和GDF-8的培养基中培养6天的来自第三代培养物的细胞的表型。标志物的表达表示为阳性细胞的百分比，即表示为表达标记物的细胞的数目除以被涂板以进行培养的细胞的总数。
[0284] 在包含血清、FGF-2和GDF-8的培养基中培养6天的来自第三代培养物的所有细胞培养条件中，HLA-DR表达比在对照条件中的低。此外，HLA-DR表达似乎随着GDF-8的浓度增加而减少(表7和图7)。
[0285] 表7:在GDF-8存在的情况下(GDF-8)，在GDF-8不存在的情况下(对照)或在TGFβ1存在的情况下(TGFβ1)培养细胞6天后标志物的表达(%)
[0286]处理 HLA-DR
对照 18.8
GDF-850ng/ml 5.2
GDF-8100ng/ml 2.2
GDF-8200ng/ml 2.4
TGFβ11ng/ml 4.6
对照 18.8
GDF-850ng/ml 5.2
GDF-8100ng/ml 2.2
GDF-8200ng/ml 2.4
TGFβ11ng/ml 4.6
[0287] 可获得下列非限定性观察结果：
[0288] 在包含血清、FGF-2和GDF-8的培养基中培养来自第三代培养物的细胞，诱导了细胞的HLA-DR表达的减少。GDF-8的浓度越高，HLA-DR表达的减少越明显。
[0289] 实施例4:在包含血清和GDF-8的培养基中培养来自原代培养物的细胞
[0290] 在包含(1)血清、FGF-2和GDF-8或(2)血清和GDF-8的培养基中培养骨髓细胞。在原代培养后，将细胞传代，并将其重新涂板以在对应的培养基中进行继代培养。使用的GDF-8浓度为100ng/ml。在培养结束时，通过它们的增殖和表型(FACS)表征细胞。
[0291] 对培养产率的作用
[0292] 通过细胞计数来测定培养产率。数据示于表8和图8中。数据显示，相较于存在FGF-2(具有或不具有GDF-8)的情况下的培养，培养产率在FGF-2不存在于培养基中的情况下减少。
[0293] 表8:在包含GDF-8(具有或不具有FGF-2)的培养基中培养来自原代培养物的细胞后的总体培养产率(%)
[0294]处理 总体培养产率
GDF-8100ng/ml+FGF-2 450
GDF-8100ng/ml 155
GDF-8100ng/ml+FGF-2 450
GDF-8100ng/ml 155
[0295] 在相同类型的另外实验中，增加样品的数目，从而产生表9中收集的结果。
[0296] 表9:在含有GDF-8(具有或不具有FGF-2)的培养基中培养来自原代培养物的细胞后的平均总体培养产率(%)
[0297]处理 总体培养产率
GDF-8100ng/ml+FGF-2 730±736(n=7)
GDF-8100ng/ml 142±99(n=4)
GDF-8100ng/ml+FGF-2 730±736(n=7)
GDF-8100ng/ml 142±99(n=4)
[0298] 通过FACS测定HLA-DR和ALP的表达
[0299] 如实施例2中所述，利用FACS分析测定原代和继代培养后的细胞表型。标志物ALP和HLA-DR的表达表示为阳性细胞的百分比。包含GDF-8的原代培养物中的ALP表达水平与存在或不存在FGF-2的培养物中的相似，然而在继代培养中，相较于不含FGF-2的培养物，在包含FGF-2的培养物中观察到ALP表达的减少(表10和图9)。相较于包含FGF-2而无GDF-8的培养基中的培养物，包含GDF-8、具有或不具有FGF-2的培养基中的培养物显示HLA-DR表达的减少。在GDF-8和FGF-2存在的情况下减少更明显(表10和图10)。
[0300] 表10:在包含FGF-2的培养基中(对照)或包含GDF-8、具有或不具有FGF-2的培养基中培养细胞后标志物的表达(%)
[0301]处理 ALP HLA-DR
对照 17.5 11.2
GDF-8+FGF-2 10.4 2
GDF-8 27.2 4.9
对照 17.5 11.2
GDF-8+FGF-2 10.4 2
GDF-8 27.2 4.9
[0302] 在相同类型的另外实验中，增加样品的数目，从而产生收集在表11中的结果。
[0303] 表11:在包含FGF-2的培养基中(对照)或包含GDF-8、具有或不具有FGF-2的培养基中培养细胞后标志物的表达(%)
[0304]处理 ALP HLA-DR
对照 32±16(n=9) 9±11(n=9)
GDF-8+FGF-2 26±11(n=7) 2±1(n=7)
GDF-8 34±6(n=3) 3±2(n=3)
对照 32±16(n=9) 9±11(n=9)
GDF-8+FGF-2 26±11(n=7) 2±1(n=7)
GDF-8 34±6(n=3) 3±2(n=3)
[0305] 可获得下列非限定性观察结果：
[0306] 如所预期的，生长因子FGF-2在细胞的培养基中的不存在减少原代和继代培养产率，但不影响细胞的HLA-DR表达的减少。GDF-8在细胞培养基中的存在能够以低免疫原性特征诱导MSC的成骨细胞分化，而不依赖于FGF-2的存在。
[0307] 综上所述，上述实施例显示，在包含血清、FGF-2和GDF-8的培养基中培养细胞，相较于在不含GDF-8的此类培养基中培养来自原代培养物的细胞，增加细胞生长，减少HLA-DR表达并且不减少成骨分化。具体地，在包含血清、FGF-2和GDF-8的培养基中培养来自原代培养物的细胞不改变ALP的表达以及骨基质蛋白例如核心蛋白聚糖和骨保护素或参与细胞招募的蛋白质例如VEGF的表达。
[0308] 此外，上述实施例显示，在包含血清、FGF-2和GDF-8的培养基中培养来自第三代培养物的细胞，相较于在不含GDF-8的此类培养基中培养来自原代培养物的细胞，对ALP表达没有影响。有利地，已观察到，在包含血清、FGF-2和GDF-8的培养基中培养来自继代或第三代培养物的细胞，相较于在不含GDF-8的此类培养基中培养来自原代培养物的细胞，减少HLA-DR表达，特别是在更长的处理下。
[0309] 实施例5:在包含GDF-8
[0310] 从人健康供体的髂嵴收集骨髓。将骨髓在密度梯度溶液(FicollTMplate Premium,GE Healthcare)中经历分级分离。密度梯度溶液允许纯化单核细胞(MNC)。随后3 5 2
以5x10 至5x10 个细胞/cm 的密度将MNC涂板，按照标准MSC培养方案进行生长。进行下列实验：
以5x10 至5x10 个细胞/cm 的密度将MNC涂板，按照标准MSC培养方案进行生长。进行下列实验：
[0311] 在培养基中添加或不添加GDF-8的情况下，将MSC经历标准软骨细胞谱系分化方案(从原代或继代培养，或适当时，从第三代培养)。所得的软骨细胞谱系的细胞，特别地成软骨细胞和软骨细胞，当包含GDF-8时，相较于未包含GDF-8时，显示减少的HLA-DR表达。
[0312] 在培养基中添加或不添加GDF-8的情况下，将MSC经历标准脂肪细胞谱系分化方案(从原代或继代培养，或适当时，从第三代培养)。所得的脂肪细胞谱系的细胞，特别地成脂肪细胞和脂肪细胞，当包含GDF-8时，相较于未包含GDF-8时，显示减少的HLA-DR表达。
[0313] 在培养基中添加或不添加GDF-8的情况下，将MSC经历标准肌细胞谱系分化方案(从原代或继代培养，或适当时，从第三代培养)。所得的肌细胞谱系的细胞，特别地成肌细胞和肌细胞，当包含GDF-8时，相较于当未包含GDF-8时，显示减少的HLA-DR表达。
[0314] 在培养基中添加或不添加GDF-8的情况下，将MSC经历标准腱细胞谱系分化方案(从原代或继代培养，或适当时，从第三代培养)。所得的腱细胞谱系的细胞，特别地成肌腱细胞和肌腱细胞，当包含GDF-8时，相较于当未包含GDF-8时，显示减少的HLA-DR表达。
[0315] 在培养基中添加或不添加GDF-8的情况下，将MSC经历标准基质源性谱系分化方案(从原代或继代培养，或适当时，从第三代培养)。所得的基质源性谱系的细胞，特别地间质细胞，当包含GDF-8时，相较于当未包含GDF-8时，显示减少的HLA-DR表达。
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