用iPS衍生的胰贝塔样细胞治疗糖尿病的方法和组合物
阅读：35发布：2023-03-08
专利汇可以提供用iPS衍生的胰贝塔样细胞治疗糖尿病的方法和组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且糖尿病的特征在于不能生成胰岛素(1型糖尿病)和/或对身体分泌的胰岛素不敏感(2型糖尿病)。在任一情况中，身体不能有效地使血液 葡萄糖 移动穿过细胞膜，从而得以利用。这导致多种局部和系统有害效应。当前对糖尿病的 治疗 着眼于外源胰岛素施用和饮食控制。本文中提供糖尿病的治疗，使用 细胞疗法 来改善与胰岛素分泌和胰岛素敏感性二者降低有关的症状。使用诱导的多能干(iPS)细胞，衍生出与内源胰岛素分泌型细胞相似的贝塔样(β样)细胞。这些β样细胞响应葡萄糖而分泌胰岛素，而且在2型糖尿病的小鼠模型中经iPS细胞移 植物 校正了高血糖表型。在2型糖尿病小鼠模型中，根据血液葡萄糖和血红蛋白A1c测量的测量，实现了高血糖的长期校正。在1型糖尿病的化学诱导小鼠模型中也看到了高血糖的降低。，下面是用iPS衍生的胰贝塔样细胞治疗糖尿病的方法和组合物专利的具体信息内容。
用iPS衍生的胰贝塔样细胞治疗糖尿病的方法和组合物
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002] 本申请涉及2010年3月5日提交的美国临时申请61/339,510。发明领域
[0003] 一般而言，本发明涉及干细胞(包括诱导的多能干细胞(iPS))及其治疗疾病(诸如糖尿病)的用途。
[0004] 发明背景
[0005] 大约3.5％的美国人诊断有糖尿病，使得这成为一个重大健康护理问题。1型糖尿病是一种自身免疫病，其中胰岛中的胰岛素分泌型β细胞受到自身免疫攻击的不可逆破坏，导致胰岛素生成缺乏。2型糖尿病在胰生成的激素胰岛素的量不足和/或身体的组织变成对正常或甚至高水平的胰岛素有抗性时发生。在任一种情况中，导入外源胰岛素通常足以改善症状。然而，胰岛素剂量难以调整。另外，即使在使用加强型方案(诸如每天多次胰岛素泵输注及频繁监测血液葡萄糖)时，外源胰岛素常常不能实现最佳葡萄糖控制。这些常常导致低血糖事件发生率和严重性升高。经导入外源胰岛素分泌型细胞，导致内源胰岛素生成，基于细胞的疗法意图降低糖尿病患者对胰岛素注射的依赖性。能实现这一点的一种有希望的途径是经由使用干细胞(1-7)。
[0006] 当前用于糖尿病的细胞疗法主要着眼于全胰移植物或通过将胰岛导入糖尿病个体的门静脉中(8)。虽然这些技术大多是有效的，但是它们受到免疫排斥和用于移植的原代组织缺乏的阻碍。自体移植自患者的自身组织干细胞衍生的(特别是自骨髓(BM)或肝衍生的)胰岛素分泌型细胞的概念是有吸引力的(3)。然而，这些细胞在动物中的移植遭遇受限的生长能力、低水平的胰岛素表达和胰岛素分泌较差或不存在的问题。更多最近的研究提示BM干细胞通过增强现有β-细胞的重产生和存活，而非用新进反分化的β-细胞重建岛，从而在体内改善实验性糖尿病(2，9)。
[0007] 最近，已经建立了使用限定的转录因子使成年体细胞逆分化成诱导的多能干(iPS)细胞的方法(10-13)。迄今为止，这些iPS细胞与胚胎干细胞相当相似且具有相同的多能特征。因为iPS细胞可以潜在具有与宿主相同的单元型，所以可以避免免疫排斥。自iPS细胞衍生的特定细胞类型已经用于在小鼠模型中治疗各种疾病，包括镰状细胞贫血(14)、帕金森氏病(15)和血友病A(16)。鉴于上文，会希望提供可用于治疗糖尿病的方法的iPS细胞。
[0008] 更广泛地在治疗上使用干细胞(包括iPS细胞)的一个障碍是在将干细胞导入身体中时肿瘤形成和不能控制干细胞命运的风险。如果移植的细胞没有正确整合，那么它们可保留分化和扩增的能力，提高不当发育的风险，导致变形或甚至畸胎瘤或癌症形成。因此，会希望提供在将干细胞导入身体中后其命运能控制的干细胞及用于产生此类干细胞的方法。
[0009] 发明概述
[0010] 格外地，申请人证明，在体外自成年体细胞(诸如皮肤成纤维细胞)衍生的iPS细胞能分化成胰岛素分泌型β样细胞，而且它们在生理或病理状态下响应葡萄糖刺激。经门静脉内注射将所得胰岛素分泌型β样细胞导入模拟1型和2型糖尿病的两种不同小鼠系统的肝。β样细胞灌输并校正两种模型中的高血糖表型，证明重编程的(reprogramed)体细胞能用于治疗1型或2型糖尿病。
[0011] 一方面，提供细胞，其中该细胞为分泌胰岛素的诱导的多能干细胞(iPS)。在一些实施方案中，该细胞为人细胞。在一些实施方案中，该iPS细胞是自成纤维细胞衍生的。在一些实施方案中，该iPS细胞是自成年体细胞衍生的，其中在没有胰蛋白酶消化的情况中实施多谱系祖先的产生(见图1，阶段2)。在一些实施方案中，该iPS细胞能分泌胰岛素至少约20天、至少约30天、至少约8周、至少约3个月、至少约6个月、至少约9个月、至少约1年或至少约2年。
[0012] 另一方面，提供治疗糖尿病的方法，包括对糖尿病受试者施用分泌胰岛素的诱导的多能干细胞(iPS)。在一些实施方案中，该糖尿病受试者为人。在一些实施方案中，该糖尿病受试者具有1型糖尿病。在一些实施方案中，该糖尿病受试者具有2型糖尿病。在一些实施方案中，该糖尿病受试者仍然对胰岛素有响应。在一些实施方案中，该糖尿病受试者对胰岛素有抗性。在一些实施方案中，施用的iPS细胞是自体的(即自该糖尿病受试者衍生的)。在一些实施方案中，该iPS细胞通过经由门静脉内注射而灌输至肝实质来施用。在一些实施方案中，施用至少约200,000个iPS细胞。在一些实施方案中，该iPS细胞是自成年体细胞衍生的，其中在没有胰蛋白酶消化的情况中实施多谱系祖先的产生(见图1，阶段2)。在一些实施方案中，该iPS细胞能分泌胰岛素至少约20天、至少约30天、至少约8周、至少约3个月、至少约6个月、至少约9个月、至少约1年或至少约2年。
[0013] 还有另一方面，提供产生诱导的多能干细胞(iPS)的方法以及通过这些方法生成的iPS细胞，包括用瞬时表达诱导多能性的转录因子的载体转化成年体细胞。在一些实施方案中，该成年体细胞为人细胞。在一些实施方案中，该成年体细胞为成纤维细胞。在一些实施方案中，该载体不能在转化的细胞中复制。在一些实施方案中，该载体不能整合入该细胞的染色体中。在一些实施方案中，该载体是自杆状病毒衍生的。在一些实施方案中，该转录因子选自Oct4、Lin28、Nanog和/或Sox2。
[0014] 还有又一方面，提供产生干细胞(iPS)的方法以及通过这些方法生成的干细胞，包括通过同源重组将异源DNA整合入该细胞的染色体中，由此在该细胞中产生诱导型自杀基因。在一些实施方案中，该干细胞为人干细胞。在一些实施方案中，该干细胞为诱导的多能干细胞。在一些实施方案中，该异源DNA包含诱导型启动子(例如通过四环素或四环素衍生物来开启的诱导型启动子)。在一些实施方案中，该异源DNA包含药物选择盒。在一些实施方案中，该自杀基因选自胱天蛋白酶(caspase)-9、胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-2、BH3相互作用域死亡激动剂(BID)或单纯疱疹病毒-1胸苷激酶。
[0015] 本文还涉及，在恰当时，本发明的任何实施方案可以与本发明的一个或多个其它实施方案组合，即使这些实施方案是在本发明的不同方面下描述的。
[0016] 除非另有限定，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的普通理解相同的含义。虽然可以在本发明的实践中使用与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料，但是下文描述了合适的方法和材料。通过述及明确收录本文中提及的所有出版物、专利申请、专利、和其它参考文献的全文。若有抵触，以本说明书(包括定义)为准。另外，本文中描述的材料、方法、和实施例仅仅是例示性的，并非意图限制。
[0018] 附图简述
[0019] 图1显示iPS细胞选择性分化为胰岛素生成型β样细胞的时间线。自ES样iPS细胞衍生胰岛素分泌型β样细胞的3阶段分化方案的示意图如下-阶段1：iPS细胞分化成胚样球状体，阶段2：产生多谱系祖先，它们自胚状体迁移，和阶段3：iPS细胞选择性分化成胰岛素分泌型β样细胞。
[0020] 图2描绘iPS细胞衍生的胰岛素生成型β样细胞的表征。图2A显示细胞在阶段3，第20天的免疫荧光染色。在阶段3第13天将体外衍生的β样细胞用针对GFP、巢蛋白和胰岛素的抗体染色。将细胞用DAPI复染色。巢蛋白染色降低至最低限度，而胰岛素染色持久。图2B显示体外衍生的β样细胞的基因表达谱。通过RT-PCR进行iPS细胞衍生的β样细胞分化期间各种胰细胞标志物的基因表达分析。自处于β样细胞发育阶段1(S1)、阶段2(S2)和阶段3(S3)的细胞分离总RNA。B5-微管蛋白用作内源对照。iPSC＝分化前的细胞。
[0021] 图3显示体外胰岛素诱导。在葡萄糖处理时，阶段3，第20天，iPS衍生的β样细胞在体外分泌胰岛素。首先将细胞暴露于5个葡萄糖浓度(5mM、10mM、20mM、30mM和40mM)并测定它们上清液中的胰岛素水平。然后自培养基除去葡萄糖并再次测量来自相同细胞的上清液中的胰岛素水平。
[0022] 图4显示糖尿病2型模型的体内表征。图4A显示未移植的2型糖尿病小鼠模型中的葡萄糖浓度。自未移植的2型糖尿病小鼠模型(n＝20)获得的基础葡萄糖浓度。如示，这种模型在3周龄时开始展现糖尿病特征(葡萄糖＞300mg/dl)。葡萄糖水平继续升高直到第6周，然后保持升高于600mg/dl。正常对照动物在整个时间段保持较低葡萄糖水平。图4B显示未移植的2型糖尿病小鼠模型中的胰岛素水平。自4周龄(n＝20)、8周龄(n＝3)、12周龄(n＝3)和16周龄(n＝3)的未移植的2型糖尿病小鼠模型获得的基础胰岛素浓度。胰岛素最初在4周时较高，但是从8周开始下降并保持降低。显示来自正常小鼠(n＝3)的胰岛素浓度供比较。图4C显示未移植的2型糖尿病小鼠模型中胰岛素耐受测试的结果。在4周龄(n＝3)、8周龄(n＝3)、和16周龄(n＝3)时给该模型腹膜内(i.p.)注射0.75U/kg人胰岛素。在注射前及在注射后30分钟、60分钟和90分钟时经尾静脉血和手持式血糖仪测量禁食葡萄糖浓度(fasting glucose concentration)。在4周时，小鼠显示对胰岛素疗法的敏感性，但是到8周龄和16周龄时有抗性。
[0023] 图5显示移植的糖尿病2型模型的体内表征。图5A显示经移植的2型糖尿病小鼠模型中的葡萄糖浓度。在移植前，所有小鼠展现高血糖表型。阶段3，第7天iPS细胞衍生的胰贝塔细胞(pancreatic βcell)植入2型糖尿病小鼠(n＝30)中能够调控葡萄糖水平且改善高血糖症达2个月以上。葡萄糖读数自尾静脉获得且每2-3天通过手持式血糖仪测量。未处理的小鼠和对照小鼠的个数n如图中标记所示。图15显示每周追踪的因术后损失和收获动物用于组织学所致的经处理的小鼠减少的情况。图5B显示经植入的2型糖尿病小鼠模型中的胰岛素生成。对于用阶段3第7天iPS细胞衍生的β样细胞植入的2型糖尿病小鼠(n＝30)，测量移植后3周的血清胰岛素水平。数据指示，经处理的小鼠具有与未经处理的小鼠相比显著升高的胰岛素水平。图5C显示经植入的2型糖尿病小鼠模型中的血红蛋白A1c测量值。在移植后4周时，由一家独立公司(DTI)测试来自植入的2型糖尿病小鼠(n＝3)的血液样品以测量血红蛋白A1c水平。未植入的小鼠的Hb A1c水平比正常高大约2.5倍。在植入后，处理的小鼠(n＝3)中的Hb A1c虽然仍高于正常对照小鼠，但降低至比未处理的同窝小鼠(n＝3)低大约40％的水平。
[0024] 图6显示来自植入的2型糖尿病小鼠模型的免疫组织化学和免疫荧光染色的肝组织。在7天时处死小鼠(每项n＝3)，用于免疫染色肝组织以分析植入的细胞的分布。小图A显示作为GFP染色的阴性对照的C57BL6对照的肝。小图B以低放大倍数显示植入的纺锤形GFP阳性细胞(褐色)在整个肝实质中散布。小图C显示GFP阳性细胞的较大放大倍数。在小图D的高放大倍数，GFP阳性细胞(绿色)在整个该组织中散布。小图E显示同一切片的胰岛素阳性细胞(红色)，而小图F显示合并图像以证明GFP和胰岛素的共定位。
[0025] 图7显示1型糖尿病小鼠模型中的葡萄糖水平。1型糖尿病小鼠模型自单次i.p.注射180mg/kg链唑霉素衍生，且在移植前稳定10天。这项研究中使用的小鼠(n＝5)都在移植前的至少3个读数中展现出大于400mg/dl葡萄糖的高血糖。然后经肝门静脉注射，给2只小鼠注射iPS细胞衍生的β样细胞。自移植后2天起每2-3天获得的禁食葡萄糖读数显示高血糖的改善。
[0026] 图8显示表达绿色荧光蛋白(GFP)的亲本皮肤成纤维细胞和体细胞重编程后的iPS细胞(2个亚克隆)的形态。在导入后20天时，低放大倍数相差图像显示两个亚克隆iPSC SC1和iPSC SC2不同于亲本皮肤成纤维细胞。GFP表达在重编程后仍然高度表达。
[0027] 图9显示两个iPS细胞系中Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的定量RT-PCR分析。两个iPS细胞亚克隆iPSC SC1和iPSC SC2的表达样式展现ESC样特征。W4ES细胞(小鼠ES细胞)用作阳性对照，而正常成纤维细胞用作阴性对照。持家基因GAPDH用作内源对照。使用只会扩增Oct4、Sox2、Klf4和cMyc内源基因的引物，在图上标记“内”(Endog)。通过扩增内源基因和总表达的基因(25)，还测试了逆转录病毒转录物在新建立的iPS细胞克隆中是否沉默。逆转录病毒转录物沉默的克隆具有不可区分的“内”和“总”(Total)基因表达。
[0028] 图10显示用熟知的多能性标志物(Oct3/4、Sox2、Nanog和SSEA-1)进行免疫荧光染色所表征的iPS细胞。这些克隆用DAPI(蓝色)复染色，确认遍及iPS细胞克隆的ES细胞标志物表达。
[0029] 图11描绘畸胎瘤的组织学分析。低(A、B、C)和高(D、E、F)放大倍数图像确认肿瘤切片内存在属于三种胚层(外胚层(皮肤)、中胚层(软骨)和内胚层(肠样))的细胞谱系。
[0030] 图12显示iPS细胞分化成β样细胞的形态。iPS细胞体外分化成β样细胞的阶段3期间3个不同时间点的图像。绿色荧光蛋白贯穿所有阶段持续表达。
[0031] 图13显示免疫荧光染色：阶段3，第7天。在阶段3第7天将体外衍生的β样细胞用针对GFP、巢蛋白和胰岛素的抗体染色。将细胞用DAPI复染色。
[0032] 图14显示免疫荧光染色：阶段3，第13天。在阶段3第13天体外衍生的β样细胞用针对GFP、巢蛋白和胰岛素的抗体染色。将细胞用DAPI复染色。巢蛋白和胰岛素都持续为强染色。
[0033] 图15描绘每周的术后存活动物数。在该研究每周时存活的经处理的2型动物的数目。移植后损失确定是由于术后并发症，如下所述。
[0034] 图16显示2只复发小鼠的胰岛素抗性测试。30只移植小鼠中的2只在植入后3-4周复发糖尿病高血糖表型。对它们进行下文所述葡萄糖耐受测试。在注射后30、60、90和120分钟获得的葡萄糖读数证明了两只小鼠已经变成对胰岛素有抗性。
[0035] 图17显示三因子iPS(3F-iPS)细胞的表征。用多能性标志物SALL4、Nanog、SSEA-1、和Oct4对3F-iPS集落进行免疫荧光测定。所有3F-iPS集落对所有4种标志物呈阳性。
[0036] 图18显示描述Lin 28、Oct4、Nanog、Sox2表达的Western印迹。第1道，胚胎干(ES)。第2道，用表达4种指定转录因子的BacMan病毒感染的成纤维细胞。第3道，对照成纤维细胞。
[0037] 图19描绘2型糖尿病小鼠模型中，移植的细胞预防胰岛素抗性和贝塔细胞衰竭的假设机制。
[0038] 图20描绘同源重组的示意图。(A)真核生物中减数分裂期间经“交换”的同源重组。(B)同源重组的示意机制。
[0039] 图21描绘按本发明一些实施方案将目标基因导入基因组序列所用的盒。
[0040] 发明详述
[0041] 本文中描述了iPS细胞在体外分化成胰岛素分泌型细胞的能力，而且进一步显示了这些细胞在体内校正糖尿病小鼠模型中的高血糖表型的功能。本文中描述的iPS细胞具有一些优点，包括但不限于：1)iPS细胞是自C57BL6背景小鼠(本文中使用的糖尿病小鼠模型的近亲)的成纤维细胞衍生的，且因此降低移植时移植物排斥的可能性，2)自移植的iPS细胞衍生的β样细胞生成的胰岛素可视为内源胰岛素，由此容许随小鼠变老，维持正常葡萄糖稳态，及3)能自iPS细胞为分化生成无限供应的细胞。
[0042] “干细胞”指特征在于经由有丝细胞分裂而自我更新的能力和分化成组织或器官的潜力的细胞。
[0043] 术语“受试者”指属于在正常情况中生成胰岛素的物种的任何个体(人或动物)。
[0044] “诱导的多能干(iPS)细胞”指自非多能细胞(可以包括但不限于造血细胞、间充质细胞、上皮细胞、皮肤细胞、神经细胞、或任何类型的非多能体干细胞)衍生的任何类型的细胞。
[0045] 术语“多能”或“多能性”指有能力产生如下的后代的细胞，所述后代能在恰当的条件下经历分化，变成总体展现与来自内胚层、中胚层、和外胚层的细胞谱系有关的特征的细胞类型。iPS细胞能促成出生前、初生后、或成年生物体的组织。
[0046] 术语“体细胞”指不是种系细胞的细胞。体细胞的一个例子是成纤维细胞细胞，尽管本领域技术人员会领会存在多种不同类型的体细胞exist。
[0047] 术语“β样细胞”指如下的自iPS细胞衍生的细胞，其具有与天然发生β细胞相同的特征且是胰岛素分泌型细胞。本领域技术人员会认识到iPS细胞具有分化成β样细胞的潜力，而且本文中描述的β样细胞是分化自本公开内容的iPS细胞且具有分泌胰岛素的能力的细胞。
[0048] 格外地，“胰岛素分泌型细胞”指分泌胰岛素的任何类型的细胞。
[0049] 术语“自体iPS”指自如下的细胞诱导的iPS细胞，所述细胞是自该iPS细胞会再导入其中的受试者衍生的。
[0050] 术语“重编程”指非多能细胞去分化成展现多能干细胞特征的细胞的过程。
[0051] 术语“载体”指在提供恰当的控制和附属元件时能够复制且能将外源基因序列转移入细胞中的任何类型的遗传元件(诸如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、等)，包括所有方式的克隆和表达媒介，以及病毒载体。细胞在导入载体后是“转化的”。
[0052] 术语“同源重组”指两个DNA分子之间(交换期间)的DNA片段交换。交换的片段侧翼为两个DNA分子之间核苷酸序列相同的位点(即同源DNA区)。
[0053] 术语“整合”或“染色体整合”指DNA区段导入细胞并经由导入的DNA区段上的和染色体内的同源DNA区之间的重组，变成与染色体一体的过程。
[0054] 术语“异源DNA”指对于它导入其中的细胞而言不是内源的DNA，但是可以包括包含修饰的内源DNA序列。
[0055] 术语“自杀基因”指如下的基因，该基因编码的蛋白质的表达导致表达该基因的细胞死亡。
[0056] 术语“诱导型启动子”指当包含该诱导型启动子的宿主细胞暴露于一些特定外部刺激时启动及促进基因转录的多核苷酸序列。诱导型启动子的活性可以例如通过化学、物理、营养或细胞生长因子来触发。
[0057] 术语“植入”指将供体干细胞输注或移植至宿主生物体的过程。如本文中使用的，干细胞可以植入宿主生物体中的任何部位。
[0058] 术语“治疗”或“处理”指减轻或缓和受试者中病症的至少一种症状。
[0059] 术语“施用”指将干细胞分配、供应、应用、给予、分派、或捐赠给需要它的受试者。施用路径可以包括但不限于口服、皮下或胃肠外，包括静脉内、门内、动脉内、肌肉内、腹膜内、鼻内、以及通过输注。
[0060] 术语“多谱系祖先”指能够分化成中胚层、外胚层和/或内胚层谱系的干细胞或祖先细胞。
[0061] 术语“转录因子”指在原核和真核生物体二者中牵涉基因调控的多核苷酸和/或多肽。
[0062] 在iPS细胞体外分化成β样细胞期间，申请人确定了分化方案的改进(17)显著改善分化过程的效率。通过消除阶段2和3之间的胰蛋白酶消化步骤，看到了分化中细胞的存活的80％实质性升高，导致更强力的β样细胞产生。
[0063] 两种不同小鼠模型的使用证明了，iPS细胞可用于经细胞移植物路径来治疗1型或2型糖尿病二者。在2型模型小鼠中，小鼠维持高血糖表型且具有随小鼠变老而迅速消减的胰岛素生成。三个关键特征是2型糖尿病的标志：高血糖，胰岛素分泌的渐进衰竭和胰岛素抗性的发生。胰岛素分泌受损有可能源自补偿现有胰岛素抗性的持久、不成功尝试所致β-细胞耗尽。另外，β-细胞功能受到葡萄糖毒性的不利影响，产生高血糖的向下循环，导致胰岛素分泌降低，这进一步恶化高血糖。
[0064] 给这些动物移植含有少至200,000个iPS衍生的β样细胞的一剂显示了细胞在肝中较好且持续植入并在移植后2天内导致胰岛素分泌恢复和葡萄糖水平正常化。注射1x 106个细胞没有提供血清胰岛素水平方面超出上文用较低细胞剂量获得的响应的可检测改进。这些小鼠寿命预期的大约20-30％维持血糖控制。与对照小鼠Leprdb相比，在iPS衍生细胞移植小鼠中没有观察到显著的重量降低(数据未显示)。
[0065] 不希望受限于理论，在2型糖尿病中，胰岛素分泌受损有可能源自补偿现有胰岛素抗性的持久、不成功尝试所致β-细胞耗尽。另外，β-细胞功能受到葡萄糖毒性的不利影响，产生高血糖的向下循环，导致胰岛素分泌降低，这进一步恶化高血糖。申请人假设，移植的胰岛素生成型iPS细胞能够通过分泌胰岛素来补偿内源岛细胞的渐进衰竭，由此控制血液葡萄糖水平，使得能避免葡萄糖毒性所致内源β-细胞损害和破坏且胰中的岛细胞能复制(图19)。因此，2型糖尿病的进展始于胰岛素分泌丧失，其诱导高血糖条件，伴随有葡萄糖毒性。此后不久就是胰岛素抗性，而且它如上所述反馈成恶化性条件。因此，在一些实施方案中，会在疾病的早期阶段(在小鼠的情况中为3周)移植胰岛素生成型iPS细胞。然而，在其它实施方案中，会稍后在疾病进展中(在小鼠的情况中为5个月)在抗性较好建立后移植胰岛素生成型iPS细胞。
[0066] 一方面，提供细胞，其中该细胞为诱导的多能干细胞(iPS)且分泌胰岛素。在一些实施方案中，该细胞为人细胞。在一些实施方案中，该iPS细胞是自成纤维细胞衍生的。在一些实施方案中，该iPS细胞是自成年体细胞衍生的，其中在没有胰蛋白酶消化的情况中实施多谱系祖先的产生(见图1，阶段2)。在一些实施方案中，该iPS细胞能分泌胰岛素至少约20天、至少约30天、至少约8周、至少约3个月、至少约6个月、至少约9个月、至少约1年或至少约2年。
[0067] 另一方面，iPS细胞可以包含微载体，微载体包含基质，基质的大小允许iPS细胞聚集和粘附至基质，从而帮助植入的iPS细胞。此类基质是本领域已知的，而且可以包括但不限于带电荷的和不带电荷的颗粒，而且可以包括本领域已知的、能够支持干细胞生长的任何别的胞外基质成分。本领域已知的、能够支持干细胞生长的成分的例子可以包括但不限于多糖、蛋白质、蛋白聚糖、糖蛋白、糖胺聚糖、纤维状蛋白质诸如弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、和胶原。
[0068] 另一方面，提供治疗糖尿病的方法，包括对糖尿病受试者施用分泌胰岛素的诱导的多能干细胞(iPS)。在一些实施方案中，该糖尿病受试者为人。在一些实施方案中，该糖尿病受试者具有1型糖尿病。在一些实施方案中，该糖尿病受试者具有2型糖尿病。在一些实施方案中，该糖尿病受试者仍然对胰岛素有响应。在一些实施方案中，该糖尿病受试者对胰岛素有抗性。在一些实施方案中，施用的iPS细胞是自体的(即自该糖尿病受试者衍生的)。在一些实施方案中，施用至少约200,000个iPS细胞。在一些实施方案中，该iPS细胞是自成年体细胞衍生的，其中在没有胰蛋白酶消化的情况中实施多谱系祖先的产生(见图1，阶段2)。在一些实施方案中，该iPS细胞能分泌胰岛素至少约20天、至少约30天、至少约8周、至少约3个月、至少约6个月、至少约9个月、至少约1年或至少约2年。在另一个实施方案中，该iPS细胞为合成并分泌胰高血糖素的α-细胞。在一些实施方案中，对受试者施用的iPS细胞为α-细胞和β-细胞的混合物。
[0069] 在一些实施方案中，iPS细胞是通过经门静脉内注射，灌输至肝实质来施用的。本领域技术人员会认识到，胰岛素生成型iPS细胞可以例如通过其它部位的注射来施用。例如，可以将胰岛素生成型iPS细胞注射入睾丸或肾下被膜中。
[0070] 还有另一方面，提供产生诱导的多能干细胞(iPS)的方法以及通过这些方法生成的iPS细胞，包括用瞬时表达诱导多能性的转录因子的载体转化成年体细胞。在一些实施方案中，该成年体细胞为人细胞。在一些实施方案中，该成年体细胞为成纤维细胞。在一些实施方案中，该载体不能在转化的细胞中复制。在一些实施方案中，该载体不能整合入细胞的染色体中。在一些实施方案中，该载体是自杆状病毒衍生的。在一些实施方案中，该转录因子选自Oct4、Lin28、Nanog和/或Sox2。不作限制，所述转录因子的例子可以找到作为GenBank登录号ABF29403.1或ADW77327.1(Oct4)、AAH28566.1(Lin28)、AAP49529.1(Nanog)和NP_003097.1(Sox2)表达。本领域技术人员会领会，编码所述转录因子的多核苷酸可以根据遗传密码的简并性质而变化。本领域技术人员会进一步领会，所述转录因子具有一定百分比同一性(例如99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％)的同系物可以在产生iPS细胞方面充当功能性等同物。
[0071] 百分比同一性可以如下确定，即比对要比较的两条序列，确定比对部分中相同残基的数目，将该数目除以提供比较基础的序列的残基总数，并将该结果乘以100。还可以关于多肽的一个规定区域，针对另一种多肽或其区域来确定百分比同一性。为了确定百分比同一性，可以使用技术人员可辨别的方法和计算机程序来比对序列。“序列比对”指为了评估相似性程度，排列两条或更多条序列以实现最大水平的同一性(及在氨基酸序列的情况中，保守性)的过程。本领域已知用于比对序列和评估相似性/同一性的众多方法，诸如例如Cluster方法(其中相似性基于MEGALIGN算法)，以及BLASTN、BLASTP、和FASTA[9，10]。在使用所有这些程序时，优选的设置是得出最高序列相似性的设置。
[0072] 本文中描述的iPS细胞可以以本领域已知的任何方式来产生，可以包括但不限于转染外源干细胞-诱导型基因和/或将此类基因的蛋白质产物引导入非多能干细胞中。
[0073] 将自杀基因导入干细胞中以控制干细胞命运
[0074] 虽然干细胞(包括iPS细胞)可用于治疗多种疾病(包括糖尿病)或组织修复，但是它们携带致癌风险。因此，会希望能够在将干细胞导入身体中后控制它们命运。本文中描述的命运可控制的干细胞指在导入身体中后其命运可以在移植后控制的干细胞。一方面，一般而言，本发明的实施方案涉及利用同源重组将自杀基因导入干细胞中。
[0075] 在一些实施方案中，利用同源重组将异源DNA整合入干细胞的染色体中，从而在移植入身体中后控制干细胞命运。该异源DNA可以包含但不限于整合在内源基因上游的启动子区(诱导型)、一种或多种基因的编码序列、药物选择盒，或引入自杀基因的整个表达盒，其包含启动子区和一种或多种基因的编码序列。自杀基因的概念是本领域公知的。该自杀基因可以选自内源促凋亡基因，例如胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-2、BH3相互作用域死亡激动剂(BID)或异源基因，例如单纯疱疹病毒-1胸苷激酶(HSV-1TK)。本领域技术人员会理解，多种自杀基因可以用于在移植后控制干细胞的命运。该自杀基因可以通过本领域已知的任何诱导型启动子(包括但不限于Tet-On(Clonetech，Mountain View，CA)，其通过四环素衍生物多西环素来诱导)或通过同二聚化系统来控制。可以将诱导的自杀基因导入染色体上的任何位点，但是优选染色体中的非功能区。
[0076] 同源重组自身通常发生于真核系统中的减数分裂过程期间。该过程牵涉染色体中高度相似的DNA序列的排列，及姐妹染色体各自DNA之间DNA序列的交换。将分子相互作用的复杂系列简单地定义为“交换”(图20A)。在这些序列排列时，DNA双链中的断裂促进遗传材料的交换。非同源序列侧翼的两段同源序列可用于将外来DNA片段导入至基因组DNA(图20B)。这种策略已经广泛用于小鼠中的基因敲入或敲除。虽然这种系统有几项潜在优点，但是主要的一项是消除随机插入DNA中的外来或异源DNA。类似地，因为同源重组要求高度相似的DNA序列区段，所以整合的插入物的位置及其拷贝数(1个或2个，与逆转录病毒投递的
3-6个比较)是较为确定的。
实施例
3-6个比较)是较为确定的。
实施例
[0077] 在后面的实施例中进一步限定本发明。应当理解，虽然这些实施例指示本发明的优选实施方案，但是它们仅仅是为了例示而给出的。根据上文讨论和这些实施例，本领域技术人员能确定本发明的本质特征，而且在不违反本发明的精神和范围的情况中，能对本发明做出各种变化和修改，从而使其适应各种用途和条件。
[0078] 实施例1
[0079] 材料和方法
[0080] iPS产生和培养
[0081] 如Yamanaka等人(12，13)所述用4种逆转录病毒转录因子转导来自绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠(C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J Stock#004353)(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)的正常成纤维细胞。在含有敲除DMEM(KDMEM，Invitrogen，Carlsbad，CA)、15％ES合格胎牛血清(FBS)(PAA，Ontario，Canada)、2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)、1x10-4M非必需氨基酸(Invitrogen)、1x10-4M 2-巯基乙醇(Sigma，St Louis，MO)、1Xpen/strep(Invitrogen)和12.5ng/ml LIF(Chemicon，Billerica，MA)的ES培养基中在丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上维持新产生的未分化小鼠iPS细胞。使用0.25％胰蛋白酶(Invitrogen)以1∶3-1∶6的拆分比每3-4天进行培养物传代。在补充有10％合格FBS(Invitrogen)和1X pen strep的DMEM高葡萄糖中维持小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞(Millipore，Billerica，MA)。
[0082] 对iPS细胞衍生的胰贝塔细胞进行诱导
[0083] iPS细胞变成β样细胞的3阶段分化方案改编自Wobus等人所述胚胎干(ES)细胞变成胰岛素生成型细胞的分化(17)，带有修正。在阶段1，自iPS细胞产生了胚状体(EB)。将10cm组织培养盘中附着至饲养层的iPS细胞用1XPBS(Invitrogen)清洗一次以除去残留血清。将细胞用0.25％胰蛋白酶处理30秒钟，除去胰蛋白酶并通过用无菌细胞刮刀(BD Biosciences)手工刮擦培养盘来瓦解细胞。将EB培养基(不含LIF的ES培养基)添加至细胞，并通过移液器将细胞进一步瓦解成单细胞和小块。将细胞悬浮液以300g离心5分钟。除去上清液并将细胞团粒在10ml EB培养基中重悬浮。为了消减不想要的饲养细胞的iPS细胞，将细胞分配到T75组织培养瓶上并容许饲养细胞于37℃在增湿CO2温箱中贴壁30-45分钟。然后收集消减了饲养细胞的细胞并以300g离心5分钟。将细胞团粒在EB培养基中以6000个细胞/mL重悬浮并作为液滴在15cm皮氏盘上分配，每块板18-22行液滴。温和翻动板以颠倒液滴并于37℃温箱温育2天。通过用1X PBS温和回荡并转移至50mL锥形管，收集并合并EB。容许合并的EB通过重力而沉降(约10分钟)，在10mL EB培养基中重悬浮，转移至10cm非贴壁皮氏板并再温育3天。
[0084] 在阶段2，收集EB并以10-15个EB/10cm组织培养盘转移至贴壁培养以诱导多谱系祖先。对于RT-PCR、免疫荧光染色和ELISA测定法，将1-3个EB转移入12孔板的每个孔中。在EB培养基中培养基的EB分化9天，每3-4天更换培养基。
[0085] 最后，在阶段3，EB被诱导7-20天，以进一步分化成β样细胞。EB培养基用由DMEM/F12补充10％敲除替换血清、20nM孕酮(Sigma，St Louis，MO)、100μM腐胺(Sigma)、1μg ml-1层粘连蛋白(Sigma)、10mM烟酰胺(Sigma)、1X含有胰岛素、运铁蛋白和硒酸的ITS预混物(BD Biosciences)、B27培养基补充物(Invitrogen)、和1X pen/strep组成的β-细胞选择性分化培养基更换。在选择性培养基中第6天后，将细胞用胰蛋白酶消化并重分配入新的培养盘中。再次，贯穿阶段3每3-4天更换培养基。
[0086] 体外胰岛素诱导和ELISA测定法
[0087] 将在12孔多孔板中培养至～80-90％汇合的阶段3第7、13、和20天iPS细胞衍生的β样细胞用1X PBS清洗三次。除去清洗液，添加500μl含2.5mM葡萄糖的KRBH溶液(KRBH：129mM NaCl，4.8mM KCl，2.5mM CaCl2，1.2mMKH2PO4，1.2mM MgSO4，5mM NaHCO3，10mM HEPES，0.1％(wt/vol)BSA)并将细胞于37℃在增湿CO2温箱中温育90分钟。然后将细胞用PBS清洗三次以除去残留的初始诱导期间生成的胰岛素。添加含有5mM、10mM、20mM、30mM或40mM葡萄糖的KRBH溶液，并将细胞返回温箱90分钟。收集并保存上清液，再次将细胞用1X PBS清洗三次，然后将500μl KRBH溶液(无葡萄糖)添加至细胞以测试β样细胞是否在葡萄糖缺失下继续生成胰岛素。使用基于ELISA的胰岛素测定法(Mercodia，Upsala Sweden)依照制造商的指令测量体外衍生细胞生成的胰岛素水平。
[0088] 荧光激光细胞分选，FACS
[0089] 在细胞移植前，通过胰蛋白酶消化将来自2个10cm培养盘的阶段3第7天iPS细胞衍生的β样细胞解离成单细胞悬浮液。将细胞用1X PBS清洗一次并用SSEA-1抗体(5ml 1X PBS中的1∶200抗体稀释液，见表2)于RT染色30分钟。SSEA-1是在干细胞上找到的一种表面抗原且广泛用于排除携带干细胞标志物的细胞以降低移植后形成畸胎瘤的机会。通过以300g离心5分钟使细胞形成团粒。将细胞用二抗(5ml1X PBS中的1∶1000抗体稀释液，表2)染色并于RT温育15分钟。将细胞用1X PBS清洗三次并在β细胞分化培养基中以2.5-5x 106个细胞/ml培养基的浓度重悬浮。使用iCyt反射细胞分选仪来分选GFP阳性/SSEA1阴性细胞。在移植前，将分选的细胞用1X PBS清洗一次并在基础DMEM/F12中以约600细胞/μl的浓度重悬浮。
[0090] 糖尿病小鼠模型
[0091] 所有动物规程得到了Applicants’institutional animal committee的批准。2型糖尿病小鼠模型，Leprdb，C57BLKS；Dock7m，DBA/J购自Jackson Laboratories(Stock#000642)。我们使用自发性糖尿病突变(Lepr db)(它引起这些小鼠在3-4周龄时变成肥胖)为纯合的经过基因分型的小鼠。该小鼠在3-4周龄时还变成高血糖，原因在于不受调控的葡萄糖代谢和对胰岛素生成型胰β细胞的严重破坏。随着该小鼠继续变老，它们变成对外源胰岛素疗法有抗性(21，22)。
[0092] 对于1型糖尿病小鼠模型，经腹膜内注射给予C57BL6小鼠单剂180mg/kg链唑霉素，STZ(Sigma)。STZ对胰β细胞有化学毒性。糖尿病表型得到了高血糖读数的确认。在细胞移植前容许这种糖尿病状况稳定10天。对于这些研究，使用禁食葡萄糖浓度＞400mg/dl的STZ处理小鼠。
[0093] 胰岛素耐受测试
[0094] 如先前所述(23)实施胰岛素耐受测试。经腹膜内注射给予4、8和16周龄(每个年龄组n＝3)的未移植2型雌性糖尿病小鼠(禁食6小时)0.75U/kg人胰岛素(Novo Nordisk，Clayton，NC)。在注射后30、60、和90分钟时使用手持式LifeScan OneTouch血糖仪(Johnson&Johnson，New Brunswick，NJ)经尾静脉获得血液葡萄糖读数。
[0095] 糖尿病小鼠模型的细胞疗法
[0096] 使用先前发表的方案(24)通过门静脉注射进行细胞移植。在麻醉下，使用32号Hamilton注射器将300μl基础DMEM/F12培养基中的200,000个FACS分选的GFP阳性/SSEA1阴性阶段3iPS细胞衍生的β样细胞注射入肝门静脉中。体外衍生的β样细胞的门静脉内注射是直接将细胞植入鼠肝窦中的一种有效方式。植入的细胞稳定表达绿色荧光蛋白，使得我们能够识别和区分移植的细胞与其它肝细胞类型。移植后每2-3天使用手持式血糖仪经尾静脉自禁食小鼠获得葡萄糖读数。自3只移植后4周具有正常葡萄糖读数的移植小鼠收集5μl血液(n＝3)并将样品送至一家独立公司(Diabetes Technologies，Inc.)以获得血红蛋白A1c读数。
[0097] 统计
[0098] 组间统计差异(P＜0.05)是通过Excel的单边Student t检验来确定的。认为小于0.05的P值是在统计学上显著的。
[0099] RT-PCR
[0100] 使用Trizol试剂(Invitrogen)依照制造商的指令自未分化iPS细胞和已分化β样细胞分离总RNA。使用cDNA Archive试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)依照制造商的指令将2μg总RNA用于逆转录。使用Platinum PCRSupermix High Fidelity(Invitrogen)依照制造商的指令实施PCR反应。表1提供用于内源/总逆转录病毒转录物(8)和特定胰标志物(25)的PCR引物序列。
[0101] 裸鼠中的畸胎瘤形成
[0102] 对iPS细胞增殖和分化的评估经由裸鼠中的畸胎瘤形成来测试。将iPS细胞用0.25％胰蛋白酶解离2分钟，然后使用细胞刮刀手工刮擦，收集并转移入15ml锥形管中，以
1500RPM离心5分钟，并在EB分化培养基中重悬浮细胞团粒。将100μl DMEM高葡萄糖中的2x
106个解离iPS细胞与等体积的Geltrex(Invitrogen)混合并皮下注射入2只裸鼠(Taconic，Hudson，NY)的体侧中。注射后30天，取出畸胎瘤，解剖并用福尔马林(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)固定。组织切片用石蜡包埋并用苏木精和曙红染色。
1500RPM离心5分钟，并在EB分化培养基中重悬浮细胞团粒。将100μl DMEM高葡萄糖中的2x
106个解离iPS细胞与等体积的Geltrex(Invitrogen)混合并皮下注射入2只裸鼠(Taconic，Hudson，NY)的体侧中。注射后30天，取出畸胎瘤，解剖并用福尔马林(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)固定。组织切片用石蜡包埋并用苏木精和曙红染色。
[0103] 免疫荧光和组织染色
[0104] 将细胞培养物用1X PBS清洗三次并在含4％低聚甲醛的PBS(EMDChemicals，Gibbstown，NJ)中于室温(RT)固定15-30分钟。然后将它们在PBS中清洗三次，并用含0.2％Triton X(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)的PBS于RT透化15-30分钟。对于表面标志物诸如SSEA-1，省略透化步骤。再次将细胞用PBS清洗三次并在含5％胎牛血清(Fisher Scientific)的PBS于RT封闭15-30分钟。表2列出一抗和二抗。将含一抗的1％BSA添加至细胞并于37℃温育2小时。再次将细胞用PBS清洗三次，并添加在PBS中稀释的二抗并于37℃温育1小时。再次清洗细胞并将核用1mg/ml 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚DAPI(Sigma，St Louis，MO)复染色10分钟，之后在PBS中最终清洗三次。通过两种方法制备肝组织，石蜡包埋组织用于图6小图A、B、和C所示免疫组织化学。冷冻切片为图6小图D、E和F中的荧光图像制备。
[0105] 分离肝，在10％中性缓冲的福尔马林中固定并在石蜡中包埋。切出5μm切片，放置在预清洁的载玻片上，使用二甲苯脱石蜡，然后使用醇梯度水合。使用RMR622G家兔HRP聚合物试剂盒(Biocare，Concord，CA)实施使用家兔抗小鼠GFP一抗的IHC染色。将脱石蜡载玻片放置在1X啮齿类Decloaker溶液中并使用Biocare的Decloaking室加热至125℃30分钟。取出载玻片并用去离子水清洗三次。将啮齿类封闭液M应用30分钟以降低非特异性背景染色和内源小鼠IgG二者。将载玻片用PBS清洗两次，应用含GFP一抗的1％抗体稀释缓冲液(1∶100)并在增湿室中于4℃温育过夜。将载玻片用PBS清洗并将家兔HRP聚合物溶液应用20分钟。再次将载玻片在PBS中清洗并将Betazoid DAB色原体试剂(将1滴Betazoid DAB色原体添加至1ml Betazoid DAB底物缓冲液)应用5分钟。然后将载玻片用去离子水漂洗并用苏木精处理30秒钟。用温和的碱性自来水清洗载玻片至核变蓝。然后将载玻片脱水，清洁并盖上盖玻片。细胞质显褐色，而核显蓝色。
[0106] 将5μm冷冻肝切片放置在带正电荷的载玻片上并容许于RT风干5分钟，之后与3％低聚甲醛/甲醇于RT混合15分钟，随后在甲醇中于-20℃温育5分钟。将切片用PBS清洗5分钟两次并在用甲醇稀释的3％过氧化氢中于RT温育10分钟。将切片用PBS清洗5分钟两次，然后与5％BSA封闭缓冲液一起于RT温育1小时。除去封闭缓冲液并添加400μl含胰岛素单克隆一抗(1∶100，见表2)的1％BSA并于4℃温育过夜。除去抗体溶液并将切片用PBS清洗三次，每次5分钟。然后添加用PBS 1∶1000稀释的二抗并于RT温育30分钟。除去二抗溶液并将切片在PBS中清洗三次，每次5分钟。将核用1mg/ml DAPI染色10分钟并将切片用PBS清洗三次，每次
5分钟。立即在荧光显微镜上捕捉图像。
5分钟。立即在荧光显微镜上捕捉图像。
[0107] 实施例2
[0108] 正常小鼠皮肤成纤维细胞重编程成诱导的多能干细胞
[0109] 使用先前记载的方法(26)，用4种逆转录病毒转录因子(10-12)转导来自绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠的正常成纤维细胞。在当前研究中，在转导后20天时挑取并扩增2个iPS亚克隆集落(图8)。这2个iPS亚克隆的mRNA表达谱显示内源干细胞标志物Oct4、Sox2、Klf4、和c-Myc上调，与胚胎干(ES)细胞相似(图9)。外源病毒转基因展现出最低限度的表达。用于评估可见于这些iPS细胞的表面和细胞内抗原的免疫荧光染色对熟知的多能标志物Oct4、Sox2、Nanog和SSEA-1呈阳性(图10)。为了测定它们增殖和分化的能力，将大约2x106个解离的iPS细胞皮下注射入3只裸鼠的体侧中。注射后30天，在所有注射小鼠中形成了畸胎瘤，提示注射细胞的完全增殖能力。经对来自畸胎瘤的组织的苏木精和曙红染色确立了分化，显示存在属于三种胚层的细胞类型：外胚层(皮肤)，内胚层(肠样)和中胚层(软骨)(图11)。形态、mRNA表达谱、免疫荧光染色和畸胎瘤形成确认ES样iPS细胞的体外产生。
[0110] 实施例3
[0111] iPS细胞选择性分化为胰岛素生成型胰β样细胞
[0112] 使用先前为ES细胞发表的方案(17)的修正，驱动iPS细胞经历3阶段分化，变成能生成胰岛素的β样细胞。这种分化的时间线显示于图1。在阶段1，ES样iPS细胞培养物解离成单细胞并放置在悬浮培养中，在那里，它们形成胚状体(图1，顶部小图)。悬浮培养5天后，将胚状体返回贴壁培养以经历进一步分化9天。在此期间，细胞自贴壁的球状体迁移(图1，中部小图)。9天后，将培养基更换为含有层粘连蛋白、胰岛素、烟酰胺、硒酸、运铁蛋白、孕酮和Knock-Out替换血清的选择性培养基，对阶段3的开始进行标记。在随后的20天期间，细胞继续分化(图1，底部小图)。先前的方案(17)包括阶段2结束时已分化细胞的酶促解附。这种规程对分化中的胰细胞有害，只有10％的细胞在胰蛋白酶消化后存活且重附着。因此，在9天后，不经胰蛋白酶消化而将阶段2培养基用阶段3选择性培养基更换，细胞存活提高80％。
[0113] 在阶段3分化期间，在选择性培养基处理的第6天时看到了存在多谱系细胞(图12，第2栏)。此时，将培养物用胰蛋白酶消化并在新鲜的选择性培养基中重分配到新盘上。在第13天，开始形成众多簇(图12，第3栏)。到第20天，有明显的大细胞簇(图12，第4栏)。GFP在整个分化期间高度表达。
[0114] 在阶段3时通过免疫荧光染色来分析胰岛素和巢蛋白的细胞水平。在第7天时，胰岛素和巢蛋白二者表达(图13)。巢蛋白的表达在第13天时达到峰值(图14)，到第20天时降低(图2A)。胰岛素在第13天和第20天以低水平表达，与先前的报告(7)一致。
[0115] mRNA分析揭示了体外胰β细胞分化的几种特异性标志物的表达，如图2B所示。权威性内胚层标志物Sox17和HNF3B(FoxA2)在阶段2共表达且直到阶段3都能检测到。在阶段1到3期间看到了细胞角蛋白19和巢蛋白的共表达，提示存在多谱系祖先。在阶段1和2看到了PDX1和HNF3B的共表达，指示胰内胚层或上皮生成。在所有内分泌祖先中高度表达的NGN3(18)在阶段1和2与PDX1共表达，指示已分化细胞进一步定型为内分泌谱系。Pax4、Pax6和岛(Islet)-1是控制内分泌细胞分化的重要转录因子，在所有3个阶段都检测到。然而，随着细胞发展成成熟的已分化表型，岛-1在阶段3早期下调。
[0116] 有5种内分泌细胞类型，即α、β、δ、PP和ε细胞，它们分别生成激素胰高血糖素、胰岛素、促生长素抑制素、胰多肽(PP)和生长素释放肽。胰岛素表达早至阶段1就检测到了，而且保持上调直至阶段3。另外，由胰β-细胞在分泌胰岛素的同时的岛淀粉状多肽(IAPP)(19，20)在阶段1到3也高度表达。促生长素抑制素和PP的表达只在阶段1明显。胰高血糖素在所有分化阶段或是检测不到或是具有低表达(数据未显示)。生长素释放肽未测试。淀粉酶阳性腺泡细胞在阶段1和2检测到，但是在选择性分化阶段3检测不到。
[0117] 在体外通过将经葡萄糖饥饿的阶段3细胞对5个葡萄糖浓度暴露90分钟来测试iPS衍生的β样细胞的葡萄糖响应性。如图3所示，第20天，已分化细胞以剂量依赖性方式响应葡萄糖。在较低的葡萄糖浓度(5mM和10mM)，已分化细胞有边缘性响应。在20mM葡萄糖，胰岛素生成达到峰值，处于比来自5mM和10mM葡萄糖处理细胞的读数高～8倍的水平。在30mM和40mM，胰岛素读数再次开始降低。在葡萄糖诱导后，彻底清洗细胞以除去残留胰岛素，然后与基础KRBH溶液一起重温育90分钟。如同一图所示，在除去葡萄糖时不生成胰岛素，提示体外衍生的β样细胞只会因响应葡萄糖处理而生成胰岛素。第7天和第13天的分化细胞在暴露于葡萄糖处理时也生成胰岛素(数据未显示)。
[0118] 实施例4
[0119] 2型糖尿病小鼠模型表型测试揭示高血糖、异常胰岛素水平、和对外源胰岛素疗法的抗性
[0120] 本文中使用的2型糖尿病小鼠模型(Leprdb，C57BLKS；Dock7m，DBA/J)随小鼠变老，显示消减的胰岛素生成，同时维持高血糖表型。到3-4周龄时，与用作对照的正常C57BL6小鼠株相比，糖尿病小鼠在禁食6-8小时后表现出高血糖，其中葡萄糖浓度大于300mg/dl(图4A)。在3周龄时，与正常对照相比，糖尿病小鼠血液葡萄糖浓度(n＝20)升高～2.6倍。在4-5周龄时，糖尿病小鼠的葡萄糖浓度升高～3.8倍。在6周龄后，高血糖非常严重且葡萄糖水平高得危险，处于＞600mg/dl。
[0121] 自4周龄糖尿病小鼠(n＝20)(图4B)收集的血清样品中的胰岛素水平波动很大，在0.64到15.32ng/l范围。胰岛素水平均值比正常对照小鼠(n＝3)高～17倍。随糖尿病小鼠继续变老，胰岛素水平降低。糖尿病小鼠在8周时(n＝3)具有比正常对照低～2.6倍的胰岛素水平，而在13周时(n＝3)具有低～3.6倍的胰岛素水平。
[0122] 随小鼠变老，还发生胰岛素抗性(图4C)。注射入4周龄(n＝3)糖尿病小鼠中的外源胰岛素导致禁食葡萄糖的降低，在注射后0到30分钟之间发生。随年龄增大，小鼠在8周(n＝3)和16周(n＝3)时显示出最低程度的对注射的响应，指示对胰岛素的抗性。
[0123] 实施例5
[0124] 在2型糖尿病小鼠模型中iPS衍生的β样细胞能够植入肝实质并改善高血糖[0125] 通过FACS分选来分离iPS衍生的胰岛素分泌型β样细胞以产生GFP阳性/SSEA1阴性细胞，通过门静脉内注射移植入糖尿病小鼠中(n＝30)。移植后2天开始的禁食葡萄糖测量显示于图5A。所有30只移植小鼠(展现100％植入效率)展现出正常葡萄糖浓度，其读数与C57BL6正常对照(n＝3)相当。3只移植GFP阴性/SSEA1阳性的阴性对照细胞(饲养细胞)的糖尿病小鼠保持高血糖。未接受植入的糖尿病对应小鼠(n＝20)也保持高血糖。
[0126] 在移植后4周时，初始30只β样细胞移植小鼠中的20只存活且维持正常血糖控制。在移植后8周时，这些小鼠中的15只仍然活着且血糖正常。到第12周的数据显示出处理小鼠持续维持正常葡萄糖水平。移植小鼠中的50％死亡率(图15)表现为手术接入门静脉所致并发症(即血栓形成)的结果。然而，所有小鼠在移植后存活至少1周且在该时间期间展现正常葡萄糖水平。2只小鼠在维持受调控葡萄糖水平8周后复发高血糖。这2只小鼠表现出具有重发生的胰岛素抗性(图16)。
[0127] 实施例6
[0128] 植入的iPS衍生的β样细胞能够在体内生成胰岛素，并且使血红蛋白A1c水平正常化
[0129] 移植iPS细胞衍生的β样细胞的2型糖尿病小鼠模型中高血糖的改善伴随着发生体内胰岛素浓度(通过小鼠胰岛素ELISA测定法测量)的升高。到移植后21-56天，与未处理小鼠相比，β样细胞移植小鼠具有～4.35倍的胰岛素水平升高(P＜0.05)(图5B)。处理小鼠中的胰岛素水平比未处理对照略高。
[0130] 在移植后4周进行血红蛋白A1c测试，以测量附着于红血球血红蛋白的葡萄糖量(图5C)。
[0131] 未经处理的糖尿病小鼠(n＝3)的血红蛋白A1c水平比正常C57BL6对照(n＝3)高～2.4倍。移植后4周具有正常葡萄糖读数的移植小鼠(n＝3)具有显著改进的血红蛋白A1c读数(超出未处理小鼠好于70％的改进)。
[0132] 实施例7
[0133] 植入的细胞在肝实质中的细胞分布
[0134] 体外衍生的β样细胞的门静脉内注射是直接将细胞植入鼠肝窦中的一种有效方式。在移植后7天和4周时，处死3只小鼠以获得组织，用于免疫组织化学和免疫荧光分析以评估植入的细胞在肝中的分布。植入的细胞稳定表达绿色荧光蛋白，使得能识别移植的细胞并将它们与其它肝细胞类型区分开。
[0135] 如图6所示，细胞能够稳定植入糖尿病小鼠模型的肝实质中。通过抗GFP抗体检测的纺锤形GFP阳性细胞(褐色)均匀分布于7天的处理小鼠的整个显微肝切片(小图B和C)。在肺和脾中检测到最低限度的GFP阳性细胞(数据未显示)。用来自C57BL6正常小鼠株的肝切片作阴性对照(小图A)。植入的β样细胞在移植后7天共表达胰岛素和GFP，如通过免疫荧光检测到的(小图D-F)。
[0136] 实施例8
[0137] 移植iPS细胞衍生的β样细胞后STZ处理小鼠中的正常血糖状态
[0138] 为了测试体外衍生的β样细胞是否在岛细胞严重消减的环境(1型糖尿病的一种模型)中发挥功能，经门静脉内注射将体外衍生的胰岛素分泌型β样细胞移植入葡萄糖浓度＞400mg/dl的STZ处理小鼠中(图7)。在移植β样细胞后2天时，STZ处理小鼠(n＝2)的葡萄糖水平变成正常，其葡萄糖浓度为160+/-5mg/dl。未移植STZ处理小鼠(n＝3)维持高血糖，其葡萄糖浓度＞400mg/dl。经处理的小鼠移植后第2天直到第30天的葡萄糖读数一直是正常的，而未经移植的小鼠保持高血糖。
[0139] 实施例9
[0140] 在不使用c-Myc的情况中产生iPS细胞
[0141] 常规产生的iPS细胞的临床应用的一项困难在于将已知的癌基因(也就是c-Myc)导入基因组。因此，产生了不含这种强效转录因子的iPS细胞。在没有c-Myc的情况中，观察到可信重编程的效率要低得多，但是我们仍然能够利用逆转录病毒感染法，仅仅用OCT4、SOX2、和KLF4来衍生iPS细胞。对这些细胞的进一步表征揭示了它们表达典型的干细胞标志物，诸如SSEA-1、Nanog、和OCT4，以及新颖的标志物诸如SALL4(图17)，提示这些确实是真的iPS细胞。为了确保这些3因子iPS(3F-iPS)细胞能产生发育中胚胎的所有胚层，将这些细胞注射入NOD-SCID小鼠的体侧中。真正的干细胞在这些条件下会产生由内胚层、外胚层、和中胚层细胞谱系构成的畸胎瘤。确实，3F-iPS细胞在注射后2周内产生了由所有三种胚层构成的畸胎瘤。这些数据清楚地提示，自成纤维细胞衍生的3F-iPS细胞具有可用于治疗性应用的干细胞样质量。
[0142] 实施例10
[0143] 使用非整合型病毒载体产生iPS细胞
[0144] 通过一种新的逆分化方法，使用在哺乳动物细胞中瞬时表达指定的转录因子的杆状病毒系统(BacMam病毒)能生成iPS细胞。通过消除意外整合问题及不给变质复制事件提供机会(原因在于创建的病毒在2-3次细胞传代后消失)，BacMam病毒提供与整合型病毒载体相比更安全的办法。另外，这种类型的病毒在哺乳动物细胞(包括人细胞)中消逝(die away)且不能复制。产生了表达Oct4、Sox2和Nanog和Lin28的BacMam病毒。它们在成纤维细胞中显示与在胚胎干细胞中看到的表达水平相当的蛋白质表达水平(图18)。
[0145] 实施例11
[0146] 产生包含自杀基因的iPS细胞
[0147] 利用同源重组将异源DNA整合入所述干细胞的染色体中，从而在移植入身体中后控制干细胞命运。用包含诱导型启动子、目标基因、和药物抗性基因的表达盒转化干细胞。目标基因和药物抗性基因应当由翻译起点(TIS；例如IRES)隔开，从而容许两种蛋白质由同一启动子驱动(图21)。通过自盒表达目标基因，例如上文所列自杀基因之一，会有可能杀死干细胞或对细胞重编程，如果这些细胞对身体有害的话。
[0148] 在此通过述及将下文所列参考文献收入本文。
[0149] 参考文献
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[0177] 用于RT-PCR的引物序列
[0178] 基因 正向引物序列 反向引物序列
内源Oct3/4 TCT TTC CAC CAG GCC CCC GGC TC TGC GGG CGG ACA TGG GGA GAT CC
总Oct3/4 CTG AGG GCC AGG CAG GAG CAC GAG CTG TAG GGA GGG CTT CGG GCA CTT
内源Sox2 TAG AGC TAG ACT CCG GGC GAT GA TTG CCT TAA ACA AGA CCA CGA AA
总Sox2 GGT TAC CTC TTC CTC CCA CTC CAG TCA CAT GTG CGA CAG GGG CAG
内源Klf4 GCG AAC TCA CAC AGG CGA GAA ACC TCG CTT CCT CTT CCT CCG ACA CA
总Klf4 CAC CAT GGA CCC GGG CGT GGC TGC CAG AAA TTA GGC TGT TCT TTT CCG GGG CCA CGA
内源c-Myc TGA CCT AAC TCG AGG AGG AGC TGG AAT C AAG TTT GAG GCA GTT AAA ATT ATG GCTGAAGC
总c-Myc CAG AGG AGG AAC GAG CTG AAG CGC TTA TGC ACC AGA GTT TCG AAG CTG TTC G
Gapdh GAT GCC CCC ATG TTT GTG AT TTG CTG ACA ATC TTG AGT GAG TTG T
Sox 17 CCA TAG CAG AGC TCG GGG TC GTG CGG AGA CAT CAG CGG AG
HNF3β(Foxa2) ACT GGA GCA GCT ACT ACG CCC ACA TAG GAT GAC ATG
细胞角蛋白19 CTG CAG ATG ACT TCA GAA CC GGC CAT GAT CTC ATA CTG AC
Isl-1 GTT TGT ACG GGA TCA AAT GC ATG CTG CGT TTC TTG TCC TT
巢蛋白 CTA CCA GGA GCG CGT GGC TCG ACA GCC AGC TGG AAC TT
Ngn3(MATH4B) TGG CGC CTC ATC CCT TGG ATG AGT CAC CCA CTT CTG CTT CG
Pax4 ACC AGA GCT TGC ACT GGA CT CCC ATT TCA GCT TCT CTT GC
Pax6 TCA CAG CGG AGT GAA TCA G CCC AAG CAA AGA TGG AAG
Pdx1(IPF-1) CTT TCC CGT GGA TGA AAT CC GTC AAG TTC AAC ATC ACT GCC
胰岛素1 TAG TGA CCA GCT ATA ATC AGA GAC CGC CAA GGT CTG AAG GTC
胰高血糖素 CAT TCA CAG GGC ACA TTC ACC CCA GCC CAA GCA ATG AAT TCC
淀粉酶 CAG GCA ATC CTG CAG GAA CAA CAC TTG CGG ATA ACT GTG CCA
Glut-2 TTC GGC TAT GAC ATC GGT GTG AGC TGA GGC CAG CAA TCT GAC
IAPP TGA TAT TGC TGC CTC GGA CC GGA GGA CTG GAC CAA GGT TG
PP ACT AGC TCA GCA CAC AGG AT AGA CAA GAG AGG CTG CAA GT
促生长素抑制素 TCG CTG CTG CCT GAG GAC CT GCC AAG AAG TAC TTG GCC AG TTC
β5-微管蛋白 TCA CTG TGC CTG AAC TTA CC GGA ACA TAG CCG TAA ACT GC
内源Oct3/4 TCT TTC CAC CAG GCC CCC GGC TC TGC GGG CGG ACA TGG GGA GAT CC
总Oct3/4 CTG AGG GCC AGG CAG GAG CAC GAG CTG TAG GGA GGG CTT CGG GCA CTT
内源Sox2 TAG AGC TAG ACT CCG GGC GAT GA TTG CCT TAA ACA AGA CCA CGA AA
总Sox2 GGT TAC CTC TTC CTC CCA CTC CAG TCA CAT GTG CGA CAG GGG CAG
内源Klf4 GCG AAC TCA CAC AGG CGA GAA ACC TCG CTT CCT CTT CCT CCG ACA CA
总Klf4 CAC CAT GGA CCC GGG CGT GGC TGC CAG AAA TTA GGC TGT TCT TTT CCG GGG CCA CGA
内源c-Myc TGA CCT AAC TCG AGG AGG AGC TGG AAT C AAG TTT GAG GCA GTT AAA ATT ATG GCTGAAGC
总c-Myc CAG AGG AGG AAC GAG CTG AAG CGC TTA TGC ACC AGA GTT TCG AAG CTG TTC G
Gapdh GAT GCC CCC ATG TTT GTG AT TTG CTG ACA ATC TTG AGT GAG TTG T
Sox 17 CCA TAG CAG AGC TCG GGG TC GTG CGG AGA CAT CAG CGG AG
HNF3β(Foxa2) ACT GGA GCA GCT ACT ACG CCC ACA TAG GAT GAC ATG
细胞角蛋白19 CTG CAG ATG ACT TCA GAA CC GGC CAT GAT CTC ATA CTG AC
Isl-1 GTT TGT ACG GGA TCA AAT GC ATG CTG CGT TTC TTG TCC TT
巢蛋白 CTA CCA GGA GCG CGT GGC TCG ACA GCC AGC TGG AAC TT
Ngn3(MATH4B) TGG CGC CTC ATC CCT TGG ATG AGT CAC CCA CTT CTG CTT CG
Pax4 ACC AGA GCT TGC ACT GGA CT CCC ATT TCA GCT TCT CTT GC
Pax6 TCA CAG CGG AGT GAA TCA G CCC AAG CAA AGA TGG AAG
Pdx1(IPF-1) CTT TCC CGT GGA TGA AAT CC GTC AAG TTC AAC ATC ACT GCC
胰岛素1 TAG TGA CCA GCT ATA ATC AGA GAC CGC CAA GGT CTG AAG GTC
胰高血糖素 CAT TCA CAG GGC ACA TTC ACC CCA GCC CAA GCA ATG AAT TCC
淀粉酶 CAG GCA ATC CTG CAG GAA CAA CAC TTG CGG ATA ACT GTG CCA
Glut-2 TTC GGC TAT GAC ATC GGT GTG AGC TGA GGC CAG CAA TCT GAC
IAPP TGA TAT TGC TGC CTC GGA CC GGA GGA CTG GAC CAA GGT TG
PP ACT AGC TCA GCA CAC AGG AT AGA CAA GAG AGG CTG CAA GT
促生长素抑制素 TCG CTG CTG CCT GAG GAC CT GCC AAG AAG TAC TTG GCC AG TTC
β5-微管蛋白 TCA CTG TGC CTG AAC TTA CC GGA ACA TAG CCG TAA ACT GC
[0179] 表1
[0180] 用于免疫染色的标志物
[0181]
[0182] *一抗和二抗在用于免疫荧光染色前稀释至1％封闭缓冲液。
[0183] 表2
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| HAb18G/CD147分子小片段干涉RNA药物及其用途 | 2021-01-31 | 3 |
| 新的成纤维细胞生长因子 | 2020-05-18 | 1 |
| 自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备方法及其生物美容产品 | 2020-05-20 | 2 |
| 一种融合蛋白TAT-OCT4及其编码基因与应用 | 2020-08-19 | 1 |
| 双重靶向抗肝纤维化药物载体拟糖蛋白纳米粒及其制法 | 2021-01-17 | 1 |
| 成纤维细胞生长因子同系物 | 2020-05-16 | 3 |
| 将表面改性的软骨细胞衍生细胞外基质膜作为有效成分包含的组合物在防止粘连中的应用 | 2020-10-27 | 2 |
| 一种细菌纤维素提纯分离的方法 | 2020-12-10 | 3 |
| 一种食蟹猴TRIM5alpha基因敲低的方法 | 2021-09-03 | 2 |
| 一种治疗肺间质纤维化的中药片剂及其制备方法 | 2022-04-11 | 1 |
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