15种男性生育相关蛋白或其组合的应用
阅读：609发布：2020-12-15
专利汇可以提供15种男性生育相关蛋白或其组合的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了15种男性生育相关蛋白或其组合的应用。具体地，本发明提供了腺苷酸激酶6(adenylate kinase6，AK6)基因或蛋白或其与其他14种男性生育相关基因或蛋白的组合的用途，用于(i)制备检测男性不育的 试剂 或 试剂盒 ；和/或(ii)制备用于避孕的药物组合物。本发明首次揭示了15个蛋白或其组合与年龄及衰老相关的新功能，可用于动物和人细胞衰老评价，人精子和 细胞质 量评价，男性不育症的诊断，并能用于男性不育症的 治疗 、避孕药的开发、抗衰老产品的开发。，下面是15种男性生育相关蛋白或其组合的应用专利的具体信息内容。
1.一种腺苷酸激酶6(adenylate kinase 6，AK6)基因或蛋白的检测试剂，或腺苷酸激酶6(adenylate kinase 6，AK6)基因或蛋白与其他男性生育相关基因或蛋白的检测试剂的组合的用途，其特征在于，用于制备检测男性不育的试剂或试剂盒，所述的其他男性生育相关蛋白包括一个或多个列于表1中的蛋白，并且当来源于检测对象的样品中AK6基因或蛋白的表达量和/或活性E1与正常人群的表达量和/或活性E2之比E1/E2≥2；和/或当来源于检测对象的样品中一种或多种选自表1中序号1-14的基因或蛋白的表达量和/或活性Ea与正常人群的表达量和/或活性Eb之比Ea/Eb≤0.5；
就表明所述的检测对象患有不育症的概率高于普通人群。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的其他男性生育相关蛋白还包括选自下表的一种或多种男性生育相关蛋白；
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合还可用于进行细胞质量的评价，所述细胞为精细胞。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合包括AK6与1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、或14种表1所示蛋白的检测试剂的组合。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的检测试剂包括AK6和/或一个或多个选自列于表1中蛋白或其基因的抗体、反义RNA、microRNA、siRNA、shRNA以及其活性抑制剂。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的AK6的抑制剂包括AK6的抗体、AK6核酸的反义RNA、microRNA、siRNA、shRNA以及AK6的活性抑制剂。
7.一种男性生育相关基因或蛋白或其调控性miRNA或它们的检测试剂的组合的用途，其特征在于，用于(i)制备检测男性不育的试剂或试剂盒；和/或(ii)制备用于判断精子来源对象的年龄的试剂或试剂盒；和/或(iii)制备判断人的年龄，或用于精子衰老评价以及精子质量评价的试剂或试剂盒，所述男性生育相关基因或蛋白包括AK6蛋白和一个或多个选自列于表1中的蛋白，所述的调控性miRNA包括AK6的调控性miRNA、和GPX5的调控性miRNA，当来源于检测对象的样品中AK6基因或蛋白的表达量和/或活性E1与正常人群的表达量和/或活性E2之比E1/E2≥2；和/或
当来源于检测对象的样品中一种或多种选自表1中序号1-14的基因或蛋白的表达量和/或活性Ea与正常人群的表达量和/或活性Eb之比Ea/Eb≤0.5；
就表明所述的检测对象患有不育症的概率高于普通人群；
并且，当用于判断精子来源对象的年龄、人的年龄，或用于精子衰老评价以及精子质量评价时，AK6蛋白与一个或多个选自列于表1中的蛋白的表达水平呈负相关。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的AK6的调控性miRNA选自下组：miR-
370，miR-544a,miR-27a,miR-27b,miR-128,miR-20a,miR-20b,miR-106b,miR-106a,miR-
17,miR-200b,miR-200c，miR-93，miR-429,miR-519d。
9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的GPX5的调控性miRNA选自下组：miR-
419-5p，miR-299-3p，miR-296-3p，miR-194，miR-134，miR-383，miR-206。
10.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的试剂为AK6蛋白或其他男性生育相关基因或蛋白的捕获试剂。
11.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的试剂包括AK6或其他男性生育相关基因或蛋白的特异性抗体、特异性扩增引物、探针或芯片。
12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的抗体包括单克隆抗体、或多克隆抗体。
13.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的试剂包括：
(a).抗AK6蛋白或其他男性生育相关基因或蛋白的特异性抗体；和/或
(b).特异性扩增AK6或其他男性生育相关基因或蛋白的mRNA或cDNA的特异性引物。
14.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的AK6来源于哺乳动物。
15.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的AK6基因的Genbank ID No为NM_
016283.4。
16.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的AK6蛋白序列如SEQ ID NO.:2所示，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。
17.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的检测包括定性和/或定量检测。
18.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的检测是对男性个体的精浆或精液样品中精子定位蛋白进行定性和/或定量检测。
19.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述检测的检测对象是男性不育或婚后1年未育女性的配偶。
20.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的检测包括蛋白芯片法、抗体芯片法、DNA芯片法、RT-PCR法、实时荧光定量PCR法、ELISA法、免疫印迹法、免疫组化法、免疫细胞化学法、流式细胞仪法、质谱法检测。
21.一种影响男性生育和/或影响男性精子受精成功率的蛋白集合，其特征在于，所述的蛋白集合包括：
AK6蛋白，以及一个或多个选自列于表1中的蛋白。
22.如权利要求21所述的蛋白集合，其特征在于，所述的蛋白集合包括CTSB，HSPA5，ALDH4A1，AK6蛋白，或其组合。
23.一种影响男性生育和/或影响男性精子受精成功率的基因集合，其特征在于，所述的基因集合中的基因分别编码权利要求21所述的蛋白集合中的蛋白。
24.一种用于检测男性不育的试剂盒，所述试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测权利要求21所述蛋白集合或权利要求23所述基因集合的检测试剂，以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测男性不育。
25.如权利要求24所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂包括CTSB，HSPA5，ALDH4A1，AK6蛋白，或其组合的单克隆抗体。
26.如权利要求24所述的试剂盒，其特征在于，所述的男性不育包括弱精症、少弱精症。
27.如权利要求24所述的试剂盒，其特征在于，所述的标签或说明书还记载如下内容：
当来源于检测对象的样品中AK6基因或蛋白的表达量和/或活性E1与正常人群的表达量和/或活性E2之比E1/E2≥2；和/或
当来源于检测对象的样品中一种或多种选自表1中序号1-14的基因或蛋白的表达量和/或活性Ea与正常人群的表达量和/或活性Eb之比Ea/Eb≤0.5；
就表明所述的检测对象患有不育症的概率高于普通人群。
28.如权利要求27所述的试剂盒，其特征在于，所述的样品包括血液样品、尿液样品、精浆/液样品、或组织样品。
29.如权利要求27所述的试剂盒，其特征在于，当所述的E1/E2≥2，和/或Ea/Eb≤0.5，还表明所述的检测对象的生活环境较差。
30.一种用于检测睾丸或附睾表达的精子结合蛋白的芯片，所述的芯片包括：
固相载体以及位于所述固相载体上的用于检测权利要求21所述蛋白集合的检测点，所述的检测点分别固定有所述的男性生育相关蛋白的捕获试剂。
31.如权利要求30所述的芯片，其特征在于，所述的捕获试剂包括特异性结合于权利要求25所述蛋白集合中蛋白的单克隆抗体。
32.如权利要求21所述的芯片，其特征在于，所述的蛋白集合至少包括1、2、3、4、5、6、7、
8、9、10、11、12、13、或14种表1所示的蛋白。
33.如权利要求30所述的芯片，其特征在于，所述的固相载体选自下组：玻璃片、塑料片、硝酸纤维膜、聚偏氟乙烯膜、微球载体。
34.一种提高男性体外受精成功率的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括(a)AK6抑制剂；(b)一个或多个选自列于表1中的蛋白或基因或其促进剂；和(c)药学上可接受的载体。
35.如权利要求34所述的药物组合物，其特征在于，所述的抑制剂包括AK6蛋白的单克隆抗体。
15种男性生育相关蛋白或其组合的应用
技术领域
背景技术
[0002] 男性不育是引起不孕症的重要因素之一。据2000年世界卫生组织(WHO)报道全球不育症约占15%，男方因素约占一半；在欧州一些国家不育症高达30%。导致男子不育的原因非常复杂广泛，涉及生殖系统解剖结构和功能、激素调节、遗传物质、感染免疫等诸多因素的异常和障碍。
[0003] 男性不育症不是一种独立的疾病，而是多种疾病或多因素综合作用的结果。虽然导致男子不育的原因非常复杂广泛，然而目前常规精液检测手段却非常局限。
[0004] 研究表明，男性不育的大部分原因是不正常的精子形成或精子缺失。人睾丸生成的精子进入附睾孵育获得成熟，而伴随着衰老过程，精子功能逐渐下降甚至完全丧失。
[0005] 尽管已有许多研究报道了附睾和睾丸的功能及其调控，然而，迄今为止，人们对于附睾和睾丸从发育到衰老的过程中各种蛋白质(尤其是精子定位蛋白)的表达情况知之甚少，更缺乏相应的、特异性的检测方法。因此本领域迫切需要寻找导致精子衰老、生育能力下降的男性生育相关蛋白。
发明内容
[0006] 本发明提供了一组与年龄相关的、男性生育相关蛋白及其组合在诊断或治疗男性不育中的应用。
[0007] 本发明第一方面，提供了一种腺苷酸激酶6(adenylate kinase6，AK6)基因或蛋白，或其与其他男性生育相关基因或蛋白的组合的用途，用于(i)制备检测男性不育的试剂或试剂盒；和/或(ii)制备用于避孕的药物组合物。
[0008] 在另一优选例中，所述的其他男性生育相关蛋白包括一个或多个列于表1中的蛋白。
[0009] 在另一优选例中，所述的其他男性生育相关蛋白还包括CN201010195377.9中所述的一种或多种男性生育相关蛋白。
[0010] 在另一优选例中，所述的腺苷酸激酶6(adenylate kinase6，AK6)基因或蛋白，或其与其他男性生育相关基因或蛋白的组合的用途，还可用于进行细胞质量的评价。
[0011] 在另一优选例中，所述的组合包括AK6与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、或14种表1所示蛋白的组合。
[0012] 在另一优选例中，所述的试剂还包括检测一个或多个选自列于表1中蛋白或其基因的检测试剂。
[0014] 在另一优选例中，所述的AK6的抑制剂包括AK6的抗体、AK6核酸的反义RNA、microRNA、siRNA、shRNA以及AK6的活性抑制剂。
[0015] 在另一优选例中，所述的拮抗剂包括一个或多个选自表1中的蛋白的抗体、编码所述蛋白核酸的反义RNA、microRNA、siRNA、shRNA以及所述蛋白的活性抑制剂。
[0016] 本发明第二方面，提供了一种男性生育相关基因或蛋白或其调控性miRNA或它们的组合的用途，用于(i)制备检测男性不育的试剂或试剂盒；和/或(ii)制备用于判断精子来源对象的年龄的试剂或试剂盒；和/或(iii)制备判断人或其他哺乳动物的年龄，或用于精子衰老评价以及精子质量评价的试剂或试剂盒。
[0017] 在另一优选例中，所述的调控性miRNA包括AK6的调控性miRNA、和GPX5的调控性miRNA。
[0018] 在另一优选例中，所述的AK6的调控性miRNA选自下组：miR-370，miR-544a,miR-27a,miR-27b,miR-128,miR-20a,miR-20b,miR-106b,miR-106a,miR-17,miR-200b,miR-
200c，miR-93，miR-429,miR-519d。
200c，miR-93，miR-429,miR-519d。
[0019] 在另一优选例中，所述的GPX5的调控性miRNA选自下组：miR-419-5p，miR-299-3p，miR-296-3p，miR-194，miR-134，miR-383，miR-206。
[0020] 在另一优选例中，所述的试剂为AK6蛋白或其他男性生育相关基因或蛋白的捕获试剂。
[0021] 在另一优选例中，所述的试剂包括AK6或其他男性生育相关基因或蛋白的特异性抗体、特异性扩增引物、探针或芯片。
[0022] 在另一优选例中，所述的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体，较佳地，为单克隆抗体。
[0023] 在另一优选例中，所述的试剂包括：
[0024] (a).抗AK6蛋白或其他男性生育相关基因或蛋白的特异性抗体；和/或
[0025] (b).特异性扩增AK6或其他男性生育相关基因或蛋白的mRNA或cDNA的特异性引物。
[0026] 在另一优选例中，所述的AK6来源于哺乳动物，较佳地来源于人或啮齿动物(小鼠、大鼠)。
[0027] 在另一优选例中，所述的AK6基因的Genbank ID No为NM_016283.4。
[0028] 在另一优选例中，所述的AK6蛋白序列如SEQ ID NO.:2所示，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。
[0029] 在另一优选例中，所述的检测包括定性和/或定量检测。
[0030] 在另一优选例中，所述的检测是对男性个体的精浆或精液样品中精子定位蛋白进行定性和/或定量检测。
[0031] 在另一优选例中，所述检测的检测对象是男性人类，较佳地，是男性不育或婚后1年未育女性的配偶。
[0032] 在另一优选例中，所述的检测包括蛋白芯片法、抗体芯片法、DNA芯片法、RT-PCR法、实时荧光定量PCR法、ELISA法、免疫印迹法、免疫组化法、免疫细胞化学法、流式细胞仪法、质谱法检测。
[0033] 本发明第三方面，提供了AK6抑制剂或其与其他男性生育相关蛋白促进剂或抑制剂的组合的用途，用于制备治疗男性不育的药物组合物；和/或(b)用于制备抗衰老组合物；
[0034] 其中，所述的其他男性生育相关蛋白包括一个或多个列于表1中的蛋白。
[0035] 在另一优选例中，所述的抗衰老组合物包括药物组合物、美容产品组合物、或保健品组合物。
[0036] 在另一优选例中，所述的AK6抑制剂或其与其他男性生育相关蛋白促进剂或抑制剂的组合还可用于药物靶点筛选、疾病预防检测，环境污染、健康管理、遗传分析、或药物疗效评价。
[0037] 在另一优选例中，所述的其他男性生育相关蛋白包括GPX5蛋白。
[0038] 在另一优选例中，所述的AK6抑制剂包括AK6的抗体、AK6核酸的反义RNA、microRNA、siRNA、shRNA以及AK6的活性抑制剂。
[0039] 在另一优选例中，所述的药物组合物包括作为活性成分的AK6抑制剂或其与其他男性生育相关基因或蛋白，或其促进剂的组合，和药学上可接受的载体。
[0040] 在另一优选例中，所述的药物组合物还包括列于表1中的蛋白或其基因以及其促进剂。
[0041] 本发明第四方面，提供了一种影响男性生育和/或影响男性精子受精成功率的蛋白集合，所述的蛋白集合包括：
[0042] (a)AK6蛋白，以及任选的一个或多个选自列于表1中的蛋白；或
[0043] (b)两个或多个选自列于表1中的蛋白。
[0044] 在另一优选例中，所述的蛋白集合包括CTSB，HSPA5，ALDH4A1，AK6蛋白，或其组合。
[0045] 本发明第五方面，提供了一种影响男性生育和/或影响男性精子受精成功率的基因集合，所述的基因集合中的基因分别编码本发明第三方面所述的蛋白集合中的蛋白。
[0046] 在另一优选例中，所述的基因包括该基因的全长序列或其片段、cDNA、或mRNA。
[0047] 在另一优选例中，所述的基因集合含有AK6基因和GPX5基因。
[0048] 在另一优选例中，所述的AK6蛋白或其基因在正常年轻男性精子中的表达量和/或活性低于正常老年男性精子中的表达量和/或活性。
[0049] 在另一优选例中，所述一个或多个选自列于表1中的蛋白或其基因在正常年轻男性精子中的表达量和/或活性高于正常老年男性精子中的表达量和/或活性。
[0050] 本发明第六方面，提供了一种用于检测男性不育的试剂盒，所述试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测本发明第四方面所述蛋白集合或本发明第五方面所述基因集合的检测试剂，以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测男性不育。
[0051] 在另一优选例中，所述的检测试剂包括CTSB，HSPA5，ALDH4A1，AK6蛋白，或其组合的单克隆抗体。
[0052] 在另一优选例中，所述的男性不育包括弱精症、少弱精症。
[0053] 在另一优选例中，所述的标签或说明书还记载如下内容：
[0054] 当来源于检测对象的样品中AK6基因或蛋白的表达量E1和/或活性与正常人群的表达量和/或活性E2之比E1/E2≥2；和/或
[0055] 当来源于检测对象的样品中一种或多种选自表1中序号1-14的基因或蛋白的表达量和/或活性Ea与正常人群的表达量和/或活性Eb之比Ea/Eb≤0.5；
[0056] 就表明所述的检测对象患有不育症的概率高于普通人群。
[0057] 在另一优选例中，所述的样品包括血液样品、尿液样品、精浆/液样品、或组织样品。
[0058] 在另一优选例中，当所述的E1/E2≥2，和/或Ea/Eb≤0.5，还表明所述的检测对象的生活环境较差。
[0059] 本发明第七方面，提供了一种用于检测睾丸或附睾表达的精子结合蛋白的芯片，所述的芯片包括：
[0060] 固相载体以及位于所述固相载体上的用于检测本发明第四方面所述蛋白集合的检测点。
[0061] 在另一优选例中，所述的检测点分别固定有所述的男性生育相关蛋白的捕获试剂(如抗体)。
[0062] 在另一优选例中，所述的捕获试剂是特异性结合于本发明第三方面所述蛋白集合中蛋白的单克隆抗体。
[0063] 在另一优选例中，所述的蛋白集合至少包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、或14种表1所示的蛋白。
[0065] 本发明第八方面，提供了一种提高男性受精成功率的药物组合物，所述的药物组合物包括(a)AK6抑制剂；任选的(b)一个或多个选自列于表1中的蛋白或基因或其促进剂；和(c)药学上可接受的载体。
[0066] 在另一优选例中，所述的抑制剂包括AK6蛋白的单克隆抗体。
[0067] 本发明第九方面，提供了一种避孕药物组合物，所述的药物组合物包括(a1)AK6基因或蛋白；任选的(b1)一个或多个选自列于表1中的蛋白或基因的拮抗剂；和(c1)药学上可接受的载体。
[0068] 本发明第十方面，提供了一种检测或诊断男性不育症的方法，所述的方法包括步骤：
[0069] (i)检测来源于对象样品中本发明第四方面所述的蛋白集合或本发明第五方面中所述的基因集合的表达量和/或活性；
[0070] (ii)根据(i)中的测定结果检测或诊断所述的对象是否患有男性不育症；
[0071] 其中当来源于检测对象的样品中AK6基因或蛋白的表达量E1和/或活性与正常人群的表达量和/或活性E2之比E1/E2≥2；和/或
[0072] 当来源于检测对象的样品中一种或多种选自表1中序号1-14的基因或蛋白的表达量和/或活性Ea与正常人群的表达量和/或活性Eb之比Ea/Eb≤0.5；
[0073] 就表明所述的检测对象患有不育症的概率高于普通人群。
[0074] 在另一优选例中，所述的检测方法还包括检测AK6调控性miRNA。
[0075] 在另一优选例中，所述AK6调控性microRNA包括：miR-370，miR-544a,miR-27a,miR-27b,miR-128,miR-20a,miR-20b,miR-106b,miR-106a,miR-17,miR-200b,miR-200c，miR-93，miR-429，miR-519d。
[0076] 在另一优选例中，相较于正常人群精子，miR-370，miR-544a，miR-27a，miR-27b，miR-128，miR-20a，miR-20b，miR-106b，miR-106a，miR-17，miR-200b，miR-200c在少弱精子症患者中表达降低。
[0077] 在另一优选例中，相较于正常人群精子，miR-93，miR-429在弱精子症患者中表达降低。
[0078] 在另一优选例中，相较于正常人群精子，miR-519d在老年、弱精子症和少弱精子症患者中均有明显降低。
[0079] 在另一优选例中，当所述AK6调控性miRNA在所述检测对象中低表达，则表明所述的检测对象患有不育症的概率高于普通人群。
[0080] 在另一优选例中，所述的检测方法还包括检测GPX5调控性miRNA。
[0081] 在另一优选例中，所述的GPX5调控性miRNA包括：miR-419-5p,miR-299-3p,miR-296-3p,miR-194,miR-134，miR-383，miR-206。
[0082] 在另一优选例中，所述的GPX5调控性miRNA在所述检测对象中高表达，则表明所述的检测对象患有不育症的概率高于普通人群。
[0083] 本发明第十一方面，提供了一种提高男性受精成功率和/或治疗不育症的方法，所述的方法包括将本发明第九方面所述的药物组合物，或选自以下一种或多种物质与受精获能液接触：
[0084] (a1)AK6抑制剂；
[0085] (b1)一个或多个选自列于表1中的蛋白或其基因或其促进剂；
[0086] (a1)和(b1)的组合；
[0087] 从而提高男性受精成功率和/或治疗不育症。
[0088] 本发明第十二方面，提供了一种判断精子来源对象的年龄；和/或判断精细胞衰老；和/或评价精子和细胞质量的的方法，包括步骤：(i)检测来源对象样品中本发明第四方面所述的蛋白集合或本发明第五方面中所述的基因集合的表达量和/或活性；
[0089] (ii)根据(i)中的测定结果判断所述的对象的年龄范围、或精细胞的衰老情况、或精子和细胞质量。
[0090] 在另一优选例中，当AK6蛋白在精子(精细胞)中高表达、1个或多个选自表1的蛋白在精子(精细胞)中低表达，则表明精子来源对象年龄较大，精细胞的衰老程度较高，或精子的质量较差。
[0091] 在另一优选例中，当AK6蛋白在精子(精细胞)中低表达、1个或多个选自表1的蛋白在精子(精细胞)中高表达，则表明精子来源对象较年轻，精细胞的衰老程度较低，或精子的质量较好。
[0093] 图1显示了精子定位蛋白LMNB2、HADH、UAP1、CALR、AKR7A2、GPX5、HSPA5、CTSB在青年人（30±2岁）和老年人（70±2岁）射出精子上的免疫荧光定位图（图1，A1-I1，图1，A2-I2），及其在30、40、50、60、65、70岁（±2岁）六个不同年龄组精子上的定量（图1，A3-I3）和定位率（图1，A4-I4）统计分析结果。其中，小横(bar)代表20微米，红色溴化乙锭染色指示核，白色箭头指示为绿色异硫氰酸荧光素染色的目标蛋白在精子上的定位定量。
[0094] 图2显示了精子定位蛋白HSPA1L、CLDN7、GP83、ALDH2、ALDH4A1、KLHL15在青年人（30±2岁）和老年人（70±2岁）射出精子上的免疫荧光定位图（图2，A1-F1，图2，A2-F2），及其在30、40、50、60、70岁（±2岁）五个不同年龄组精子上的定量（图2，A3-F3）和定位率（图2，A4-F4）统计分析结果。其中，小横(bar)代表10微米，红色溴化乙锭染色指示核。
[0095] 图3显示了精子定位蛋白HSPA5的表达纯化SDS-PAGE电泳图。其中，各泳道如下：1.分子量标准品(Marker)；2.亲和纯化后的HSPA5蛋白(又称GRP78蛋白)；3.破菌上清；4.亲和纯化时去除的杂蛋白。
[0096] 图4显示了CTSB，HSPA5，ALDH4A1，AK6在正常青年人Young（30±2岁）、老年人Aged（70±2岁）、弱精症患者（Asthenozoospermia）精子上的荧光定位及强度。绿色箭头指正常青年人精子定位蛋白表型，黄色箭头指青年弱精症精子定位蛋白表达减弱表型，红色箭头指精子定位蛋白增强或缺失表型，标尺10微米。
[0097] 图5显示了AK6在正常青年人（30±2岁）与老年人（70±2岁）精子上的定量和定位率统计分析结果。
[0098] 图6显示了7种年龄相关的精子定位蛋白mRNA在不同来源精子中的定量检测结果。Young adult指正常青年人，Aged指老年人，Asthenozoospermia指弱精症患者，Oligo asthenozoospermia指少弱精症患者。
[0099] 图7显示了正常青年人、老年人、弱精子症及少弱精子症患者精子中15个AK6调控相关miRNA表达的qRT-PCR分析结果。
[0100] 图8显示了正常青年人、老年人、弱精子症及少弱精子症患者精子中9个GPX5调控相关miRNA表达的qRT-PCR分析结果。
具体实施方式
[0101] 本发明人经过广泛深入的研究，首次发现了腺苷酸激酶6(AK6)蛋白与人男性不育之间存在着密切的相关性，即在男性不育患者中，AK6的表达量和/或活性增高，且AK6的表达量和/或活性在正常人群中也随着年龄的上升而增高。本发明人通过实验发现，降低AK6的表达量和/或活性能够增加男性受精的成功率。此外，本发明人还发现，将AK6与表1中的14种蛋白组合应用，更有助于男性不育症的诊断，而当降低AK6的表达量和/或活性，或同时增高一种或多种选自表1中14种蛋白的表达量和/或活性，能够对男性不育症，尤其是弱精症、少弱精症具有治疗作用。在此基础上，完成了本发明。
[0102] 精子定位蛋白
[0103] 如本文所用，术语“本发明蛋白”、“男性生育相关蛋白”、“本发明的精子定位蛋白”、“精子定位蛋白”和“与年龄相关的精子定位蛋白”可互换使用，指在雄性哺乳动物(尤其人)的睾丸和/或附睾中表达的、与年龄相关的、在精子上有定位的蛋白。其相关的分子生物学材料包括（但不限于）：突变蛋白、蛋白的任意片段、基因及其任意DNA片段、突变基因、mRNA、干扰RNA、抗体等。代表性的精子定位蛋白包括表1中所示的14种下调蛋白和1种上调蛋白(AK6)。
[0105] 在表1所示的14种蛋白中，有14种在老年人精子上、弱精症患者精子上含量少，归类于老年人或弱精中表达下调的精子定位蛋白（序号1-14）；另一种本发明蛋白(AK6)在老年人精子、弱精症患者精子上含量高，归类于老年人或弱精中表达上调的精子定位蛋白。
[0106] 表1与年龄相关的15种人精子定位蛋白
[0107]
[0108]
[0109] 编码SEQ ID NO.:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30所示蛋白的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29所示。
[0110] 蛋白集合
[0111] 本发明提供了一种可用于诊断或治疗男性不育的蛋白集合，所述的蛋白集合至少含有AK6，以及其他男性不育相关的蛋白，尤其是精子定位蛋白。通常，本文所述的“其他男性不育相关的蛋白”指的是现有技术中发现的与男性不育存在相关联性的蛋白。优选的，本发明的蛋白集合包括了AK6以及表1中一种或多种的精子定位蛋白。其中，AK6蛋白是本发明新发现的与男性不育密切相关，且在年轻人和老年人中有差异性表达的蛋白。
[0112] 应理解，本发明的蛋白集合包括(a)AK6蛋白，以及任选的一个或多个选自列于表1中的蛋白；或
[0113] (b)2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、或14个任意选自列于表1中的蛋白。
[0114] 本发明人通过实验发现，AK6、表1中的任意个的蛋白、或其组合在年轻人与老年人精子中的表达量和/或活性具有显著的差异，因此可以作为判断精子衰老、功能衰退的目标蛋白。通过深入的研究，本发明人还发现了其中的部分蛋白还在已经确诊为弱精症、少弱精症的患者中呈现与正常人群(年轻人)的差异性表达。
[0115] 根据以上实验结果，本发明人获得了能够用于诊断或治疗男性不育的蛋白集合。即将AK6与现有技术(尤其是本发明表1)中的蛋白进行组合的蛋白集合，测定这些蛋白集合的表达量和/或活性，有助于判断或预测所检测的对象患有不育症的几率。而研发针对这些蛋白集合的抗体，可有助于治疗男性不育症或开发成为避孕的药物。例如，制备AK6蛋白的单克隆抗体。
[0116] 应理解，本发明的蛋白集合可以是AK6与任意男性不育相关蛋白形成的集合。通过对AK6或其他男性不育相关蛋白进行表达量和/或活性的调控，可以分别制备提高受精率(促进生育)或降低受精率(避孕)的药物组合物。
[0117] 此外，本发明还提供了编码本发明蛋白集合的基因集合，所述的基因集合包括编码蛋白的cDNA、完整的基因序列，或与原始编码核酸有70%、80%，更佳地85%、90%、95%以上同源性的核酸序列。利用这些基因(或编码核酸)的集合，可以通过常规手段制备其反义核酸，或测定其mRNA，或通过测定相应的miRNA进行对这些基因的定性或定量检测。
[0118] miRNA
[0119] 本发明提供了一种诊断或预测/检测不育症的目标基因集合，可采用本发明基因集合中各个基因已知的miRNA来测定所述的基因集合的表达量。
[0120] 一种优选的基因调控相关miRNA如下所示：
[0121] 在AK6的基因调控相关miRNA中，miR-370，miR-544a,miR-27a,miR-27b,miR-128,miR-20a,miR-20b,miR-106b,miR-106a,miR-17,miR-200b,miR-200c在少弱精子症组中表达降低，miR-93，miR-429在弱精子症组中表达降低，miR-519d在老年、弱精子症和少弱精子症患者中均有明显降低。AK6基因调控相关miRNA的序列如下所示：
[0122]miRNA SEQ ID NO.: 序列
hsa-miR-128 31 TCACAGTGAACCGGTCTCTTT
hsa-miR-27a 32 TTCACAGTGGCTAAGTTCCGC
hsa-miR-27b 33 TTCACAGTGGCTAAGTTCTGC
hsa-miR-200b 34 TAATACTGCCTGGTAATGATGA
hsa-miR-200c 35 TAATACTGCCGGGTAATGATGGA
hsa-miR-429 36 TAATACTGTCTGGTAAAACCGT
hsa-miR-370 37 GCCTGCTGGGGTGGAACCTGGT
hsa-miR-544a 38 ATTCTGCATTTTTAGCAAGTTC
hsa-miR-106b 39 TAAAGTGCTGACAGTGCAGAT
hsa-miR-519d 40 CAAAGTGCCTCCCTTTAGAGTG
hsa-miR-106a 41 AAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAG
hsa-miR-17 42 CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAG
hsa-miR-20a 43 TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAG
hsa-miR-20b 44 CAAAGTGCTCATAGTGCAGGTAG
hsa-miR-93 45 CAAAGTGCTGTTCGTGCAGGTAG
hsa-miR-128 31 TCACAGTGAACCGGTCTCTTT
hsa-miR-27a 32 TTCACAGTGGCTAAGTTCCGC
hsa-miR-27b 33 TTCACAGTGGCTAAGTTCTGC
hsa-miR-200b 34 TAATACTGCCTGGTAATGATGA
hsa-miR-200c 35 TAATACTGCCGGGTAATGATGGA
hsa-miR-429 36 TAATACTGTCTGGTAAAACCGT
hsa-miR-370 37 GCCTGCTGGGGTGGAACCTGGT
hsa-miR-544a 38 ATTCTGCATTTTTAGCAAGTTC
hsa-miR-106b 39 TAAAGTGCTGACAGTGCAGAT
hsa-miR-519d 40 CAAAGTGCCTCCCTTTAGAGTG
hsa-miR-106a 41 AAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAG
hsa-miR-17 42 CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAG
hsa-miR-20a 43 TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAG
hsa-miR-20b 44 CAAAGTGCTCATAGTGCAGGTAG
hsa-miR-93 45 CAAAGTGCTGTTCGTGCAGGTAG
[0123] 而在GPX5基因调控相关miRNA中，miR-419-5p，miR-299-3p，miR-296-3p，miR-194，miR-134，miR-383，miR-206在少弱精子症和弱精症患者中均显著升高。GPX5基因调控相关miRNA的序列如下所示：
[0124]miRNA SEQ ID NO.: 序列
hsa-miR-194 46 TGTAACAGCAACTCCATGTGGA
hsa-miR-134 47 TGTGACTGGTTGACCAGAGGGG
hsa-miR-194 46 TGTAACAGCAACTCCATGTGGA
hsa-miR-134 47 TGTGACTGGTTGACCAGAGGGG
[0125] hsa-miR-206 48 TGGAATGTAAGGAAGTGTGTGGhsa-miR-383 49 AGATCAGAAGGTGATTGTGGCT
hsa-miR-296-3p 50 GAGGGTTGGGTGGAGGCTCTCC
hsa-miR-299-3p 51 TATGTGGGATGGTAAACCGCTT
hsa-miR-491-5p 52 AGTGGGGAACCCTTCCATGAGG
hsa-miR-296-3p 50 GAGGGTTGGGTGGAGGCTCTCC
hsa-miR-299-3p 51 TATGTGGGATGGTAAACCGCTT
hsa-miR-491-5p 52 AGTGGGGAACCCTTCCATGAGG
[0126] 因此，本领域技术人员可根据本发明的启示以及现有技术中miRNA的筛选方法，测定本发明基因组合中各基因调控相关的miRNA，从而开发更多的男性不育相关的检测试剂或试剂盒，以及治疗男性不育的药物组合物。
[0127] 检测方法
[0128] 在本发明中，还提供了定性或定量检测本发明15种精子定位蛋白及其相关分子生物学材料的方法，其中包括(但并不限于)：人精子定位蛋白检测，基因突变的检测，基因转录的mRNA的检测，调控相关miRNA的检测，突变蛋白的检测，蛋白活性的检测。供检测的生物样本包括（但并不限于）：精子、精液、尿液、血液、前列腺液。
[0129] 代表性的检测方法包括(但并不限于)：蛋白芯片、抗体芯片、DNA芯片、液态芯片、ELISA法、免疫印迹法、RT-PCR、实时荧光定量PCR法、免疫组化法、免疫荧光法、流式细胞仪法、质谱法、毛细管电泳法、免疫沉淀法、酶活检测法等。
[0130] 弱精症
[0131] 根据WHO人类精液实验室检验手册第5版的规定，前向运动（PR）精子所占的比例小于32%的为弱精症。本发明所述弱精症是指精液常规其他各项（如畸形率、精子密度、白细胞数、精液量等）基本正常的青年弱精症。
[0132] 少弱精症
[0133] 本发明所述少弱精症是指精液中前向运动精子所占比例<32%，精子浓度<15*106/ml或一次射精<39*106的人。
[0134] 人精子定位蛋白的定性或定量检测
[0136] 通常地，将特异性抗体与检测标本(精子)共同孵育后，通过荧光标记的二抗来确定精子定位蛋白的定位，进而通过激光共聚焦显微镜的扫描结果来计算蛋白的定位率和含量。利用共聚焦扫描显微镜定量精子蛋白表达的方法如下：以400倍放大比例观察免疫荧光片。顺序观测包含精子的视野（该视野要求没有非精子细胞，精子尾部没有重叠，视野中精子尾部应该完整）直到视野中精子总数达200个。背景荧光选取没有精子的空白区域计量。荧光值低于或者高于空白值（大约均值为10）的精子用于统计染色精子比率。LSM510META自带软件（LSM5version3.2）自动测量所有染色精子的荧光值，扣除荧光背景阈值，然后给出染色精子的平均免疫荧光强度值。该方法检测的结果与通过流式细胞仪检测的结果是一致的。流式细胞仪对蛋白定位率和含量的检测方法如下：精子洗涤及准备同前者，精子样本的荧光值通过BD流式细胞仪进行测定，计数10000个精子，使用Cellquest软件进行分析染色细胞比率和染色细胞荧光强度。
[0137] 特异性的荧光标记抗体可以溶解在溶液中，与精子表面结合，通过流式细胞仪等检测手段定性或定量地测定流动的精子表面蛋白含量；也可以将抗体固定在支持物(例如聚乙烯板，免疫微球，玻璃片、硝酸纤维膜、PVDF膜等)上，用普通扫描仪定性或定量地测定阳性精子百分含量；还可以将抗体偶联到磁珠或塑料珠子上，通过液体芯片的双抗夹心法定性或定量检测精浆或精子裂解液等样本中的精子定位蛋白。
[0138] 蛋白芯片及其在人精浆等样本检测中的应用
[0139] 本发明还提供了可用于检测精子定位蛋白的蛋白芯片。这种芯片可以定性地或定量的检测样品中的精子定位蛋白含量。这些检测结果可以辅助性地用于判断例如精子质量、精子的功能水平和/或精子质量下降的原因。
[0140] 术语“蛋白质阵列”或“蛋白芯片”可互换使用，都指捕获试剂能结合蛋白质标志物的阵列，包括液体芯片。典型地，捕获试剂为多克隆或单克隆抗体，可以与特异的蛋白质结合。当标志物被捕获后，再用标记的检测分子检测，达到定性或定量（使用标准品）检测的目的。
[0141] 本发明蛋白质芯片的特点在于，在所述的芯片上设置有精子定位蛋白的检测点，如本文所用，术语“检测点”指位于蛋白芯片上，用于检测某一蛋白质所对应的点样点，例如用于检测AK6蛋白的检测点，通常是将抗AK6蛋白的单克隆抗体点样于芯片基片或偶联到磁珠、塑料珠子所形成的。
[0142] 适用于本发明的蛋白质芯片没有特别限制，可以采用本领域中各种已知结构的空白蛋白质芯片。通常，这些蛋白质芯片载体包括：磁珠、塑料珠、免疫微球、玻璃片、塑料片、硝酸纤维膜、PVDF膜等，其中特别优选的是磁珠、塑料珠、免疫微球和各种基片。采用原位合成、机械点样或共价结合的方法将多肽、蛋白、或抗体有序地固定偶联于各种载体上成为检测用的芯片，将标记荧光的抗体或其他成分与结合了待检样品的芯片相互作用，经漂洗将未能与芯片上蛋白质互补结合的成分洗去，再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片或其它载体上各点的荧光强度，来分析每种蛋白质的含量，由此达到测定各种蛋白质的目的。
[0143] 本发明的蛋白质芯片可以含有一种或多种表1中所示的精子定位蛋白，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15种本发明首次揭示的精子定位蛋白的检测点。这15个检测点可以单独使用，也可以任意组合使用，或者与已公开的精子检测指标联合使用，用于精子质量评价、男性不育诊断等。
[0144] 产业应用
[0145] 精子生成、成熟与衰老主要表现在睾丸附睾分泌并结合在精子上的蛋白分子的量，增多、减少或残缺都会导致精子成熟障碍或功能异常，进而造成男性不育。基于本发明，精子定位蛋白的检测方法和检测工具可用于检测与年龄相关的15种精子定位蛋白的含量，进而判断精子质量，诊断男性不育。
[0146] 例如，通过测定14种表达下调的精子定位蛋白的含量，来获得一些检测或诊断结果，如精子质量、精子健康状态、是否不育等。总之，这14种精子定位蛋白的含量高了，就提示精子健康状态好、质量好或精子来自正常青年人；含量低，则提示精子健康状态欠佳或精子来自老年人。
[0147] 此外，补充这14种表达下调的精子定位蛋白中的一种或多种，有助于改善精子的健康状态，增强精子活力。
[0148] 对于正常人，通过抗体封闭或者siRNA干扰等方法，降低这14种表达下调的精子定位蛋白的表达或活性，有助于避孕。
[0149] 就不同领域而言，代表性的应用包括(但并不限于)：
[0150] (a)精子质量和健康状态的评价：通过测定精子上或精浆中本发明蛋白的含量，来评价精子健康状态和质量。14种表达下调蛋白含量低或缺失，1种表达上调蛋白（如AK6蛋白）含量高，则表明精子健康状态差，精子质量水平低，精子有残缺现象；反之，说明健康状态好，精子质量高。
[0151] (b)男性不育症的诊断：通过测定精子上或精浆中本发明蛋白的含量，来诊断男性不育症。14种表达下调蛋白含量低或缺失，1种表达上调蛋白含量高，则提示可能发生不育。
[0152] (c)环境污染评价：通过检查精子上本发明蛋白的含量，进行生殖健康的预防检测或环境污染评价。生活在不同地方的人，如果蛋白含量低，说明所生活的环境不好。通过统计学分析大量人群，有助于判断环境问题。
[0153] (d)人类健康管理：对本发明蛋白在人类样品（如血、尿、精浆、组织等）中的含量进行测定，如果超出正常范围，则提示说明健康可能出现问题，需要进一步检查或诊断。
[0154] (e)年龄鉴定：例如，在法医领域，通过本发明蛋白含量的测定，可鉴定或辅助测定年龄。
[0155] (f)保健、治疗应用：通过补充本发明蛋白，可以治疗和该蛋白功能相关的疾病，有助于增强精子活力、治疗男性不育症。例如，制成栓剂，体外用于女性生殖道；或制成注射剂，用于男性（局部注射、皮下注射等）。
[0156] (g)避孕：使用抗本发明蛋白的抗体，可被制成制剂（如栓剂），用于避孕。
[0157] (h)药物靶点和筛选：本发明蛋白可用作药物靶点，用于避孕药物或者男性不育症治疗药物的筛选。
[0158] (i)疗效评价指标：本发明蛋白的含量变化，可用作对男性不育症治疗手段的疗效进行评价的辅助指标。
[0159] (j)毒性试验：通过测定动物精子或精浆中该蛋白的含量变化，来评价药品、化学品、化妆品等对生殖的影响。
[0160] 以上应用的完成，除了可以通过测定这15种蛋白在人类样本中的含量变化来实现，还可以通过检测基因的突变、转录水平、氨基酸变化、核苷酸或氨基酸的增加缺失、调控相关miRNA水平、抗体等来实现。
[0161] 本发明的主要优点在于：
[0162] (a)可快速有效的获得与年龄相关的精子定位蛋白含量的检测结果。
[0163] (b)本发明蛋白的相关分子生物学材料及其检测方法，有助于推进对男性不育症的诊断、治疗、预防有关的医疗技术以及诊断剂、治疗药、预防药或避孕药的开发。
[0164] (c)本发明蛋白还可用于判断人或其他哺乳动物的年龄，或用于细胞衰老评价以及精子和细胞质量评价，或用于抗衰老产品的开发。
[0165] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0166] 通用方法
[0167] 基因的克隆、原核表达及蛋白纯化
[0168] 上述15种基因的蛋白产品可通过如下方法获得。根据基因序列，合成一对扩增成熟编码区的特异引物。以用常规方法制备的人附睾cDNA文库为模板，通过PCR直接扩增目的基因，然后克隆至市售的载体pGM-T vector(购自上海贝博生物公司)进行测序鉴定正确。将经过测序鉴定后的基因通过酶切位点克隆至表达载体pET32b(+)(购自上海贝博生物公司)中，使其与融合标签的阅读框一致。将重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，超声破碎菌体，根据载体中的His-Tag标签，运用“两步镍亲和层析法”对重组蛋白进行分离纯化。
[0169] 实施例1表1中15种精子定位蛋白在不同年龄人精子上的定量分析
[0170] 收取不同年龄正常人精液标本（30、40、50、60、65、70±2岁）各30例，均无生殖系统疾病记录。待精液完全液化后分别将1ml精液加入15ml无菌圆锥底试管中，然后分别加PBS至8ml，轻轻吹打混匀后500g离心15min。弃上清，然后再用PBS洗涤2次(500g，10min)，弃上清，所收集精子沉淀用含3%(w/v)BSA的PBS调整精子浓度为1×106个/ml，然后分别涂布在0.1%明胶包被的片子上，室温自然干燥，-20℃甲醇固定10min，干燥后用PBS洗3次，每次
5min；然后滴加针对目标蛋白的一抗(用含3%BSA的PBS按1:50稀释)室温孵育1h。PBS洗涤3次，每次5min。加入FITC标记的二抗(用含3%BSA的PBS按1:100稀释)，室温孵育1h。PBS洗3次，每次5min。PI复染，蒸馏水洗2次，每次10min。缓冲甘油封片，分别置Meta510激光共聚焦显微镜(Zeiss,Germany)下进行蛋白的定位和定量分析。
5min；然后滴加针对目标蛋白的一抗(用含3%BSA的PBS按1:50稀释)室温孵育1h。PBS洗涤3次，每次5min。加入FITC标记的二抗(用含3%BSA的PBS按1:100稀释)，室温孵育1h。PBS洗3次，每次5min。PI复染，蒸馏水洗2次，每次10min。缓冲甘油封片，分别置Meta510激光共聚焦显微镜(Zeiss,Germany)下进行蛋白的定位和定量分析。
[0171] 结果如图1和图2所示，14种精子定位蛋白(表1中序号为1－14的14种蛋白)在精子上的定位率和含量随年龄增加呈现出逐步下降的趋势，在某些老年精子中还发现了定位蛋白缺失现象。
[0172] 而表1中序号为15的精子定位蛋白AK6是表达上调的，其在老年人精子上的定位率和含量明显高于正常青年人(见图4、图5)。这提示，AK6蛋白在老年人精子中的高表达或许是代偿性缓解精子低能量状态的一种方式。
[0173] 实施例2重组蛋白的鉴定
[0174] 对纯化后的15个重组蛋白用Bradford(Bradford1976)法进行定量鉴定，然后冷冻干燥进行保存。图3显示了15种精子定位蛋白中的一种，即HSPA5基因对应的蛋白（也称为GRP78蛋白）的表达纯化SDS-PAGE电泳结果。
[0175] 经鉴定，纯化获得的重组蛋白为本发明蛋白。
[0176] 实施例3弱精症精子相关蛋白分析
[0177] 收集青年弱精样本102例，对CTSB，HSPA5，ALDH4A1，AK6这4种蛋白在弱精精子上的定位率和含量进行定量分析。具体方法同实施例1，结果见图4。
[0178] 结果表明，弱精症精子中CTSB，HSPA5，ALDH4A1这3种蛋白其定位呈现显著缺失的比例分别为45.1%，45.1%和57.8%，总覆盖率达到85.5%，即85%以上的弱精症精子至少含有一种上述蛋白的表达缺陷，而AK6则表现出增高趋势。可见，通过对这4种蛋白在精子上的定量检测，有助于弱精症、男性不育的诊断。
[0179] 实施例4单克隆抗体的制备和应用
[0180] 4.1单克隆抗体的制备
[0181] 本发明蛋白的单抗可通过常规蛋白单克隆抗体制备方法制备而得，优选地，本实施例通过如下方法获得：采用各纯化的本发明重组蛋白分别免疫BALB/C小鼠，每只老鼠于第1天注射50μg重组蛋白与等量的完全福氏佐剂(CFA)；然后在第15，30和45天分别注射25μg重组蛋白和等量的不完全福氏佐剂(IFA)加强免疫。末次免疫后3～4天，分离脾细胞与Sp2骨髓瘤细胞株混合后加入PEG使细胞彼此融合，将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养，一般稀释至0.8个细胞/孔，细胞培养至覆盖20%孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。筛选出的阳性细胞株小鼠腹腔接种，收集腹水，用葡萄球菌A蛋白制备亲和层析柱富集其中的抗体，然后洗脱回收单克隆抗体。
[0182] 4.2采用4.1中的单克隆抗体进行蛋白免疫荧光定位
[0183] 收集精子用PBS洗涤后涂布于1%明胶包被的载玻片上，自然晾干，然后用甲醇固定10分钟。含有精子的载玻片用3%BSA在室温下封闭1小时，然后添加4.1中制备所得的每种蛋白单抗(1：200)，4℃过夜。用PBST(PBS containing0.1%Tween-20)洗涤三次，加入对应的FITC-标记羊抗鼠IgG二抗(1:200)。载玻片用PBST洗涤三次，然后用80%甘油封片。用Olympus BX-52显微镜观察结果。结果列于表1。各蛋白分别定位于成熟精子尾部、颈部和顶体等部位。
[0184] 实施例5蛋白质芯片的制备
[0185] 用以下方法制备蛋白质芯片No.1-3:
[0186] a载玻片芯片No.1
[0187] (1)用高速点样仪将多孔板中的各蛋白质样品(抗本发明蛋白的抗体)，直接高密度地点印于经化学处理过的、表面具有活性醛基的载玻片上，每阵列15个样点(分别对于表1中序号为1-15的15种蛋白)，每个样点直径0.4mm；
[0188] (2)于室温过夜或于37℃温育1小时，使蛋白质的氨基与载玻片上的醛基发生缩合反应，以固定样品；
[0189] (3)还原载玻片上未被蛋白质占据的活性醛基，然后充分洗涤并室温干燥；
[0190] (4)最后用避光材料密封包装并保存于4℃环境中。
[0191] b PVDF膜芯片No.2
[0192] (1)用高速点样仪将多孔板中的各蛋白质样品(抗本发明蛋白的抗体)点到PDVF膜上，每阵列15个样点(同上)，每个样点直径0.4mm；
[0193] (2)用缓冲液漂洗膜2-3次，每次3-6分钟，
[0194] (3)用5%的小牛血清或脱酯奶粉室温下封闭1-2小时，
[0195] (4)再用缓冲液漂洗膜2-3次，每次3-6分钟；
[0196] (5)干燥后，用避光材料密封包装并保存于4℃环境中。
[0197] c液态芯片No.3
[0198] （1）制备待检蛋白对应的抗体对，一种作为捕获抗体，一种作为检测抗体。
[0199] （2）将捕获抗体偶联到磁珠上，一种捕获抗体对应一种序号的磁珠。
[0200] （3）对检测抗体进行荧光标记。
[0201] （4）对捕获抗体和检测抗体进行优选，防止不同待测蛋白之间发生交叉反应。
[0202] 实施例6栓剂处方及制备工艺
[0203] 5.1配方
[0204] 组分 用量
[0205] HSPA5蛋白 5mg
[0206] β-CD 10mg
[0207] 吐温80 2mg
[0209] 5.2制备工艺：
[0211] 2.将36型半合成脂肪酸酶加热溶解后保温38℃，加主药的包合物、吐温80，充分混合均匀保温。
[0212] 3.将混合均匀的保温物灌膜冷却成形。
[0213] 实施例8制备用于提高体外受精成功率的药物
[0214] 通过检测用于体外受精的精子上15种上述蛋白的含量，确定含量偏低的蛋白，将实施例2中获得的该精子定位蛋白或多种蛋白的组合物置换到体外受精获能液中，然后让精子和卵子在含蛋白的获能液中完成受精过程。对于男性不育障碍、弱精症患者，加入蛋白后30min就能提高精子活力，增加前向运动精子数量，进而提高体外受精的成功率。
[0215] 实施例9精子定位蛋白对应的mRNA的定量检测
[0216] 收集30±5岁正常青年人、弱精症患者、少弱精症患者，70±2岁老人精液样本各10例，进行PBS洗涤3次，镜检计数，离心获得的精子采用Trizol法提取精子RNA。精子RNA样本用CD52，CDH1基因筛选后，进行Real-time PCR。
[0217] 每组样品进行3个平行实验。按照Invitrogen公司 Green qPCR SuperMix-UDG反应试剂盒的产品说明进行反应，使用QIAGEN公司的Rotor-Gene Q进行荧光定量PCR检测，反应条件为：50℃10min，95℃10min，95℃15s，60℃45s，40循环。采用2-△△CT法计算靶基因相对表达水平(Kenneth J，et al)。△△CT=(Ct(实验组目标基因)-Ct(实验组内参基因))-(Ct(对照组目标基因)-Ct(对照组内参基因))。选用GAPDH作为内参基因。
[0218] 使用上述方法检测表1中15种基因在正常青年人精子中的mRNA转录水平，结果7个基因可检测到。进一步分析其在老年人，弱精症，少弱精症精子中的转录水平，发现其中AK6的mRNA在老年人精子中的含量是正常青年人的2倍，在少弱精症患者精子中的含量是青年人的8倍，GPX5的mRNA在老年人精子中的含量是正常青年人的0.12倍，在少弱精症患者精子中的含量是正常青年人的0.07倍。UAP1，CTSB,HSPA1L,HSPA5，CALR mRNA在正常青年人精子和老年人精子、弱精症精子、少弱精症精子中的含量无明显差别。统计结果见图6。
[0219] 实施例10AK6基因调控相关miRNA在精子中的定量检测
[0220] 联合使用TargetScan(http://www.targetscan.org/)和miRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)两个软件同时预测调控AK6转录的miRNA分子。
TargetScan预测到53个miRNA，miRanda预测到17个miRNA，其中有15个miRNA是两个数据库重叠的。对这15个miRNA在精子中的含量进行定量检测。方法如下：选取正常人捐献的精子、弱精症患者捐献的精子、老年人捐献的精子（70±2岁）、少弱精子症患者捐献的精子各10份提取总RNA。对于每个miRNA反转录反应，用miRNA特异性茎环引物、1ng-1μg总RNA及ReverTra Ace反转录酶(Toyobo)。PCR时使用miRNA特异性正向引物和通用反向引物(URP)，仪器为QIAGEN’s Roter-Gene Q。在20μL反应体系中，包含了1μL cDNA模板，PCR反应条件为
95℃5分钟,95℃10秒，60℃45秒，共40个循环。PCR所用的酶为Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG，购自Life Technologies公司(货号:11733-038)。U6snRNA作为参照基因。运-△△Ct
用2 方法来计算样本中miRNA含量的差异。所有的实验重复三次。结果见图7。
TargetScan预测到53个miRNA，miRanda预测到17个miRNA，其中有15个miRNA是两个数据库重叠的。对这15个miRNA在精子中的含量进行定量检测。方法如下：选取正常人捐献的精子、弱精症患者捐献的精子、老年人捐献的精子（70±2岁）、少弱精子症患者捐献的精子各10份提取总RNA。对于每个miRNA反转录反应，用miRNA特异性茎环引物、1ng-1μg总RNA及ReverTra Ace反转录酶(Toyobo)。PCR时使用miRNA特异性正向引物和通用反向引物(URP)，仪器为QIAGEN’s Roter-Gene Q。在20μL反应体系中，包含了1μL cDNA模板，PCR反应条件为
95℃5分钟,95℃10秒，60℃45秒，共40个循环。PCR所用的酶为Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG，购自Life Technologies公司(货号:11733-038)。U6snRNA作为参照基因。运-△△Ct
用2 方法来计算样本中miRNA含量的差异。所有的实验重复三次。结果见图7。
[0221] 结果显示，相对于正常人精子组，miR-370，miR-544a,miR-27a,miR-27b,miR-128,miR-20a,miR-20b,miR-106b,miR-106a,miR-17,miR-200b,miR-200c在少弱精子症组中表达降低，miR-93，miR-429在弱精子症组中表达降低，miR-519d在老年、弱精子症和少弱精子症患者中均有明显降低。通过这15个miRNA的定量检测，有望实现对弱精症、男性不育等的辅助诊断。
[0222] 实施例11GPX5基因调控相关miRNA在精子中的定量检测
[0223] GPX5转录调控相关miRNA的预测及其在精子中的定量检测方法同实施例11。共预测到9个GPX5转录调控相关miRNA，其在正常青年人、老年人（70±2岁）、弱精症患者、少弱精症患者精子中的定量检测结果见图8。
[0224] 结果显示，相对于正常人精子组，这9个miRNA在老年和少弱精子症患者中表达增高至少2.5倍。其中miR-419-5p，miR-299-3p，miR-296-3p，miR-194，miR-134，miR-383，miR-206在少弱精子症组表达增高至少66倍，在弱精组中表达增高至少2.4倍。
[0225] 讨论
[0226] 目前，临床上已有少数精浆蛋白用于不育症的辅助诊断和治疗，多项标志物联合检测可筛选和提高诊断的阳性率。常用的免疫学检测方法包括放射免疫测定(RIA)、酶联免疫测定(ELISA)、化学发光免疫测定(CLIA)等虽各具优点，但是这些技术都存在一个共同的局限性，即每次仅能检测一种不育症蛋白标志物。这显然不能满足临床上需要联合检测多种不育症标志物的需要，基因芯片和蛋白质芯片可对同一样本中的多种不同目的基因或蛋白同时进行分析，又可以同时对多份样本进行检测，大大提高了工作效率；灵敏度和准确度高，信噪比好，只需要微量样本即可，操作简便，重复性好。
[0227] 本发明首次筛选获得了与年龄相关的15种人精子定位蛋白，这些蛋白及其分子生物学材料，如基因、抗体、mRNA、以及调控这些基因转录的miRNA等分子生物学材料，包括干扰RNA、蛋白或基因的任意片段、疫苗等，并建立了对15种男性生育相关基因中1种或1种以上基因的转录水平、表达水平、基因突变、氨基酸变化、增加缺失、调控相关miRNA水平、抗体等进行检测的方法，制备了含有1种或1种以上表1中蛋白以及AK6的药物组合物。此外，本发明人基于正常青年人睾丸和附睾精子成熟微环境蛋白质组学，进行了人类不同年龄组睾丸、附睾2D-DIGE差异蛋白质组学以及精子上的蛋白免疫荧光定位定量等分析研究，共发现15种蛋白在老年人精子上的定位定量与青年人存在显著差异（其中14种显著减少，1种显著增加）。此外，随着年龄增加，这种差异程度更显著。这提示，老年人精子功能减弱或失去功能与这些精子定位蛋白相关，尤其与14种表达下调蛋白的减少有关或所述14种表达下调蛋白的减少会在某种程度上导致生育功能减弱或失去功能。本发明有助于推进对男性不育症的诊断、治疗、预防有关的医疗技术的开发，以及诊断剂、治疗药、预防药或避孕药的开发。
本发明还有助于推进对抗衰老产品及医疗美容技术的开发。
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