生物工程化的组织构建物、其制备方法及其应用
阅读：164发布：2023-03-05
专利汇可以提供生物工程化的组织构建物、其制备方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了经培养的组织的构建物，其含有培养的细胞和无需外源性基质成分或网状系统支持物或 支架 组件便可内源产生的细胞外基质成分。本发明的某些组织构建物由多层细胞或不止一种类型的细胞组成。本发明的组织构建物具有与组织类似的形态特征和功能，它们的强度使它们更易于操作。本发明的优选组织构建物均在 指定 的培养基上制备，所谓指定的培养基即不含化学性质不确定的成分。，下面是生物工程化的组织构建物、其制备方法及其应用专利的具体信息内容。
1.一种细胞-基质层，包含：
培养的产生细胞外基质的细胞；和
内源产生的细胞外基质；
其中所述产生细胞外基质的细胞被包含在所述细胞外基质内并穿过所述细胞外基质。
2.一种细胞-基质层，包含：
培养的产生细胞外基质的细胞；和
非外源的细胞外基质；
其中所述产生细胞外基质的细胞被包含在所述非外源细胞外基质内并穿过所述非外源细胞外基质。
3.权利要求1或2的细胞-基质层，其中所述产生细胞外基质的细胞来自选自下组的组织：新生男婴包皮，真皮，腱，肺，尿道，脐带，角膜基质，口腔粘膜，和肠。
4.权利要求1或2的细胞-基质层，其中所述产生细胞外基质的细胞选自：真皮成纤维细胞，面颊成纤维细胞，角膜角质细胞，跟腱成纤维细胞，和间质成纤维细胞。
5.权利要求1或2的细胞-基质层，其中所述产生细胞外基质的细胞为真皮成纤维细胞。
6.权利要求1或2的细胞-基质层，其中所述产生细胞外基质的细胞来自人的组织、且在不含动物来源的成分的培养基中培养。
7.权利要求1或2的细胞-基质层，其中所述产生细胞外基质的细胞在化学确定的培养基中培养。
8.权利要求7的细胞-基质层，其中所述化学确定的培养基包含营养基本培养基，胰岛素，L-谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，运铁蛋白，和抗坏血酸盐或抗坏血酸盐衍生物。
9.权利要求1或2的细胞-基质层，其中所述产生细胞外基质的细胞在所述培养条件下培养14天后具有至少63微米的厚度。
10.权利要求1或2的细胞-基质层，其中所述细胞外基质在所述培养条件下培养14天后每平方厘米包含至少329微克胶原。
11.权利要求1或2的细胞-基质层，其中所述细胞外基质在所述培养条件下培养21天后每平方厘米包含至少465微克胶原。
12.权利要求1或2的细胞-基质层，在所述细胞外基质层上还包含一层上皮细胞，以形成上皮细胞层。
13.权利要求11的细胞-基质层，其中所述上皮细胞选自角质细胞、角膜上皮细胞、口腔粘膜的上皮细胞、食道上皮细胞、和尿道上皮细胞。
14.权利要求12的细胞-基质层，其中所述上皮细胞是角质细胞，其形成多层、分层的已分化层，并表现为基底层、基底上层、立方上皮层和角质层；且，其中所述细胞-基质层和上皮细胞层之间有基底膜。
15.权利要求1或2的细胞-基质层，其中所述细胞外基质具有细至少30μM的厚度。
16.权利要求1或2的细胞-基质层，其中所述细胞外基质具有细至少120μM的厚度。
生物工程化的组织构建物、其制备方法及其应用
[0002] 本发明属于组织工程领域。本发明涉及诱导细胞体外产生细胞外基质的方法。这种有生命的细胞外基质具有类似于组织的特征，可用于检验或临床目的。
[0003] 发明背景
[0004] 组织工程领域将生物工程方法与生命科学的基本原理结合起来，以便了解正常及病理状态下的哺乳动物组织中结构与功能之间的关系。组织工程的目标是开发并最终应用生物代用品保存、维持或改进组织的功能。因此，通过组织工程有可能在实验室里设计并制造生物工程化的组织。生物工程化的组织可包括通常与天然哺乳动物或人类组织相关的细胞，以及合成的或外源的基质支架。新的生物工程化组织应当是移植至宿主后具有功能，而且可在该宿主体内持久掺入或由受体宿主患者的细胞不断进行生物再改造。不含支持组件或支架的组织等价体的制备为新型生物工程化组织的产生带来了科学挑战。
[0005] 发明简述
[0006] 本发明涉及生物工程化的组织构建物，其含有培养的细胞和无需外源性基质成分或网状系统支持物或支架组件便可内源产生的细胞外基质成分。因此，当本发明的生物工程化组织构建物是设计用于人类时，它可从人的细胞，以及由这些细胞产生的人的基质成分而完整产生。
[0008] 本发明还涉及另一种产生组织构建物的方法，其为刺激培养中的细胞，如成纤维细胞，以便在组成已知的培养基系统中和/或在没有使用不明确或非人类衍生的生物成分，如牛血清或有机提取物的情况下产生细胞外基质成分。
[0009] 该组织构建物的产生可以是，通过不同类型细胞的系列培养，导致产生与天然组织具有类似细胞组成和组织构建物的培养的组织构建物。
[0010] 培养的细胞无需加入支架支持物或外源性细胞外基质成分，就可以产生所述组织构建物。
[0011] 该组织构建物的强度特征使其便于操作，可以从产生它的培养仪器中轻易剥离，并在临床或检验中直接转移而无需任何支持物或载体。
[0013] 更具体地，本发明涉及：
[0014] 1.一种含成纤维细胞的培养的组织构建物，所述成纤维细胞在产生细胞外基质层的条件下生长，所述细胞外基质由培养的成纤维细胞合成并装配，培养的成纤维细胞包含在所述合成的细胞外基质层内，其中所述细胞外基质包括：
[0015] (i)纤丝胶原，其显示纤丝和纤丝束的紧密排列，为垂直交错的67nm带状；
[0016] (ii)decorin；和
[0017] (iii)糖胺聚糖；
[0018] 且其中所述细胞外基质由培养的成纤维细胞于培养条件下在缺乏外源基质成分或合成的成分时产生。
[0020] 3.项1的培养的组织构建物，其中所述培养的细胞为真皮成纤维细胞。
[0021] 4.项1的培养的组织构建物，其中所述培养的细胞来自毛囊的真皮乳头。
[0022] 5.项1的培养的组织构建物，其中所述层具有来自毛囊的真皮乳头的培养细胞，它们定位于该层。
[0023] 6.项1的培养的组织构建物，其中所述培养细胞在化学确定的培养基中培养。
[0024] 7.项1的培养的组织构建物，其中所述培养的细胞来自人的组织并在不含非人成分的培养基中培养。
[0025] 8.一种含培养的真皮成纤维细胞的培养的组织构建物，所述成纤维细胞在产生细胞外基质层的条件下生长，所述细胞外基质由培养的成纤维细胞合成并装配，所述培养的成纤维细胞包含在所述合成的细胞外基质层内，其中所述细胞外基质包括：
[0026] (i)纤丝状I型和II型胶原，其显示纤丝和纤丝束的紧密排列，为垂直交错的67nm带状；
[0027] (ii)decorin，
[0028] (iii)纤连蛋白，
[0029] (iv)腱生蛋白；和
[0030] (v)糖胺聚糖；
[0031] 且其中所述细胞外基质由培养的成纤维细胞于培养条件下在缺乏外源基质成分或合成的成分时产生。
[0032] 9.一种培养的组织构建物，其至少有2层，其包括：
[0033] (a)第一层培养的成纤维细胞，其在产生细胞外基质层的条件下生长，所述细胞外基质由培养的成纤维细胞合成并装配，所述培养的成纤维细胞包含在所述合成的细胞外基质层内，其中所述细胞外基质包括：
[0034] (i)纤丝胶原，其显示纤丝和纤丝束的紧密排列，为垂直交错的67nm带状；
[0035] (ii)decorin；和
[0036] (iii)糖胺聚糖；
[0037] 其中所述细胞外基质由培养的成纤维细胞于培养条件下在缺乏外源基质成分或合成的成分时产生；和
[0038] (b)第二层细胞，其含有处于所述第一层上的上皮细胞。
[0039] 10.项9的培养的双层组织构建物，其中所述上皮细胞选自角质细胞、角膜上皮细胞、口腔粘膜的上皮细胞、食道上皮细胞、和尿道上皮细胞。
[0040] 11.项9的培养的双层组织构建物，其中所述包含在该第一层中的成纤维细胞衍生自选自下组的组织：新生男婴包皮，真皮，腱，肺，软骨，尿道，角膜基质，口腔粘膜，和肠。
[0041] 12.项9的培养的双层组织构建物，其中所述包含在该第一层中的成纤维细胞为皮成纤维细胞。
[0042] 13.项12的培养的双层组织构建物，其中所述包含在该第一层中的成纤维细胞来自毛囊的真皮乳头。
[0043] 14.项9的培养的双层组织构建物，其中所述第一层具有来自毛囊真皮乳头的培养的细胞，它们定位于该第一层上。
[0044] 15.项9的培养的双层组织构建物，还包括位于所述第二层上皮细胞上的第三层细胞。
[0045] 16.一种培养的皮肤构建物，其至少有2层，其包含：
[0046] (a)第一层培养的真皮成纤维细胞，其在产生细胞外基质层的条件下生长，所述细胞外基质由所述培养的成纤维细胞合成并装配，所述培养的成纤维细胞包含在所述合成的细胞外基质层内，其中所述细胞外基质包括：
[0047] (i)I型和II型胶原，其显示纤丝和纤丝束的紧密排列，为垂直交错的67nm带状；
[0048] (ii)decorin，
[0049] (iii)纤连蛋白，
[0050] (iv)腱生蛋白；和
[0051] (v)糖胺聚糖；
[0052] 且其中所述细胞外基质由所述培养的真皮成纤维细胞于培养条件下在缺乏外源基质成分或合成的成分时产生；和
[0053] (b)第二层角质细胞，其位于第一层上，形成一个表皮细胞层，其中所述表皮细胞层为多层、分层的已分化层，并表现为基底层、基底上层、立方上皮层和角质层；
[0054] 且其中所述培养的双层皮肤构建物在该第一和第二层之间的连接处有一基底膜。
[0055] 17.项1，8，9，和16中任一项的构建物，其中所述培养的成纤维细胞受到遗传修饰以产生细胞外基质成分。
[0057] 19.一种产生培养的组织构建物的方法，其包括：
[0058] (a)在培养容器中的多孔膜上，于第一细胞培养基中接种能合成细胞外基质的成纤维细胞；
[0059] (b)于所述第一细胞培养基中培养步骤(a)的成纤维细胞，使所述多孔膜上的细胞融合达到约80％-约100％；
[0060] (c)在培养条件下刺激所述成纤维细胞在第二培养基中合成、分泌并排列细胞外基质成分；和
[0061] (d)继续培养这些成纤维细胞，直至这些细胞合成至少约30μM厚的细胞外基质层，所述培养的成纤维细胞包含在该合成的细胞外基质层中，其中所述细胞外基质层包括：
[0062] (i)纤丝胶原，其显示纤丝和纤丝束的紧密排列，为垂直交错的67nm带状；
[0063] (ii)decorin；和
[0064] (iii)糖胺聚糖；
[0065] 且其中所述细胞外基质由培养的成纤维细胞于培养条件下在缺乏外源基质成分或合成的成分时产生。
[0066] 20.项19的方法，其中所述第一培养基，或所述第二培养基为化学确定的培养基，或这两种培养基均为化学确定的培养基。
[0067] 21.项19的方法，其中所述第一和第二培养基不含非人的成分。
[0069] 23.项19的方法，其中所述成纤维细胞衍生自选自下组的组织：新生男婴包皮，脐带，真皮，腱，肺，尿道，角膜基质，口腔粘膜，和肠。
[0070] 24.一种产生培养的双层组织构建物的方法，其包括：
[0071] (a)在培养容器中的多孔膜上，于第一细胞培养基中接种能合成细胞外基质的成纤维细胞；
[0072] (b)于所述第一细胞培养基中培养步骤(a)的成纤维细胞，使所述多孔膜上的细胞融合达到约80％-约100％；
[0073] (c)在培养条件下刺激所述成纤维细胞在第二培养基中合成、分泌并排列细胞外基质成分；和
[0074] (d)继续培养这些成纤维细胞，直至这些细胞合成约30μM-约110μM厚的细胞外基质层，所述培养的成纤维细胞包含在该合成的细胞外基质层中，其中所述细胞外基质层包括：
[0075] (i)纤丝胶原，其显示纤丝和纤丝束的紧密排列，为垂直交错的67nm带状；
[0076] (ii)decorin；和
[0077] (iii)糖胺聚糖；
[0078] 且其中所述细胞外基质由培养的成纤维细胞于培养条件下在缺乏外源基质成分或合成的成分时产生；
[0079] (e)在步骤(d)的合成的细胞外基质之上表面接种上皮细胞，和
[0080] (f)在培养条件下刺激步骤(e)的上皮细胞，使之形成细胞外基质的双层组织构建物，其中所述培养的成纤维细胞包含在该合成的细胞外基质中，和第二层上皮细胞层。
[0081] 25.项24的方法，其中所述能合成细胞外基质的成纤维细胞衍生自选自下组的组织：新生男婴包皮，真皮，腱，肺，软骨，尿道，角膜基质，口腔粘膜，和肠。
[0082] 26.项24的方法，其中所述上皮细胞选自角质细胞、角膜上皮细胞、口腔粘膜的上皮细胞、食道上皮细胞、和尿道上皮细胞。
[0083] 27.一种产生培养的双层皮肤构建物的方法，所述构建物包含一个真皮层和一个表皮层，该表皮层在缺乏结构支持物或外源基质成分的情况下处在该真皮层上，其中该方法包括以下步骤：
[0084] (a)将成纤维细胞接种在培养容器中多孔膜上的化学确定的第一细胞培养基中，5 2 5 2
接种密度为约1×10 个细胞/cm-约6.6×10 个细胞/cm ；
接种密度为约1×10 个细胞/cm-约6.6×10 个细胞/cm ；
[0085] (b)于所述化学确定的第一培养基中培养步骤(a)的成纤维细胞至约80％-约100％的融合；
[0086] (c)通过在化学确定的第二培养基中培养步骤(a)的成纤维细胞，刺激它们合成、分泌并排列细胞外基质成分；
[0087] (d)继续培养所述成纤维细胞，直至这些细胞合成至少约30μM厚的细胞外基质层，所述培养的成纤维细胞包含在该合成的细胞外基质层中，其中所述细胞外基质包括：
[0088] (i)I型和II型胶原，其显示纤丝和纤丝束的紧密排列，为垂直交错的67nm带状；
[0089] (ii)decorin，
[0090] (iii)腱生蛋白；和
[0091] (iv)糖胺聚糖；
[0092] 且其中所述细胞外基质由培养的真皮成纤维细胞于培养条件下在缺乏外源基质成分或合成的成分时产生；
[0093] (e)于步骤(d)的合成的细胞外基质之上表面接种角质细胞，和
[0094] (f)在培养条件下培养这些角质细胞以形成表皮层，
[0095] 其中所述表皮细胞层为多层、分层的、已分化的角质细胞层，它表现为基底层、基底上层、立方上皮层和角质层；
[0096] 且其中所述培养的双层皮肤构建物在该第一和第二层之间的连接处有一基底膜。
[0097] 28.一种将培养的组织构建物移植或植入患者的方法，其包括将项1，8，9，或16中任一项的培养的组织构建物移植或植入需要相应治疗的患者。
[0098] 29.一种产生培养的组织构建物的方法，其包括
[0099] (a)在培养容器中的多孔膜上，于细胞培养基中接种能合成细胞外基质的成纤维细胞至约80％-约100％融合；
[0100] (b)在培养条件下刺激所述成纤维细胞在第二培养基中合成、分泌并排列细胞外基质成分；和
[0101] (c)继续培养所述成纤维细胞，直至这些细胞合成至少约30μM厚的细胞外基质层，所述培养的成纤维细胞包含在该合成的细胞外基质层中，其中所述细胞外基质包括：
[0102] (i)纤丝胶原，其显示纤丝和纤丝束的紧密排列，为垂直交错的67nm带状；
[0103] (ii)腱生蛋白；和
[0104] (iii)糖胺聚糖；
[0105] 其中所述细胞外基质由培养的成纤维细胞于培养条件下在缺乏外源基质成分或合成的成分时产生。
[0106] 30.项1-18中任一项的构建物，其中所述构建物能维持物理整体性以及类似于组织的手感特征。
[0109] 图2为显微照片(接物镜20×)，显示在化学确定型培养基中培养21天的人真皮成纤维细胞所形成的细胞-基质构建物经固定、石蜡包埋、苏木精和伊红染色后的切片。多孔膜呈现为所述构建物以下的薄层透明带。
[0110] 图3为透射电镜图，显示在化学确定型培养基中培养21天的人真皮成纤维细胞所形成的细胞-基质构建物在两种分辨率下的图像。图3A为7600×分辨率，显示内源基质，包括成纤维细胞之间的胶原纤丝的排列。图3B为19000×分辨率，显示完整形成的内源胶纤丝，其证实纤丝的排列和包裹。
[0111] 图4为显微照片(接物镜20×)，显示在化学确定型培养基中，在缺乏外源基质成分的情况下，形成的皮肤构建物经固定、石蜡包埋、苏木精和伊红染色后的切片，其中包含人真皮成纤维细胞在化学确定型培养基上所形成的细胞-基质构建物，以及由人的角质细胞在化学确定型培养基上形成的多层、已分化的表皮。
[0112] 发明详述
[0113] 现有人工活组织构建物并非完全由细胞组成，需另行加入或掺入外源基质成分或人工合成的结构和/或支持物。
[0114] 本文所述经生物工程技术产生的组织构建物显示其来源组织的很多天然特征。如此产生的组织构建物可用于向患者移植或体外检测。
[0115] 一个优选实施方案是一种细胞-基质构建物，其含有第一种细胞及内源产生的细胞外基质，其中所述第一种细胞能合成并分泌细胞外基质，从而产生所述细胞-基质构建物。
[0116] 另一优选实施方案是一种双层构建物，其包含第一种细胞，外源产生的细胞外基质，以及由所述第一种细胞形成于其上层或其内部的一层第二种细胞。
[0117] 一个更优选实施方案是一种细胞-基质构建物，其含有成纤维细胞(如衍生于真皮的那些)以形成人工培养型真皮构建物。
[0118] 另一更优选实施方案是一种细胞-基质构建物，其含有成纤维细胞(如衍生于真皮的那些)以形成人工培养型真皮构建物，其上层为一层培养的角化蛋白，用于形成表皮，从而最终形成人工培养型双层皮肤构建物。本发明的人工培养型皮肤构建物可表达天然皮肤的多种物理、形态、及生化特征。
[0119] 在一个还要更优选的实施方案中，所述细胞-基质构建物是一种组织构建物，它是类似于皮肤真皮层的人类真皮构建物，是在含有人源细胞、但未使用任何化学非确定成分的、成分确定的系统中经培养而形成的。
[0120] 在一个最优选实施方案中，本发明的组织构建物形成于一种化学确定型系统，该系统包含人源细胞，但不含化学非确定的或非人类生物学的成分或细胞。
[0121] 本发明一个优选实施方案包括由至少一种产细胞外基质的细胞和内源产生的细胞外基质成分(简称“基质”)所形成的结构层，其中所述基质完全由细胞经培养而合成并装配。该层在本文称为“细胞-基质构建物”或“细胞-基质层”，因为这些细胞可分泌基质并使它们自身包含在该基质中或穿过该基质。所述人工培养的组织构建物无需，因此也不包括，外源基质成分，即并非由培养细胞而是通过其它方式引入的基质成分。在一个更优选实施方案中，所述由人的真皮成纤维细胞产生的细胞-基质构建物具有类似于天然皮肤的胶原优势浓度。电镜检查表明，该基质本性为纤维状，其含有表现为垂直交错(quarter-staggered)的67nm带状形式的胶原，以及类似于天然胶原的纤丝构成和纤丝束。经延迟还原型SDS-PAGE检测出这些构建物中同时存在I型和III型胶原，这是天然人类皮肤中出现的占优势类型的胶原。用标准的免疫组化(IHC)技术，所述真皮细胞-基质构建物中的decorin(已知其为与胶原纤丝相关的硫酸皮肤素蛋白多糖，并被认为可体内调节纤丝直径)为阳性染色。在用TEM检查所述构建物时也可见到decorin。所产生的组织中腱生蛋白(在诸如间质或待修复的组织中发现的细胞外基质)也为阳性染色。与体内待修复的组织极其相似的是，培养中产生的组织在形成基质时其I型和III型胶原的比例增加。在不受任何理论限制的情况下，认为所述细胞很快与一种松散基质一起充斥于它们之间(该松散基质类似于粒状组织(granulation tissue)，主要包含III型胶原和纤连蛋白)，然后用主要含有I型胶原的较紧密基质重新改造上述松散基质。所产生的细胞-基质含有糖胺聚糖(GAG)，如透明质酸(HA)；纤连蛋白；除decorin以外的多糖蛋白如双糖和多功能蛋白聚糖；以及一组(a profile)硫酸糖胺聚糖如二-透明质酸；二-软骨素-0-硫酸；二-软骨素-4-硫酸；二-软骨素-6-硫酸；二-软骨素-4，6-硫酸；二-软骨素-4-硫酸-UA-2S；及二-软骨素-6-硫酸-UA-2S。这些结构和生化特征在培养形成构建物时表现出来，在构建物最终形成时变得明显，并各具特色。这些成分在已完全形成的培养型真皮细胞-基质构建物中的存在，表明所述构建物具有接近于正常真皮的结构和生化特征。
[0122] 上述所列是由真皮成纤维细胞形成的培养细胞-基质构建物的生化及结构特征，须知由其它类型成纤维细胞形成的培养型细胞-基质构建物可产生其来源组织类型的这些特征和其它表型特征。在某些例子中，可通过化学暴露或接触、物理压力、或通过转基因方式诱导成纤维细胞，使之表达非表型成分。本发明的另一优选实施方案是细胞-基质层，其上层有第二层细胞。在所述细胞-基质上培养所述第二层细胞，以形成一种生物工程化的双层组织构建物。在一个更优选实施方案中，所述第二层包含培养的人源角质细胞，其与第一层细胞-基质(由真皮成纤维细胞形成的细胞-基质构建物)以及内源基质一起形成一个包含活的皮肤构建物的真皮层。当彻底成形时，该表皮层为角质细胞的多层、分层的、良好分化层，其表现为基底层、基底上层、立方上皮层(granular layer)和角质层。该皮肤构建物在真皮-表皮连接处有发育良好的基底膜，如透射电镜(TEM)所示。该基底膜在半桥粒周围是最厚的，由包含VII型胶原的锚着纤丝包围，如TEM所示。可观察到该锚着纤丝始于基底膜，将胶原纤丝陷在真皮层中。这些锚着纤丝，以及其它基底膜成分均由角质细胞分泌。已知白色角质细胞能在它们的表面分泌基底膜，可识别的基底膜在缺乏成纤维细胞的情况下不能形成。对本发明皮肤构建物的免疫组化染色也显示存在层粘连蛋白，它是一种基底膜蛋白。
[0123] 本发明关于形成一种细胞-基质构建物的优选实施方案中，将第一种能产生细胞外基质的细胞接种于培养基质上，加以培养，并进行诱导以便合成和在它们周围分泌一种有序排列的细胞外基质，从而形成细胞-基质构建物。本发明另一实施方案中，在该细胞-基质构建物的一个表面上接种第二种细胞，进行培养以形成双层组织构建物。在一个更优选方法中，通过在足以诱导基质合成以便形成真皮细胞和基质的细胞-基质构建物的条件下，培养成纤维细胞，如人类真皮成纤维细胞，在真皮层上接种人类表皮细胞如角质细胞并在足以形成完全分化的分层的表皮层的条件下培养，最终可形成具有类似于天然人类皮肤的特征的完整厚度的皮肤构建物。
[0124] 因此，获得本发明组织构建物的一种方法包括：
[0125] (a)在缺乏外源基质成分或结构支持物的情况下，培养至少一种产细胞外基质的细胞；和
[0126] (b)刺激步骤(a)的细胞，使它们合成、分泌、和排列细胞外基质成分，从而形成一种组织构建物，该构建物包含上述细胞及其合成的基质；其中步骤(a)和(b)可以同时进行，也可以依次进行。
[0127] 为了形成双层组织构建物(其包含细胞-基质构建物和位于其上的第二细胞层)，所述方法还包括以下步骤：(c)在所形成的组织构建物上培养第二种细胞，以产生双层组织构建物。
[0128] 本发明所用的产细胞外基质的细胞可以是能产生并分泌细胞外基质成分，排列这些细胞外基质成分以形成细胞-基质构建物的任何细胞类型。可对不止一种的产细胞外基质细胞进行培养，以形成细胞-基质构建物。可对不同类型或组织来源的细胞进行混合培养以产生类似于天然组织中的互补成分和结构。例如，所述产细胞外基质的细胞类型可能有其它细胞类型参与其产生细胞外基质，这种产量并非上述第一种类型细胞的正常产量。或者，也可将所述产细胞外基质的细胞类型与其它细胞类型混合，所述其它类型的细胞来自所述组织中特化的组织结构，但基本不参与所述细胞-基质构建物中基质方面的整个形成，如在本发明的某些皮肤构建物中那样。
[0129] 根据本发明，任何产细胞外基质的细胞类型均可使用，但优选使用衍生于间质的细胞。更优选的细胞类型有成纤维细胞、基质细胞、和其它支持性结缔组织细胞，更优选发现于人的真皮的人真皮成纤维细胞，以便产生人的真皮构建物。通常，成纤维细胞产生多种细胞外基质蛋白，主要是胶原。由成纤维细胞产生的胶原有数种类型，但体内最常见的是I型胶原。人成纤维细胞株有多种来源，包括但不限于新生男性包皮、真皮、腱、肺、脐带、软骨、尿道、角膜基质、口腔粘膜、和肠。人的细胞可包括但不限于成纤维细胞，但可包括平滑肌细胞、软骨细胞和间质来源的其它结缔组织细胞。优选(但非必需)用于产生组织构建物的产基质细胞衍生自以下组织类型，即通过应用本发明的培养方法将被类似或模拟的组织类型。例如，在产生皮肤构建物的实施方案中，优选的产基质细胞为成纤维细胞，优选为真皮来源。在另一优选实施方案中，可使用由毛囊的真皮乳头经显微解剖分离的成纤维细胞来产生所述基质或与其它成纤维细胞相连。在产生角膜构建物的实施方案中，所述产基质细胞衍生自角膜基质。细胞供体可能在发育和年龄上有差异。细胞可衍生自胚胎、新生儿、或较年长个体包括成人的供体组织。胚胎始祖细胞如间质干细胞可用于本发明，并可通过诱导而分化发育为所需组织。
[0130] 虽然本发明优选使用人的细胞，但本发明方法所用的细胞不限于人源的。细胞可来自其它哺乳动物物种，包括但不限于马、犬、猪、牛、和绵羊；或啮齿类动物如小鼠或大鼠。此外，本发明的细胞均通过自发转染、化学转染、或病毒转染，或可使用重组细胞或遗传工程化细胞。对于那些掺入了不止一种细胞类型的实施方案而言，可使用两种或多种来源的正常细胞的嵌合混合物；正常细胞与遗传修饰的细胞或转染的细胞的混合物；或两个或多个物种或组织来源的细胞的混合物。
[0131] 重组细胞或遗传工程化细胞可用于所述细胞-基质构建物的产生，从而产生一种组织构建物，其可作为向患者运送药物的转移物发挥作用，其中所述患者需要增加天然细胞产物水平或需要药物治疗。所述细胞可产生并通过该转移物向患者运送重组细胞产物、生长因子、激素、肽或蛋白质，这种行为可以是连续的或发生在患者病情变化而发出了生物学、化学、或热学信号以示需要时。根据所培养的组织构建物的使用说明，可能需要基因产物的长期或短期表达。通过埋植培养型组织构建物而在较长时间段内向患者运送治疗性产物时，需要长期表达。相反，当转移培养型组织构建物旨在使该培养型组织构建物的细胞促进患者伤口恢复正常或接近正常或减小伤处的损伤时，需要短期表达。一旦伤处治愈，不再需要所述培养型组织构建物产生的基因产物或其在该部位的存在。也可对细胞进行遗传工程修饰，使其表达以下蛋白质或不同类型的细胞外基质成分，所述蛋白质或成分既可以是“正常”的但表达水平较高，也可以以某种方式被修饰而能产生包含细胞外基质及活细胞的转移装置，该装置对于促进伤口复原、促进或指导新血管形成、或减少疤痕或瘢痕瘤形成具有治疗作用。这些方法为领域内已知，见Sambrook等，分子克隆：实验室手册，冷泉港出版社，冷泉港，纽约(1989)，已引入作参考。上述所有类型的细胞均包括在本发明所用“产基质细胞”的定义内。
[0132] 成纤维细胞产生的最主要细胞外基质成分是纤丝胶原，尤其I型胶原。纤丝胶原是细胞-基质结构中的关键成分；但本发明并不限于仅包含这种蛋白或蛋白类型的基质。例如，通过使用适当的细胞类型可以产生其它胶原，它们可以是胶原家族的纤丝胶原或非纤丝胶原，如II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII、XIX型胶原。类似地，可用现有方法产生并保存的其它基质蛋白包括，但不限于，弹性蛋白；
多糖蛋白如decorin或双糖；或糖蛋白如腱生蛋白；玻连蛋白；纤连蛋白；层粘连蛋白，血小板反应蛋白I，及糖胺聚糖(GAG)如透明质酸(HA)。
多糖蛋白如decorin或双糖；或糖蛋白如腱生蛋白；玻连蛋白；纤连蛋白；层粘连蛋白，血小板反应蛋白I，及糖胺聚糖(GAG)如透明质酸(HA)。
[0133] 产基质细胞在适于动物细胞或组织培养的培养皿、烧瓶、或滚瓶(roller-bottle)等允许形成三维组织样结构的容器内培养。可用于所述细胞生长的适当细胞生长表面可以是能允许所述细胞粘附并为所述细胞-基质构建物的形成提供固定方式的任何生物学兼容性材料。玻璃；不锈钢；聚合物，包括聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚偏乙烯、聚二甲基硅氧烷、含氟聚合物、及氟化亚乙基丙烯；硅物质如熔凝硅石、聚硅、或硅晶等均可作为细胞生长表面使用。细胞生长表面材料可接受化学处理或修饰，或带电荷，或用生物材料如多聚-1-赖氨酸或多肽包被。肽包被的实例如RGD肽。
[0134] 本发明的组织构建物虽然可以生长在固相细胞生长表面，但优选带有孔的细胞生长表面，它可以联通这种膜的上表面和下表面，从而允许培养基与形成中的组织构建物的双向交流或仅与培养基以下部分进行接触。双向交流使培养基与形成中的构建物的顶部和底部均可以交流，从而有最大表面积与培养基所含营养物质接触。培养基也可以仅与形成中的组织构建物底部接触，而使上表面在形成皮肤构建物时暴露于空气。优选的培养容器是应用了隔膜插入件的容器，所述隔膜插入件是一种经培养处理的渗透膜如多孔膜，它悬浮于含有培养基的培养容器中。通常将此膜固定在某种管状膜或基架的一端，后者则插入底座并形成接触面，如有盖培养皿。插入了多孔隔膜插入件的培养容器为领域内已知，并被优选用于实施本发明，参见本领域的多个美国专利，其中部分已有商品，如：5766937，5466602，5366893，5358871，5215920，5026649，4871674，4608342，均引入本文参考。使用这些类型的容器时，组织构建物产生于所述膜的其中一个表面，优选上表面，细胞培养基可同时与上、下两个表面接触。生长表面上的孔可传送培养基，以便为穿膜培养物的下表面提供营养，从而使细胞接受双面营养或仅从下表面接受营养。优选孔的孔径小到不会让生长的细胞穿过此膜，但又大到足以使培养基所含营养物可自由地向该细胞-基质构建物的下表面传送，如通过毛细作用。优选的孔径大小约不到3μm，可使用约0.1-3μm，更优选约
0.2-1μm，最优选约0.4-0.6μm。在人类真皮成纤维细胞的例子中，最优选的材料是孔径为约0.4-0.6μm的聚碳酸酯。最大孔径不仅取决于细胞大小，还取决于细胞改变其形状并穿过该膜的能力。重要的是，该组织样构建物与所述表面粘附，但不掺入或包埋至所述材料，因此只需稍稍加力便可剥除。所形成的组织构建物的大小和形状受它生长于其上的容器表面或膜的大小的引导。所述材料可以是圆形、有角形、或带有圆形边角的形状、或不规则形状，也可以是平整的、或有一定轮廓的模具，以便形成一定形状的构建物而与伤口吻合或可模仿天然组织的物理结构。用于生长的材料表面积越大，就需要在该表面接种越多的细胞，并加入更大体积的培养基从而足以浸泡并滋养这些细胞。当组织构建物最终形成时，不管它是单层细胞-基质构建物还是双层构建物，均需在植入患者前从所述膜材料上剥离。
0.2-1μm，最优选约0.4-0.6μm。在人类真皮成纤维细胞的例子中，最优选的材料是孔径为约0.4-0.6μm的聚碳酸酯。最大孔径不仅取决于细胞大小，还取决于细胞改变其形状并穿过该膜的能力。重要的是，该组织样构建物与所述表面粘附，但不掺入或包埋至所述材料，因此只需稍稍加力便可剥除。所形成的组织构建物的大小和形状受它生长于其上的容器表面或膜的大小的引导。所述材料可以是圆形、有角形、或带有圆形边角的形状、或不规则形状，也可以是平整的、或有一定轮廓的模具，以便形成一定形状的构建物而与伤口吻合或可模仿天然组织的物理结构。用于生长的材料表面积越大，就需要在该表面接种越多的细胞，并加入更大体积的培养基从而足以浸泡并滋养这些细胞。当组织构建物最终形成时，不管它是单层细胞-基质构建物还是双层构建物，均需在植入患者前从所述膜材料上剥离。
[0135] 本发明的培养型组织构建物的形成并不依赖于合成的或生物可吸收的膜如网状膜。网状膜为机织物、手工编织物、或毛毡材料。在使用了网状膜的系统中，细胞在该网状膜上培养，可生长于其中任一面的网眼中，使该网状膜被包裹或掺入所述培养型组织构建物内。通过这些掺入网状膜的方法最终形成的构建物依赖于这些网状膜以获得物理支持并扩增。依赖合成的网状膜的培养型组织构建物可参见Naughton等人的美国专利5580781，5443950，5266480，5032508，4963489。
[0136] 产生细胞-基质层的系统可以是静态的，也可以是向培养基中灌注式的。静态系统中的培养基相对较平静，而灌注系统中的培养基是处于动态的。培养基的灌注影响细胞的活性并促进基质层的形成。灌注方式包括，但不限于：在培养皿下部或邻近含培养膜的隔膜材料处使用磁力棒或机动叶轮来搅拌培养基；在培养皿或室内抽吸培养基或使之流经培养皿或室；在振动或旋转平台上轻轻摇动培养皿；如果是形成于滚瓶，则滚动。本领域技术人员可确定能在本发明中使用的其它灌注方式。
[0137] 适用于本发明的培养基可根据待培养的细胞类型和待形成的组织结构来选择。促进细胞生长、基质合成、以及活力的培养基以及具体培养条件取决于培养细胞的类型。
[0138] 有时，如形成本发明生物工程化的双层皮肤构建物时，不同形成阶段培养基的组成不同以适应不同的添加需要。在一优选方法中，细胞-基质层在指定条件，即在化学确定的培养基中形成。在另一优选方法中，组织构建物含有细胞-基质层以及在其上生长的第二细胞层，其中这两种细胞均在指定的培养系统中培养。或者，该组织构建物含有在限定的培养条件下形成的细胞-基质层，和在非限定的培养条件下于该层上形成的第二层。反之，所述组织构建物含有可在非限定培养条件下形成的细胞-基质层，以及在限定的培养条件下形成于其上的第二层。
[0139] 优选使用化学确定的培养基，即不含成分不明的动物器官或组织提取物，如血液、垂体提取物、下丘脑提取物、胎盘提取物、或胚胎提取物或滋养细胞分泌的蛋白质和因子。在最优选实施方案中，所述培养基不含未确定的成分和确定的非人源生物成分。未确定的成分虽然不优选加入，但可根据已公开的方法在任何时间点向培养基中加入，以便成功地形成组织构建物。当利用在非人动物来源的化学确定的成分上培养后筛选出来的人类细胞实施本发明时，所得组织构建物是限定的组织构建物。可在化学确定的培养基中添加最优选的制备方法中所用的化学确定的人工合成型功能等价体。通常，本领域的细胞培养技术人员无需调查或实验就能确定向本发明培养基中添加的等价于公知动物成分的天然人类等价体、人的重组等价体、或人工合成的等价体。这种构建物在临床上的优势在于消除了偶然的动物或其它物种病毒的污染和感染。在检验环节中，化学确定的构建物的优势在于，进行检验时，所得结果不会由于未限定的成分的存在而被混淆。
[0140] 培养基由营养基质组成，通常还添加其它成分。技术人员可确定动物细胞领域的适当营养基质并有理由预期能成功地产生本发明的组织构建物。有很多商供营养源可有效实施本发明。这些包括提供无机盐、能源、氨基酸、以及B族维生素的商供营养源如Dulbecco’s改良型Eagle’s培养基(DMEM)；最小基本培养基(MEM)；M100；RPMI 1640；Iscove’s改良型Dulbecco’s培养基(EDMEM)。最小基本培养基(MEM)和M199需要额外加入磷脂前体和非必需氨基酸。商供的可提供额外氨基酸、核酸、酶之輔因子、磷脂前体、及无机盐的富含维生素之混合物包括Ham’s F-12，Ham’s F-10，NCTC 109，和NCTC 135。虽然在各种浓度下，所有基本培养基以葡萄糖、氨基酸、维生素、和无机离子，以及其它基本培养基成分的形式为细胞提供基本营养源。最优选的本发明基本培养基所含营养源为无钙或低钙的Dulbecco’s改良型Eagle’s培养基(DMEM)，或可任选的，DMEM加Ham’s F-12(比例在3∶1至1∶3之间)。
[0141] 在所述基本培养基中添加氨基酸、生长因子、和激素等成分。培养本发明细胞的确定型培养基见Parenteau的美国专利5712163，和PCT国际公开号WO 95/31473，该文本已引入本文作参考。其它培养基为领域内已知，如Ham& McKeehan，酶学方法，58：44-93(1979)所述的那些，或Bottenstein等，酶学方法，58：94-109(1979)中的其它合适的化学确定型培养基。在优选的实施方案中，向基本培养基中添加本领域技术人员已知用于动物细胞培养的以下成分：胰岛素、运铁蛋白、三碘甲状腺原氨酸(T3)、乙醇胺与对磷酰基乙醇胺之一或全部，其中这些添加物的浓度和替换由技术人员确定。
[0142] 胰岛素是促进对葡萄糖和氨基酸的摄取，从而在数代内提供长期效益的一种多肽激素。长期培养中由于细胞摄取葡萄糖和氨基酸的能力逐渐损耗，且细胞表型可能退化，故必需添加胰岛素或胰岛素样生长因子(IGF)。胰岛素可离子动物如牛，人类，或经重组产生如人型重组胰岛素。因此，人型胰岛素将被定性为并非来自非人生物来源的化学确定型成分。进行系列培养时优选添加胰岛素，加至培养基的浓度变化范围较大。优选范围为约0.1μg/ml-约500μg/ml，更优选约5μg/ml-约400μg/ml，最优选约375μg/ml。添加胰岛素样生长因子(如IGF-1或IGF-2)的适当浓度可由本领域技术人员根据所培养的细胞类型很轻易地确定。
[0143] 运铁蛋白在培养基中可调节铁的转运。铁是发现于血清中的必需的痕量元素。游离铁对细胞有毒性，因此，在血清中铁是以结合于运铁蛋白的形式供给细胞，其浓度范围优选约0.05-约50μg/ml，更优选约5μg/ml。
[0144] 三碘甲状腺原氨酸(T3)是一种基本成分，是甲状腺激素的活性形式，在培养基中可以维持细胞代谢的速率。培养基中所加的三碘甲状腺原氨酸的浓度范围为约0-约400ρM，更优选约2-约200ρM，最优选约20ρM。
[0145] 乙醇胺和对磷酰基乙醇胺均为磷脂，它们中的任一个或全部是肌醇途径中以及脂肪酸代谢的重要前体。在无血清培养基中必需添加通常发现于血清中的脂类。培养基中所-6 -2 -4加乙醇胺和对磷酰基乙醇胺的浓度范围为约10 -10 M，更优选约1×10 M。
[0146] 在整个培养期间，该基本培养基还将额外添加其它成分如氢化可的松、硒、和L-谷氨酰胺，以诱导合成或分化或改善细胞的生长。
[0147] 已知氢化可的松可在角质细胞培养中促进角质细胞的表型形成并因此强化分化特征如外皮蛋白(involucrin)和角质细胞转氨酶的含量(Rubin等，细胞生理学杂志，138：208-214(1986))。因此，当这些特征有利于诸如形成角质细胞片层转移物或皮肤构建物时，氢化可的松是优选的添加剂。氢化可的松的所用浓度为约0.01μg/ml-约4.0μg/ml，最优选约0.4μg/ml-16μg/ml。
[0148] 可在无血清培养基中添加硒以取代通常由血清提供的痕量元素硒。所添加的硒的-9 -7 -8浓度范围为约10 -10 M，最优选约5.3×10 M。
[0149] L-谷氨酰胺存在于某些营养基质中，当缺乏或其量不足时可以添加。也可提供稳TM TM定形式的L-谷氨酰胺，如GlutaMAX-1 (Gibco BRL，Grand Island，NY)。GlutaMAX-1 是L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定二肽形式，可与L-谷氨酰胺互换使用，添加时所用浓度等同于L-谷氨酰胺的。这种二肽可使L-谷氨酰胺在长期保存以及保温期间不被降解，从而避免了培养基中L-谷氨酰胺有效浓度的不确定性。通常，基本培养基中优选加入L-谷氨酰TM
胺或GlutaMAX-1 约1mM-约6mM，更优选约2mM-约5mM，最优选4mM。
胺或GlutaMAX-1 约1mM-约6mM，更优选约2mM-约5mM，最优选4mM。
[0150] 培养基中还可加入生长因子如表皮生长因子(EGF)，以帮助在细胞按比例增加以及接种期间形成培养物。EGF的天然形式或重组形式均可使用。当形成不含非人生物成分的皮肤替代物时，优选使用天然或重组的人型EGF。EGF是任选添加的成分，添加浓度为约1-15ng/ml，更优选约5-10ng/ml。
[0151] 上述培养基通常如下制备。但应理解本发明的成分可用与它们的生理特征相容的常规方法制备并组装。领域内众所周知，基于适用性或经济的考虑，特定成分可用相应类似物或功能等价的活性试剂取代，并获得相似的结果。天然生长因子可用具有相似特性并可在实施本发明时获得相似结果的重组的或人工合成的生长因子取代。
[0152] 本发明的培养基均为无菌。无菌成分用常规方法除菌，如制备完成后过滤除菌。正确的无菌操作在以下实施例的全程中使用。首先混合DMEM和F-12，然后加入单个成分以组成完整培养基。所有成分的原液贮存于-20℃，但营养源应贮存于4℃。所有原液的终浓度为上述所列的500×。胰岛素、运铁蛋白、和三碘甲状腺原氨酸(均来自Sigma)的原液均如下制备：三碘甲状腺原氨酸先溶于2∶1的无水乙醇与1N盐酸(HCl)中。胰岛素溶于稀盐酸(约0.1N)，运铁蛋白溶于水。然后将这三者混合，用水稀释至500×并过滤除菌。黄体酮溶于无水乙醇并用水稀释。氢化可的松溶于无水乙醇并用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释。硒溶于水至500×的浓度并过滤除菌。EGF为无菌商品，将其溶于PBS。腺嘌呤难以溶解，但可用本领域技术人员已知的任何多种方法溶解。血清白蛋白可加入特定成分中以便使它们在溶液中稳定，现有的血清白蛋白来自人类或动物。例如，人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)加入后可延长保存时间，从而维持黄体酮和EGF原液的活性。培养基可在制备好后马上投入使用，也可贮存于4℃。如果是贮存，先不加EGF，使用前再加。
[0153] 为了通过产基质细胞的培养形成细胞-基质层，所述培养基中还添加了能促进细胞合成基质并贮存基质的试剂。正向添加剂均与细胞相容、成分明确、纯度很高，且无污染。用于产生所述细胞-基质层的培养基称为“产基质培养基”。
[0154] 为了制备产基质培养基，在基本培养基中添加一种抗坏血酸衍生物，如抗坏血酸钠、抗坏血酸、或其化学更稳定的衍生物之一如L-抗坏血酸磷酸酶盐的n水合物。加入抗坏血酸可以促进脯氨酸的羟化和溶胶原(所贮存的胶原分子的可溶性前体)的分泌。已知抗坏血酸是其它酶的翻译后加工的重要辅因子以及I型和II型胶原合成的调节因子。
[0155] 在不限于任何理论的前提下，在培养基中加入参与蛋白质合成的氨基酸可保存细胞的能量，因为这些细胞不必再产生这些氨基酸。优选加入脯氨酸和甘氨酸，因为它们，以及脯氨酸的羟化形式羟脯氨酸都是组成胶原的结构的基本氨基酸。
[0156] 所述产基质培养基还可任选(非必需)加入一种中性聚合物。本发明的细胞-基质构建物可在无中性聚合物的情况下生成，但同样不限于任何理论，培养基中中性聚合物的存在使胶原的加工和保存在不同样品之间更趋于一致。一种优选的中性聚合物是聚乙二醇(PEG)，它可促进培养细胞产生的溶胶原可溶性前体体外加工成基质中储存的胶原。本发明的培养基中优选加入分子量约1000-4000MW的组织培养级PEG，更优选约3400-约
3700MW。所述方法中使用的PEG浓度优选约5％w/v或更少，还优选约0.01％w/v-约0.5％w/v，更优选约0.025％w/v-约0.2％w/v，最优选约0.05％w/v。其它培养级中性聚合物如葡聚糖，优选葡聚糖T-40，或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，优选范围为30,000-40,000MW，使用浓度也可优选为约5％w/v或更少，还优选约0.01％w/v-约0.5％w/v，更优选约0.025％w/v-约0.2％w/v，最优选约0.05％w/v。其它细胞培养级以及有利于胶原加工和储存的与细胞相容的试剂可由技术人员在哺乳动物细胞培养领域内确定。
3700MW。所述方法中使用的PEG浓度优选约5％w/v或更少，还优选约0.01％w/v-约0.5％w/v，更优选约0.025％w/v-约0.2％w/v，最优选约0.05％w/v。其它培养级中性聚合物如葡聚糖，优选葡聚糖T-40，或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，优选范围为30,000-40,000MW，使用浓度也可优选为约5％w/v或更少，还优选约0.01％w/v-约0.5％w/v，更优选约0.025％w/v-约0.2％w/v，最优选约0.05％w/v。其它细胞培养级以及有利于胶原加工和储存的与细胞相容的试剂可由技术人员在哺乳动物细胞培养领域内确定。
[0157] 当细胞发生融合、而培养基中也添加了有助于基质的合成、分泌或排列的成分时，称这些细胞受到刺激，将形成含有细胞及细胞所合成基质的组织构建物。
[0158] 因此，优选的产基质培养基配方是：Dulbecco’s改良型Eagle’s培养基(DMEM)(高葡萄糖配方，无L-谷氨酰胺)与Hams F-12(添加有4mM L-谷氨酰胺或等价物)的-43∶1混合物，5ng/ml表皮生长因子，0.4μg/ml氢化可的松，1×10 M邻磷酰基乙醇胺，
5μg/ml胰岛素，5μg/ml运铁蛋白，20ρM三碘甲状腺原氨酸，6.78ng/ml硒，50ng/ml L-抗坏血酸，0.2μg/ml L-脯氨酸，和0.1μg/ml甘氨酸。可在所述产基质培养基中加入其它药理试剂，以改变所分泌的细胞外基质的特点、量、或类型。这些试剂可包括多肽生长因子，转录因子或无机盐以上调胶原的转录。多肽生长因子有转化生长因子-β1(TGF-β1)和组织-纤溶酶原激活剂(TPA)，已知它们均可上调胶原合成。Raghow等，临床研究杂志，79：
1285-1288(1987)；Pardes等，皮肤病学研究杂志，100：549(1993)。刺激胶原产生的无机盐有铈。Shivakumar等，分子和细胞心脏病学杂志，24：775-780(1992)。
5μg/ml胰岛素，5μg/ml运铁蛋白，20ρM三碘甲状腺原氨酸，6.78ng/ml硒，50ng/ml L-抗坏血酸，0.2μg/ml L-脯氨酸，和0.1μg/ml甘氨酸。可在所述产基质培养基中加入其它药理试剂，以改变所分泌的细胞外基质的特点、量、或类型。这些试剂可包括多肽生长因子，转录因子或无机盐以上调胶原的转录。多肽生长因子有转化生长因子-β1(TGF-β1)和组织-纤溶酶原激活剂(TPA)，已知它们均可上调胶原合成。Raghow等，临床研究杂志，79：
1285-1288(1987)；Pardes等，皮肤病学研究杂志，100：549(1993)。刺激胶原产生的无机盐有铈。Shivakumar等，分子和细胞心脏病学杂志，24：775-780(1992)。
[0159] 将培养物维持在温箱中以确保控制温度、湿度、气体混合物条件，使之有利于细胞生长。优选的条件是约34℃-约38℃，更优选37±1℃，气体环境为约5-10±1％CO2，相对湿度(Rh)约80-90％。
[0160] 在优选的实施方案中，所述细胞-基质构建物是由真皮成纤维细胞及它们分泌的基质形成的真皮构建物。优选使用人的真皮成纤维细胞，它们来源于真皮原代细胞或更优选其来自已检查了病毒和细菌污染并检测了纯度的现有细胞原种或细胞库的连续传代培养物。在培养基上用适当条件培养细胞，使之生长至适当数量，该数量接种至培养基质后足以形成细胞-基质构建物。或者，可将冻存的细胞直接培养在所述培养基质上。
[0161] 一旦获得了足够的细胞量，即可收获细胞并接种于适当的培养表面，使之在适当的培养条件下生长，从而形成细胞融合层。在优选的实施方案中，将细胞接种在多孔膜上，这种膜通过浸没使培养层之下的培养基通过膜上的孔直接与上层的细胞接触。优选，5 2
将细胞悬浮于基座或培养基中，并接种在细胞培养表面，密度为约1×10 个细胞/cm-约
5 2 5 2 5 2
6.6×10 个细胞/cm，优选约3×10 个细胞/cm-约6.6×10 个细胞/cm，最优选约
5 2
6.6×10 个细胞/cm(每平方厘米的表面的细胞数)。通过在培养基中生长形成培养物，当培养至约80％至100％融合时，将培养基换成产基质的培养基，从而对细胞进行化学诱导，以上调细胞外基质的合成和分泌。在另一方法中，细胞直接接种在产基质的培养基中，这样可不必将基本培养基替换成产基质培养基，但这种方法要求较高的接种密度。
将细胞悬浮于基座或培养基中，并接种在细胞培养表面，密度为约1×10 个细胞/cm-约
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6.6×10 个细胞/cm，优选约3×10 个细胞/cm-约6.6×10 个细胞/cm，最优选约
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6.6×10 个细胞/cm(每平方厘米的表面的细胞数)。通过在培养基中生长形成培养物，当培养至约80％至100％融合时，将培养基换成产基质的培养基，从而对细胞进行化学诱导，以上调细胞外基质的合成和分泌。在另一方法中，细胞直接接种在产基质的培养基中，这样可不必将基本培养基替换成产基质培养基，但这种方法要求较高的接种密度。
[0162] 在培养期间，成纤维细胞将所分泌的分子排列成三维组织样结构，但它们不表现显著的收缩力，因而不导致所形成的细胞-基质构建物与所述培养基质接触并从培养基质上剥离。每两到三天用新鲜的产基质培养基替换原有培养基，逐渐地，所分泌的基质厚度增加，排列更有序。生成细胞-基质构建物所需时间取决于原始接种密度、细胞类型、细胞系的年龄、细胞系合成并分泌基质的能力。本发明的构建物完全形成时，由于细胞产生并排列的纤维状基质而使所述构建物具有相当的厚度；它们并非通常的细胞融合或层叠的融合细胞培养物，这些培养物中细胞松散地相互粘附。纤维状特性使所述构建物具有不同于普通培养物的组织样特点，它们在临床常规操作中更能抵抗物理损伤，如撕裂或爆裂。在培养型真皮构建物的形成过程中，细胞将在细胞培养表面上沿它们自身的周围排列，优选厚度至少约30μm，更优选跨膜表面的约60-120μm厚，但已获得了超过120μm的厚度，其适用于需此厚度的检测或临床应用。
[0163] 在一更优选的方法中，在一个表面上应用一个上皮层，优选为上表面，向上直面所述细胞-基质构建物。可在该细胞-基质构建物上接种并培养上皮细胞，从而形成一种多层组织构建物。在最优选的方法中，于所述细胞构建物上培养来自皮肤的角质细胞，以形成皮肤构建物。在另一优选实施方案中，可在所述细胞-基质构建物上接种角膜上皮细胞，也称为角膜角质细胞，从而形成角膜构建物。可在所述细胞-基质上接种来自口腔粘膜的上皮细胞以形成口腔粘膜的构建物。将来自食道的上皮细胞接种在所述细胞-基质构建物上可形成食道组织的构建物。来自泌尿生殖道的尿道上皮细胞接种在所述细胞-基质构建物上可形成尿道上皮的构建物。可选择上皮来源的其它细胞用于形成产生这些细胞的组织的构建物。
[0164] 向真皮基质提供上皮细胞的方法，它们的培养方法，包括诱导分化和角质化以形成分化的角质细胞层的方法均为领域内已知，见Parenteau等人的美国专利5712613，Kemp等人的美国专利5536656(均全文引入作参考)。通常将角质细胞接种在细胞-基质构建物上，培养至1-3层细胞层厚，从而使该细胞-基质构建物表皮化。然后诱导角质细胞分化以形成一种多层表皮，然后诱导角质化以形成角质层。
[0165] 在形成分化的表皮层的方法中，自细胞原种中取角质细胞继续培养，使其细胞数增加。获得所需细胞数后，将它们从培养基质中分离出来，悬浮、计数、稀释、然后接种在所3 2 5 2
述细胞-基质构建物的上表面，接种密度约4.5×10 细胞/cm-约5.0×10 细胞/cm，更
4 2 5 2 4 2
优选约1.0×10 细胞/cm-约1.0×10 细胞/cm，最优选约4.5×10 细胞/cm。然后将构建物于37±1℃、10％CO2下培养约60-90分钟，使角质细胞相互接触。然后将这些构建物浸没在表皮化培养基中。培养足够长的时间后，这些角质细胞增殖并向周围扩展形成横跨所述细胞-基质构建物的融合单层。一旦融合，就将细胞培养基换成分化培养基以诱导细胞分化。形成多层上皮后，使用角质化培养基，并将培养物置于气-液界面。使这些细胞暴露于干燥或低湿度的气-液界面以便角质细胞的分化和角质化。干燥或低湿度的气-液界面的特征是，努力达到皮肤之低湿度水平的两倍。逐渐地，角质细胞表达大多数或全部角蛋白及其它可见于天然皮肤暴露在这些条件下出现的特征。
述细胞-基质构建物的上表面，接种密度约4.5×10 细胞/cm-约5.0×10 细胞/cm，更
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优选约1.0×10 细胞/cm-约1.0×10 细胞/cm，最优选约4.5×10 细胞/cm。然后将构建物于37±1℃、10％CO2下培养约60-90分钟，使角质细胞相互接触。然后将这些构建物浸没在表皮化培养基中。培养足够长的时间后，这些角质细胞增殖并向周围扩展形成横跨所述细胞-基质构建物的融合单层。一旦融合，就将细胞培养基换成分化培养基以诱导细胞分化。形成多层上皮后，使用角质化培养基，并将培养物置于气-液界面。使这些细胞暴露于干燥或低湿度的气-液界面以便角质细胞的分化和角质化。干燥或低湿度的气-液界面的特征是，努力达到皮肤之低湿度水平的两倍。逐渐地，角质细胞表达大多数或全部角蛋白及其它可见于天然皮肤暴露在这些条件下出现的特征。
[0166] 如上述，产生细胞-基质构建物的方法可用于形成角膜构建物。所述角膜上皮细胞可来自各种哺乳动物。优选的上皮细胞为兔或人的角膜上皮细胞(角膜角质细胞)，但任何哺乳动物角膜角质细胞均可使用。也可用诸如来自巩膜(眼部外层白色不透明部分)或真皮的上皮角质细胞，但优选角膜的角质细胞。在形成角膜构建物的方法中，将插入的培养物(含有细胞-基质构建物)和其周围部分除去。正常的兔角膜上皮细胞通过连续培养而扩增，胰蛋白酶消化使它们与所述培养基质分离，将它们悬浮于培养基中，然后接种在所述4 2 5 2
膜的上表面，接种密度约7.2×10 细胞/cm-约1.4×10 细胞/cm。然后将这些构建物在无培养基的条件下37±1℃、10％CO2中培养至这些上皮细胞粘附。之后，将这些构建物浸没在角膜维持培养基(CMM)(Johnson等，1992)中。使上皮细胞培养至所述细胞-基质构建物被这些上皮细胞覆盖。上皮的彻底覆盖可用各种方法测知，如用硫酸尼罗兰溶液(磷酸盐缓冲液中1∶10,000稀释)对培养物进行染色。一旦覆盖了所述细胞-基质构建物，约
7天后，将这些构建物无菌转移至含有充足的角膜维持培养基(CMM)的新培养皿中，使所述构建物的表面形成流体，从而无需浸没上皮层就可维持潮湿界面。所述构建物在37±1℃、
10％CO2和60％以上的湿度下，用CMM培养，必要时更换培养基，通常每周三次。
膜的上表面，接种密度约7.2×10 细胞/cm-约1.4×10 细胞/cm。然后将这些构建物在无培养基的条件下37±1℃、10％CO2中培养至这些上皮细胞粘附。之后，将这些构建物浸没在角膜维持培养基(CMM)(Johnson等，1992)中。使上皮细胞培养至所述细胞-基质构建物被这些上皮细胞覆盖。上皮的彻底覆盖可用各种方法测知，如用硫酸尼罗兰溶液(磷酸盐缓冲液中1∶10,000稀释)对培养物进行染色。一旦覆盖了所述细胞-基质构建物，约
7天后，将这些构建物无菌转移至含有充足的角膜维持培养基(CMM)的新培养皿中，使所述构建物的表面形成流体，从而无需浸没上皮层就可维持潮湿界面。所述构建物在37±1℃、
10％CO2和60％以上的湿度下，用CMM培养，必要时更换培养基，通常每周三次。
[0167] 产生角膜构建物时需要使上皮细胞分化，但不角质化，为此使上皮细胞表面暴露于潮湿的气-液界面。提供气-液界面的方法见Parenteau的美国专利5374515。如本文所用，“潮湿界面”指一种培养环境，其经过调节可以使构建物的表面潮湿，具有较高湿度，但不干也不浸没。对培养环境中潮湿的确切水平并无苛求，但其应足以避免形成角质化细胞。潮湿界面的特征可以是使人的眼睛的类似潮湿水平加倍。
[0168] 在另一优选实施方案中，可在第一细胞-基质构建物之上接种第二种产基质细胞，以获得一种更厚的细胞-基质构建物或一种双层细胞-基质构建物。第二次接种可使用相同类型的细胞或菌株或使用不同类型的细胞或菌株，这取决于所要达到的结果。第二次接种使用产生第一层所用的方法和产基质培养基以相同条件进行。用不同类型的细胞实施第二次接种的一个结果是形成具有不同基质成分之特征或基质包装密度的基质，该构建物移植至患者后可以影响伤口的恢复。第一次的细胞接种产生类似于真皮网状层的基质，这是I型胶原和组成型细胞外基质成分的更致密包装层。第二次细胞接种产生类似于真皮乳头层的基质，其特征为更松散的胶纤丝和细胞外基质。另一结果是所述第二层细胞可产生一种有治疗价值的物质，其也可以影响伤口复原，如改善对移植物的吸收，促进移植物整合，使形成的疤痕最小或阻止其形成。
[0169] 在另一优选实施方案中，两种或更多种细胞的混合群体可以在形成细胞-基质构建物期间一起培养，只要所用的细胞至少有一种能合成细胞外基质。所述第二种细胞可以发挥所需的另一种组织功能或形成该组织构建物的特有结构特征。例如，在产生皮肤构建物时，来自附件的真皮乳头细胞或上皮细胞可与产基质细胞一起培养，从而形成上皮附件或它们的成分。表皮附件如汗腺或皮脂腺结构或成分或毛囊结构或成分可以在与产基质细胞一起培养的时侯形成。上皮细胞可以衍生自深部真皮中腺体和毛发的附件结构，如通过显微解剖，它们包括外分泌细胞、肌上皮细胞、腺体分泌细胞、毛囊干细胞。也可加入皮肤中常见的组成皮肤的其它类型细胞如黑色素细胞、郎罕细胞、和Merkel细胞。类似地，血管内皮细胞也可实施共培养以产生可用于新血管形成的基本成分。脂肪细胞也可以与产基质细胞一起培养以形成用于再造手术的构建物。运送这第二种细胞的另一方式是，将细胞点种或多点排列式接种于正在形成或已彻底形成的用于定位形成所述结果的细胞-基质构建物上或其中。可以将细胞注射至上表面和下表面之间，所述细胞-基质内，以便于细胞生长，形成特定结构并发挥它们的特殊功能。
[0170] 为了产生第三层组织构建物，将含有产基质细胞或非产基质型细胞的第一次接种物接种于所述培养基质上，培养至形成细胞-基质构建物或细胞层。一旦形成第一细胞-基质构建物或细胞层，将含有产基质细胞的第二细胞接种物接种在第一细胞-基质构建物或细胞层的上表面，培养直至在该第一构建物上形成第二细胞-基质构建物。在该第二细胞-基质构建物上接种第三种细胞，培养至形成第三层。例如，为产生一种三层角膜构建物，第一细胞层可能由内皮来源的细胞如角膜内皮细胞构成；第二细胞层可能由结缔组织来源的细胞如角膜角质细胞组成；第三细胞层可能由上皮来源的细胞如角膜上皮细胞组成。另一种三层式皮肤构建物如第一次接种的细胞为血管来源以提供用于血管形成的成分；第二次接种的细胞可能含有真皮成纤维细胞以形成细胞-基质构建物来作为真皮构建物，第三次接种的细胞可以是表皮角质细胞以形成表皮层。
[0171] 本发明的组织构建物可使用透明(vitrification)技术或低温贮藏方法保存在低温下。使组织构建物透明的方法如美国专利5518878所述，低温贮藏的方法如美国专利5689961和5891617以及国际PCT申请WO96/24018所述，它们均全文引入作参考。
[0172] 本发明的皮肤构建物可在体外毒理学检验的组织检测系统中使用。为检验的目的加入了皮肤构建物的检测系统如美国专利4835102所述，其已引入本文作参考。由于这种产生细胞的皮肤构建物具有类似于皮肤的结构，更重要的是具有类似的构成，它可以作为活的人或动物体检验的另一种或取而代之的检测系统，用于检验产物的吸收作用，毒力，以及大多数情况下产物的有效性。所述基质的形成已显示可模拟体内基质产生以及基质修复的多个过程。因此，所述系统可以成为分析创伤恢复和组织再生，以及检测和分析创伤修复的化学和/或物理次级的良好工具。
[0173] 本发明皮肤构建物的最优选应用是移植或植入哺乳动物宿主中以修复皮肤因受伤或疾病造成的损伤。移植皮肤构建物的指标包括但不限于整形手术、皮肤创伤、烧伤、牛皮癣、静脉和糖尿病性溃疡、及基底细胞癌。本发明的皮肤构建物可有效用于保护受伤的组织，然后作为宿主组织向内生长的支架。据信本发明中产生的组织构架也可以简化并很可能加速创伤修复作用。
[0174] 本发明的细胞-基质构建物具有共聚特征。“共聚”在本文指能维持物理整体性以及类似于组织的手感特征。主要产生本发明构建物之共聚特征的物理特性是厚度和纤维状基质结构。所述纤维状细胞外基质形成于细胞所合成的胶原以及其它基质成分，主要为纤丝中排列的纤维状胶原和纤维束，它们使这些构建物具有一定体积。本发明的细胞-基质构建物均可用手操作，即，可以用手使它们与它们的培养基质脱离，无需载体支持物或特殊工具，然后可以应用于患者或检测仪器。它可抵抗诸如撕裂或爆裂等常规临床操作中的伤害，而不会损伤其结构或功能。当应用于患者时，可通过缝线或钉(staple)将它们固定。
[0175] 为了将本发明的皮肤构建物移植至患者，可根据常规操作准备该移植区域。对于烧伤指征而言，待移植的烧伤部位经处理应使烧伤皮肤区彻底切除。切除后暴露的部分在移植前应是清洁的且无临床感染。对于因手术切除造成的深部伤口而言，需在操作前刮毛，必要时用抗微生物的皮肤消毒剂进行清洁并用生理盐水冲洗。局部麻醉通常包括皮内给予利多卡因和/或肾上腺素。一旦完成麻醉，即用植皮刀除去皮肤至一适当深度，造成一个深部伤口。可通过压入含有利多卡因的肾上腺素及通过电烙术止血。然后在这一伤口床上施用皮肤构建物，必要时用缝线和钉固定，然后用适当的敷料定位并包扎。
[0176] 本发明的皮肤构建物还可在移植给患者之前形成网状。网状化使皮肤构建物与伤口床更好地吻合，并使伤口渗出物可以从移植物下面通过该网状排出。术语“网状化”指一种机械方法，其使组织上产生孔隙，从而形成网状排列。网状化优选使用常规皮肤网获得。也可用解剖刀或针在组织上手动打孔。网状化的皮肤可通过将皮肤拉伸而使其扩展，从而使孔隙打开，然后可施用于伤口床。扩展的网状组织可对伤口区实施最大范围的覆盖。或者，可以不扩展而直接以具有未扩展之孔阵的片状物形式应用网状组织。网状化的皮肤构建物可单独施用，也可与来自患者机体其它部位的自体皮肤一起施用。组织构建物也可带有洞或穿孔以及以其它方式产生的孔。穿孔可以使用激光、拳击(punch)、解剖刀、针或大头针经手动应用。
[0177] 本发明的皮肤构建物可以应用于除外科手术伤口以外的创伤或烧伤区域。应用此次公开的皮肤构建物可以对其他创伤例如静脉性溃疡，糖尿病性溃疡，褥疮等起到治疗效应。对其他先天性皮肤疾病如大疱性表皮松解也可能有益处。
[0179] 实施例1：利用人新生期包皮成纤维细胞形成胶原基质
[0180] 人新生期包皮成纤维细胞(来自Organognesis，Inc.Canton，MA)以5×105个细2
胞/162cm 接种于组织培养处理瓶(Costar Corp.，剑桥，MA，批号3150)并在生长培养基上生长。生长培养基的组成为：Dulbecco’s改良型Eagle’s培养基(DMEM)(高糖型，无L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)加有10％新生小牛血清(NBCS)(HyClone实验室，Inc.，Logan，Utah)和4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)。将细胞置于培养箱于37±1℃，10±1％CO2中维持。每2-3天将培养基更换成新鲜培养基。培养8天后，细胞长至融合，即细胞沿组织培养瓶的底部形成紧密的单细胞层，从培养瓶中将培养基吸出。将经无菌过滤的磷酸盐缓冲液加到每个培养瓶的底部以冲洗单细胞层，然后从瓶中吸出。向每个瓶中加入5ml胰蛋白酶-维尔烯谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)并轻轻摇动以确保完全覆盖单细胞层，使细胞从瓶上消化下来。将培养物放回培养箱。
一旦细胞被消化下来立即向每个瓶中加入5ml SBTI(大豆胰蛋白酶抑制剂)并与悬浮液混合使胰蛋白酶-维尔烯的作用终止。将细胞混悬液从瓶中移出并均分入无菌圆锥形离心管中。于大约800-1000g离心5分钟收集细胞。
胞/162cm 接种于组织培养处理瓶(Costar Corp.，剑桥，MA，批号3150)并在生长培养基上生长。生长培养基的组成为：Dulbecco’s改良型Eagle’s培养基(DMEM)(高糖型，无L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)加有10％新生小牛血清(NBCS)(HyClone实验室，Inc.，Logan，Utah)和4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)。将细胞置于培养箱于37±1℃，10±1％CO2中维持。每2-3天将培养基更换成新鲜培养基。培养8天后，细胞长至融合，即细胞沿组织培养瓶的底部形成紧密的单细胞层，从培养瓶中将培养基吸出。将经无菌过滤的磷酸盐缓冲液加到每个培养瓶的底部以冲洗单细胞层，然后从瓶中吸出。向每个瓶中加入5ml胰蛋白酶-维尔烯谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)并轻轻摇动以确保完全覆盖单细胞层，使细胞从瓶上消化下来。将培养物放回培养箱。
一旦细胞被消化下来立即向每个瓶中加入5ml SBTI(大豆胰蛋白酶抑制剂)并与悬浮液混合使胰蛋白酶-维尔烯的作用终止。将细胞混悬液从瓶中移出并均分入无菌圆锥形离心管中。于大约800-1000g离心5分钟收集细胞。
[0181] 用新鲜培养基将细胞重悬至浓度为3.0×106个细胞/ml，并在六孔板中以6 5 2
3.0×10 个细胞/插条(insert)(6.6×10 个细胞/cm)的密度接种于孔径为0.4μm，直径为24mm的组织培养处理的插条( Corning Costar)上。细胞在培养
箱中以37±1℃，10±1％CO2维持，并每2-3天换以新鲜的生产培养基，培养21天。生产培养基含有：DMEM和Hams F-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基TM
本混合物，4mMGlutaMAX-1 (Gibco BRL，Grand Island，纽约)及添加剂，至终浓度为：5ng/ml人重组表皮生长因子(Upstate Biotechnology Lake Placid，纽约)，2％新生小牛血-4
清(HyClone，Logan，Utah)，0.4μg/ml氢化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10 M乙醇胺-4
(Fluka，Ronkonkoma，纽约，分析纯)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.，Milwaukee，WI)，50ng/ml L-抗坏血酸(WAKO Chemicals USA，Inc.#013-12061)，0.2μg/ml L-脯氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.1μg/ml甘氨酸(Sigma St.Louis，MO)和0.05％聚乙二醇(PEG)3400-3700MW(细胞培养级)(Sigma St.Louis，MO)。
3.0×10 个细胞/插条(insert)(6.6×10 个细胞/cm)的密度接种于孔径为0.4μm，直径为24mm的组织培养处理的插条( Corning Costar)上。细胞在培养
箱中以37±1℃，10±1％CO2维持，并每2-3天换以新鲜的生产培养基，培养21天。生产培养基含有：DMEM和Hams F-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基TM
本混合物，4mMGlutaMAX-1 (Gibco BRL，Grand Island，纽约)及添加剂，至终浓度为：5ng/ml人重组表皮生长因子(Upstate Biotechnology Lake Placid，纽约)，2％新生小牛血-4
清(HyClone，Logan，Utah)，0.4μg/ml氢化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10 M乙醇胺-4
(Fluka，Ronkonkoma，纽约，分析纯)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.，Milwaukee，WI)，50ng/ml L-抗坏血酸(WAKO Chemicals USA，Inc.#013-12061)，0.2μg/ml L-脯氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.1μg/ml甘氨酸(Sigma St.Louis，MO)和0.05％聚乙二醇(PEG)3400-3700MW(细胞培养级)(Sigma St.Louis，MO)。
[0182] 于第7，14和21天取标本进行组织学分析，在福尔马林中固定，然后在石蜡中包埋。将福尔马林固定的标本包埋于石蜡中并取5μm按本领域已知的方法用苏木精-伊红(H&E)染色。使用H&E染色切片，随机挑选10个显微镜视野利用装有10mm/100测微计网格的10×目镜测量厚度。
[0183] 人真皮成纤维细胞的两个不同细胞株的结果总结于表1，它显示细胞基质在发育过程中的厚度。
[0184]
[0185] 在7天，14，和21天取样分析胶原浓度。使用本领域已知的羟脯氨酸含量比色测定法(Woessner，1961)来评估胶原的含量。在上述相同时间点测定细胞数。用上述方法从两种细胞株(B156和B119)产生的细胞-基质构建物得到中胶原浓度(表2)和细胞数据(表3)。
[0186]
[0187]
[0188] 在第7，14，21天取源于皮肤基质的人类细胞标本经延迟还原型SDS-PAGE测定标本中显示I型和III型胶原α带的胶原组合物。
[0189] 所述真皮基质的生化特征用免疫组化方法测定。应用zymed组织染色链亲和素-生物素系统(Zymed Laboratories Inc.，南旧金山，CA)在石蜡包埋的切片上完成对纤连蛋白的鉴定。用抗-腱生蛋白抗体作第一抗体(Dako，Carpintheria，CA)、抗-小鼠辣根过氧化物酶标记的抗体(Calbiochem)作为第二抗体染色测定腱生蛋白的存在。用二氨基苯炔(Sigma St.Louis，MO)和核坚牢红(Nuclear Fast red)复染观察标本。
[0190] 用上述方法(Famdale，1986)在21天的标本上测定糖胺聚糖(GAG)的量。试验显2
示接种后21天由真皮基质产生的人型细胞标本中GAG的量为0.44g/cm。
示接种后21天由真皮基质产生的人型细胞标本中GAG的量为0.44g/cm。
[0191] 实施例2：完整厚度的皮肤构建物
[0192] 使用通过实施例1所述的方法形成的皮肤构建物将正常人新生期包皮表皮的角质细胞(来自Organogenesis，Inc.Canton，MA)铺于细胞-基质构建物上以形成皮肤构建物的表皮层。
[0193] 从培养物插条和其周围无菌去除培养基。将正常人表皮角质细胞从细胞冻存株传4代至融合。然后用胰蛋白酶-维尔烯将细胞从培养皿上消化下来，混合，离心以形成细胞
4 2
沉淀，在表皮化培养基中重悬，计数并按4.5×10 个细胞/cm 的密度接种于膜的上表面。然后将此构建物在37±1℃，10±1％CO2条件下保温90分钟以允许角质细胞贴壁。保温后，将这些构建物浸没到表皮化培养基中。表皮化培养基含有：Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)(高糖型，无L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)和Hams F-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，加有0.4μg/ml氢化可-4 -4
的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10 M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，纽约)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Aldrich)，24.4μg/ml腺嘌呤(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)，0.3％螯合的新生小牛血清(Hyclone，Logan，Utah)，0.628ng/ml黄体酮(Amersham Arlington Heights，IL)，50μg/ml L-抗坏血酸钠盐(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，10ng/ml表皮生长因子(Life Technologies Inc.，MD)和50μg/ml硫酸庆大霉素(Amersham，Arlington，Heights，IL)。将这些构建物在37±1℃，10±1％CO2的表皮化培养基中培养2天。
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沉淀，在表皮化培养基中重悬，计数并按4.5×10 个细胞/cm 的密度接种于膜的上表面。然后将此构建物在37±1℃，10±1％CO2条件下保温90分钟以允许角质细胞贴壁。保温后，将这些构建物浸没到表皮化培养基中。表皮化培养基含有：Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)(高糖型，无L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)和Hams F-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，加有0.4μg/ml氢化可-4 -4
的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10 M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，纽约)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Aldrich)，24.4μg/ml腺嘌呤(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)，0.3％螯合的新生小牛血清(Hyclone，Logan，Utah)，0.628ng/ml黄体酮(Amersham Arlington Heights，IL)，50μg/ml L-抗坏血酸钠盐(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，10ng/ml表皮生长因子(Life Technologies Inc.，MD)和50μg/ml硫酸庆大霉素(Amersham，Arlington，Heights，IL)。将这些构建物在37±1℃，10±1％CO2的表皮化培养基中培养2天。
[0194] 2天后将此构建物浸入含以下成分的培养基中：Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)(高糖型，无L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)和Hams F-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，加有0.4μg/ml氢-4 -4化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10 M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，纽约)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒 (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，24.4μg/ml腺 嘌 呤(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，4mM L-谷 氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)，0.3％螯合的新生小牛血清(BioWhittaker，WalkeFsville，MD)，0.628ng/ml黄体酮(Amersham，Arlington，Heights，IL)，50μg/ml L-抗坏血酸钠，265μg/ml氯化钙(Mallinckrodt，Chesterfield，MO)，和50μg/ml硫酸庆大霉素(Amersham，Arlington，Heights，IL)。将此构建物再次于37±1℃，10％CO2条件下培养2天。
[0195] 2天后将含有此构建物的载体无菌转移到含有足量(9ml)角质化培养基的新培养板上，使液面刚好到达载体膜表面，以维持能使上皮层分层的干燥界面。将这些构建物在37±1℃，10％CO2，和低湿度条件下保温，每隔2-3天更换培养基，持续7天。该培养基含有：Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)(高糖型，无L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)和HamsF-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)1∶1-4
的混合物，加有0.4μg/ml氢化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10 M乙醇胺(Fluka，-4
Ronkonkoma，纽约)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Aldrich)，24.4μg/ml腺嘌呤(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company)，4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)，2％新生小牛血清(BioWhittaker，Walkersville，MD)，50μg/ml L-抗坏血酸钠，和50μg/ml硫酸庆大霉素(Amersham，Arlington，Heights，IL)。7天后将此构建物用维持培养基再培养10天，每2-3天更换培养基。维持培养基含有：Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)(高糖型，无L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)和Hams F-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)1∶1的混合物，加有0.4μg/ml氢化可的-4 -4
松(Sigma St.Louis，MO)，1×10 M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，纽约)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，24.4μg/ml腺嘌呤(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)，1％新生小牛血清(BioWhittaker，Walkersville，MD)，和50μg/ml硫酸庆大霉素(Amersham，Arlington，Heights，IL)。
的混合物，加有0.4μg/ml氢化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10 M乙醇胺(Fluka，-4
Ronkonkoma，纽约)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Aldrich)，24.4μg/ml腺嘌呤(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company)，4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)，2％新生小牛血清(BioWhittaker，Walkersville，MD)，50μg/ml L-抗坏血酸钠，和50μg/ml硫酸庆大霉素(Amersham，Arlington，Heights，IL)。7天后将此构建物用维持培养基再培养10天，每2-3天更换培养基。维持培养基含有：Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)(高糖型，无L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)和Hams F-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)1∶1的混合物，加有0.4μg/ml氢化可的-4 -4
松(Sigma St.Louis，MO)，1×10 M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，纽约)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，24.4μg/ml腺嘌呤(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)，1％新生小牛血清(BioWhittaker，Walkersville，MD)，和50μg/ml硫酸庆大霉素(Amersham，Arlington，Heights，IL)。
[0196] 取最终的标本按照实施例1所述用苏木精-伊红染色，在光镜下判断总体形态。此所得构建物包括成纤维细胞构成的底(真皮)层，其周围包绕具有实施例1所述特征的基质，并且上面被多层、已分层且分化良好的角质细胞层完全覆盖，此角质细胞层显示出与原位皮肤相似的基底层，基底上层，粒状层和角质层。透射电镜(TEM)显示皮肤构建物在真皮-表皮交界处存在发育良好的基底膜。如TEM所见以VII型胶原构成的锚着纤丝为标记的半桥粒周围基底膜呈现为最厚。如所预期，可以容易地看到这些锚着纤丝从基底膜伸出并捕捉胶纤丝。用上述亲和素-生物素免疫酶技术(Guesdon，1979)显示层粘连蛋白(一种基底膜糖蛋白)的存在。
[0197] 实施例3：人新生期包皮成纤维细胞在化学确定的培养基上体外形成胶原基质[0198] 将人新生期包皮成纤维细胞用实施例1所述方法扩增。然后将细胞重悬使浓6 6 5 2
度为3×10 个细胞/ml，并在六孔板中以3.0×10 个细胞/TW(6.6×10 个细胞/cm)的
密度接种于孔径为0.4μm，直径为24mm的组织培养处理膜插条上。然后如实施例1所述维持这些细胞，全程中培养基不含新生小牛血清。更具体而言培养基中含有：DMEM和Hams F-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，4mM TM
GlutaMAX-1 (Gibco BRL，Grand Island，纽约)和添加剂：5ng/ml人重组表皮生长因子(Upstate Biotechnology Lake Placid，纽约)，0.4μg/ml氢化可的松(Sigma St.Louis，-4 -4
MO)，1×10 M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，纽约批号02400，分析纯)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.，Milwaukee，WI)，50ng/ml L-抗坏血酸(WAKO Chemicals USA，Inc.)，0.2μg/ml L-脯氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.1μg/ml甘氨酸(Sigma St.Louis，MO)和0.05％聚乙二醇(PEG)(Sigma St.Louis，MO)。用上述方法于第
7天，14天，和21天检测标本的胶原浓度和细胞数。结果见表4(细胞数目)和5(胶原)。
如实施例1所述将标本用福尔马林固定并用苏木精和伊红染色，光镜分析。组织学评价证明，在确定的培养基中构建物的生长相似于在有2％新生小牛血清存在的培养基中的生长。
用实施例1所述方法，标本也呈纤连蛋白染色阳性.。
度为3×10 个细胞/ml，并在六孔板中以3.0×10 个细胞/TW(6.6×10 个细胞/cm)的
密度接种于孔径为0.4μm，直径为24mm的组织培养处理膜插条上。然后如实施例1所述维持这些细胞，全程中培养基不含新生小牛血清。更具体而言培养基中含有：DMEM和Hams F-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，4mM TM
GlutaMAX-1 (Gibco BRL，Grand Island，纽约)和添加剂：5ng/ml人重组表皮生长因子(Upstate Biotechnology Lake Placid，纽约)，0.4μg/ml氢化可的松(Sigma St.Louis，-4 -4
MO)，1×10 M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，纽约批号02400，分析纯)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.，Milwaukee，WI)，50ng/ml L-抗坏血酸(WAKO Chemicals USA，Inc.)，0.2μg/ml L-脯氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.1μg/ml甘氨酸(Sigma St.Louis，MO)和0.05％聚乙二醇(PEG)(Sigma St.Louis，MO)。用上述方法于第
7天，14天，和21天检测标本的胶原浓度和细胞数。结果见表4(细胞数目)和5(胶原)。
如实施例1所述将标本用福尔马林固定并用苏木精和伊红染色，光镜分析。组织学评价证明，在确定的培养基中构建物的生长相似于在有2％新生小牛血清存在的培养基中的生长。
用实施例1所述方法，标本也呈纤连蛋白染色阳性.。
[0199]
[0200]
[0201] 细胞-基质构建物中除内源产生的纤丝胶原外还有decorin和糖胺聚糖。
[0202] 实施例4：用化学确定的培养基形成的完全厚度的皮肤构建物
[0203] 使用人的真皮成纤维细胞在类似于实施例3所述方法的化学确定的条件下培养25天形成的皮肤构建物，将正常人新生期包皮表皮的角质细胞接种于该细胞-基质构建物的上表面以形成皮肤构建物的表皮层。
[0204] 无菌操作除去培养插条及其周围的培养基。将正常人表皮角质细胞从细胞冻存株传4代至融合。然后用胰蛋白酶-维尔烯将细胞从培养皿上消化下来，混合，离心以形4 2
成细胞沉淀，在表皮化培养基中重悬，计数并按4.5×10 个细胞/cm 的密度接种于膜的上表面。然后将这些构建物在37±1℃，10±1％CO2条件下保温90分钟以允许角质细胞贴壁。保温后，将这些构建物浸没到表皮化培养基中。表皮化培养基含有：Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)(高糖型，无L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)和Hams F-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，加有-4
0.4μg/ml氢化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10 M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，纽-4
约)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Aldrich)，24.4μg/ml腺嘌呤(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)，50μg/ml L-抗坏血酸钠盐(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，16μM亚油酸(Sigma St.Louis，MO)，1μM醋酸生育酚(Sigma St.Louis，MO)和50μg/ml硫酸庆大霉素(Amersham，Arlington，Heights，IL)。将这些构建物在37±1℃，10±1％CO2的表皮化培养基中培养2天。
成细胞沉淀，在表皮化培养基中重悬，计数并按4.5×10 个细胞/cm 的密度接种于膜的上表面。然后将这些构建物在37±1℃，10±1％CO2条件下保温90分钟以允许角质细胞贴壁。保温后，将这些构建物浸没到表皮化培养基中。表皮化培养基含有：Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)(高糖型，无L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)和Hams F-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，加有-4
0.4μg/ml氢化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10 M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，纽-4
约)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Aldrich)，24.4μg/ml腺嘌呤(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)，50μg/ml L-抗坏血酸钠盐(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，16μM亚油酸(Sigma St.Louis，MO)，1μM醋酸生育酚(Sigma St.Louis，MO)和50μg/ml硫酸庆大霉素(Amersham，Arlington，Heights，IL)。将这些构建物在37±1℃，10±1％CO2的表皮化培养基中培养2天。
[0205] 2天后将培养基更换成成分同上的新鲜培养基，并再放回设置为37±1℃，10±1％CO2的培养箱中保持2天。2天后将含有构建物的载体无菌转移到新培养板上，板中所含培养基足以使液面恰至载体膜表面，从而使生长中的构建物维持在气-液界面。空气接触形成中的表皮层上表面可以使上皮层分层。将这些构建物在37±1℃，10％CO2，和低湿度条件下保温，每隔2-3天更换培养基，持续7天。此培养基包含：Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)(高糖型，无L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)和Hams F-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)1∶1的混合物，加有0.4μg/ml氢-4 -4
化可的松(Sigma St.Louis，MO)，5×10 M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，纽约)，5×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company)，24.4μg/ml腺嘌呤(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company)，4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)，2.65μg/ml氯化钙(Mallinckrodt，Chesterfield，MO)，16μM亚油酸(Sigma St.Louis，MO)，1μM醋酸生育酚(Sigma St.Louis，MO)，1.25mM丝氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.64mM胆碱盐酸盐(Sigma St.Louis，MO)和50μg/ml硫酸庆大霉素(Amersham，Arlington，Heights，IL)。将培养物培养14天，每2-3天更换培养基。
化可的松(Sigma St.Louis，MO)，5×10 M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，纽约)，5×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company)，24.4μg/ml腺嘌呤(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company)，4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)，2.65μg/ml氯化钙(Mallinckrodt，Chesterfield，MO)，16μM亚油酸(Sigma St.Louis，MO)，1μM醋酸生育酚(Sigma St.Louis，MO)，1.25mM丝氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.64mM胆碱盐酸盐(Sigma St.Louis，MO)和50μg/ml硫酸庆大霉素(Amersham，Arlington，Heights，IL)。将培养物培养14天，每2-3天更换培养基。
[0206] 取出将构建物提升到气-液界面后10天，12天，和14天的标本，一式三份，按照实施例1中所述方法进行苏木精伊红染色以在光镜下判定总体形态。所得构建物包括由成纤维细胞及周围包绕的具有实施例3所述特征的基质构成的底(真皮)层，其上层为分层且已分化的角质细胞。
[0207] 实施例5：用人跟腱成纤维细胞体外形成胶原基质
[0208] 按实施例1所述方法用人跟腱成纤维细胞(HATF.)替换人新生期包皮成纤维细胞来形成细胞-基质构建物。在生产培养基中培养21天后，用实施例1中所述方法取标本做H&E染色和厚度判定。观察到所得构建物为厚度75.00±27.85微米(n＝2)的细胞基质组织样构建物。在该构建物中也存在内源产生的纤丝胶原，decorin和糖胺聚糖。
[0209] 实施例6：用转染的人新生期包皮成纤维细胞体外形成胶原基质
[0210] 按以下方法产生转染的人新生期包皮成纤维细胞。将一小瓶jCRIP-43血小板衍6 2
生生长因子(PDGF)病毒生产者(Morgan，J.等)解冻，以2×10 个细胞/162cm 瓶(Coming Costar，Cambridge，MA)接种。培养瓶中含生长培养基，在37±1℃，10±1％CO2的培养箱中保温。生长培养基的组成为：Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)(高糖型，无L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)加有10％新生小牛血清(HyClone实验室，Inc.，Logan，Utah)和4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)。于同一天，也
6 2
融化1小瓶人新生期包皮成纤维细胞(HDFB156)并按1.5×10 个细胞/162cm 瓶(Coming Costar，Cambridge，MA)平铺。3天后将jCRIPPDGF-43病毒生产者用新鲜生长培养基培养。将HDFB156用上述生长培养基加8μg/ml Polybrene(Sigma St.Louis，MO)培养。第二天将HDFB156细胞如下感染。收集已培养过jCRIP PDGF-43病毒生产者的培养基并经
0.45μm滤膜过滤。向已过滤的培养基中加入8μg/ml Polybrene。然后将此培养基放于HDF上。接下来的两天用新鲜生长培养基培养HDF。再过一天将HDF从第5代传至第6代
6 2
并以2.5×10 个细胞/162cm 瓶(Corning Costar，Cambridge，MA)接种。细胞按下述传代：吸除旧培养基。然后用磷酸盐缓冲液冲洗培养瓶以去除任何残留的新生小牛血清。通过向每个瓶中加入5mL胰蛋白酶-维尔烯并轻轻摇动以确保完全覆盖单细胞层可使细胞从瓶上消化下来。将培养物放回培养箱。一旦细胞被消化下来，立即向每个瓶中加入5ml SBTI(大豆胰蛋白酶抑制剂)并与悬浮液混合使胰蛋白酶-维尔烯的作用终止。将细胞/胰蛋白酶/SBTI混悬液从瓶中移出并均分入无菌圆锥形离心管中。于大约800-1000g离心
5分钟收集细胞。将细胞在生长培养基中重悬，以上述同样浓度接种。用生长培养基培养细胞两天。随后的一天里同上收获细胞，并在含10％新生小牛血清(NBCS)及10％二甲亚砜
6
(DMSO)(Sigma St.Louis，MO)的生长培养基中稀释至1.5×10 个细胞/ml。然后将细胞在大约-80℃以1ml/冷冻瓶冻存。
生生长因子(PDGF)病毒生产者(Morgan，J.等)解冻，以2×10 个细胞/162cm 瓶(Coming Costar，Cambridge，MA)接种。培养瓶中含生长培养基，在37±1℃，10±1％CO2的培养箱中保温。生长培养基的组成为：Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)(高糖型，无L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)加有10％新生小牛血清(HyClone实验室，Inc.，Logan，Utah)和4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)。于同一天，也
6 2
融化1小瓶人新生期包皮成纤维细胞(HDFB156)并按1.5×10 个细胞/162cm 瓶(Coming Costar，Cambridge，MA)平铺。3天后将jCRIPPDGF-43病毒生产者用新鲜生长培养基培养。将HDFB156用上述生长培养基加8μg/ml Polybrene(Sigma St.Louis，MO)培养。第二天将HDFB156细胞如下感染。收集已培养过jCRIP PDGF-43病毒生产者的培养基并经
0.45μm滤膜过滤。向已过滤的培养基中加入8μg/ml Polybrene。然后将此培养基放于HDF上。接下来的两天用新鲜生长培养基培养HDF。再过一天将HDF从第5代传至第6代
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并以2.5×10 个细胞/162cm 瓶(Corning Costar，Cambridge，MA)接种。细胞按下述传代：吸除旧培养基。然后用磷酸盐缓冲液冲洗培养瓶以去除任何残留的新生小牛血清。通过向每个瓶中加入5mL胰蛋白酶-维尔烯并轻轻摇动以确保完全覆盖单细胞层可使细胞从瓶上消化下来。将培养物放回培养箱。一旦细胞被消化下来，立即向每个瓶中加入5ml SBTI(大豆胰蛋白酶抑制剂)并与悬浮液混合使胰蛋白酶-维尔烯的作用终止。将细胞/胰蛋白酶/SBTI混悬液从瓶中移出并均分入无菌圆锥形离心管中。于大约800-1000g离心
5分钟收集细胞。将细胞在生长培养基中重悬，以上述同样浓度接种。用生长培养基培养细胞两天。随后的一天里同上收获细胞，并在含10％新生小牛血清(NBCS)及10％二甲亚砜
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(DMSO)(Sigma St.Louis，MO)的生长培养基中稀释至1.5×10 个细胞/ml。然后将细胞在大约-80℃以1ml/冷冻瓶冻存。
[0211] 利用实施例1和3的相同方法，使用上述已转化而能产生高水平血小板衍生生长因子(PDGF)的人新生期包皮成纤维细胞生产本实施例的胶原基质。于接种后18天取标本做H&E染色。将标本用实施例1的亲和素-生物素方法染色以检测纤连蛋白的存在。接种后18天取标本按实施例1所述做H&E染色，显示与实施例1所述相似的细胞基质总体形态，所测厚度为123.6μm(N＝1)。在培养期全程(18天)，用ELISA检测细胞-基质构建物中转染细胞的PDGF产量为100ng/ml，而对照组未检测到PDGF产量。
[0212] 实施例7：真皮构建物作为移植材料的应用
[0213] 使用源自新生期包皮的人真皮成纤维细胞按照实施例1的方法制备细胞-基质构建物，移植到无胸腺裸鼠的完全切除伤口上。按照Parenteau等(1996)所述方法移植给小鼠，其内容在此引入以作参考。在14，28和56天检测移植物粘附创伤床的迹象，伤口收缩、移植物缺失区、和血管再生存在(颜色)的指征。当移植区在小鼠上完整时将其拍照。在每个时间点处死一些小鼠，将移植区及其周围沿鼠皮肤边缘切下至少达肌层。每份标本保留移植物与鼠皮肤的连接。然后将外植的组织标本在磷酸盐缓冲的10％福尔马林中固定并于甲醇中固定。按照实施例1所述方法将福尔马林固定的标本作H&E染色。移植物能与鼠皮肤融为一体，表现出最轻微收缩。在移植14天，鼠的表皮已经完全迁移过移植物。使用H&E染色的标本，在14天时移植物上血管明显可见，并贯穿试验全程。在实验全程中，经过总体观察和H&E染色的标本，可断定看起来能持久存留于皮肤并保持健康的移植物含有活细胞，无总体基质的异常等。
[0214] 实施例8：完整厚度皮肤构建物作为皮肤移植物的应用
[0215] 如实施例2所述，用新生期包皮真皮层的人真皮成纤维细胞和另一新生期包皮表皮层的人角质细胞制备双层皮肤构建物。不需载体支持处理能使所述皮肤构建物从膜上手工脱离，并将其放置在移植部位。将双层皮肤构建物移植到无胸腺裸鼠的完全切除伤口上。按照Parenteau等(1996)所述方法移植给小鼠，其内容在此引入以作参考。取标本的时间点为移植后7，14，28，56，和184天。当移植区在小鼠上完整时将其拍照。在每个时间点处死一些小鼠，将移植区及其周围沿鼠皮肤边缘切下至少达肌层。每份标本保留移植物与鼠皮肤的连接。然后将外植的组织标本在磷酸盐缓冲的10％福尔马林中固定并于甲醇中固定。按照实施例1所述方法将福尔马林固定的标本作H&E染色。
[0216] 通过大体观察和组织学表现显示在7天内移植物与宿主组织融为一体。通过H&E染色，在移植7天内可见血管从宿主组织长入移植物。整个试验期间移植物保持健康并且持久停留于皮肤上，呈最轻微的收缩。利用抗人Involucrin染色发现整个移植期人的表皮细胞持久停留。
[0217] 实施例9：用人的角膜角质细胞体外形成基质
[0218] 在角膜的基质构建物生产中使用人角膜角质细胞(来自Organognesis，Inc.，Canton，MA)。将人角质细胞的融合培养物用胰蛋白酶-维尔烯从其培养基质上消化下来。消化下来后，使用大豆胰蛋白酶抑制剂中和胰蛋白酶-维尔烯，将细胞悬液离心，6
弃去上清然后将细胞在基本培养基中重悬使浓度达3×10 个细胞/ml。在六孔板中以
6 5 2
3.0×10 个细胞/TW(6.6×10 个细胞/cm)的密度接种于孔径为0.4μm，直径为24mm的组织培养处理的transwell上。将这些培养物在接种培养基中过夜。接种培养基包含：
DMEM和HamsF-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD cat.)3∶1的基本混合物，4mMGlutaMAX(Gibco BRL，Grand Island，纽约)和添加剂：5ng/ml人重组表皮生长因子(EGF)(Upstate Biotechnology Lake Placid，纽约)，0.4μg/ml氢化可的松(Sigma -4 -4
St.Louis，MO)，1×10 M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，纽约，分析纯)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.，Milwaukee，WI)。此后将培养物用新鲜的生产培养基培养。生产培养基包含：DMEM和Hams F-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，4mM GlutaMAX(Gibco BRL，Grand Island，纽约)和添加剂：5ng/ml人重组表皮生长因子(Upstate Biotechnology Lake Placid，纽约)，2％新生小牛血-4
清(HyClone，Logan，Utah)，0.4μg/ml氢化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10 M乙醇胺-4
(Fluka，Ronkonkoma，纽约分析纯)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.，Milwaukee，WI)，50ng/ml L-抗坏血酸(WAKO Chemicals USA，Inc.#013-12061)，0.2μg/ml L-脯氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.1μg/ml甘氨酸(Sigma St.Louis，MO)和0.05％聚乙二醇(PEG)(Sigma St.Louis，MO，细胞培养级)。
弃去上清然后将细胞在基本培养基中重悬使浓度达3×10 个细胞/ml。在六孔板中以
6 5 2
3.0×10 个细胞/TW(6.6×10 个细胞/cm)的密度接种于孔径为0.4μm，直径为24mm的组织培养处理的transwell上。将这些培养物在接种培养基中过夜。接种培养基包含：
DMEM和HamsF-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD cat.)3∶1的基本混合物，4mMGlutaMAX(Gibco BRL，Grand Island，纽约)和添加剂：5ng/ml人重组表皮生长因子(EGF)(Upstate Biotechnology Lake Placid，纽约)，0.4μg/ml氢化可的松(Sigma -4 -4
St.Louis，MO)，1×10 M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，纽约，分析纯)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.，Milwaukee，WI)。此后将培养物用新鲜的生产培养基培养。生产培养基包含：DMEM和Hams F-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，4mM GlutaMAX(Gibco BRL，Grand Island，纽约)和添加剂：5ng/ml人重组表皮生长因子(Upstate Biotechnology Lake Placid，纽约)，2％新生小牛血-4
清(HyClone，Logan，Utah)，0.4μg/ml氢化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10 M乙醇胺-4
(Fluka，Ronkonkoma，纽约分析纯)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.，Milwaukee，WI)，50ng/ml L-抗坏血酸(WAKO Chemicals USA，Inc.#013-12061)，0.2μg/ml L-脯氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.1μg/ml甘氨酸(Sigma St.Louis，MO)和0.05％聚乙二醇(PEG)(Sigma St.Louis，MO，细胞培养级)。
[0219] 将细胞在10％±1％CO2，37±1℃的培养箱中保温并且每隔2-3天更换新鲜生产培养基，持续20天(总计培养21天)。培养21天后，用实施例1所述方法测量显示，角质细胞已经沉积为约40微米厚的基质层。在该细胞-基质构建物中也存在内源产生的纤丝胶原，decorin和糖胺聚糖。
[0220] 实施例10：用接种于生产培养基的人新生期包皮成纤维细胞体外形成胶原基质[0221] 将人新生期包皮成纤维细胞(来自Organognesis，Inc.，Canton，MA)在六孔板( Costar Corp.Cambridge，MA)上以1×105个细胞/ml 0.4微米孔径、24mm直径之组织培养处理载体接种，并在生长培养基上培养。生长培养基包含：
Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)(高糖型，无L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)加有10％新生小牛血清(HyClone实验室，Inc.，Logan，Utah)和4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)。将细胞置于10±1％CO2，37±1℃的培养箱中。每两到三天更换培养基。培养9天后，从培养皿上吸除培养基，并换成生产培养基。将细胞在10％±1％CO2和37±l℃的培养箱中保温并且每隔2-3天更换新鲜生产培养基，持续培养21天。生产培养基包含：DMEM和Hams F-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，4mM GlutaMAX(Gibco BRL，Grand Island，纽约)和添加剂：5ng/ml人重组表皮生长因子(Upstate Biotechnology Lake Placid，纽约)，
2％新生小牛血清(HyClone，Logan，Utah)，0.4μg/ml氢化可的松(Sigma St.Louis，MO)，-4 -4
1×10 M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，纽约，分析纯)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.，Milwaukee，WI)，50ng/ml L-抗坏血酸(WAKO Pure Chemical Company)，
0.2μg/ml L-脯氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.1μg/ml甘氨酸(Sigma St.Louis，MO)和
0.05％聚乙二醇(PEG)(Sigma St.Louis，MO，细胞培养级)。
Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)(高糖型，无L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)加有10％新生小牛血清(HyClone实验室，Inc.，Logan，Utah)和4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)。将细胞置于10±1％CO2，37±1℃的培养箱中。每两到三天更换培养基。培养9天后，从培养皿上吸除培养基，并换成生产培养基。将细胞在10％±1％CO2和37±l℃的培养箱中保温并且每隔2-3天更换新鲜生产培养基，持续培养21天。生产培养基包含：DMEM和Hams F-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，4mM GlutaMAX(Gibco BRL，Grand Island，纽约)和添加剂：5ng/ml人重组表皮生长因子(Upstate Biotechnology Lake Placid，纽约)，
2％新生小牛血清(HyClone，Logan，Utah)，0.4μg/ml氢化可的松(Sigma St.Louis，MO)，-4 -4
1×10 M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，纽约，分析纯)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.，Milwaukee，WI)，50ng/ml L-抗坏血酸(WAKO Pure Chemical Company)，
0.2μg/ml L-脯氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.1μg/ml甘氨酸(Sigma St.Louis，MO)和
0.05％聚乙二醇(PEG)(Sigma St.Louis，MO，细胞培养级)。
[0222] 于第21天取标本并福尔马林固定，石蜡包埋。将福尔马林固定的标本包埋于石蜡中并取5μm按本领域已知方法用苏木精-伊红(H&E)染色。使用H&E染色切片，随机挑选10个显微镜视野利用装有10mm/100测微计网格(Olympus America Inc.，Melville，纽约)的10×目镜(Olympus America Inc.，Melville，纽约)测量。用此方法生成的构建物具有类似于实施例1所生成构建物的结构和生化组成，其厚度为82.00±7.64微米。
[0223] 实施例11：用猪真皮成纤维细胞体外形成胶原基质5
[0224] 将猪真皮成纤维细胞(来自Organognesis，Inc.Canton，MA)按5×10 个细胞2
/162cm 组织培养处理瓶(Costar Corp.，剑桥，MA，批号3150)接种于并在下述的生长培养基上生长。生长培养基包含：Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)(高糖型，无L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)加有10％胎牛血清(HyClone实验室，Inc.，Logan，Utah)和4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)。将细胞置于10±1％CO2，37±1℃的培养箱中。每两到三天更换培养基。当融合即细胞沿组织培养瓶的底部形成紧密的一层后，从培养瓶中将培养基吸出。将无菌过滤的磷酸盐缓冲液加到每个培养瓶的底部以冲洗单细胞层，然后从瓶中吸出。向每个瓶中加入5mL胰蛋白酶-维尔烯谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)并轻轻摇动以确保完全覆盖单细胞层以使细胞从瓶上消化下来。将培养物放回培养箱。一旦细胞被消化下来立即向每个瓶中加入5ml SBTI(大豆胰蛋白酶抑制剂)并与悬浮液混合使胰蛋白酶-维尔烯的作用终止。将细胞混悬液从瓶中移出并均分入无菌圆锥形离心管中。于大约800-1000g离心5分钟收集细胞。将细胞重
6 6 5
悬并稀释至浓度为3.0×10 个细胞/ml，并在六孔板中以3.0×10 个细胞/TW(6.6×10 个
2
细胞/cm)的密度接种于孔径0.4μm，直径为24mm的组织培养处理的transwell上。将细胞在接种培养基上维持过夜。接种培养基的组成为：DMEM和Hams F-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD cat.)3∶1的基本混合物，4mM GlutaMAX(Gibco BRL，Grand Island，纽约)和添加剂：5ng/ml人重组表皮生长因子(Upstate Biotechnology Lake -4
Placid，纽约)，0.4μg/ml氢化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10 M乙醇胺(Fluka，-4
Ronkonkoma，纽约分析纯)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.，Milwaukee，WI)，50ng/ml L-抗坏血酸(WAKO Pure Chemical Company)，0.2μg/ml L-脯氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.1μg/ml甘氨酸(Sigma St.Louis，MO)。将细胞置于10±1％CO2，37±1℃的培养箱中并且每两到三天用新鲜的生产培养基培养持续7天。生产培养基的组成为：
DMEM和Hams F-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，
4mM GlutaMAX(Gibco BRL，Grand Island，纽约)和添加剂：5ng/ml人重组表皮生长因子(Upstate Biotechnology Lake Placid，纽约)，2％新生小牛血清(HyClone，Logan，Utah)，-4
0.4μg/ml氢化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10 M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，纽约，-4
分析纯)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.，Milwaukee，WI)，50ng/ml L-抗坏血酸(WAKO Chemicals USA，Inc.#013-12061)，0.2μg/ml L-脯氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.1μg/ml甘氨酸(Sigma St.Louis，MO)和0.05％聚乙二醇(PEG)(Sigma St.Louis，MO，细胞培养级)。7天后将培养基换成无新生小牛血清的生产培养基。每2-3天将培养基换液再持续20天，总计培养28天。
/162cm 组织培养处理瓶(Costar Corp.，剑桥，MA，批号3150)接种于并在下述的生长培养基上生长。生长培养基包含：Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)(高糖型，无L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)加有10％胎牛血清(HyClone实验室，Inc.，Logan，Utah)和4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)。将细胞置于10±1％CO2，37±1℃的培养箱中。每两到三天更换培养基。当融合即细胞沿组织培养瓶的底部形成紧密的一层后，从培养瓶中将培养基吸出。将无菌过滤的磷酸盐缓冲液加到每个培养瓶的底部以冲洗单细胞层，然后从瓶中吸出。向每个瓶中加入5mL胰蛋白酶-维尔烯谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)并轻轻摇动以确保完全覆盖单细胞层以使细胞从瓶上消化下来。将培养物放回培养箱。一旦细胞被消化下来立即向每个瓶中加入5ml SBTI(大豆胰蛋白酶抑制剂)并与悬浮液混合使胰蛋白酶-维尔烯的作用终止。将细胞混悬液从瓶中移出并均分入无菌圆锥形离心管中。于大约800-1000g离心5分钟收集细胞。将细胞重
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悬并稀释至浓度为3.0×10 个细胞/ml，并在六孔板中以3.0×10 个细胞/TW(6.6×10 个
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细胞/cm)的密度接种于孔径0.4μm，直径为24mm的组织培养处理的transwell上。将细胞在接种培养基上维持过夜。接种培养基的组成为：DMEM和Hams F-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD cat.)3∶1的基本混合物，4mM GlutaMAX(Gibco BRL，Grand Island，纽约)和添加剂：5ng/ml人重组表皮生长因子(Upstate Biotechnology Lake -4
Placid，纽约)，0.4μg/ml氢化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10 M乙醇胺(Fluka，-4
Ronkonkoma，纽约分析纯)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.，Milwaukee，WI)，50ng/ml L-抗坏血酸(WAKO Pure Chemical Company)，0.2μg/ml L-脯氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.1μg/ml甘氨酸(Sigma St.Louis，MO)。将细胞置于10±1％CO2，37±1℃的培养箱中并且每两到三天用新鲜的生产培养基培养持续7天。生产培养基的组成为：
DMEM和Hams F-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，
4mM GlutaMAX(Gibco BRL，Grand Island，纽约)和添加剂：5ng/ml人重组表皮生长因子(Upstate Biotechnology Lake Placid，纽约)，2％新生小牛血清(HyClone，Logan，Utah)，-4
0.4μg/ml氢化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10 M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，纽约，-4
分析纯)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.，Milwaukee，WI)，50ng/ml L-抗坏血酸(WAKO Chemicals USA，Inc.#013-12061)，0.2μg/ml L-脯氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.1μg/ml甘氨酸(Sigma St.Louis，MO)和0.05％聚乙二醇(PEG)(Sigma St.Louis，MO，细胞培养级)。7天后将培养基换成无新生小牛血清的生产培养基。每2-3天将培养基换液再持续20天，总计培养28天。
[0225] 于第21天取材并福尔马林固定，石蜡包埋。将福尔马林固定的标本包埋于石蜡中并取5μm按本领域习惯使用的技术用苏木精-伊红(H&E)染色。使用H&E染色切片，随机挑选10个显微镜视野利用装有10mm/100测微计网格(Olympus America Inc.，Melville，纽约)的10×目镜(Olympus America Inc.，Melville，纽约)测量。标本显示由细胞和基质组成的厚度为71.20±9.57微米的结构。除内源产生的纤丝胶原外，在该细胞-基质构建物中也存在decorin和糖胺聚糖。
[0226] 实施例12：体外形成含真皮乳头细胞的双层皮肤构建物
[0227] 用人新生期包皮成纤维细胞作为第一基质生产型细胞按实施例1的方法制造细胞基质。在该细胞基质局部点种真皮乳头细胞作为第二细胞群，再在第二细胞群上接种角质细胞作为第三细胞群，从而在所述细胞基质和真皮乳头上形成连续的表皮层。
[0228] 首先，用人的新生期包皮皮肤成纤维细胞(HDF)形成细胞-基质构建物。通过将5 2
HDF以5×10 个细胞/162cm 组织培养处理瓶(Costar Corp.，剑桥，MA)接种于生长培养基使其扩增，所述生长培养基含有：Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)(高糖型，无L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)加有10％新生小牛血清(NBCS)(HyClone实验室，Inc.，Logan，Utah)和4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)。当融
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合后，用胰蛋白酶-维尔烯将HDF从瓶上消化下来并用新鲜培养基重悬至浓度为3.0×10
6 5 2
个细胞/ml，在六孔板中以3.0×10 个细胞/插条(6.6×10 个细胞/cm)的密度接种于孔径为0.4μm，直径为24mm的组织培养处理的插条( Coring Costar)上。
按照实施例1详述的方法将HDF培养物置于10±1％CO2，37±1℃的培养箱中培养，每两到三天更换新鲜的生产培养基，持续23天。
HDF以5×10 个细胞/162cm 组织培养处理瓶(Costar Corp.，剑桥，MA)接种于生长培养基使其扩增，所述生长培养基含有：Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)(高糖型，无L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)加有10％新生小牛血清(NBCS)(HyClone实验室，Inc.，Logan，Utah)和4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)。当融
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合后，用胰蛋白酶-维尔烯将HDF从瓶上消化下来并用新鲜培养基重悬至浓度为3.0×10
6 5 2
个细胞/ml，在六孔板中以3.0×10 个细胞/插条(6.6×10 个细胞/cm)的密度接种于孔径为0.4μm，直径为24mm的组织培养处理的插条( Coring Costar)上。
按照实施例1详述的方法将HDF培养物置于10±1％CO2，37±1℃的培养箱中培养，每两到三天更换新鲜的生产培养基，持续23天。
[0229] 在细胞-基质构建物形成后，在其上点种真皮乳头细胞作为第二细胞群。真皮乳头细胞是特化的成纤维细胞的分散群体，其被毛囊的发根包围，可支持毛发生长。通过显微解剖毛囊和用前面Messenger，A.G.，人毛囊的真皮乳头细胞的培养，Br.J.Dermatol.110：685-9(1984)所述方法在体外培养可以分离真皮乳头，该培养方法在此引入以作参考。当真皮乳头细胞的培养物达融合时可形成聚集体，将其再铺入培养瓶中可以再形成新聚集体。
从4周龄猪的皮肤活检物上分离真皮乳头。将真皮乳头(PDP)细胞在含20％NBCS的DMEM上连续培养至第8代。培养3周后，PDP细胞形成真皮乳头样结构，或聚集体，其每个直径约
90-210微米。然后用移液管强力吸取培养基使聚集体与培养基分离，然后将聚集体以200聚集体/cm2的密度接种在人胶原基质上。在DMEM 20％NBCS中将聚集体另浸没培养15天，每2-3天用新鲜培养基更换旧培养基。
从4周龄猪的皮肤活检物上分离真皮乳头。将真皮乳头(PDP)细胞在含20％NBCS的DMEM上连续培养至第8代。培养3周后，PDP细胞形成真皮乳头样结构，或聚集体，其每个直径约
90-210微米。然后用移液管强力吸取培养基使聚集体与培养基分离，然后将聚集体以200聚集体/cm2的密度接种在人胶原基质上。在DMEM 20％NBCS中将聚集体另浸没培养15天，每2-3天用新鲜培养基更换旧培养基。
[0230] 在含有真皮乳头细胞的细胞基质培养物上接种角质细胞并培养，从而在细胞基质和真皮乳头上形成连续的表皮层。制备两种不同的构建物：第一种用人角质细胞，第二种用猪角质细胞。从人新生期包皮(HEP)，或从猪角质细胞(PEP)分离正常表皮角质细胞，用外植块生长建立原代培养。然后将猪的细胞扩增至第3代，将人的细胞扩增至第4代。约培养5-6天后，用胰蛋白酶-维尔烯将细胞从培养皿上消化下来，混合，离心以形成沉淀，在表皮化培养基中重悬，计数并以HEP为4.5×104个细胞/cm2的密度或PEP为1.6×105个细胞/cm2的密度接种于膜的上表面。如前面实施例2所述将表皮化培养物培养12天。
[0231] 取最终标本做苏木精伊红染色，光镜镜检。所得皮肤构建物显示出与皮肤相似的基本形态构成：由成纤维细胞及其周围的内源生基质构成的真皮层，局部的真皮乳头细胞区，穿过该细胞-基质层的连续、分层式角质细胞层和真皮乳头，其中所述内源生基质包括内源生纤丝胶原，decorin和糖胺聚糖。在覆盖有人或猪角质细胞的两种组织构建物中，真皮乳头保持紧密的结构，该结构可引起其上覆盖的上皮出现小的起伏。分化的上皮细胞经常出现在真皮乳头细胞附近。
[0232] 实施例13：用夹心法ELISA检测透明质酸
[0233] 在分别按照实施例1和3的方法于含血清的培养基和化学确定的培养基中由真皮成纤维细胞形成的细胞-基质构建物中检测透明质酸(HA)。
[0234] 在直径75mm的结合有多孔膜( Coming Costar)的圆形载体上形成细胞-基质构建物。通过向含有细胞-基质构建物的试管中加入10ml醋酸铵缓冲液和
0.5mg/ml蛋白酶K来制备所述细胞-基质构建物的提取物。所述混合物在60℃保存过夜。
完全消化后，将混合物离心并将上清提取物转移到用于测定透明质酸的另一试管中。96孔板用20μg/ml HA结合蛋白的0.1M NaHCO3溶液50μl包被并于4℃过夜。然后将此平板用含0.05％吐温20的0.85％NaCl洗三次。每孔加250μl封闭溶液(磷酸钠缓冲液，10mM，，pH＝7.4，含有3％BSA和0.9％NaCl，PBS+3％BSA)，将平板于室温保持2h。然后将此平板用含有0.05％吐温20的0.85％NaCl洗三次。平板中加入标准HA溶液50μl以及在两种试验条件(包括这些条件的各种稀释度)下的提取物。将平板在室温(约20℃)保温2h，然后用含有0.05％吐温20的0.85％NaCl洗三次，向平板中加入生物素化的HA(1∶2000稀释)50μl并于室温保持2h。然后将平板用含有0.05％吐温20的0.85％NaCl洗三次，每孔加50μl的HRP-亲和素D(1∶3000稀释)。然后将平板于室温保温45分钟。再将平板用含有0.05％吐温20的0.85％NaCl洗三次，每孔加100μl邻苯二胺底物溶液。将平板在37℃保温10分钟。加50μl的1M HCl终止反应。最后，用酶标仪，在492nm读取光吸收值并记录。
0.5mg/ml蛋白酶K来制备所述细胞-基质构建物的提取物。所述混合物在60℃保存过夜。
完全消化后，将混合物离心并将上清提取物转移到用于测定透明质酸的另一试管中。96孔板用20μg/ml HA结合蛋白的0.1M NaHCO3溶液50μl包被并于4℃过夜。然后将此平板用含0.05％吐温20的0.85％NaCl洗三次。每孔加250μl封闭溶液(磷酸钠缓冲液，10mM，，pH＝7.4，含有3％BSA和0.9％NaCl，PBS+3％BSA)，将平板于室温保持2h。然后将此平板用含有0.05％吐温20的0.85％NaCl洗三次。平板中加入标准HA溶液50μl以及在两种试验条件(包括这些条件的各种稀释度)下的提取物。将平板在室温(约20℃)保温2h，然后用含有0.05％吐温20的0.85％NaCl洗三次，向平板中加入生物素化的HA(1∶2000稀释)50μl并于室温保持2h。然后将平板用含有0.05％吐温20的0.85％NaCl洗三次，每孔加50μl的HRP-亲和素D(1∶3000稀释)。然后将平板于室温保温45分钟。再将平板用含有0.05％吐温20的0.85％NaCl洗三次，每孔加100μl邻苯二胺底物溶液。将平板在37℃保温10分钟。加50μl的1M HCl终止反应。最后，用酶标仪，在492nm读取光吸收值并记录。
[0235] 将光吸收值取均值并转换成定量值。在含血清培养基中形成的圆形细胞-基质构建物经测定每个含透明质酸约200μg，在化学确定的培养基中形成的每个含透明质酸约1.5mg。
[0236] 实施例14：所产生的细胞-基质构建物的物理测试和机械特性
[0237] 实施例1(细胞-基质构建物)，实施例2(其上带有角质细胞层的细胞-基质构建物)，和实施例3(在化学确定的培养基中形成的细胞-基质构建物)的组织构建物的机械特性用膜膨胀试验定量检测。这些实验与用于临床的试验(例如 CyberdermInc.，Media，PA，和 Courage Khazaka，Cologne，Germany)相似但有更强的压
力包括能使膜破裂的压力。将细胞基质标本平放于聚碳酸酯板上，该板位于充满张力正常之盐水的直径10mm柱形孔中心。在标本上放置一块金属板，此板有一圆孔直径与所述柱形孔相符，使该金属板与聚碳酸酯板夹紧。然后用注射泵向孔中注入额外的盐水使标本膨胀。
通过压力传感器测量所达压力。加压直至装置受损，破裂强度在用实施例1的方法产生的细胞-基质构建物上平均为439.02mm Hg；在用实施例2的方法产生的带有角质细胞层的细胞-基质构建物标本上平均为998.52mm Hg；在用实施例3的方法于化学确定的培养基上产生的细胞-基质构建物标本上平均为1542.26mm Hg。
力包括能使膜破裂的压力。将细胞基质标本平放于聚碳酸酯板上，该板位于充满张力正常之盐水的直径10mm柱形孔中心。在标本上放置一块金属板，此板有一圆孔直径与所述柱形孔相符，使该金属板与聚碳酸酯板夹紧。然后用注射泵向孔中注入额外的盐水使标本膨胀。
通过压力传感器测量所达压力。加压直至装置受损，破裂强度在用实施例1的方法产生的细胞-基质构建物上平均为439.02mm Hg；在用实施例2的方法产生的带有角质细胞层的细胞-基质构建物标本上平均为998.52mm Hg；在用实施例3的方法于化学确定的培养基上产生的细胞-基质构建物标本上平均为1542.26mm Hg。
[0238] 为判定真皮基质的熔点，将在21天取材的标本(细胞-基质构建物)按照实施例1程序制备。通过使用Mettler Toledo(Highston，NJ)差示扫描测热仪(DSC产品，批号DSC12E)分析来判定标本的变性温度。为了我们的目的，通过将标本以1℃/分钟的速率从45℃加热到80℃来判定熔化温度。标本的平均变性温度为60.8±1.2℃(n＝3)。
[0239] 检测按实施例1(细胞-基质构建物)和3(在化学确定的培养基中形成的细胞-基质构建物)产生的表皮基质的缝线保持和牵拉强度，从而判定特定临床情况下构建物的可缝合性。根据关于血管移植修复术的美国国家标准出版物中所述方法(Instruments，1986)使 用Mini-Bionex 858试 验 系 统 (MTS systems Corporation，Minneapolis，Minn.)判定21天龄的人真皮基质的缝线保持强度。
[0240] 经测定，实施例1的标本(细胞-基质构建物)可伸展强度为365N/m；按照实施例2制备的标本(带有角质细胞层的细胞-基质构建物)，可伸展强度为2720N/m。
[0241] 按照实施例1制备的标本缝缝线保持强度为0.14N；实施例2所得标本的为0.22N。
[0242] 将如实施例1，2和3所述生成的构建物制成直径24mm和75mm两种。用三种培养方法制得的构建物带有组织样结构，可用微小的力轻易使它们从膜上脱离，因此为“可脱离的”，并且使用和检测时可物理操作而不发生损伤。
[0243] 实施例15：在化学确定的培养基中用人新生期包皮成纤维细胞形成胶原基质[0244] 用实施例1所述方法扩增人新生期包皮成纤维细胞。然后将细胞重悬使浓度为6 6 5 2
3×10 个细胞/ml，并在六孔板中以3.0×10 个细胞/TW(6.6×10 个细胞/cm)的密度接种于孔径为0.4μm，直径为24mm的组织培养处理的膜插条上。本实施例全程中，细胞在化学确定的培养基中培养。
3×10 个细胞/ml，并在六孔板中以3.0×10 个细胞/TW(6.6×10 个细胞/cm)的密度接种于孔径为0.4μm，直径为24mm的组织培养处理的膜插条上。本实施例全程中，细胞在化学确定的培养基中培养。
[0245] 所述培养基包含：DMEM和Hams F-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，4mM GlutaMAX(Gibco BRL，Grand Island，纽约)和添加剂：5ng/-4ml人重组表皮生长因子(Upstate Biotechnology Lake Placid，纽约)，1×10 M乙醇胺-4
(Fluka，Ronkonkoma，纽约，#02400分析纯)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.，Milwaukee，WI)，50ng/ml L-抗坏血酸(WAKO Chemicals USA，Inc.)，0.2μg/ml L-脯氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.1μg/ml甘氨酸(Sigma St.Louis，MO)。
(Fluka，Ronkonkoma，纽约，#02400分析纯)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.，Milwaukee，WI)，50ng/ml L-抗坏血酸(WAKO Chemicals USA，Inc.)，0.2μg/ml L-脯氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.1μg/ml甘氨酸(Sigma St.Louis，MO)。
[0246] 向上述基本培养基中添加其它成分，条件分别如下：
[0247] 1.5μg/ml胰 岛 素(Sigma St.Louis，MO)，0.4μg/ml氢 化 可 的 松 (Sigma St.Louis，MO)，0.05％聚乙二醇(PEG)(Sigma St.Louis，MO)。
[0248] 2.5μg/ml胰 岛 素(Sigma St.Louis，MO)，0.4μg/ml氢 化 可 的 松 (Sigma St.Louis，MO)。
[0249] 3.375μg/ml胰 岛 素(Sigma St.Louis，MO)，6μg/ml氢 化 可 的 松 (Sigma St.Louis，MO)。
[0250] 标本经福尔马林固定，苏木精-伊红染色，以便光学显微镜分析。组织学观察证实，由缺乏PEG的条件2产生的基质与有PEG的条件1产生的基质相似。所述构建物胶原2
含量的生化分析显示，两者胶原量几乎相同：有PEG的条件1为168.7±7.98μg/cm，无PEG
2
的条件2为170.88±9.07μg/cm。含有高水平胰岛素和氢化可的松的条件3在比其他两种条件早的时间点上显示出基质，包括胶原的高表达。除了内源产生的纤丝胶原外，decorin和糖胺聚糖也存在于各种条件下的细胞-基质构建物中。本实施例中用条件2的方法形成的培养型皮肤构建物如图2所示。图2是人真皮成纤维细胞于化学确定的培养基中培养21天，形成的细胞-基质构建物切片经固定、石蜡包埋、苏木精-伊红染色的显微照片。多孔膜表现为构建物下方的窄透明带，细胞生长在膜表面，并未被带有基质的膜整个包埋。
含量的生化分析显示，两者胶原量几乎相同：有PEG的条件1为168.7±7.98μg/cm，无PEG
2
的条件2为170.88±9.07μg/cm。含有高水平胰岛素和氢化可的松的条件3在比其他两种条件早的时间点上显示出基质，包括胶原的高表达。除了内源产生的纤丝胶原外，decorin和糖胺聚糖也存在于各种条件下的细胞-基质构建物中。本实施例中用条件2的方法形成的培养型皮肤构建物如图2所示。图2是人真皮成纤维细胞于化学确定的培养基中培养21天，形成的细胞-基质构建物切片经固定、石蜡包埋、苏木精-伊红染色的显微照片。多孔膜表现为构建物下方的窄透明带，细胞生长在膜表面，并未被带有基质的膜整个包埋。
[0251] 图3显示用本实施例中条件2的方法于21天形成的真皮构建物培养物两种分辨率的透射电子显微镜(TEM)图像。图3A为7600×分辨率，显示在成纤维细胞之间内源胶原纤丝的排列。图3B为19000×分辨率，显示完整成形的内源胶原纤丝，其证明纤丝排列和包裹。
[0252] 在本实施例的所有条件下，所形成的培养的真皮构建物包括皮肤成纤维细胞和内源产生的基质。它们均含有于细胞间包裹排列的完整成形的胶原纤丝。它们的纤维性质，厚度，和所具整体性赋予该构建物相当大的强度从而可将它从膜上脱离并移走，当转移给接受该构建物的患者(如在移植物或植入物中)可进行处理。
[0253] 实施例16：完整厚度的皮肤构建物
[0254] 将正常人新生期包皮的表皮角质细胞接种于细胞-基质构建物的上表面以形成皮肤构建物的表皮层，所述构建物是根据实施例15条件2(无PEG)的方法在化学确定的条件下，对人真皮成纤维细胞培养21天形成的皮肤构建物。
[0255] 从培养物插条和其周围无菌去除培养基。将正常人表皮角质细胞从细胞冻存株传4代至融合。然后用胰蛋白酶-维尔烯将细胞从培养皿上消化下来，混合，离心以形成4 2
细胞沉淀，在表皮化培养基中重悬，计数并按4.5×10 个细胞/cm 的密度接种于膜的上表面。然后将此构建物在37±1℃，10±1％CO2条件下保温90分钟以允许角质细胞贴壁。保温后，将这些构建物浸没到表皮化培养基中。表皮化培养基含有：Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)(不含葡萄糖和钙，BioWhittaker，Walkersville，MD)和Hams F-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，加有0.4μg/ml-4 -4
氢化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10 M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，纽约)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和
6.78ng/ml硒(Aldrich)，24.4μg/ml腺嘌呤(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)，50μg/ml L-抗坏血酸钠盐(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，16μM亚油酸(Sigma St.Louis，MO)，1μM醋酸生育酚(Sigma St.Louis，MO)和50μg/ml硫酸庆大霉素(Amersham，Arlington，Heights，IL)。将所述构建物在37±1℃，10±1％CO2的表皮化培养基中培养2天。
细胞沉淀，在表皮化培养基中重悬，计数并按4.5×10 个细胞/cm 的密度接种于膜的上表面。然后将此构建物在37±1℃，10±1％CO2条件下保温90分钟以允许角质细胞贴壁。保温后，将这些构建物浸没到表皮化培养基中。表皮化培养基含有：Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)(不含葡萄糖和钙，BioWhittaker，Walkersville，MD)和Hams F-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，加有0.4μg/ml-4 -4
氢化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10 M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，纽约)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和
6.78ng/ml硒(Aldrich)，24.4μg/ml腺嘌呤(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)，50μg/ml L-抗坏血酸钠盐(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，16μM亚油酸(Sigma St.Louis，MO)，1μM醋酸生育酚(Sigma St.Louis，MO)和50μg/ml硫酸庆大霉素(Amersham，Arlington，Heights，IL)。将所述构建物在37±1℃，10±1％CO2的表皮化培养基中培养2天。
[0256] 2天后将培养基更换成成分同上的新鲜培养基，并再放回设置为37±1℃，10±1％CO2的培养箱中保持2天。2天后将含有构建物的载体无菌转移到新培养板上，板中所含培养基足以使液面恰至载体膜表面，从而使生长中的构建物维持在气-液界面。空气接触形成中的表皮层上表面可以使上皮层分层。将这些构建物在37±1℃，10％CO2，和低湿度条件下保温，每隔2-3天更换培养基，持续7天。此培养基包含：Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)(高糖型，无L-谷氨酰胺，BioWhittaker，Walkersville，MD)和Hams F-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)1∶1的混合物，加有0.4μg/ml氢-4 -4
化可的松(Sigma St.Louis，MO)，5×10 M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，纽约)，5×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company)，24.4μg/ml腺嘌呤(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company)，4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)，2.65μg/ml氯化钙(Mallinckrodt，Chesterfield，MO)，16μM亚油酸(Sigma St.Louis，MO)，1μM醋酸生育酚(Sigma St.Louis，MO)，1.25mM丝氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.64mM胆碱盐酸盐(Sigma St.Louis，MO)和50μg/ml硫酸庆大霉素(Amersham，Arlington，Heights，IL)。将培养物培养14天，每2-3天更换培养基。
化可的松(Sigma St.Louis，MO)，5×10 M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，纽约)，5×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company)，24.4μg/ml腺嘌呤(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company)，4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)，2.65μg/ml氯化钙(Mallinckrodt，Chesterfield，MO)，16μM亚油酸(Sigma St.Louis，MO)，1μM醋酸生育酚(Sigma St.Louis，MO)，1.25mM丝氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.64mM胆碱盐酸盐(Sigma St.Louis，MO)和50μg/ml硫酸庆大霉素(Amersham，Arlington，Heights，IL)。将培养物培养14天，每2-3天更换培养基。
[0257] 取出将构建物提升到气-液界面后10天，12天，和14天的标本，一式三份，按照实施例1中所述方法进行苏木精伊红染色以在光镜下判定总体形态。所得构建物包括由真皮成纤维细胞及周围包绕的基质构成的底层真皮层，其上层为分层且已分化的角质细胞构成的上层表皮层。本实施例的双层皮肤构建物如图4所示。图4是培养的皮肤构建物的切片经固定，石蜡包埋，苏木精伊红染色的显微照片，该构建物形成于缺乏外源基质成分的化学确定的培养基，该构建物包括由培养的人真皮成纤维细胞在化学确定的培养基上形成的细胞-基质构建物，以及由培养的人角质细胞在化学确定的培养基上形成的多层、已分化的表皮。
[0258] 实施例17：用人面颊成纤维细胞形成胶原基质
[0259] 本实验的目的是用由人面颊组织分离的面颊成纤维细胞生产细胞-基质构建物。将面颊于T-150瓶内含10％NBCS的DMEM培养基中培养。7天后，为进一步扩增细胞数，收
6
获面颊细胞并以4.0×10 细胞转移至9个T-150瓶中含10％NBCS的DMEM培养基中，培养至融合时收获细胞。
6
获面颊细胞并以4.0×10 细胞转移至9个T-150瓶中含10％NBCS的DMEM培养基中，培养至融合时收获细胞。
[0260] 为收获细胞，从培养瓶中吸出培养基。向每个培养瓶底部加入经无菌过滤的磷酸盐缓冲液以冲洗单细胞层，然后从瓶中吸出。向每个瓶中加入5mL胰蛋白酶-维尔烯谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)并轻轻摇动以确保完全覆盖单细胞层，从而使细胞从瓶上消化下来。将培养物放回培养箱。一旦细胞被消化下来立即向每个瓶中加入5ml SBTI(大豆胰蛋白酶抑制剂)并与悬浮液混合使胰蛋白酶-维尔烯的作用终止。将细胞混悬液从瓶中移出并均分入无菌圆锥形离心管中。于大约800-1000g离心5分钟收集细胞。
[0261] 用新鲜培养基将细胞重悬至浓度为3.0×106个细胞/ml，并在六孔板中以6 5 2
3.0×10 个细胞/插条(6.6×10 个细胞/cm)的密度接种于孔径为0.4μm，直径为24mm的组织培养处理插条( Coming Costar)上。将细胞置于10±1％CO2，
37±1℃的培养箱中培养。培养基含有：DMEM和Hams F-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，4mM GlutaMAX(Gibco BRL，Grand Island，纽约)和添加剂：5ng/ml人重组表皮生长因子(Upstate Biotechnology Lake Placid，纽约)，-4
0.4μg/ml氢化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10 M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，纽约-4
#02400分析纯)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)， 和 6.78ng/ml 硒 (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.，Milwaukee，WI)，50ng/ml L-抗坏血酸(WAKO Chemicals USA，Inc.)，0.2μg/ml L-脯氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.1μg/ml甘氨酸(Sigma St.Louis，MO)和0.05％聚乙二醇(PEG)(Sigma St.Louis，MO)。
3.0×10 个细胞/插条(6.6×10 个细胞/cm)的密度接种于孔径为0.4μm，直径为24mm的组织培养处理插条( Coming Costar)上。将细胞置于10±1％CO2，
37±1℃的培养箱中培养。培养基含有：DMEM和Hams F-12培养基(Quality Biologics Gaithersburg，MD)3∶1的基本混合物，4mM GlutaMAX(Gibco BRL，Grand Island，纽约)和添加剂：5ng/ml人重组表皮生长因子(Upstate Biotechnology Lake Placid，纽约)，-4
0.4μg/ml氢化可的松(Sigma St.Louis，MO)，1×10 M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，纽约-4
#02400分析纯)，1×10 M邻磷酰基乙醇胺(Sigma St.Louis，)，5μg/ml胰岛素(Sigma St.Louis，MO)，5μg/ml运铁蛋白(Sigma St.Louis，MO)，20ρm三碘甲状腺原氨酸(Sigma St.Louis，MO)， 和 6.78ng/ml 硒 (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.，Milwaukee，WI)，50ng/ml L-抗坏血酸(WAKO Chemicals USA，Inc.)，0.2μg/ml L-脯氨酸(Sigma St.Louis，MO)，0.1μg/ml甘氨酸(Sigma St.Louis，MO)和0.05％聚乙二醇(PEG)(Sigma St.Louis，MO)。
[0262] 接种1天后，将培养基换成无血清的生产培养基，每2-3天换液持续21天。于21天，将标本固定于福尔马林中以便组织学分析。三份标本用于蛋白和胶原产量的分析。
[0263] 培养21天后的直径24mm的构建物，胶原产量平均为每构建物519μg，总蛋白质产量平均为每构建物210μg。形态学上，面颊成纤维细胞-基质构建物(一种口腔结缔组织的培养型组织构建物)显示由基质围绕的面颊成纤维细胞，在物理学上，该构建物具有较大体积和完整性。
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