技术领域
[0001] 本
发明涉及细胞模型技术领域，具体涉及一种正常人NCM460细胞恶性转化模型的建立方法及鉴定方法。
背景技术
[0002] 目前结肠癌的研究仅局限用结肠癌细胞，并没有结肠癌相关的正常细胞恶性转化模型；
肿瘤细胞鉴定方法基本都包括细胞活
力测定(MTT比色试验或XTT比色试验)、
细胞增殖能力测定(软琼脂克隆形成试验或锚着独立生长试验)以及细胞迁移能力测定(细胞划痕试验或MiLLicell小室测定法)及裸鼠成瘤试验，结肠癌的发生发展是一个多步骤、多阶段的复杂过程，直接运用结肠癌细胞不能研究人正常结肠细胞癌变整个过程中各种
生物学特性的变化。
发明内容
[0003] 针对以上问题，本发明提供了一种正常人NCM460细胞恶性转化模型的建立方法及鉴定方法，为更好地了解结肠癌发生过程提供了较好的细胞研究模型，对于阐明结肠癌发病机制，减缓结肠癌进展，以及结肠癌的
治疗具有重要意义，可以有效解决背景技术中的问题。
[0004] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种正常人NCM460细胞恶性转化模型的建立方法，包括如下步骤：
[0005] (1)细胞培养：将正常人结直肠上皮细胞接种于含有10％胎
牛血清的DMEM高糖培养液中，于37℃，5％CO2
培养箱中培养备用；
[0006] (2)细胞恶性转化过程：在步骤(1)
基础上，待细胞贴壁融合率达78％-82％时，弃培养液，用PBS洗液3次，加入含有50ul/ml MNNG的DMEM培养液，于37℃，5％CO2条件下培养2h，弃培养液，用PBS洗液3次，加入含有100ng/ml PMA的DMEM培养液，于37℃，5％CO2条件下培养48h，弃培养液，加入含有10％胎牛血清的DMEM培养液，于37℃，5％CO2条件下继续培养
24h，按上述步骤进行细胞传代培养，传代过程中观察细胞形态学的改变；
[0007] 作为本发明一种优选的技术方案，细胞传代培养过程中，从第17代开始细胞形态学发生改变，出现形态多样，大小不一，此后，每隔3代进行细胞恶性转化鉴定试验。
[0008] 另外本发明还设计了一种正常人NCM460细胞恶性转化模型的鉴定方法，包括如下步骤：
[0009] (1)细胞形态学观察；
[0010] (2)MTT比色实验：取胰酶消化NCM460正常细胞、第17代处理细胞NCM460-M-P17和第30代处理细胞NCM460-M-P30，离心后用DMEM培养液配制成单个细胞悬液，以每孔1×104个细胞接种于96孔板中，每孔200ul，每组32孔，于37℃，5％CO2条件下培养3天后，加入20ul(5mg/ml)MTT溶液，继续培养4h，弃上清，每孔加入150ulDMSO，震荡10min，酶联免疫检测仪490nm下测定各孔吸光度值，对细胞存活率进行分析；
[0011] (3)血清抗性试验：取对数生长期的NCM460、NCM460-M-P17和NCM460-M-P30，常规消化后用DMEM培养液配制单个细胞悬液，按每孔500个细胞接种于6孔板中，每组细胞接种6孔，其中3孔加入10％胎牛血清，在37℃，5％CO2条件下培养6天后终止培养，PBS洗液3次，甲醇固定20min,吉母萨染液
染色15min，冲洗晾干后
显微镜下计数克隆数，计算接种效率＝(克隆数/接种细胞数)×100％；
[0012] (4)锚着独立生长试验：用DMEM培养液配制1.4％的备用琼脂糖，高温灭菌，稍冷却后放于39℃
水浴中保温，然后加入预热37℃含10％胎牛血清DMEM培养液稀释为0.7％琼脂糖，每皿3ml倒入60mm培养皿中，铺制底层凝胶，待
凝固后备用，常规消化NCM460、NCM460-M-P17和NCM460-M-P30，离心收集细胞与0.7％琼脂糖1:1混匀，稀释成0.35％细胞琼脂糖
混合液，加到60mm培养皿中0.7％琼脂糖凝胶上，每孔1×104个细胞，每组6皿，待上层琼脂糖凝固后，每孔加入2mlDMEM培养液，于37℃，5％CO2条件下培养，每3天换液1次，4周后镜下计数直径大于75um或细胞数多于50个的克隆数，克隆形成率＝(克隆数/接种细胞)×100％；
[0013] (5)细胞划痕试验：将NCM460、NCM460-M-P17和NCM460-M-P30接种于6孔板中，每组6孔，其中3孔加入DMEM培养液，另外3孔加入10％胎牛血清DMEM培养液，作为阳性对照，于37℃，5％CO2条件下培养，待细胞贴壁融合率达100％时，用10ul枪头垂直划痕，PBS洗3次，加入培养液继续培养，培养24h，48h，72h后镜下观察细胞迁移情况。
[0014] 作为本发明一种优选的技术方案，所述MTT比色试验用于检测细胞活力；所述血清抗性试验测定细胞对环境的适应能力及自主生长能力；所述锚着独立生长试验测定单个细胞增殖能力；所述细胞划痕试验判断细胞是否具有迁移能力。
[0015] 本发明的有益效果：
[0016] 本发明为更好地了解结肠癌发生过程提供了较好的细胞研究模型，对于阐明结肠癌发病机制，减缓结肠癌进展，以及结肠癌的治疗具有重要意义；该种建立方法仅涉及到细胞培养技术，操作简单；建立人
体细胞体外培养及恶性转化实验既能排除免疫系统的干扰，又能更深入研究人体细胞在暴露于致癌物质情况下，细胞在恶性转化过程中的各种生物学特性的变化；肿瘤细胞鉴定试验操作简单、方便、
费用低廉。
附图说明
[0017] 图1为本发明的NC460细胞形态图。
[0018] 图2为本发明中NCM460-M-P30细胞形态图。
[0019] 图3为本发明锚着独立生长试验中NCM460细胞克隆数图。
[0020] 图4为本发明锚着独立生长试验中NCM460-M-P30细胞克隆数图。
[0021] 图5为本发明细胞划痕试验中t＝0h时NCM460细胞迁移情况图。
[0022] 图6为本发明细胞划痕试验中t＝24h时NCM460细胞迁移情况图
[0023] 图7为本发明细胞划痕试验中t＝0h时NCM460-M-P30细胞迁移情况图。
[0024] 图8为本发明细胞划痕试验中t＝24h时NCM460-M-P30细胞迁移情况图。
具体实施方式
[0025] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及
实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0026] 实施例：
[0027] 一种正常人NCM460细胞恶性转化模型的建立方法，包括如下步骤：
[0028] (1)细胞培养：将正常人结直肠上皮细胞接种于含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养液中，于37℃，5％CO2培养箱中培养备用；
[0029] (2)细胞恶性转化过程：在步骤(1)基础上，待细胞贴壁融合率达78％-82％时，弃培养液，用PBS洗液3次，加入含有50ul/ml MNNG的DMEM培养液，于37℃，5％CO2条件下培养2h，弃培养液，用PBS洗液3次，加入含有100ng/ml PMA的DMEM培养液，于37℃，5％CO2条件下培养48h，弃培养液，加入含有10％胎牛血清的DMEM培养液，于37℃，5％CO2条件下继续培养
24h，按上述步骤进行细胞传代培养，传代过程中观察细胞形态学的改变；
[0030] 作为本发明一种优选的技术方案，细胞传代培养过程中，从第17代开始细胞形态学发生改变，出现形态多样，大小不一，此后，每隔3代进行细胞恶性转化鉴定试验。
[0031] 一种正常人NCM460细胞恶性转化模型的鉴定方法，包括如下步骤：
[0032] (1)细胞形态学观察；
[0033] (2)MTT比色实验：取胰酶消化NCM460正常细胞、第17代处理细胞NCM460-M-P17和第30代处理细胞NCM460-M-P30，离心后用DMEM培养液配制成单个细胞悬液，以每孔1×104个细胞接种于96孔板中，每孔200ul，每组32孔，于37℃，5％CO2条件下培养3天后，加入20ul(5mg/ml)MTT溶液，继续培养4h，弃上清，每孔加入150ulDMSO，震荡10min，酶联免疫检测仪490nm下测定各孔吸光度值，对细胞存活率进行分析；
[0034] (3)血清抗性试验：取对数生长期的NCM460、NCM460-M-P17和NCM460-M-P30，常规消化后用DMEM培养液配制单个细胞悬液，按每孔500个细胞接种于6孔板中，每组细胞接种6孔，其中3孔加入10％胎牛血清，在37℃，5％CO2条件下培养6天后终止培养，PBS洗液3次，甲醇固定20min,吉母萨染液染色15min，冲洗晾干后显微镜下计数克隆数，计算接种效率＝(克隆数/接种细胞数)×100％；
[0035] (4)锚着独立生长试验：用DMEM培养液配制1.4％的备用琼脂糖，高温灭菌，稍冷却后放于39℃水浴中保温，然后加入预热37℃含10％胎牛血清DMEM培养液稀释为0.7％琼脂糖，每皿3ml倒入60mm培养皿中，铺制底层凝胶，待凝固后备用，常规消化NCM460、NCM460-M-P17和NCM460-M-P30，离心收集细胞与0.7％琼脂糖1:1混匀，稀释成0.35％细胞琼脂糖混合液，加到60mm培养皿中0.7％琼脂糖凝胶上，每孔1×104个细胞，每组6皿，待上层琼脂糖凝固后，每孔加入2mlDMEM培养液，于37℃，5％CO2条件下培养，每3天换液1次，4周后镜下计数直径大于75um或细胞数多于50个的克隆数，克隆形成率＝(克隆数/接种细胞)×100％；
[0036] (5)细胞划痕试验：将NCM460、NCM460-M-P17和NCM460-M-P30接种于6孔板中，每组6孔，其中3孔加入DMEM培养液，另外3孔加入10％胎牛血清DMEM培养液，作为阳性对照，于37℃，5％CO2条件下培养，待细胞贴壁融合率达100％时，用10ul枪头垂直划痕，PBS洗3次，加入培养液继续培养，培养24h，48h，72h后镜下观察细胞迁移情况。
[0037] 作为本发明一种优选的技术方案，所述MTT比色试验用于检测细胞活力；所述血清抗性试验测定细胞对环境的适应能力及自主生长能力；所述锚着独立生长试验测定单个细胞增殖能力；所述细胞划痕试验判断细胞是否具有迁移能力。
[0038] 具体的，鉴定方法的鉴定结果：
[0039] (1)细胞形态学观察：NCM460细胞经过MNNG和PMA低浓度诱导后，在17代观察到有形态学改变，呈现形态多样，大小不一，排列紧密，团
块状生长。此后，每隔3代进行一次鉴定试验(20代、23代、27代和30代)。以下鉴定试验对象选取最具代表性的细胞代数进行；
[0040] 在NCM460镜下呈
单层生长，排列有序，形态为梭形，细胞结构清晰。NCM460-M-P30形态发生明显变化，倒置显微镜下呈现形态多样，大小不一，排列紧密，团块状生长，无细胞间
接触抑制或
密度抑制，铺满培养瓶底壁后出现重叠生长现象；如图1和图2所示。
[0041] (2)MTT比色试验：胰酶消化NCM460正常细胞(NCM460)、第17代处理细胞(NCM460-M-P17)和第30代处理细胞(NCM460-M-P30)，离心后用DMEM培养液配制成单个细胞悬液，以每孔1×104个细胞接种于96孔板中，每孔200ul，每组32孔，于37℃，5％CO2条件下培养3天后，加入20ul(5mg/ml)MTT溶液，继续培养4h，弃上清，每孔加入150ulDMSO，震荡10min，酶联免疫检测仪490nm下测定各孔吸光度值，对细胞存活率进行分析，如下表1：
[0042] 表1MTT比色试验
[0043] (n＝32, )
[0044]
[0045] **P＜0.001vs对照 △△P＜0.001vsNCM460-MP17
[0046] 结论：由表1可知，NCM460-M-P17与NCM460存活率无明显差异，NCM460-M-P30与NCM460相比细胞存活率有显著性差异(p＜0.001)，与NCM460-M-P17相比细胞存活率有显著性差异(p＜0.001)。由此说明，长期生长在含有低浓度MNNG和PMA环境中的细胞增殖能力增强，提示有恶性转化的趋势。
[0047] (3)血清抗性试验：取对数生长期的NCM460、NCM460-M-P17和NCM460-M-P30，常规消化后用DMEM培养液配制单个细胞悬液，按每孔500个细胞接种于6孔板中，每组细胞接种6孔，其中3孔加入10％胎牛血清，在37℃，5％CO2条件下培养6天后终止培养，PBS洗液3次，甲醇固定20min,吉母萨染液染色15min，冲洗晾干后显微镜下计数克隆数，计算接种效率＝(克隆数/接种细胞数)×100％。结果详见表2。
[0048] 表2血清抗性试验
[0049] (n＝6, ％)
[0050]
[0051] **P＜0.001vs对照组 △△P＜0.001vs无血清
[0052] 结论：NCM460有血清组与无血清组相比，细胞接种效率无差异，而经MNNG和PMA分阶段多次诱导细胞的接种效率与对照组相比明显升高(P＜0.001)，说明MNNG和PMA对细胞有明显的促增殖作用，并且NCM460-MP30接种效率在有血清的条件下明显高于无血清组(p＜0.001)，表明经多次诱导处理的细胞对环境依赖性降低，适应能力增强，细胞的自主生存能力增强，细胞有恶性转化的趋势。
[0053] (4)锚着独立生长试验：用DMEM培养液配制1.4％的备用琼脂糖高温灭菌，稍冷却后放于39℃水浴中保温，然后加入预热37℃含10％胎牛血清DMEM培养液稀释为0.7％琼脂糖。每皿3ml倒入60mm培养皿中，铺制底层凝胶，待凝固后备用。常规消化NCM460、NCM460-M-P17和NCM460-M-P30，离心收集细胞与0.7％琼脂糖1:1混匀，稀释成0.35％细胞琼脂糖混合液，加到60mm培养皿中0.7％琼脂糖凝胶上，每孔1×104个细胞，每组6皿。待上层琼脂糖凝固后，每孔加入2mlDMEM培养液，于37℃，5％CO2条件下培养。每3天换液1次，4周后镜下计数直径大于75um或细胞数多于50个的克隆数，克隆形成率＝(克隆数/接种细胞)×100％。结果详见表3、图3和图4。
[0054] 表3锚着独立生长试验
[0055] (n＝6, )
[0056]
[0057]
[0058] **P＜0.001vsNCM460 ▲▲P＜0.001vsNCM460-M-P17
[0059] 结论：用来判断细胞在软琼脂中克隆生长的能力，是细胞发生恶性转化的重要标志。培养1周后，经MNNG和PMA多次诱导的细胞出现较小的团块状细胞团，培养4周后，细胞集落大量形成，且多数集落细胞数量大于50个。正常细胞形成的克隆细胞团很小，数量极少，培养4周后细胞固缩死亡(图3)。克隆形成率测定结果详见表3，经MNNG和PMA处理细胞的克隆形成率明显高于对照组(p＜0.001)，并且NCM460-M-P30与对照组相比，克隆形成率明显高于对照组(p＜0.001)。
[0060] (5)细胞划痕试验：将NCM460、NCM460-M-P17和NCM460-M-P30接种于6孔板中，每组6孔，其中3孔加入DMEM培养液，另外3孔加入10％胎牛血清DMEM培养液，作为阳性对照，于37℃，5％CO2条件下培养。待细胞贴壁融合率达100％时，用10ul枪头垂直划痕，PBS洗3次，加入培养液继续培养。培养24h，48h，72h后镜下观察细胞迁移情况。详见表4、图5、图6、图7、图
8。
[0061] 表4细胞划痕试验
[0062] (n＝6, )
[0063]
[0064] **P＜0.001vsNCM460 ▲▲P＜0.001vsNCM460-M-P17
[0065] 结论：细胞划痕试验主要用于判断转化细胞是否具有迁移能力。
[0066] NCM460细胞培养24h及48h后的迁移细胞数都是0(图4)，说明NCM460细胞无迁移能力；经MNNG和PMA分阶段诱导处理的细胞在培养24h后，镜下可见划痕处有细胞生长(图5)，表明经MNNG和PMA分阶段诱导处理的细胞具有迁移能力。并且，经处理细胞与NCM460相比迁移细胞数具有显著性差异(P＜0.001)，培养48h后，NCM460-M-P30与NCM460-M-P17相比迁移细胞数具有显著性差异(P＜0.001)，由此说明，经过MNNG和PMA分阶段长期诱导处理的细胞获得了迁移能力，可能具有了肿瘤细胞的转移特性。
[0067] 基于上述，本发明的优点在于，本发明为更好地了解结肠癌发生过程提供了较好的细胞研究模型，对于阐明结肠癌发病机制，减缓结肠癌进展，以及结肠癌的治疗具有重要意义；该种建立方法仅涉及到细胞培养技术，操作简单；建立人体细胞体外培养及恶性转化实验既能排除免疫系统的干扰，又能更深入研究人体细胞在暴露于致癌物质情况下，细胞在恶性转化过程中的各种生物学特性的变化；肿瘤细胞鉴定试验操作简单、方便、费用低廉。
[0068] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何
修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
