用于抑制CRIPTO/GRP78复合物形成和信号的组合物和方法专利检索-细胞增殖生物学专利检索查询-专利查询网

用于抑制CRIPTO/GRP78复合物形成和 信号的组合物和方法

阅读：571发布：2023-03-05

专利汇可以提供用于抑制CRIPTO/GRP78复合物形成和信号的组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供用于治疗高增生性疾病的组合物和方法，包括破坏高增生性细胞中的Cripto/GRP78复合物的形成。在某些实施方案中，抗体和/或siRNA可用于抑制Cripto/GRP78结合，任选地与其它癌症治疗相结合。还提供用于鉴定可选择性抑制Cripto/GRP78结合的治疗化合物的方法。，下面是用于抑制CRIPTO/GRP78复合物形成和信号的组合物和方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.抑制细胞中Cripto 信号以降低细胞增殖的方法，包括将细胞与一定量的选择性的GRP78/Cripto靶向性化合物接触，所述的GRP78/Cripto靶向性化合物有效抑制Cripto和GRP78之间复合体的形成，由此降低细胞的增殖。
2.权利要求1的方法，其中所述复合体的形成被a)抗GRP78抗体、b)结合至在Cripto的GRP78-结合结构域或CFC结构域中的表位的抗体或c)缺乏天然GRP78的氨基酸19-68位的GRP78突变体抑制。
3.权利要求2的方法，其中抗体是结合GRP78的N-20表位的抗GRP78抗体。
4.权利要求2的方法，其中抗体是人单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
5.权利要求2的方法，其中抗体是双特异性抗体。
6.权利要求2的方法，其中抗体结合至报告分子。
7.权利要求6的方法，其中报告分子是放射性配体或荧光性标签。
8.权利要求2的方法，其中抗体是抗GRP78scFv、F(ab)或F(ab)2。
9.权利要求1的方法，其中靶向性化合物是shRNA、siRNA或siNA。
10.权利要求9的方法，其中靶向性化合物是包括SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：4的shRNA。
11.权利要求2的方法，其中靶向性化合物是缺乏天然GRP78的氨基酸19-68位的GRP78突变体。
12.权利要求11的方法，其中缺乏天然GRP78的氨基酸19-68位的GRP78突变体是Δ19-68GRP78。
13.权利要求1的方法，其中施用是全身施用、局部施用、部位施用、肠胃外施用、静脉内施用、腹膜内施用、通过吸入施用或者肿瘤内施用。
14.权利要求1的方法，其中所述细胞是乳腺、结肠、胃、胰、肺、卵巢、子宫内膜、睾丸、膀胱、前列腺、头、颈、子宫颈、胃、胆囊或肾上腺皮质细胞。
15.权利要求1的方法，其中细胞是癌性细胞、癌前细胞或恶性细胞，并且其中方法进一步定义为治疗受试者中高增生性疾病的方法。
16.权利要求15的方法，其中高增生性疾病是癌症。
17.权利要求16的方法，其中癌症选自乳腺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、睾丸癌、膀胱癌、前列腺癌、头颈癌、宫颈癌、胆囊癌或肾上腺皮质癌。
18.权利要求16的方法，其中方法包括向受试者施用第二癌症治疗。
19.权利要求18的方法，其中第二癌症治疗是化学治疗、放射治疗、基因治疗、免疫治疗或外科手术。
20.权利要求19的方法，其中第二癌症治疗是化学治疗。
21.权利要求20的方法，其中化学治疗是紫杉醇、顺铂或碳铂。
22.权利要求1的方法，其中方法进一步定义为促进干细胞分化成为神经元细胞的方法，其中细胞是干细胞，并且其中抑制Cripto和GRP78之间复合体的形成促进细胞分化成为神经元细胞。
23.权利要求22的方法，其中细胞是人胚胎干细胞。
24.权利要求23的方法，其中人胚胎干细胞是H9或BG02。
25.权利要求23的方法，其中干细胞是诱导的多能干细胞(iPSC)。
26.筛选Cripto/GRP78复合物形成抑制剂的方法，包括：
a)获得候选调节剂；
b)将候选调节剂与Cripto和GRP78接触；和
c)测量Cripto/GRP78复合体的形成；其中在候选调节剂存在下Cripto/GRP78复合体形成的降低或Cripto/GRP78复合体信号的降低表明候选调节剂是Cripto/GRP78复合物形成的抑制剂。
27.人源化单克隆抗GRP78抗体，其中抗体结合GRP78的N-20表位，并且其中所述结合抑制Cripto/GRP78复合体的形成。
28.权利要求26的抗体，其中抗体包含在药物组合物中。
29.权利要求28的组合物，其中药物组合物被配制成用于肠胃外、静脉内或瘤内施用。

说明书全文

用于抑制CRIPTO/GRP78复合物形成和 信号的组合物和方

法

[0001] 本申请要求于2008年11月7日提出的美国临时申请系列号61/112,579的优先权，该申请的全部内容并入本文作为参考。

[0002] 本发明得到国家癌症研究所给与的R01CA107420的政府基金支持。政府具有本发明的某些权利。

技术领域

[0003] 本发明一般涉及分子生物学和医学领域。更加具体而言，其涉及对Cripto/GSP78信号破坏所涉及高增生性疾病的治疗。

背景技术

[0004] Cripto(Cripto-1，TDGF1)是在胚胎发生过程中具有基本生理学作用的小的GPI锚定信号蛋白。其还在人肿瘤中高水平表达，并且与肿瘤引发和进展的数个方面相联系，包括增强的细胞增殖、迁移、侵袭、肿瘤血管发生和上皮间质转化(EMT)(Strizzi等，2005)。

[0005] 认为数个作用机制促成了Cripto的致癌作用基础(Strizzi等，2005)。例如，它通过与这些配体中的一些配体以及它们各自的信号受体形成复合体调节TGF-β超家
族成员的信号。在该背景下，Cripto在促进某些配体例如Nodal的信号(Schier，2003；
Shen和Schier，2000)而抑制激活蛋白(Adkins等，2003；Gray等，2003)和TGF-β1(Reddy
等，2003)的信号中具有专一性作用。由于激活蛋白和TGF-β具有肿瘤阻抑制因子作用
(Pardali和Moustakas，2007)，它们的信号被Cripto抑制提供了至少部分解释Cripto促
进肿瘤生长的机制(Adkins等，2003；Gray等，2003；Gray等，2006)。相反地，Cripto依赖的Nodal信号将促成肿瘤生长和转移的晚期阶段，在该条件下细胞变成抵抗TGF-β配体的
生长抑制作用(Pardali和Moustakas，2007；Topczewska等，2006)。

[0006] Cripto也可以溶解形式从细胞释放并且以类似于分泌的生长因子的方式起作用(Strizzi等2005)。在该方面，据报导，Cripto和爪蟾的Cripto直向同源物FRL-1分别引
起erbB-4(Bianco等，1999)和FGFR-1(Kinoshita等，1995)的磷酸化。然而，Cripto不直接结合这些蛋白质，并且介导这些磷酸化事件的假定的Cripto受体还没有找到(Bianco等，
1999；Kinoshita等，1995)。在该方面，虽然Cripto拥有EGF样结构域并且类似于EGF受
体的配体，但它不直接结合EGF受体家族的任何成员(Bianco等，1999)。此外，虽然Cripto结合细胞外的GPI锚定的蛋白聚糖磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1通过c-Src引起MAPK和PI3K
途径的活化，但是仍没有鉴定出介导该作用的跨膜蛋白质(Bianco等，2003)。

[0007] 因此，虽然Cripto具有促进肿瘤生长的多种信号机制，但是已知其细胞表面结合配偶体似乎不能完全解释所报导的其致癌作用。考虑到高增生性疾病的明显的社会和经济
影响，因此需要对高增生性疾病的改良治疗，并且对Cripto引起这些效应的机制的了解将
得到改良的治疗和筛选方法。

发明内容

[0008] 本发明通过确定了Cripto可结合葡萄糖调节蛋白78(GRP78)并引起促进高增生性细胞的生长的下游信号而克服现有技术的局限性。因此，本发明提供可用于治疗疾病如
癌症的Cripto/GRP78相互作用抑制剂。在另外的方面中，本发明提供用于筛选Cripto/
GRP78复合物形成的调节剂的方法。

[0009] 本发明至少部分地基于这样一个令人惊奇的发现，即细胞表面的GRP78是Cripto结合配偶体并且是人肿瘤细胞、人胚胎干细胞和正常人乳腺上皮细胞中Cripto信号所必
需的。因此，细胞表面Cripto/GRP78复合体代表着干细胞和肿瘤细胞中可以被治疗性靶向
的新的和称心如意的靶标。发明人在下面进一步证明，细胞表面Cripto/GRP78相互作用
对于Cripto共受体功能和肿瘤生长因子活性是必需的。结果表明，对细胞表面GRP78的敲
低或免疫中和封闭了Cripto对激活蛋白、Nodal和TGF-β信号的调节并阻止了Cripto对
c-Src/MAPK/PI3K途径的活化。因此资料支持这样一种想法，即GRP78是对于Cripto信号
必需的Cripto受体/共因子。重要的是，发明人首次证明GRP78存在于人ES细胞表面，其
中它与Cripto共定位并且介导Cripto对激活蛋白和Nodal信号的相反作用。Cripto与细
胞表面GRP78的结合对于Cripto增加细胞增殖和降低E-钙黏着蛋白表达和细胞粘附的能
力也是必需的，表明这些蛋白质会一起作用促进肿瘤生长和转移。发明人发现，激活蛋白-A和Nodal在Cripto/GRP78复合体存在下是促有丝分裂的而在Cripto/GRP78复合体缺乏时
激活蛋白-A具有细胞抑制作用并且Nodal对增殖无作用。不希望被任何理论所束缚，该结
果支持这样一个想法，即细胞表面Cripto/GRP78复合体通过协调MAPK/PI3K和Smad2/3途
径之间的通讯调节细胞增殖。

[0010] 本发明的一个方面涉及用于抑制细胞中Cripto信号的方法，包括抑制Cripto和GRP78之间复合体形成的形成。方法将包括将至少所述细胞表面与选择性的GRP78靶向性
化合物接触，其中所述抑制包括抑制Cripto/GRP78复合体在细胞表面上的形成。所述复合
体的形成将被抗GRP78抗体抑制，并且抗GRP78抗体将结合GRP78的N-20表位。在某些实
施方案中，抗GRP78抗体是人源化单克隆抗体。抗体可与报告分子，例如放射性配体或荧光标签缀合。所述复合体的形成将被抗GRP78F(ab)或F(ab)2，或GRP78靶向性shRNA、siRNA
或siNA(例如包括SEQ ID NO：5的GRP78靶向性shRNA)抑制。施用可以是全身性的、局部
的、部位性的、肠胃外的、静脉内的、腹膜内的、通过吸入或者瘤内的。

[0011] 在某些实施方案中，方法进一步定义为降低细胞增殖的方法，包括细胞与有效量的优先结合GRP-78并抑制GRP-78结合Cripto并引起Nodal信号的能力的GRP-78靶向性
化合物接触。方法可包括将至少所述细胞表面与Cripto靶向性化合物接触，其中Cripto
靶向性化合物选择性地结合Cripto的CFC结构域或GRP78-结合结构域中的表位并抑制
Cripto与GRP78之间复合物的形成。Cripto靶向性化合物可以是结合Cripto的GRP78-结
合结构域或CFC结构域中表位的抗体。方法可包括将至少所述细胞的表面与shRNA接触，其
中shRNA包括SEQID NO：4。靶向性化合物可以是不结合或基本不结合Cripto的GRP78突变
体。GRP78突变体可以是缺乏天然GRP78的氨基酸19-68位的GRP78突变体，例如Δ19-68
GRP78。在另外的实施方案中，GRP78可以通过在GRP78的19-68位氨基酸区的一个或更多
个替代或插入突变进行突变以产生不结合或者基本不结合Cripto的GRP78突变体。所述
细胞可以衍生自选自下列的器官：乳腺、结肠、胃、胰脏、肺、卵巢、子宫内膜、睾丸、膀胱、前列腺、头、颈、子宫颈、胃、胆囊和肾上腺皮质。细胞可以是癌性细胞、癌前细胞或恶性细胞，并且其中方法进一步定义为治疗高增生性疾病例如癌症的方法。癌症可以选自乳腺癌、结
肠癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、睾丸癌、膀胱癌、前列腺癌、头颈癌、宫颈癌、胆囊癌或肾上腺皮质癌。

[0012] 在某些实施方案中，方法进一步定义为降低细胞增殖的方法。方法可包括降低细胞中由Cripto引起的Nodal信号、激活蛋白/TGF-β信号或c-Src/MAPK/PI3K信号的方法。
方法可包括向受试者施用第二治疗，例如化学治疗(例如紫杉醇、顺铂或碳铂)、放射治疗、基因治疗、免疫治疗或外科手术。

[0013] 方法可进一步定义为促进干细胞向神经元细胞分化的方法，其中细胞是干细胞，并且其中抑制Cripto与GRP78之间复合体的形成促进细胞向神经元细胞分化。细胞可以
是人胚胎干细胞(例如H9或BG02)或者诱导的多能干细胞(iPSC)。

[0014] 本发明的另一个方面涉及筛选Cripto/GRP78复合物形成的抑制剂的方法，包括：得到候选调节剂，将候选调节剂与Cripto和GRP78接触，并测量Cripto/GRP78复合体的形
成，其中在候选调节剂存在下Cripto/GRP78复合体形成的减少或者Cripto/GRP78复合体
信号的降低表明候选调节剂是Cripto/GRP78复合物形成的抑制剂。Cripto和GRP78可以
由细胞表达。在某些实施方案中，Cripto和GRP78由细胞转基因性过表达。细胞可以是癌
性细胞或癌前细胞。方法可包括测量Cripto/GRP78信号，其中Cripto/GRP78信号包括激
活蛋白/TGF-β信号、c-Src/MAPK/PI3K信号或PI3K/Akt/GSK3β信号。方法可包括测量
Cripto和GRP78之间的结合，其中在候选调节剂存在下Cripto/GRP78结合的降低表明候
选调节剂抑制Cripto/GRP78复合物形成。所述的测量结合可包括细胞表面生物素化作用
125
/Co-IP测定(例如如在Shani等2008中所述的那样)、 I-Cripto结合测定(例如在完整
细胞中)、包括测量Cripto与固定化GRP78结合的测定(例如在多孔板中)、或者测量可溶
性Cripto结合的ELISA测定。在许多实施方案中，包括将Cripto和GRP78用荧光团或猝
灭剂标记并例如使用FACS测量荧光的荧光测定可以在本发明中使用。

[0015] 本发明的又一方面涉及人源化单克隆抗GRP78抗体，其中抗体结合GRP78中的N-20表位，并且其中所述结合抑制Cripto/GRP78复合体形成。抗体可以包含在药物组合物
中，并且药物组合物可以配制成用于肠胃外、静脉内或瘤内施用。

[0016] 术语“抑制”、“降低”或“阻止”或者这些术语的任何变形，当在权利要求书和/或说明书中使用时包括任何可测量的降低或者完全抑制以达到预期结果。

[0017] 如在说明书和/或权利要求书中使用的术语“有效的”意思是指足以达到想要的、期望的或预期的结果。

[0018] 当词语“a”或“an”在权利要求书和/或说明书中与术语“包括(包含)”结合使用时意思是指“一”，但是其还有“一或更多”、“至少一”和“一或一以上”的含义。

[0019] 考虑了就本发明的任何方法或组合物而言，在本说明书中讨论的任何实施方案可以实施，并且反之亦然。此外，本发明组合物可以用于实现本发明的方法。

[0020] 在本申请通篇中，术语“大约”用于指数值包括对于所采用测定数值的设备、方法所固有的误差变化，或者在研究受试者当中存在的变异。

[0021] 虽然本公开支持术语“或”的定义指仅仅备选方案和“和/或”，但是除非明确地指出是仅指备选方案或者备选方案相互排斥，否则术语“或”在权利要求书的使用意思是指“和/或”。

[0022] 如在本说明书和权利要求书中所使用，词语“包含”(和包含的任何形式，例如复数和单数形式的“包含”)、“具有”(和具有的任何形式，例如复数和单数形式的“具有”)、“包括”(和包括的任何形式，例如复数和单数形式的“包括”)或“含有”(和含有的任何形式，例如复数和单数形式的“含有”)是包含在内的或开放式的并且不排除另外的、非描述的元素或方法步骤。

[0023] 根据下列详细的描述，本发明的其他目的、特征和优势将变得显而易见。然而，应当理解，详细的描述和表明本发明特定实施方案的特定实施例仅通过例证方式给出，因为根据该详细的描述，处于本发明精神和范围内的许多改变和修改对本领域技术人员而言将
变得显而易见。
附图说明

[0024] 下列图构成本说明书的一部分，并且旨在进一步证明本发明的某些方面。通过参考一个或更多个这些附图并结合本文呈现的特定实施方案的详细描述可更好的理解本发
明。

[0025] 图1A-C.新的Cripto结合蛋白的鉴定.293T细胞以空载体或Cripto-Flag转染，免疫沉淀在抗Flag珠上，然后以Flag肽洗脱。通过SDS-PAGE分离Cripto相关蛋白然后
或者进行银染色(A)或者印迹在硝酸纤维素上并用抗GRP78或抗Cripto抗体探测(C)，如
在下面材料和方法中所述。将在(A)中指定为a和b的条带切下并进行质谱分析，如在下
面材料和方法中所述。对应于条带a的鉴定为GRP78的质量指纹数据示于(B)中。

[0026] 图2A-D.Cripto结合细胞表面上的GRP78.293T细胞根据指示以的构建体转染(A-D)并且P19细胞(D)以细胞不渗透性NHS-LC-生物素标记。使用所标明的抗体对细胞
裂解液进行免疫沉淀，然后用Flag肽(肽洗脱液)或者通过在样品缓冲液中加热珠洗脱。
样品通过SDS-PAGE分离并且用抗生物素蛋白-HRP或者标明的抗体进行印迹，如下面材料
和方法中所述。在一些情况中(B和C)，对过表达GRP78的293T细胞进行细胞表面生物素
化作用，然后将所得到的细胞裂解液与载体或Cripto-Flag珠孵育。

[0027] 图3A-C.使用RNA干扰对GRP78表达的靶向性降低.HeLa细胞以包含GRP78shRNA(G1)或空载体的慢病毒感染，并用如所标明的毒胡萝卜内酯处理或者不处理。
(A)通过使用抗GRP78或抗肌动蛋白的抗体的Western印迹分析细胞裂解液，如在材料和
方法中所描述。(B)柱表示每100个GFP阳性细胞中凋亡细胞的数量，如在材料和方法中
所述。(C)以载体或G1shRNA病毒感染的细胞以包含Cripto-Flag的病毒再次感染。使用
抗Flag珠对来自这些细胞的裂解液进行免疫沉淀，然后用Flag肽洗脱。使用抗生物素蛋
白-HRP、抗GRP78和抗Cripto抗体对洗脱蛋白质进行Western印迹分析，如下面材料和方
法中所述。

[0028] 图4A-D.内源GRP78表达的抑制增强TGF-β诱导的Smad2磷酸化.HeLa细胞以包含靶向GRP78的shRNA(G1)或空载体的慢病毒感染，然后用如所标明的5μM毒胡萝卜内
酯处理或者不处理。在毒胡萝卜内酯过夜处理之后，细胞根据指示以剂量的TGF-β1处理
(A和B)，然后通过Western印迹确定磷酸化Smad2和总的Smad2水平，如在下面材料和方
法中所述。备选地，按照所标明处理的相同的细胞以细胞不渗透性生物素标记，所得到的裂解液用抗GRP78抗体(抗KDEL)免疫沉淀，接着使用抗生物素蛋白-HRP进行Western印迹
(C)，或者使用抗TβRI、抗TβRII或抗肌动蛋白抗体将裂解液直接进行Western印迹(D)，
如在材料和方法中所述。

[0029] 图5.GRP78不直接结合TGF-β类型I和类型II受体.293T细胞以p26-Flag、Cripto-Flag、TβRI-HA或TβRII-His转染，然后使用如所标明的抗Flag、抗HA或抗His
抗体进行免疫沉淀。使用抗生物素蛋白-HRP或标明的抗体对沉淀的蛋白质进行Western
印迹分析，如在下面材料和方法中所述。

[0030] 图6A-D.Cripto和GRP78协同抑制TGF-β信号.(A)以空载体、GRP78、Cripto或者GRP78和Cripto两者转染的PC3细胞根据指示以的TGF-β1(10pM)处理或者不处理。磷
酸化Smad2(pSmad2)和总Smad2(Smad2)水平通过Western印迹测定，如下面材料和方法中
所述。(B)来自(A)的磷酸化Smad2条带使用光密度测定法定量并且相对于对应的Smad2
条带标准化，如下面材料和方法中所述。(C)使用如所标明和如在材料和方法中所述的抗
TβRII、抗TβRI和抗肌动蛋白抗体对PC3细胞裂解液进行Western印迹。(D)将细胞铺于
96孔板上，然后8天后测量细胞增殖，如下面材料和方法中所述。

[0031] 图7A-D.GRP78和Cripto协同抑制TGF-β对前列腺癌细胞贴壁不依赖性生长的抗增殖作用.如下面材料和方法中所述，在媒介物或者增加剂量的TGF-β1存在下，以载
体、GRP78、Cripto或者GRP78和Cripto两者转染的PC3细胞在贴壁不依赖性条件下于软
琼脂中生长15天。数据表示为在缺乏或存在所标明剂量TGF-β1下单一视野中计数的集
落数(A)或者表示为在存在所标明TGF-β1浓度下计数的集落数除以在缺乏TGF-β1处理
时所计数的集落数(％基础)(B)。(C)来自100pM TGF-β1存在或缺乏情况下所标明视野
的照片。(D)图解Cripto/GRP78复合体致癌作用的模型。TGF-β通过经Smad2/3途径发
信号而潜在抑制许多细胞类型的增殖(左)。Cripto和GRP78相互作用形成复合体，并且
协同作用减弱TGF-β-依赖性Smad信号和生长抑制。此外，它们独立地增加细胞增殖/存
活。在Cripto和GRP78存在下，TGF-β还可增加细胞增殖(虚线箭头)。

[0032] 图8A-G.Cripto和GRP78协同调节激活蛋白、Nodal和TGF-β信号.稳定表达Cripto和/或GRP78shRNA的NCCIT细胞通过使用所标明抗体的Western印迹(A)或者完
整细胞表面ELISA(B)分析。同样的细胞以激活蛋白-A(C)或Nodal(D)处理，并且磷酸化
Smad2(pSmad2)和Smad2的最终水平通过使用pSmad2和Smad2抗体的Western印迹测量。
过表达所标明蛋白质和/或shRNA的NCCIT细胞(E)和293T细胞(F，G)以Smad2响应性
萤光素酶报告分子转染并根据指示以剂量的TGF-β配体处理。所得到的萤光素酶活性相
对于未处理样品标准化并表示为未处理样品的诱导倍数。

[0033] 图9A-G.人ES细胞中细胞表面GRP78介导Cripto信号.使用所标明的抗体对H9人ES细胞进行完整细胞ELISA(A)或免疫荧光(B)。在(B)中，抗Cripto染色是绿色的并
且抗GRP78染色是红色的。(C)H9ES细胞根据指示以的激活蛋白-A或Nodal处理，并且通
过使用pSmad2和Smad2抗体的Western印迹测量磷酸化Smad2(pSmad2)和Smad2的最终
水平。用Smad2响应性萤光素酶报告分子转染以空载体(D)或Cripto shRNA(E)稳定感染
的NCCIT细胞，并如所标明在N-20抗体存在或缺乏情况下用标明剂量的TGF-β配体处理。
所得到的萤光素酶活性相对于未处理样品标准化并表示为相对于未处理样品的诱导倍数。
(F)说明野生型GRP78和缺乏N-20表位的Δ19-68GRP78构建体的简图。(F，G)如所标明，
使用抗HA、抗Flag和抗GRP78抗体对根据指示以构建体转染的293T细胞的裂解液进行免
* ***
疫沉淀和Western印迹。p＜0.01；p＜0.001。

[0034] 图10A-F.Cripto需要GRP78受体功能以激活PI3K和MAPK途径并促进NCCIT细胞增殖.稳定表达所标明shRNA的NCCIT细胞进行血清饥饿，然后根据指示以剂量的可溶
性Cripto与所标明的或者PI3K抑制剂(LY2940002)(A)或者MEK1/2抑制剂(PD98059)(B)
处理。使用所标明的抗磷酸化Akt(pAkt)、Akt、磷酸化GSK3β(pGSK3β)和肌动蛋白抗体
(A)或磷酸化ERK1/2(pERK1/2)和ERK1/2抗体(B)对细胞裂解液进行Western印迹。(C)
相同的NCCIT细胞以如所标明的Cripto处理，生长8天，然后使用CyQuant增殖测定试剂
盒测量增殖。(D)以Cripto shRNA感染的NCCIT细胞在一定范围剂量的N-20抗体或IgG
125
对照存在下进行 I-Cripto结合。Cripto特异性结合代表着被过量非标记可溶性Cripto
125
封闭的 I-Cripto结合的量。以Cripto shRNA感染的NCCIT细胞进行(E)血清饥饿，然
后在所标明剂量IgG或抗GRP78(N-20)预处理后根据指示以剂量的可溶性Cripto处理，或
者(F)在以IgG或抗GRP78(N-20)抗体预处理后以可溶性Cripto处理。细胞另外生长8
* ***
天并且使用CyQuant增殖测定试剂盒测定增殖。p＜0.01；p＜0.001。

[0035] 图11A-I.在人乳腺上皮细胞中细胞表面GRP78的免疫中和阻止Cripto的肿瘤生长因子活性.以空载体感染的人乳腺上皮MCF10A细胞使用IgG或N-20抗体进行完整细胞
125
ELISA(A)或者根据指示在一定范围剂量N-20抗体或对照IgG抗体存在下进行 I-Cripto
结合(B)。(C)以空载体感染的MCF10A细胞进行血清饥饿，然后如所标明，根据指示以剂量
的可溶性Cripto、N-20抗体和/或IgG处理。如所标明，所得到的细胞裂解液以抗磷酸化
Tyr(pTyr)抗体进行免疫沉淀并且以抗磷酸化Src(pSrc，Y416)或抗Src抗体进行Western
印迹。(D)以空载体感染的MCF10A细胞进行血清饥饿，根据指示以剂量的可溶性Cripto处
理，然后细胞裂解液通过使用如所标明的磷酸化Akt(pAkt)和Akt抗体的Western印迹进
行分析。(E)来自空载体感染的或者Cripto感染的MCF10A细胞的细胞裂解液通过使用如
所标明的Cripto和肌动蛋白抗体的Western印迹分析。以空载体或Cripto(F)或者以空
载体(G)感染的MCF10A细胞根据指示以的可溶性Cripto、IgG和/或N-20抗体处理。细
胞生长8天并且使用CyQuant增殖测定试剂盒测量增殖。(H)以空载体或Cripto感染的
MCF10A细胞在根据指示以IgG或N-20抗体预处理之后用可溶性Cripto处理。通过使用
E-钙黏着蛋白和肌动蛋白抗体的Western印迹分析细胞裂解液。(I)以空载体或Cripto
感染的MCF10A细胞用IgG或N-20抗体预处理，铺板并允许粘附。所得到的细胞粘附使用
***
CyQuant粘附测定定量。 p＜0.001。

[0036] 图12A-C.在NCCIT和MCF10A细胞中激活蛋白-A和Nodal的促增殖作用需要Cripto和GRP78.以空载体、Cripto和/或GRP78shRNA感染的NCCIT细胞(A，B)和以空载
体或Cripto感染的MCF10A细胞(C)根据指示在IgG或N-20抗体存在或缺乏情况下以激
活蛋白-A或Nodal处理或不处理。细胞另外生长8天并且使用CyQuant增殖测定试剂盒
*** ** *
测量增殖。 p＜0.001；p＜0.005；p＜0.01。

[0037] 图13A-C.GRP78D19-68抑制经由erbB2、erbB4和PI3K的Cripto信号.如所标明，293T细胞以空载体、ErbB2和/或ErbB4表达载体连同葡萄糖-6-磷酸酶-萤光素酶
(G6Pase-Lux)和b-半乳糖苷酶构建体转染细胞。此外，细胞以(A)空载体、(B)GRP78或(C)
GRP78 D19-68转染。细胞不经处理或者如所标明以Cripto(400ng/ml)和/或LY294002(LY)
处理。所得到的萤光素酶活性相对于b-半乳糖苷酶表达标准化并且表示为相对于未处理
样品的变化倍数。

[0038] 图14A-B.说明所提出的Cripto/GRP78信号机制和拮抗作用的模型.(A)细胞表面Cripto/GRP78复合体是经由MAPK/PI3K和Smad2/3途径的致癌Cripto信号所必需的。
Cripto与细胞表面GRP78的结合导致通过ErbB2和ErbB4的cSrc/MAPK/PI3K途径的活化。
Cripto与细胞表面GRP78的结合还促进Cripto对由激活蛋白/Nodal/TGF-β配体所发出
信号的影响，导致低水平的Smad2/3活化。(B)打断细胞表面Cripto/GRP78复合体致癌功
能的试剂包括N-20 GRP78抗体、GRP78 D19-68突变体和sALK4-L75A-Fc。

具体实施方式

[0039] 本发明通过提供用于抑制Cripto/GRP78复合物形成的方法和用于假定Cripto/GRP78复合体调节剂的筛选方法克服了现有技术中的局限性。Cripto是在脊椎动物胚胎发
生和人肿瘤进展中具有重要作用的多功能细胞表面蛋白质。虽然已经证明其调节多重信号
途径，但是先前鉴定的其配偶体不能完全解释它的分子作用。发明人针对鉴定新的Cripto
相互作用蛋白质开展筛选，结果鉴定出葡萄糖调节蛋白78(GRP78)，它是一种在肿瘤细胞表面上也表达的ER蛋白伴侣。如在下面实施例中所示，Cripto与GRP78在多种细胞系的细
胞表面上相互作用并且它们的相互作用不依赖于先前在ER内的结合。使用shRNA对内源
GRP78的敲低导致TGF-β信号增强，表明GRP78与Cripto一样抑制该途径。当GRP78和
Cripto共表达时协同对抗TGF-β的反应，包括在贴壁依赖性或不依赖性条件下生长的前
列腺癌细胞的Smad磷酸化和生长抑制。下面的实例进一步提供了证据表明，共表达GRP78
和Cripto的细胞在软琼脂中比单独表达任一种蛋白的细胞生长快的多。

[0040] 对GRP78/Cripto复合物形成的抑制可以打断Cripto信号并且降低细胞增殖。细胞表面GRP78的丧失或免疫中和阻断了Cripto依赖性Nodal信号，激活蛋白/TGF-β信号
的拮抗作用和ERK/MAPK和PI3K/Akt/GSK3β途径的活化。发明人已经证明，GRP78存在于
人ES细胞的表面上，其中它与Cripto共定位并且介导Cripto对激活蛋白和Nodal信号的
相反作用。此外，细胞表面GRP78的敲低或免疫中和阻断了Cripto引起增加的细胞增殖、降低的E-钙黏着蛋白表达和降低的细胞粘附的能力。发明人发现，虽然在细胞表面Cripto/
GRP78复合体缺乏情况下激活蛋白-A是细胞抑制剂，但是在细胞表面Cripto/GRP78复合体
存在情况下激活蛋白-A和Nodal均增加细胞增殖。这些资料共同表明细胞表面GRP78对
于Cripto信号是必需的，并且支持了这样一个想法，即在正常胚胎发育和肿瘤发生过程中
GRP78介导Cripto的功能。

[0041] Cripto

[0042] Cripto是在发育和癌症进展过程中具有重要作用的GPI锚定信号蛋白(Strizzi等，2005)。在发育中的小鼠胚胎中，Cripto对于前-后轴的正确建立和胚层形成和心脏
发生是必需的。Cripto还被认为是在多能性维持和分化中具有重要作用的胚胎干细胞的
标志物(Adewumi等，2007；Strizzi等，2005)。虽然在正常成人组织中Cripto表达通常
低或缺乏，但是发现在许多人实体肿瘤中水平高并且过表达促进贴壁不依赖性生长、增殖、存活、迁移、侵袭、血管发生和EMT(Strizzi等，2005)。Cripto还促进体内肿瘤生长，因为MMTV-Cripto和WAP-Cripto小鼠产生了乳腺肿瘤(Strizzi等，2005；Strizzi等，2004；Sun等，2005；Wechselberger等，2005)并且靶向Cripto的单克隆抗体降低肿瘤异种移植物在
裸鼠中的生长(Adkins等，2003；Xing等，2004)。

[0043] 与其它生长因子类似，Cripto在从其GPI锚中断裂之后可从细胞释放，并且已经证明可溶形式的Cripto活化促有丝分裂的ras/raf/MAPK和PI3K/Akt途径(Strizzi
等，2005)。Cripto还充当TGF-β超家族成员例如Nodal(Schier，2003；Shen，2007)、
GDF1(Cheng等，2003)和GDF3(Chen等，2006)的专一性共受体。该共受体功能是胚胎发育过程所必需的(Schier，2003；Strizzi等，2005)并且在成体中可调节正常组织生长和重塑，如通过Cripto和Nodal在怀孕和哺乳的乳腺中共表达的事实所表明(Bianco等，2002a)。
Cripto共受体功能还促进肿瘤生长，因为最新表明Nodal信号在促进人黑素瘤和乳腺癌细
胞的可塑性和致瘤性中起着关键的作用(Postovit等，2008；Topczewska等，2006)。Cripto还抑制由激活蛋白(Adkins)(Gray等，2003；Kelber等，2008)和TGF-β1(Gray等，2006)
引起的信号并且抑制对人乳腺上皮细胞和前列腺癌细胞的TGF-β1-依赖性抗增殖作用
(Gray等，2006；Shani等，2008)。因此，Cripto可通过激活生长/存活途径和通过抑制肿
瘤抑制基因途径促进肿瘤发生(Strizzi等，2005)。

[0044] GRP78

[0045] 发明人已经鉴定出GRP78作为新的Cripto结合配偶体，并且表明这两种蛋白质形成抑制细胞抑制性TGF-β信号和促进肿瘤细胞生长的细胞表面复合体。GRP78已经广
泛表征为辅助蛋白质折叠、成熟和装配的ER蛋白伴侣并且还协调未折叠蛋白质反应(UPR)
(Bernales等，2006；Lee，2005；Lee，2001)。GRP78在低氧和营养物缺乏条件下被诱导，并且发现在肿瘤细胞中水平高(Lee，2007)。GRP78在肿瘤发生中起着必需作用的证据第一次出
现于如下证明中，即用反义核酸对纤维肉瘤细胞中GRP78诱导的抑制致使它们在裸鼠中完
全不能形成肿瘤，而它们的体外生长不受影响(Jamora等，1996)。此外，向纤维肉瘤和乳腺肿瘤细胞中递送由GRP78启动子驱动的自杀转基因导致完全消灭小鼠中的相当大的肿瘤
(Chen等，2000；Dong等，2004；Gazit等，1999)。因此，在实体肿瘤中建立的环境导致诱导GRP78并且其表达促进肿瘤生长。

[0046] 虽然GRP78主要位于ER中，但是其可以作为跨膜蛋白质存在(Reddy等，2003)并定位在人肿瘤细胞的质膜上，这最初在以毒胡萝卜内酯处理后的人横纹肌肉瘤细胞中证明
(Delpino和Castelli，2002；Delpino等，1998)。随后，细胞表面蛋白质组的总图谱证实
GRP78暴露于肿瘤细胞表面上(Shin等，2003)。的确，GRP78已经显示与MHC类I一起在细
胞表面上作为病毒的共受体起作用(Triantafilou等，2002)并且作为纤维蛋白溶酶原衍
生的Kringle 5结构域(Davidson等，2005)和活化的 2-巨球蛋白(. 2M)(Misra等，2002；
Misra等，2004)的受体起作用。值得注意的是，GRP78受体功能显示引起生长途径的活化，导致增加的细胞增殖和抗细胞凋亡行为(Misra等，2006；Misra等，2005；Misra等，2004)。
GRP78的此类受体功能从GRP78自身抗体的存在已经与增加的前列腺癌进展和降低的患者
存活相联系的观察中描绘出癌症相关的关联性(Mintz等，2003)。此外，GRP78在癌症进展
中的因果作用由如下发现支持，即靶向质膜上GRP78的自杀肽被证明选择性地杀死肿瘤细
胞(Arap等，2004)。重要的是，这些发现验证了细胞表面GRP78作为癌症治疗的推定的靶
标。

[0047] Cripto和GRP78结合并引起促进细胞增殖的细胞内信号

[0048] 基于Cripto结合位于肿瘤细胞表面上的GRP78的证据，发明人评价了GRP78作为Cripto受体起作用的可能性。与该假设相一致并且如下面实例所示，Cripto与细胞表面
GRP78的结合对于肿瘤细胞、ES细胞和乳腺上皮细胞中的Cripto信号是必需的。

[0049] Cripto与GRP78的结合导致几个下游细胞内信号途径的活化。例如，如下面实例所示，Cripto与细胞表面GRP78的结合对于Cripto作为专一性Nodal共受体和激活蛋白
和TGF-β信号的拮抗剂的功能是必需的。GRP78受体功能介导可溶性Cripto肿瘤生长因
子活性，包括活化c-Src/MAPK/PI3K途径，增加细胞增殖，降低E-钙黏着蛋白表达和降低细胞粘附。在Cripto/GRP78复合体存在情况下激活蛋白-A和Nodal具有促增殖作用，而当
Cripto/GRP78复合体被打断时激活蛋白-A是抗增殖的。不希望被任何理论所束缚，这些
发现表明，GRP78作为细胞表面Cripto受体/共因子起作用，这对于Cripto对激活蛋白/
Nodal/TGF-β和MAPK/PI3K信号途径的发育和致癌作用是必需的。

[0050] A.GRP78和Cripto在细胞表面上形成复合体，其不需要先前在ER中结合.

[0051] 如在下面实例中所证明，GRP78与Cripto在细胞表面上形成复合体，这是一个有用的以及潜在治疗暗示的发现。该相互作用看起来是特异性的和排他性的，因为GRP78是
所观察到的与Cripto共纯化的仅有的两种细胞表面蛋白质之一并且因为大小与Cripto相
似的无关的跨膜蛋白不与GRP78共纯化。同样，在相同条件下I型和II型TGF-β受体均不
能免疫沉淀GRP78。结果还表明，Cripto/GRP78结合不依赖于GRP78ER蛋白伴侣功能，因为
在单独的细胞群体中这些蛋白质成熟和加工之后的无细胞环境中观察到它们的相互作用。
该结果还支持在细胞表面上该复合体的存在，因为显示在这些条件下结合Cripto的GRP78
来自于质膜。此外，该结果表明对于该特异性结合相互作用所需的信息可以完全包含在这
两种蛋白质的三级结构中，并且预期使用特异性地打断它们相互作用的分子可以靶向肿瘤
细胞。

[0052] 发明人发现，内源Cripto和内源GRP78可作为来自小鼠胚性癌细胞的复合体分离。不希望被任何理论所束缚，该发现进一步支持了对于它们作为质膜上信号共因子的相
互作用的内在作用，并且再一次地反对GRP78只是在ER中过表达Cripto的折叠中起作用
的可能性。发明人还通过免疫细胞化学探究了Cripto和GRP78在同一细胞中的定位并且
发现Cripto和GRP78主要共定位于作为部分出现在细胞表面的斑点状结构中。这些发现
支持Cripto和GRP78在质膜上一起起作用的结论，但是还表明，它们在对于信号蛋白质所
普遍的囊泡运输过程中是相关的。此外，细胞表面染色的斑点状性质与先前显示两种蛋白
质均与脂筏相关的报导一致(Triantafilou和Triantafilou，2003；Watanabe等，2007)。

[0053] B.GRP78作为细胞表面受体起作用

[0054] GRP78在ER中作为蛋白伴侣和UPR的协调者起着保护性作用，但是它还在细胞表面上表达，其在细胞表面上的功能理解甚少。细胞表面GRP78已经被鉴定为是人乳腺癌
样品中的肿瘤特异性抗原，并且在前列腺癌患者血清中发现了靶向GRP78的自身抗体并且
显示靶向GRP78的自身抗体充当癌症侵袭性增加的生物标志物(Arap等，2004；Mintz等，
2003)。而且，由融合至凋亡诱导序列的GRP78结合模体构成的嵌合肽抑制前列腺和乳腺癌
小鼠模型中的肿瘤生长(Arap等，2004；Liu等，2007)。资料表明GRP78不仅仅是肿瘤细胞
的选择性细胞表面标志物，而且还是介导Cripto对激活蛋白/Nodal/TGF-β和MAPK/PI3K
信号的效应的受体/共因子。虽然对GRP78和激活蛋白/Nodal/TGF-β信号之间存在功能
性联系的发现似乎是独特的，但是先前研究已经表明细胞表面GRP78具有受体活性并且可
以介导生长/存活信号。例如，在1-LN前列腺癌细胞中，2-巨球蛋白( 2-M)通过细胞表面
GRP78发信号引起MAPK和PI3K途径活化，产生促增殖和抗细胞凋亡行为(Misra等，2006；
Misra等，2004)。来自前列腺癌患者血清的靶向GRP78的抗体类似地显示出活化MAPK/PI3K
途径并且增加细胞增殖。有趣的是，细胞表面GRP78也显示在介导内皮细胞中经由Akt的
GPI锚定的T-钙黏着蛋白依赖性存活信号转导中具有必不可少的作用(Philippova等，
2008)。Cripto、T-钙黏着蛋白和GRP78每一个定位在脂筏中，表明GRP78受体功能也许局
限在这些质膜微域中。

[0055] 下面的结果表明，对于Cripto与TGF-β配体和它们的受体功能性相互作用的能力而言需要GRP78。不希望被任何理论所束缚，发明人预期，GRP78将充当质膜上的锚或支
架，允许Cripto采用对于其与TGF-β配体以及它们的受体形成复合体并且改变它们的信
号特性所需要的构象或定向。Cripto的CFC介导与GRP78的结合以及与类型I信号受体
ALK4和ALK7的结合。不希望被任何理论所束缚，发明人预期，Cripto与GRP78或者ALK4/7
之间的结合相互作用不是彼此排斥的，而是GRP78将促进Cripto与ALK4/7和配体如Nodal
和激活蛋白之间复合物的形成。GRP78除了作为Cripto对TGF-β配体信号的作用的必不
可少的介导物的作用之外，结果还显示GRP78与可溶性Cripto偶联活化MAPK/PI3K途径。
该发现表明，GRP78或者作为跨膜受体起作用，或者与一种或者两者偶联。虽然通常认为
GRP78是局限在ER腔内的可溶性蛋白质，但是表明相当大部分的GRP78作为具有两个推定
跨膜螺旋的整合膜蛋白质存在(Reddy等，2003)。Reddy等对ER微粒体使用有限的胰蛋白
酶消化表明，膜相关GRP78的N-末端和C-末端区在ER腔内/细胞外，而蛋白质的中间三
分之一在细胞质中(Reddy等，2003)。该罕见的跨膜拓扑学与这样的事实一致，即已经表明细胞外蛋白质结合GRP78的N-末端或C-末端附近(Davidson等，2005；Gonzalez-Gronow
等，2006；Jakobsen等，2007；Philippova等，2008).

[0056] C.Cripto结合GRP78的N-末端附近

[0057] 下面的资料表明，Cripto结合至GRP78的最N-末端，因为N-末端N-20抗体封闭结合并且缺乏N-20表位的GRP78缺失突变体不能够结合Cripto。N-20抗体还显示竞争性
的封闭Kringle 5(Davidson等，2005)和T-钙黏着蛋白(Philippova等，2008)的细胞效
应，表明这些蛋白质结合GRP78的N-末端。此外，2-M和促增殖性前列腺癌患者来源自身
抗体结合至定位于GRP78的邻近N-20表位的N-末端的部位(Gonzalez-Gronow等，2006)。
这些细胞外蛋白质的每一种结合GRP78最N-末端的事实表明它们具有相似的激活GRP78
受体功能的方式并且它们还彼此竞争对GRP78的结合。

[0058] D.GRP78结合Cripto的CFC.

[0059] Cripto和GRP78之间相互作用的特异性被如下证明进一步支持，即Cripto的CFC结构域对于GRP78结合似乎是必需的和足够的。该发现是值得注意的，因为它表明Cripto
可通过其EGF-样结构域结合TGF-β，如发明人先前证明的那样(Gray等，2006)，而同时通
过其CFC结构域结合GRP78。发明人推测，包含Cripto、GRP78、TGF-β和TGF-β受体的
更大级别的蛋白质复合体也可形成并导致TGF-β信号的降低和/或改变。此外，Cripto
的CFC结构域结合GRP78的观察进一步肯定了GRP78对Cripto通过其它TGF-β配体例如
Nodal和激活蛋白调节信号的可能影响。例如，先前已经表明，Cripto的CFC结构域特异性
地结合激活蛋白/Nodal I型受体ALK4(Yeo和Whitman，2001)，并且因此GRP78可与ALK4
竞争与Cripto的结合。备选地，GRP78可参与包含ALK4、Cripto和激活蛋白/Nodal的蛋
白质复合体。

[0060] E.Cripto相关GRP78的靶向敲低抑制TGF-β信号.

[0061] 多条线的证据表明，Cripto和GRP78每一个促进肿瘤形成并且两种蛋白质均选择性地表达于癌细胞的细胞表面。如本文所述，现在已经发现，先前已经表明涉及促进肿瘤生长的这两种蛋白质在细胞表面形成复合体。该发现将这些蛋白质在物理上以及通过抑制
TGF-β信号的机制上关联起来。

[0062] 最初，GRP78在TGF-β信号中的作用通过开发能够降低与质膜上Cripto结合的GRP78水平的shRNA评价。该shRNA(SEQ ID NO：5)增强TGF-β依赖的Smad2磷酸化，这
提供了内源GRP78可限制TGF-β信号的证据。据发明人所知，该发现是GRP78影响TGF-β
信号的首次证明，并且重要的是，其构成了一个新的机制，通过该机制细胞表面的GRP78可传送其致瘤信息。该结果还与内源Cripto在这些细胞中具有相似作用的先前证明不谋而
合(Gray等，2006)并且与GRP78结合细胞表面上的Cripto以对抗生长抑制性的TGF-β信
号的假设相一致。

[0063] F.GRP78和Cripto协同减弱细胞抑制性TGF-β信号并且增强人前列腺癌细胞的增殖.

[0064] 当GRP78和Cripto一起表达时比单独表达时更大程度地抑制TGF-β-依赖性Smad2磷酸化作用的证明表明它们一起作用抑制TGF-β信号。不希望被任何理论所束缚，
由于Smad磷酸化的水平直接依赖于受体活化的程度，该结果表明Cripto和GRP78通过降
低TGF-β激活其受体的能力发挥它们的抑制性效应。这样的解释得到如下事实的进一步
支持，即Cripto和/或GRP78在这些细胞中的过表达不改变TGF-β受体水平。此外，未能
检测到GRP78与其I型或II型TGF-β受体之间的相互作用表明GRP78可通过结合Cripto
或者通过直接结合TGF-β或者两者发挥其对TGF-β信号的抑制性效应。

[0065] 发明人进一步地证明，Cripto和GRP78协同起作用以增强细胞生长并抑制TGF-β的细胞抑制性效应。当细胞在贴壁依赖性条件下生长时，Cripto和GRP78每一个减弱
TGF-β的生长抑制性效应，并且有趣的是，它们的共表达导致TGF-β性质上从抗增殖转
变成促增殖。虽然对于Cripto和GRP78对细胞对TGF-β的增殖反应的联合作用的机制
尚未确立，但是已经显示TGF-β在其细胞抑制效应已经丧失的条件下增加增殖/存活
(Paradali和Moustakas，2007)。同样地，发明人发现，Cripto和GRP78可协同封闭贴壁不
依赖性条件下TGF-β的细胞抑制效应。然而，与在单层中观察到的不同，TGF-β处理不能
增强共表达Cripto和GRP78的细胞在软琼脂中的生长。另一个差异是，当GRP78和Cripto
单独表达时并且更显著地当它们共表达时，在缺乏TGF-β处理的情况下，GRP78和Cripto
增加在软琼脂中的集落生长。

[0066] 因此，结果表明GRP78和Cripto以取决于特定生长条件而变的方式影响细胞生长和TGF-β反应性。与贴壁不依赖性条件相反，在生长在贴壁依赖性条件下的细胞中，不同
的信号途径可响应环境而活化。例如，肿瘤细胞利用信号途径例如FAK和Src促进贴壁不依
赖性生长和避免失巢凋亡(Mitra和Schlaepfer，2006)。因此，虽然特定的机制有待阐明，但是从TGF-β发源的具有与特定生长环境明确相关的信号途径的信号的集中可导致生长
效应的细微差别。不管发明人观察的差别如何，然而，发明人已经一致性的发现，当Cripto和GRP78蛋白质一起表达时Cripto和GRP78对TGF-β反应性的效应大于它们单独表达
时。因此，细胞表面Cripto-GRP78复合体表现出在贴壁依赖性和贴壁不依赖性生长条件下
抑制细胞抑制性TGF-β反应的明确且一致的作用。

[0067] TGF-β是主要的肿瘤阻抑因子并且其细胞抑制功能的丧失与肿瘤起始和进展相关(Pardali和Moustakas，2007)。这种生长抑制性TGF-β信号的丧失将源于受体信号的
减少，Smad功能受损或者转录调节物或其它靶标的破坏，它们一起构成了细胞抑制性程序
(Siegel和Massague，2003)。的确，TGF-β信号频繁地加重了抵抗抗增殖效应的肿瘤的生
长和扩散(Pardali和Moustakas，2007)。Cripto和GRP78每一种已经单独涉及到人癌进展
并且这些蛋白质中的每一个在肿瘤细胞表面上选择性表达。在此发明人已经提出证据证明
这两种蛋白质在细胞表面上物理性相互作用。发明人还进一步提供了证明，即它们协同增
强肿瘤细胞生长并且逆转TGF-β的肿瘤阻抑因子效应。不希望被任何理论所束缚，这些结
果支持这样的一个想法，即该复合体导致恶性肿瘤增加并且其通过在受体水平抑制TGF-β
信号赋予肿瘤细胞以竞争性增殖的优势。依据这些发现，预期细胞表面Cripto-GRP78复合
体代表着具有重要治疗潜能的称心如意的靶标，因为其具有仅影响癌症细胞而不影响其正
常组织对等物的固有选择性优势。

[0068] G.GRP78/Cripto/TGF-β配体

[0069] 结果显示，GRP78介导Cripto的共受体功能并且涉及细胞表面GRP78在胚胎发生和干细胞调节过程中的新的和必不可少的作用。在胚胎发育过程中Cripto作为Nodal和相
关TGF-β配体的共受体起着至关重要的作用，并且在斑马鱼和小鼠中的遗传学研究已经
表明Cripto和相关的EGF-CFC蛋白质对于中胚层和内胚层形成、心脏发生和左/右不对称
性的建立是必不可少的。Cripto还已经被公认为是胚胎干细胞的标志物并且在干细胞维持
和分化中起着重要的作用。从Cripto-无效小鼠产生的ESC不能够经历心肌发生和自发分
化成神经元。如在下面实例中所示，内源GRP78是Cripto信号包括Cripto-依赖性Nodal
信号的必需的介导者。此外，发明人提供了证明，即GRP78出现在人ES细胞的表面上，它在表面上与Cripto共定位。对hES细胞上GRP78的抗体阻断封闭了Nodal信号，表明在这些
细胞中对于Nodal信号需要GRP78。这些结果支持靶向Cripto和GRP78之间的界面将有助
于对hES细胞需要优先分化成神经元的神经变性疾病的基于细胞的治疗。

[0070] 数项研究也支持Cripto对促进肿瘤表型的激活蛋白/Nodal/TGF-β信号的调节作用(Adkins等，2003；Gray等，2003；Gray等，2006；Salomon，2006；Shani等，2008；Shen，
2003；Shukla等，2008；Topczewska等，2006)。Cripto抑制TGF-β信号以及TGF-β对乳
腺上皮细胞(Gray等，2006)和原代角质形成细胞(Shukla等，2008)的细胞抑制性效应。
Cripto还抑制TGF-β对前列腺癌细胞的抗增殖效应，这是一种被GRP78过表达所增强的效
应(Shani等，2008)。与TGF-β一样，激活蛋白-A抑制大多数上皮细胞的增殖并且已经提
出激活蛋白/TGF-β信号的拮抗作为致癌性Cripto的机制。与之相反，已经证明Nodal促
进黑素瘤和乳腺癌可塑性和致瘤性(Hendrix等，2007；Postovit等，2008；Salomon，2006；
Topczewska等，2006)并且结果表明这将需要经由Cripto和GRP78的信号。在本发明中，
发明人已经证明使用shRNA或N-20GRP78封闭性抗体靶向NCCIT上的细胞表面GRP78消除
了Cripto对通过激活蛋白、TGF-β和Nodal的信号的影响。该影响可能是通过Cripto和
GRP78之间的相互作用介导的，因为将两种蛋白质一起敲低比将任一个蛋白质单独敲低具
有更深远的影响。重要的是，这是内源Cripto抑制激活蛋白-A和激活蛋白-B信号的首次
证明并且证实了内源Cripto阻断通过TGF-β的信号的先前证明。这些发现还支持GRP78
具有作为Cripto共因子的新作用，这对于Cripto对激活蛋白/Nodal/TGF-β信号的潜在
致癌效应是必需的。

[0071] H.GRP78介导Cripto生长因子活性

[0072] Cripto除了对激活蛋白/Nodal/TGF-β信号具有效应外，还激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)途径(De Santis等，1997；Ebert等，1999；
Strizzi等，2005)。这些途径在大多数人癌症中被异常活化并且广泛认为它们具有促进
多种致瘤后果包括增加肿瘤细胞存活和增殖的能力(Dhillon等，2007；Shaw和Cantley，
2006)。已经显示，用可溶性Cripto处理HC-11乳腺上皮细胞导致SH2-衔接蛋白Shc的酪
氨酸磷酸化、Shc与Grb2的结合以及p42/44Erk/MAPK途径的活化(Kannan等，1997)。可
溶性Cripto还引起PI3K的p85调节亚基的磷酸化，导致SiHa颈癌细胞中Akt的磷酸化和
活化(Ebert等，1999)。Cripto不结合EGF受体家族成员(Kannan等，1997)，并且据报导
MAPK/PI3K途径被可溶性Cripto的活化是ALK4-不依赖性的(Bianco等，2002b)。在用可
溶性Cripto处理细胞之后c-Src被活化并且c-Src活化对于MAPK和PI3K途径的Cripto
依赖性活化是必需的(Bianco等，2003)。此外，据报导GPI-锚定蛋白聚糖磷脂酰肌醇蛋白
聚糖-1结合Cripto并促进Cripto依赖性c-Src活化(Bianco等，2003)。然而，尚未鉴定
出介导c-Src活化和MAPK/PI3K信号的跨膜Cripto受体。下面的资料证明细胞表面GRP78
介导Cripto的肿瘤生长因子活性。

[0073] Cripto/GRP78复合体还影响Akt/ErK信号。对NCCIT细胞中Cripto/GRP78复合体的敲低或抗体破坏阻断了可溶性Cripto诱导Akt、GSK3b和p42/44的磷酸化。

[0074] I.Cripto/GRP78复合体转换激活蛋白-A和Nodal的增殖效应

[0075] 响应于激活蛋白、Nodal和TGF-β配体的Smad2/3信号取决于细胞类型和细胞环境具有对细胞增殖、凋亡和分化可变性并且甚至具有相反的作用。Smad2/3途径的肿瘤阻抑制因子功能已经被广泛表征，并且从其具有抑制多种细胞类型增殖的能力以及在一些情况
下引起终末分化或凋亡的能力得出来的。现在已经广泛确立，Smad2/3信号下游的细胞抑
制性转录程序对于正常的组织稳态和肿瘤抑制是至关重要的，并且已经在数个类型的人癌
症，包括乳腺癌中观察到该途径的破坏或改变。然而，激活蛋白/Nodal/TGF-β配体在肿瘤细胞已经变得抵抗Smad2/3途径的抗增殖效应的条件下加重肿瘤表型。肿瘤细胞通常分泌
高水平的这些配体，这些配体作用于肿瘤细胞和肿瘤微环境内的其它细胞类型包括基质成
纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞。在该环境中Smad2/3的活化可引起增强的肿瘤细胞增殖、运动性、侵袭和上皮间质转化(EMT)以及增加的血管发生和降低的免疫监视。加在一起，
这些效应可导致肿瘤生长和转移的增强并且产生针对阻断人癌症中TGF-β信号的治疗成
就。

[0076] 发明人还显示，取决于细胞表面Cripto/GRP78复合体的存在与否，激活蛋白-A对细胞增殖具有相反的作用。在空载体感染的NCCIT细胞和其中Cripto/GRP78复合体完
整的Cripto-过表达性MCF10A细胞中激活蛋白-A具有促增殖效应。相反，当通过敲低或
N-20抗体阻断将这些细胞中的Cripto/GRP78复合体破坏时，激活蛋白-A具有抗增殖效应。
与激活蛋白-A一样，在表达完整Cripto/GRP78复合体的这些细胞中，Nodal增强增殖。然
而，与激活蛋白-A不同，Nodal对其中Cripto/GRP78复合体被破坏的细胞的增殖没有影响。
激活蛋白-A和Nodal之间的这种差异可能反映出这样的一个事实，即Cripto对于Nodal
信号是必需的而对于激活蛋白-A信号是不需要的。这些资料表明，细胞表面上的Cripto/
GRP78复合体可通过促进Nodal的促有丝分裂效应并引起激活蛋白-A性质上从细胞抑制转
变成促增殖而促进肿瘤生长。因此，Cripto引起从上皮-细胞抑制性向间质-促增殖性转
变的细胞反应，并且这类似于当肿瘤细胞变成对Smad2/3的细胞抑制效应抵抗时所观察到
的情况。这些结果暗示了通过它激活蛋白和Nodal变成促肿瘤发生性的机制，并且该效应
似乎是GRP78依赖性的。有趣的是，发明人发现，激活蛋白-A和Nodal在Cripto/GRP78复
合体存在下是促有丝分裂性的，然而在这些复合体缺乏情况下激活蛋白-A具有细胞抑制
性效应并且Nodal对增殖无影响。因此，细胞表面Cripto/GRP78复合体可促进MAPK/PI3K
和Smad2/3途径之间的交叉通讯，使得细胞抑制性Smad2/3信号在性质上变成促增殖性的。
因此，细胞表面Cripto/GRP78复合体作为细胞信号节点起作用以调节多种肿瘤和干细胞
行为。

[0077] 如下事实支持Cripto和GRP78之间存在生物学相互作用，即Cripto和GRP78具有重叠的分布和功能。Cripto(Ding等，1998)和GRP78(Luo等，2006)敲除小鼠均是早期胚胎
致死性的。Cripto还可调节胚胎干细胞行为(Minchiotti，2005)并且发明人在此已经证明
Cripto和GRP78在干细胞中共定位并且协同调节激活蛋白和Nodal信号。就此而论，发现
GRP78对于作为多能性干细胞前体的胚胎内细胞团的增殖和存活是必需的(Luo等，2006)。
此外，Cripto(Xu等，1998；Xu等，1999)和GRP78(Mao等，2006)在发育中的心脏中显著表达并且它们中的每一个已经涉及到心脏发生。最后，向Cripto一样(Strizzi等，2005)，GRP78增加了恶性肿瘤并且通过增强肿瘤细胞存活、增殖和血管发生向肿瘤细胞提供了竞争性生
长优势(Dong等，2008；Lee，2007)。重要的是，Cripto和GRP78均选择性地表达于人肿瘤
细胞的质膜上并在它们的正常组织对等物上不表达，并且它们中的每一个均独立地验证可
作为体内的肿瘤特异性治疗靶标。因此，Cripto/GRP78复合体代表着具有显著治疗潜力的
新的且称心如意的靶标。

[0078] IV.Cripto/GRP78相互作用的抑制剂

[0079] Cripto/GRP78相互作用可以通过抑制Cripto/GRP78复合物形成和/或功能的Cripto靶向性化合物和/或GRP78靶向性化合物选择性地抑制。在某些实施方案中，
Cripto靶向性或GRP78靶向性化合物可以是抗体、双功能抗体、适体、抗体片段例如f(ab)
或f(ab)2区、抑制性肽、小分子、反义分子或siNA(例如siRNA或shRNA)。这些化合物可以
由技术人员通过测试Cripto/GRP78结合和/或下游信号被候选化合物改变的筛选法产生。
在某些实施方案中，Cripto靶向性化合物可特异性影响或结合Cripto的CFC结构域并且抑
制Cripto/GRP78结合和/或信号。在另外的实施方案中，GRP78靶向性化合物可与GRP78
的N-末端区或最N-末端区，例如GRP78的N-20抗体表位结合或相互作用。

[0080] A.抗体

[0081] 本发明的某些方面涉及选择性结合Cripto和/或GRP78的一种或更多种抗体。这些抗体可以用于治疗癌症(例如黑素瘤、肝癌、结直肠癌、胰腺癌、肺癌、NSCLC、头颈癌症)。
此外，这些抗体可用于评估Cripto和/或GRP78在组织中，例如癌性组织或癌前组织中的
表达。在某些实施方案中，N-20抗体或结合GRP78的N-20表位的抗体可用于靶向GRP78并
破坏Cripto/GRP78复合体的形成。

[0082] 在某些实施方案中，希望产生抗所鉴定靶向性肽或它们的受体的抗体。适当的靶向性肽或受体或其部分可通过连接体、多连接体或衍生的氨基酸与一种或更多种试剂偶
联、结合、连接、缀合或化学交联。这可以如下开展以致于产生双特异性或多价组合物或疫苗。进一步地构想，在制备这些组合物中使用的方法是本领域技术人员熟悉的并且将适宜
向人施用，即可药用。优选的试剂是载体钥孔血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)。

[0083] 术语“抗体”用于指具有抗原结合区的任何抗体样分子，并且包括抗体片段例如Fab’、Fab、F(ab’)2、单结构域抗体(DAB)、Fv、scFv(单链Fv)等等。用于制备和使用多种基于抗体的构建体和片段的技术在本领域众所周知。用于制备和表征抗体的方法也是本领
域众所周知的(见例如Harlow和Lane，1988；通过参考并入本文)。

[0084] 在本发明的多个实施方案中，可以针对噬菌体展示文库得到和筛选来自一个或更多个患病个体的循环抗体。结合循环抗体的靶向性肽可充当天然抗原，例如位于靶组织内
皮细胞表面上的受体蛋白质的模拟位。例如，在患有前列腺癌个体中的循环抗体可以结合
特异性或选择性地位于前列腺肿瘤中的抗原。如在下面更详细地讨论，可以通过噬菌体展
示针对此类抗体鉴定靶向性肽。此类靶向性肽可以用于通过例如使用已知技术如免疫亲和
纯化、Western印迹、电泳后的条带切除和蛋白质/肽测序和/或计算机同源性检索，鉴定
被抗体识别的天然抗原。技术人员将认识到，针对疾病特异性或选择性抗原的抗体可用于
多种应用中，例如疾病状态的检测、诊断和/或预后、患病组织成像和/或治疗剂的靶向递
送。

[0085] 在某些实施方案中，Cripto和/或GRP78抗体是单克隆抗体。单克隆抗体(MAb)被认为具有某些优势，例如重现性和大规模生产，并且通常优选使用它们。因此，本发明提供人、小鼠、猴、大鼠、仓鼠、兔甚至鸡来源的单克隆抗体。由于小鼠单克隆抗体具有易制备性和立即可用性，因此常优选小鼠单克隆抗体。

[0086] “人源化”抗体是本发明特别考虑的，它们是携带有人恒定区和/或可变区结构域的来自小鼠、大鼠或其它物种的嵌合抗体、双特异性抗体、重组和工程化抗体及其片段。用于开发针对患者疾病的“客户定制”抗体的方法同样也是已知的并且此类客户定制的抗体也在考虑之内。

[0087] 1.用于抗体产生的方法

[0088] 可以使用本领域众所周知的技术制备Cripto和/或GRP78选择性抗体。例如，用于产生单克隆抗体(MAb)的方法通常以与制备多克隆抗体的方法相同的路线开始。简言
之，以根据本发明的LEE或CEE组合物免疫动物并从所免疫动物收集抗血清来制备多克隆
抗体。

[0089] 广范围的动物种类可以用于产生抗血清。有代表性地，用于产生抗血清的动物是兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或山羊。动物的选择可以根据操作的难易程度、成本或预期的血清量决定，这将是本领域技术人员已知的。

[0090] 为了产生更强烈的免疫反应和帮助产生抗血清，特定免疫原成分的免疫原性可以通过使用称作佐剂的非特异性免疫反应刺激剂增强。适宜的佐剂包括所有可接受的免疫刺
激化合物，例如细胞因子、趋化因子、辅因子、毒素、合胞体、合成的组合物或者编码此类佐剂的LEE或CEE。

[0091] 可以使用的佐剂包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、γ-干扰素、GMCSP、BCG、氢氧化铝、MDP化合物如thur-MDP和nor-MDP、CGP(MTP-PE)、脂质A和单磷酰脂质A(MPL)。还考虑了RIBI，其包含在2％鲨烯/Tween 80中的从细菌提取的MPL、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)
和细胞壁支架(CWS)三种成分。甚至可以使用MHC抗原。示例性的常常优选的佐剂包括完
全弗氏佐剂(包含杀死的结核分枝杆菌的非特异性的免疫反应刺激剂)、不完全弗氏佐剂
和氢氧化铝佐剂。

[0092] 除了佐剂之外，还希望共同施用已经显示上调T细胞免疫或者下调阻抑因子细胞活性的生物反应调节剂(BRM)。此类BRM包括，但不限于，西咪替丁(CIM；1200mg/d)(Smith/
2
Kline，PA)；低剂量环磷酰胺(CYP；300mg/m)(Johnson/Mead，NJ)，细胞因子例如γ-干扰素、IL-2或IL-12或者编码涉及免疫辅助功能蛋白质的基因，例如B-7。

[0093] 用于产生多克隆抗体的免疫原组合物的量根据免疫原的性质以及用于免疫的动物而变化。可采用多种途径施用免疫原，包括但不限于皮下、肌内、真皮内、表皮内、静脉内和腹膜内。可以通过在免疫后不同点从所免疫动物抽取血液检测多克隆抗体的产生。

[0094] 还可以给于第二次加强剂量(例如注射提供)。重复加强或滴定过程直到达到适宜的滴度。当得到所渴望水平的免疫原性时，可将免疫的动物放血并将分离的血清储存，和/或动物可以用于产生MAb。

[0095] 对于兔多克隆抗体的产生，可以通过耳静脉或备选地通过心脏穿刺从动物中取血。使所取出的血液凝固，然后离心从全细胞和血液凝块中分离血清部分。血清可以用于
多种应用中，或者通过众所周知的方法纯化想要的抗体部分，例如使用另一抗体即结合至
固体基质上的肽的亲和层析或者通过使用例如蛋白质A或蛋白质G层析。

[0096] 可以通过使用众所周知的技术，例如在美国专利4,196,265中例证的那些技术容易地制备MAb，该美国专利通过参考并入本文。有代表性地，该技术涉及以所选择的免疫成分，例如纯化或部分纯化的蛋白质、多肽、肽或结构域免疫适宜的动物，而不管它是野生型的或者突变体成分。免疫成分以有效刺激抗体产生性细胞的方式施用。

[0097] 用于产生单克隆抗体(MAb)的方法通常以与产生多克隆抗体的方法相同的路线开始。啮齿类例如小鼠和大鼠是优选的动物，然而，也可以使用兔、绵羊或青蛙细胞。使用大鼠可以提供某些优势(Goding，1986，第60-61页)，但是优选小鼠，BALB/c小鼠是最优选的，因为这是最常规使用的并且通常得到更高百分比的适宜融合体。

[0098] 通常如上所述，以抗原注射动物。抗原可以与佐剂混合，例如弗氏完全佐剂或不完全佐剂。以同一抗原或者编码抗原的DNA进行加强施用将以大约两周的间隔进行。

[0099] 在免疫之后，选择具有产生抗体潜能的体细胞，特别是B淋巴细胞(B细胞)用于MAb生产方案中。这些细胞可以从活组织检查的脾脏、扁桃体或淋巴结中得到，或者从外周血液样品得到。脾脏细胞和外周血细胞是优选的，前者是因为它们是处于分裂中的浆母细
胞阶段的抗体产生性细胞的丰富来源，并且后者是因为外周血容易得到。

[0100] 通常将免疫一组动物，并且具有最高抗体滴度的动物的脾脏将被取出并通过用注7
射器将脾脏匀浆得到脾脏淋巴细胞。有代表性地，来自所免疫小鼠的脾脏包含大约5×10
8
至2×10 个淋巴细胞。

[0101] 然后将来自所免疫动物的抗体产生性B淋巴细胞与永生化骨髓瘤细胞的细胞融合，骨髓瘤细胞通常与所免疫动物为同一物种。适用于杂交瘤产生融合方法中的骨髓瘤细
胞系优选地是非抗体产生性的、具有高的融合效率和酶缺乏，酶缺乏使得它们不能够在支
持仅想要的融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择培养基中生长。

[0102] 可使用本领域技术人员已知的许多骨髓瘤细胞中的任何一种(Goding，第65-66页，1986；Campbell，第75-83页，1984)。例如，当免疫的动物是小鼠时，可以使用P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0Bul；对于大鼠可使用R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210；并且与人细胞融合体相关的可使用U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。

[0103] 一个优选的小鼠骨髓瘤细胞是NS-1骨髓瘤细胞系(也称作P3-NS-1-Ag4-1)，其可以通过请求细胞系库编号GM3573容易地从NIGMS人基因突变细胞库中得到。可以使用的
另一个小鼠骨髓瘤细胞系是8-氮鸟嘌呤抗性小鼠骨髓瘤SP2/0非生产者细胞系。

[0104] 用于产生抗体产生性脾脏或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂合体的方法通常包括在促进细胞膜融合的一种试剂或多种试剂(化学的或电的)存在下以2∶1的比例混合体
细胞与骨髓瘤细胞，虽然比例可以大约20∶1至大约1∶1变化。使用仙台病毒的融合方
法已经由Kohler和Milstein描述(1975；1976)，并且使用聚乙二醇(PEG)的那些方法，例
如37％(v/v)PEG，由Gefter等描述(1977)。电诱导融合方法的使用也是适当的(Goding，
第71-74页，1986)。

[0105] 融合过程通常以低的频率，大约1×10-6至1×10-8，产生能存活的杂合体。然而，这不存在难题，因为通过在选择性培养基中培养，可存活的融合杂合体可与亲本、未融合的细胞(特别是正常情况下将连续无限分裂的未融合骨髓瘤细胞)区别开来。选择性培养基
通常是在组织培养基中包含阻断核苷酸从头合成的试剂的培养基。示例性且优选的试剂是
氨基蝶呤、甲氨蝶呤和偶氮丝氨酸。氨基蝶呤和甲氨蝶呤阻断嘌呤和嘧啶两者的从头合成，而偶氮丝氨酸仅阻断嘌呤的合成。当使用氨基蝶呤或甲氨蝶呤时，培养基补充有次黄嘌呤
和胸腺嘧啶核苷作为核苷酸的来源(HAT培养基)。当使用偶氮丝氨酸时，培养基补充有次
黄嘌呤。

[0106] 优选的选择培养基是HAT。仅能够利用核苷酸补救途径的细胞能够在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞缺乏补救途径的关键酶，例如次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)，并且因此它们不能存活。B细胞能够利用该途径，但是它们在培养时具有有限的寿命并通常在大约两周内死亡。因此，能够在选择培养基中存活的仅有的细胞是从骨髓瘤和B细胞形成的那
些杂合体细胞。

[0107] 这种培养提供一群杂交瘤，从这些杂交瘤中可以选择特异性的杂交瘤。有代表性地，杂交瘤的选择可以如下开展，即通过在微量滴定板中进行单克隆稀释来培养细胞，接着测试各个克隆上清液(大约两周至三周之后)的预期反应性。测定将是敏感的、简单的和快
速的，例如放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、空斑测定、斑点免疫结合测定等等。

[0108] 然后将所选择的杂交瘤进行连续稀释并克隆成各个抗体-产生性细胞系，然后克隆可以无限繁殖以提供MAb。细胞系可以用来以两个基本方式生产MAb。第一，可将杂交瘤
样品注射入(常常注射入腹腔)用于提供最初融合的体细胞和骨髓瘤细胞的组织相容性动
物类型中(例如同基因小鼠中)。任选地，在注射前，动物以碳氢化合物，特别是油类例如
降植烷(四甲基十五烷)致敏。所注射的动物产生分泌由所融合细胞杂合体产生的特异性
单克隆抗体的肿瘤。然后可以抽取动物的体液，例如血清或腹水，以提供高浓度的MAb。第二，各个细胞系可体外培养，其中MAb可天然地分泌进入培养基中，从培养基中可以容易地得到高浓度的MAb。

[0109] 如果需要的话，通过任一种方法产生的MAb可以使用过滤、离心和多种层析方法如HPLC或亲和层析进一步纯化。本发明单克隆抗体的片段可以通过包括用酶例如胃蛋白
酶或木瓜蛋白酶消化的方法和/或通过化学还原断裂二硫键从如此产生的单克隆抗体得
到。备选地，本发明包括的单克隆抗体片段可以使用自动肽合成仪合成。

[0110] 还考虑了可使用分子克隆方法产生单克隆。在一个实施方案中，从所免疫动物脾脏分离的RNA制备组合的免疫球蛋白噬菌体文库，并且通过使用表达抗原的细胞和对照细
胞淘洗选择表达适当抗体的噬菌粒。该方法相对于常规杂交瘤技术的优势是在一轮中可以
4
产生和筛选大约10 次量的抗体，并且通过H和L链组合产生新的特异性，这进一步提高发
现适当抗体的机会。在另一实例中，LEE或CEE可以用于在无细胞体系中体外产生抗原。这
些可以用作用于筛选单链抗体文库的靶标。这可以极其快速地鉴定许多不同的抗体，而无
需使用动物。

[0111] 备选地，本发明包括的单克隆抗体片段可以使用自动肽合成仪合成，或者通过在大肠杆菌中表达全长基因或基因片段合成。

[0112] 全部为人的单克隆抗体可以使用转基因动物产生，例如包括携带人IgH和Igkappa基因座部分，包括大多数可变区库，对于Cmicro、Cdelta和Cgamma1、Cgamma2或
Cgamma4任一的基因，以及对于它们的功能必需的顺式元件的种系配置的巨碱基大小YAC
的XenoMouse(Green，1999)。可以繁殖在遗传背景上小鼠免疫球蛋白产生不足的IgH和
Igkappa转基因。在XenoMouse品系中的Ig转基因上编码的大且复杂的人可变区库支
持开发大的外周B细胞分隔和产生多种与来自成人相似的初次免疫库。以人抗原免疫
XenoMouse小鼠通常导致强烈的次级免疫反应，这可以最终作为具有亚纳摩尔亲和性的一
大组抗原特异性的完全人IgGkappa mAb收集到。来自XenoMouse动物的单克隆抗体已经
显示在体外和体内均具有治疗潜能，并且基于人临床试验似乎具有正常人抗体的药物代谢
动力学。

[0113] 2.抗体结合物

[0114] 本发明还提供选择性结合Cripto或GRP78的连接至至少一种试剂形成抗体结合物抗体，通常是单克隆类型的抗体。为了增加抗体分子作为诊断或治疗剂的有效性，抗体可以与至少一个想要的分子或部分共价结合或复合。此类分子或部分可以是，但不限于，至少一个效应子或报告分子。效应子分子包括具有所希望活性如细胞毒性活性的分子。连接至
抗体的效应子分子的非限定性实例包括毒素、抗肿瘤剂、治疗酶、放射性标记的核苷酸、抗病毒剂、螯合剂、细胞因子、生长因子和寡或多核苷酸。相反，报告分子被定义为可使用测定法检测的任何部分。与抗体缀合的报告分子的非限定性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、生色团、发光分子、光亲和性分子、有色颗粒或者配体，例如生物素。

[0115] Cripto和/或GRP78抗体可以用作抗体结合物的基础。除了抗体分子的抗原结合位点之外，抗体分子中用于结合生物活性分子的位点包括位于可变结构域中的可结合病
原体、B细胞超抗原、T细胞共受体CD4和HIV-1包膜的位点(Sasso等，1989；Shorki等，
1991；Silvermann等，1995；Cleary等，1994；Lenert等，1990；Berberian等，1993；Kreier等，1991)。此外，可变结构域参与抗体自身结合(Kang等，1988)，并且包含由抗抗体识别的表位(独特位)(Kohler等，1989)。

[0116] 某些抗体结合物的实例是其中抗体被连接至可检测标记的那些结合物。“可检测标记”是由于它们的特异性功能特性和/或化学特征而可以被检测到化合物和/或元素，它
们的使用使得与其连接的抗体可以被检测和/或根据需要被进一步定量。另一个此类实例
是包含连接至细胞毒性剂或抗细胞剂的抗体的结合物的形成，并且可以称作“免疫毒素”。

[0117] 抗体结合物通常优选作为诊断剂。抗体诊断通常分为两类，即用于体外诊断的那些，例如在多种免疫测定中，和/或用于体内诊断方案的那些，通常称作“抗体导向的成像”。

[0118] 许多适当的成像剂是本领域已知的，如用于附着抗体的方法的那些(见例如美国专利5,021,236，4,938,948，和4,472,509，每一文献通过参考并入本文)。所使用的成像部分可以是顺磁离子；放射性同位素；荧光染料；NMR可检测的物质；X射线成像。

[0119] 以顺磁离子为例，可以以实例方式提到的离子例如铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和/或铒(III)，其中钆是特别优选的。用于其它背景，如X射线成像的离子包括但不限于镧(III)、金(III)、铅(II)并且特别是铋(III)。

[0120] 用于治疗和/或诊断应用的放射性同位素包括砹211、14碳、51铬、36氯、57钴、58钴、67 152 67 3 123 125 131 111 59 32 186 188 75 35 99m
铜、铕、镓、氢、碘、碘、碘、铟、铁、磷、铼、铼、硒、硫、锝和/
90 125 99m 111
或钇。 I对于某些实施方案是优选的，并且锝和/或铟由于它们能量低并且对大
范围的检测具有适应性也是经常优选的。可以根据本领域众所周知的产生放射性标记的本
发明单克隆抗体。例如，单克隆抗体可以通过与碘化钠和/或碘化钾和化学氧化剂如次氯
酸钠，或酶性氧化剂如乳过氧化物酶接触被碘化。根据本发明的单克隆抗体可以通过配体
99m
交换过程以锝标记，例如通过以亚锡溶液还原过锝酸盐，将还原的锝螯合在Sephadex柱
上并且向该柱应用抗体。备选地，可以使用直接标记技术，例如通过孵育过锝酸盐、还原剂例如SNCl2、缓冲溶液如邻苯二甲酸钠-钾溶液和抗体。常用于将作为金属离子存在放射性
同位素结合至抗体的中间的功能基是钆喷酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。

[0121] 在荧光标记中考虑用作结合物的包括Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、Cascade Blue、Cy3、Cy5、6-FAM、异硫氰酸荧光素、HEX、6-JOE、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿
514、太平洋蓝、REG、罗丹明绿、罗丹明红、肾造影剂、ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明、和/或德克萨斯红。

[0122] 本发明考虑的另一类型的抗体结合物是预期主要用于体外使用的那些，其中抗体与第二个结合配体和/或酶(酶标签)连接，当与生色底物接触时酶产生有色的产物。适
宜的酶实例包括尿素酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶。优选的第二个
结合配体是生物素和/或抗生物素蛋白和链亲和素化合物。此类标签的使用是本领域技术
人员众所周知的并且描述于例如美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；
4,277,437；4,275,149和4,366,241中；每一美国专利通过参考并入本文。

[0123] 分子与抗体的位点特异性附着的另一已知方法包括抗体与基于半抗原的亲和性标签的反应。基本上，基于半抗原的亲和性标签与抗原结合位点中的氨基酸反应，由此破坏了该位点并封闭特异性的抗原反应。然而，这并不是有利的，因为这导致抗原丧失结合抗体结合物。

[0124] 包含叠氮基的分子还可用于通过由低强度紫外线产生的活性氮烯中间体与蛋白质形成共价键(Potter和Haley，1983)。具体而言，嘌呤核苷酸的2-和8-叠氮类似物已
经用作位点定向光探针来鉴定粗细胞提取液中的核苷酸结合蛋白(Owens和Haley，1987；
Atherton等，1985)。2-和8-叠氮核苷酸也已经用于所纯化蛋白质的核苷酸结合结构域作
图(Khatoon等，1989；King等，1989；以及Dholakia等，1989)并且可以用作抗体结合剂。

[0125] 用于抗体附着或缀合至其结合物部分的数个方法是本领域已知的。一些附着方法涉及使用金属螯合复合物，采用例如有机螯合剂，如钆喷酸酐(DTPA)；二亚乙基三胺；
N-氯-p-甲苯磺酰胺；和/或tetrachloro-3α-6α-diphenylglycouril-3与抗体连接
(美国专利4,472,509和4,938,948，每一美国专利通过参考并入本文)。单克隆抗体还可
在偶联剂如戊二醛或高碘酸盐存在下与酶反应。带有荧光素标记物的结合物在这些偶联剂
存在下或者通过与异硫氰酸酯反应制备。在美国专利4,938,948中，使用单克隆抗体实现
乳腺肿瘤的成像并且可检测的成像部分使用连接体如对羟基苯甲亚胺酸甲酯或3-(4-羟
基苯基)-丙酸-N-琥珀酰亚胺酯与抗体连接。

[0126] 在另外的实施方案中，考虑了通过使用不改变抗体结合位点的反应条件向免疫球蛋白的Fc区选择性引入巯基的免疫球蛋白的衍生化。公开了根据该方法学产生的表现出
改善的寿命、特异性和敏感性的抗体结合物(美国专利号5,196,066，通过参考并入本文)。
在文献中已经公开了其中报告分子或效应子分子结合至Fc区糖残基的效应子或报告分子
的位点特异性附着(O′Shannessy等，1987)。已经报导该方法产生当前处于临床评定中的
有希望用于诊断和治疗的抗体。

[0127] 3.双功能性抗体

[0128] 在某些实施方案中，双功能性抗体可以用于靶向Cripto和/或GRP78。例如，双特异性的Fc-二聚体可用于靶向和结合Cripto和GRP78两者，并且构想这种结合将抑制随后
的Cripto/GRP78复合体的信号，例如Nodal信号、激活蛋白/TGFβ信号、ERK/MAPK信号和
/或PI3K/Akt/GSK3β信号。在某些实施方案中，双功能性的或双特异性的抗体可以结合至
少一部分的Cripto EGF样区、Cripto CFC结构域、GRP78的氨基酸19-68，和/或GRP78的
N-20区。备选地，包含多个scFv分子的双链抗体、三链抗体或四链抗体可用于以例如增加
的亲和性结合Cripto和/或GRP78。

[0129] 位于双特异性抗体中V结构域之间不同长度的连接体可用于指导双链抗体(例如大约60kDa)、三链抗体(例如大约90kDa)或四链抗体(例如大约120kDa)的形成，如取决
于所希望的特定应用，例如体内或体外成像或治疗所希望的那样以优化大小、柔性和效价
(Robinson等2008；Todorovska等，2001)。多功能性抗体表现出对这些scFv多聚体增强
的结合效价，导致高的亲和力和降低的脱落。在一些实施方案中，多功能性抗体可以有利地用于肿瘤靶向，因为大约60-100kDa的某些分子表现出与亲本Ig(例如大约150kDa)相比
增加的肿瘤渗透性和快速的清除率。

[0130] 在某些实施方案中，设计多特异性Fv模块以交联两个或更多个不同的靶抗原。这些双特异性和三特异性多聚体可以通过不同scFv分子的结合形成(Dutertre和Teillaud，
2006；Plückthun等，1997；Kortt等，2001；Hudson等，1999；Atwell等，1996)。

[0131] B.Cripto/GRP78靶向性肽

[0132] Cripto靶向性或GRP78靶向性蛋白质或肽可以用于抑制Cripto/GRP78复合体的形成和/或功能。例如，可以使用例如体外细胞噬菌体展示筛选肽文库以鉴定可结合
Cripto和/或GRP78以抑制Cripto/GRP78复合物形成的肽或蛋白质。多种方法可以用于
此目的，包括例如Mintz PJ等Nat Biotechnol 2003 21(1)57-63；Kim Y等Biochemistry
45(31)9434-44；Jakobsen CG等Cancer Res 2007 67(19)9507-17；和Gonzalez-Gronow M
等Cancer Res 2006 66(23)11424-31中描述的那些，它们通过参考并入本文。如本文中所
使用，蛋白质或肽通常指，但不限于从基因翻译的大于大约200个氨基酸直至全长序列的
蛋白质；大约100至200个氨基酸的多肽；和/或从大约3个至大约100个氨基酸的肽。为
了方便起见，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中互换使用。

[0133] 在某些实施方案中，包含GRP78的N-20表位的肽可用于结合Cripto并抑制Cripto/GRP78复合物的形成。如本文所示，GRP78的N-20表位对于Cripto/GRP78结合是
至关重要的；因此，包含GRP78的N-20表位的肽可用于竞争性地拮抗Cripto/GRP78复合物
的形成。N-20表位由GRP78信号肽下游的前50个残基内的20个氨基酸组成。N-20抗体可
以购自Santa Cruz Biotechnology(CA，美国)。类似地，在另外的实施方案中，包含Cripto的CFC结构域的肽可用于结合GRP78并抑制Cripto/GRP78复合物的形成。如在下面实例
中所示，Cripto的CFC结构域对于Cripto/GRP78结合是至关重要的；因此，包含Cripto的
CFC结构域的肽可用于竞争性地拮抗Cripto/GRP78复合物的形成。

[0134] 使用125I-标记的可溶性Cripto的结合测定法，例如在Kelber等中描述的那些，可用于本发明中。例如，Cripto与完整MCF10A或NCCIT细胞的结合可被未标记的Cripto
竞争性阻断，并且重要的是可被N-20GRP78抗体竞争性阻断。该测定法或其改良形式可用
于筛选能够破坏Cripto/GRP78结合的肽。

[0135] 在某些实施方案中，至少一种蛋白质或肽的大小可包括，但不限于，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、
33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、
58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、
83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、大约110、大约120、大约
130、大约140、大约150、大约160、大约170、大约180、大约190、大约200、大约210、大约
220、大约230、大约240、大约250、大约275、大约300、大约325、大约350、大约375、大约
400、大约425、大约450、大约475、大约500、大约525、大约550、大约575、大约600、大约
625、大约650、大约675、大约700、大约725、大约750、大约775、大约800、大约825、大约
850、大约875、大约900、大约925、大约950、大约975、大约1000、大约1100、大约1200、大约1300、大约1400、大约1500、大约1750、大约2000、大约2250、大约2500或更多个氨基酸残基。

[0136] 如本文中所使用，“氨基酸残基”指本领域已知的任何天然存在的氨基酸、任何氨基酸衍生物或任何氨基酸模拟物。在某些实施方案中，蛋白质或肽的残基是连续的，没有任何非氨基酸打断氨基酸残基序列。在另外的实施方案中，序列可以包含一个或更多个非氨基酸部分。在特定的实施方案中，蛋白质或肽残基序列可被一个或更多个非氨基酸部分打
断。

[0137] 因此，术语“蛋白质或肽”包括包含在天然存在蛋白质中发现的20种常见氨基酸中至少一种或者至少一种修饰或罕见氨基酸，包括但不限于下表2所示的那些的氨基酸。

[0138]

[0139]

[0140] 蛋白质或肽可以通过本领域技术人员已知的任何技术产生，包括通过标准分子生物学技术的蛋白质、多肽或肽的表达，蛋白质或肽从天然来源的分离，或者蛋白质或肽的
化学合成。对应于不同基因的核苷酸和蛋白质、多肽和肽序列先前已经公开，并且可以在
本领域普通技术人员已知的计算机化数据库中找到。一个此类的数据库是the National
Center for Biotechnology Information的Genbank和GenPept数据库。对于已知基因的
编码区可以使用本文所公开的技术或者本领域普通技术人员所已知的技术扩增和/或表
达。备选地，蛋白质、多肽和肽的多种商业制剂是本领域技术人员已知的。

[0141] 1.肽模拟物

[0142] 用于制备根据本发明的多肽的另一实施方案是使用肽模拟物。模拟物是模拟蛋白质二级结构元素的包含肽的分子。见例如Johnson等，(1993)，通过参考并入本文。肽模拟物应用的潜在原理是蛋白质的肽主链主要是以促进分子相互作用，例如抗体和抗原的那些
相互作用的方式定向氨基酸侧链。预期肽模拟物允许类似于天然分子的分子相互作用。这
些原理可用于改造具有本文所公开靶向性肽的许多天然特性，但具有改变并且甚至改良特
性的第二代分子。

[0143] 2.融合蛋白

[0144] 本发明另外的实施方案涉及融合蛋白。这些分子通常具有在N-或C-末端连接至第二多肽或蛋白质的全部或部分的靶向性肽的全部或相当大的部分。例如，融合可采用来
自另外物种的前导序列以允许蛋白质在异源宿主中重组表达。另一有用的融合包括加入免
疫活性结构域，例如抗体表位以促进融合蛋白质的纯化。在融合连接处或附近包含切割位
点将利于在纯化后去除外来的多肽。其它有用的融合包括功能结构域的连接，例如酶的活
性位点、糖基化结构域、细胞靶向性信号或跨膜区。在优选的实施方案中，本发明的融合蛋白包含连接至治疗蛋白质或肽的靶向性肽。可整合入融合蛋白内的蛋白质或肽的实例包括
细胞抑制性蛋白质、杀细胞性蛋白质、促凋亡剂、抗血管生成剂、激素、细胞因子、生长因子、肽药物、抗体、抗体Fab片段、抗原、受体蛋白质、酶、凝集素、MHC蛋白质、细胞粘附蛋白和结合蛋白。这些实例不意味着是限制性的并且考虑它们事实上处于本发明的范围之中，并且
蛋白质或肽可整合入包含靶向性肽的融合蛋白中。产生融合蛋白的方法对本领域技术人员
而言是众所周知的。此类蛋白质可以通过例如使用双功能交联剂的化学吸附、通过完整融
合蛋白的从头合成、或者通过编码靶向性肽的DNA序列与编码第二肽或蛋白质的DNA序列
的结合然后通过完整融合蛋白的表达来产生。

[0145] 3.蛋白质纯化

[0146] 在某些实施方案中，蛋白质或肽可以分离或纯化。在一个实施方案中，这些蛋白质可以用于产生用于以任何所列举标签(例如多聚体拉曼标签)标记的抗体。蛋白质纯化技术对本领域技术人员而言是众所周知的。这些技术在一个水平上涉及细胞、组织或器官的
匀浆和粗分级分离至多肽和非多肽的分级分离。感兴趣的蛋白质或多肽可以使用层析和电
泳技术进一步纯化以达到部分或完全纯化(或纯化至同质性)。特别适用于制备纯肽的分
析方法是离子交换层析、凝胶排阻层析、HPLC(高效液相色谱)FPLC(AP Biotech)、聚丙烯酰胺凝胶电泳、亲和层析、免疫亲和层析和等电聚焦。通过亲和层析纯化受体蛋白质的实例描述于美国专利号5,206,347中，其全文通过参考并入本文。纯化多肽的更有效的方法之一
是快速高效液相色谱(AKTA FPLC)，或者甚至纯化的蛋白质或肽旨在指可与其他成分分离
的组合物，其中蛋白质或肽以相对于其天然可得到的状态的任何程度被纯化。因此，分离或纯化的蛋白质或肽还指从其天然存在的环境游离的蛋白质或肽。通常，“纯化的”指已经经历分级分离以去除许多其它成分的蛋白质或肽组合物，并且组合物基本上保留了其表达的
生物学活性。当使用术语“基本上纯化的”时，该名称指其中蛋白质或肽形成组合物的大部分成分，例如蛋白质构成组合物的大约50％、大约60％、大约70％、大约80％、大约90％、大约95％或更高的组合物。

[0147] 根据本公开，用于定量蛋白质或肽纯化程度的多种方法是本领域技术人员已知的。这包括例如，测定活性级分的比活性或通过SDS/PAGE分析评价级分内多肽的量。用于
评价级分纯度的优选方法是计算级分的比活性，以将其与最初提取物的比活性相比较，并
且因此计算纯度程度，在本文中通过“纯化倍数”评价。当然，用于表示活性量的实际单位将取决于选择开展纯化的特定测定技术和所表达的蛋白质或肽是否表现出可检测的活性。

[0148] 适用于蛋白质纯化的多个技术是本领域技术人员众所周知的。这包括例如使用硫酸铵、PEG、抗体等等的沉淀，或者通过热变性，接着是：离心；层析步骤例如离子交换、凝胶过滤、反相、羟基磷灰石和亲和层析；等电聚焦；凝胶电泳；和这些技术和其它技术的组合。
如本领域所通常已知的那样，据信开展多个纯化步骤的顺序可以改变，或者某些步骤可以
省略，并且仍然产生用于制备相当程度纯化的蛋白质或肽的适宜方法。

[0149] 通常不需要蛋白质或肽以它们最纯的状态提供。实际上，在某些实施方案中考虑了基本上纯的产物将具有实用性。部分纯化可通过使用更少的组合纯化步骤或者通过利用
相同的一般纯化方案的不同形式实现。例如，应当意识到，利用HPLC装置开展的阳离子交
换柱层析通常将比利用低压层析系统的相同技术产生更大“倍数”的纯化。表现出更低程
度的相对纯化的方法在蛋白质产物的收回总量中或者在维持所表达蛋白质的活性中具有
优势。

[0150] 亲和层析是依赖于待分离物质与其可特异性结合的分子之间的特异亲和性的层析方法。这是受体-配体类型的相互作用。通过共价偶联结合配偶体之一至不溶解的基质
上合成柱材料。然后柱材料能够从溶液中特异性地吸附物质。通过改变条件至不发生结合
的那些条件(例如改变的pH、离子强度、温度等)进行洗脱。基质应该是自身不以任何明显
程度吸附分子并且具有广范围化学、物理和热稳定性的物质。配体应该以如此方式偶联以
致于不影响其结合特性。配体还应当提供相对紧密的结合。并且应该可以洗脱物质，而不
破坏样品或配体。

[0151] 4.合成肽

[0152] 由于本发明的靶向性肽在大小上相对小，所以可以按照常规技术在溶液中或者在固体支持物上合成。多种自动合成仪可以商业性得到并且可以按照已知的方案使用。见例
如，Stewart和Young，1984；Tam等，1983；Merrifield，1986；以及Barany和Merrifield，
1979，每一文献通过参考并入本文。通常从大约6个直至大约35至50个氨基酸的短肽序
列可以容易地通过此类方法合成。备选地，可以采用重组DNA技术，其中编码本发明肽的核苷酸序列被插入至表达载体中，被转化或转染进入适宜的宿主细胞中，并且在适宜表达的
条件下培养。

[0153] C.短干扰核酸

[0154] 本发明提供下调Cripto和/或GRP78表达的短干扰核酸(例如siRNA)。这些Cripto靶向性和GRP78靶向性siNA可以在药物组合物中向受试者施用(例如肠胃外、静脉
内或瘤内)以治疗癌症。例如，如在下面实例中所示，shRNA可有效地用于敲低GRP78(SEQ
ID NO：5)或Cripto(SEQ ID NO：4)信号并且破坏Cripto/GRP78复合物的形成。

[0155] “siNA”，如本文中所使用，定义为短干扰核酸。siNA的实例包括但不限于RNAi、双链RNA和siRNA。siNA可以抑制细胞中基因的转录。siNA长度从16个至50或更多个核苷酸。在某些实施方案中，siNA长度可以是16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、
29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个核苷酸。
siNA可以包含核酸和/或核酸类似物。有代表性地，siNA将抑制细胞内单一基因的翻译；
然而，在某些实施方案中，siNA将抑制细胞内一个以上基因的翻译。虽然在某些实施方案
中，siNA可用于破坏Cripto/GRP78相互作用，但是在另外的实施方案中反义核酸将用于靶
向Cripto和/或GRP78以破坏Cripto/GRP78相互作用。

[0156] 在siNA内，核酸没有必要是相同的类型(例如siNA可包含核苷酸和核苷酸类似物)。siNA形成双链结构；双链结构可来自于部分或完全互补的两个单独的核酸。在本发
明的某些实施方案中，siNA可包含仅单一核酸或核酸类似物并且通过自身互补形成双链结
构(例如形成发夹环)。siNA的双链结构可包含16至500或更多个连续核碱基。siNA可
包含17至35个连续核碱基，更优选18至30个连续核碱基，更优选19至25个核碱基，更
优选20至23个连续核碱基，或者20至22个连续核碱基，或者21个连续核碱基与互补核
酸(其可以是同一核酸的另一部分或者是单独的互补核酸)杂交以形成双链结构。

[0157] siNA(例如siRNA)是本领域众所周知的。例如，siRNA和双链RNA已经描述于美国专利6,506,559和6,573,099以及美国申请2003/0051263、2003/0055020、2004/0265839、
2002/0168707、2003/0159161、2004/0064842中，它们全文通过参考并入本文。

[0158] 1.核酸

[0159] 本发明提供用于通过中性脂质体递送siNA的方法和组合物。由于siNA有核酸构成，所以与核酸有关的方法(例如核酸产生、核酸修饰等)可用于siNA。

[0160] 术语“核酸”是本领域众所周知的。“核酸”如本文中所使用通常指包含核碱基的DNA、RNA分子(即一链)或其衍生物或类似物。核碱基包括，例如，在DNA中发现的天然存在的嘌呤或嘧啶碱基(例如腺嘌呤“A”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”或胞嘧啶“C”)或在RNA中发现的天然存在的嘌呤或嘧啶碱基(例如A、G、尿嘧啶“U”或C)。术语“核酸”包括术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”，它们每一个是术语“核酸”的亚单位。术语“寡核苷酸”指长度大约3和大约100个核碱基之间的分子。术语“多核苷酸”指长度大于大约100个核碱基
的至少一个分子。

[0161] 这些定义指单链或双链核酸分子。双链核酸通过完全互补性结合形成，虽然在一些实施方案中双链核酸可以通过部分或相当大的互补性结合形成。因此，核酸可包括包含
特定序列的一个或更多个互补链或“互补物”的双链分子，有代表性地包含分子。如本文中所使用，单链核酸可以通过前缀“ss”表示并且双链核酸通过前缀“ds”表示。

[0162] 2.核碱基

[0163] 如本文中所使用，“核碱基”指杂环碱基，例如在至少一种天然存在核酸(即DNA和RNA)中发现的天然存在核碱基(即A、T、G、C或U)，和此类核碱基的天然或非天然存在衍生物和类似物。核碱基通常与至少一种天然存在核碱基以可替代天然存在核碱基配对的方
式(例如A和T、G和C以及A和U之间的氢键)形成一个或更多个氢键(“复性”或“杂
交”)。

[0164] “嘌呤”和/或“嘧啶”核碱基包括天然存在的嘌呤和/或嘧啶核碱基并且还包括它们的一种或多种衍生物和一种或多种类似物，包括但不限于，嘌呤或嘧啶被一个或跟多
个烷基、羧烷基、氨基、羟基、卤素(即氟、氯、溴或碘)、巯基或烷硫基部分内取代的那些。优选的烷基(例如烷基、羧烷基等)部分包含从大约1、大约2、大约3、大约4、大约5至大约6
个碳原子。嘌呤或嘧啶的其它非限定性实例包括脱氮嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、8-溴鸟嘌呤、8-氯鸟嘌呤、溴胸腺嘧啶、8-氨基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、
8-甲基鸟嘌呤、8-硫鸟嘌呤、氮鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、5-乙基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-丙基尿嘧啶、硫尿嘧啶、2-甲基腺嘌呤、甲基硫腺嘌呤、N，N-二乙基腺嘌呤、氮杂腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤、6-羟基氨基嘌呤、6-硫嘌呤、4-(6-氨基己基/胞嘧啶)等等。下面还提供一列非限定性的嘌呤和嘧
啶衍生物和类似物。

[0165]

[0166]

[0167] 可以使用本文所述或者本领域普通技术人员已知的任何化学或天然合成方法将核碱基加在核苷或核苷酸中。

[0168] 3.核苷

[0169] 如本文中所使用，“核苷”指包含共价连接至核碱基连接体部分的各个化学单位。“核碱基连接体部分”的非限定性实例是包含5-碳原子的糖(即“5-碳糖”)，包括但不限
于脱氧核糖、核糖、阿拉伯糖、或5-碳糖的衍生物或类似物。5-碳糖衍生物或类似物的非限定性实例包括2′-氟-2′-脱氧核糖或其中碳代替糖环内氧原子的碳环糖。

[0170] 核碱基和核碱基连接体部分的不同类型的共价连接在本领域是已知的。通过非限定性实例的方式，包含嘌呤(即A或G)或7-脱氮嘌呤核碱基的核苷有代表性地共价连接
嘌呤或7-脱氮嘌呤的9位与5-碳糖的1′-位。在另外的非限定性实例中，包含嘧啶核碱
基(即C、T或U)的核苷有代表性地共价连接嘧啶的1位与5-碳糖的1′-位(Kornberg
和Baker，1992)。

[0171] 4.核苷酸

[0172] 如本文中所使用，“核苷酸”指还包含“主链部分”的核苷。主链部分通常共价连接核苷酸至包含核苷酸的另一分子，或者至另一核苷酸以形成核酸。天然存在核苷酸中的“主链部分”有代表性地包含磷部分，其共价连接至5-碳糖。主链部分的连接有代表性地发生在5-碳糖的3′-或5′-位。然而，其他类型的连接是本领域已知的，特别是当核苷酸包
含天然存在5-碳糖的衍生物或类似物或者磷部分时。

[0173] 5.核酸类似物

[0174] 核酸可包含核碱基的衍生物或类似物、核碱基连接体部分和/或在天然存在核酸中存在的主链部分，或者完全由它们组成。如本文中所使用，“衍生物”指化学修饰或改变形式的天然存在分子，而术语“模拟物”或“类似物”指结构上与天然存在分子或部分类似或不类似但拥有相似功能的分子。如本文中所使用，“部分”通常指较大的化学或分子结构的较小的化学或分子成分。核碱基、核苷和核苷酸类似物或衍生物是本领域中众所周知的，并且已经被描述(见例如，Scheit，1980，通过参考并入本文)。

[0175] 包含5-碳糖和/或主链部分衍生物或类似物的核苷、核苷酸或核酸的另外的非限定性实例包括下列文献中的那些，美国专利5,681,947，其描述了包含嘌呤衍生物的寡核苷酸，其形成三螺旋和/或阻止dsDNA表达；美国专利5,652,099和5,763,167，其描述了
掺入有在DNA或RNA中发现的核苷的荧光类似物的核酸，特别是用作荧光核酸探针；美国
专利5,614,617，其描述了在嘧啶环上具有替代基并具有增强的核酸酶稳定性的寡核苷酸
类似物；美国专利5,670,663，5,872,232和5,859,221，其描述了用于核酸检测带有修饰
的5-碳糖(即修饰的2′-脱氧呋喃部分)的寡核苷酸类似物；美国专利5,446,137，其
描述了可以用于杂交分析的，包含至少一个在4′位被氢以外的取代基取代的5-碳糖部分
的寡核苷酸；美国专利5,886,165，其描述了含有具有3′-5′核苷酸间化学键的脱氧核糖
核苷酸和具有2′-5′核苷酸间化学键的荷塘核苷酸的寡核苷酸；美国专利5,714,606，其
描述了修改的核苷酸间化学键，其中核苷酸间化学键的3′-位氧被碳取代以增强核酸对
核酸酶的抵抗；美国专利5,672,697，其描述了包含一个或更多个5′甲叉膦酸酯核苷酸间
化学键的增强核酸酶抵抗的寡核苷酸；美国专利5,466,786和5,792,847，其描述了可包含
药物或标签的取代基部分与寡核苷酸2′碳的键合以提供增强的核酸酶稳定性和递送药物
或检测部分的能力；美国专利5,223,618，其描述了具有连接临近5-碳糖部分4′和3′
位的2或3碳主链化学键的寡核苷酸类似物以增强细胞吸收、对核酸酶的抵抗和与靶RNA
的杂交；美国专利5,470,967，其描述了至少一个氨基磺酸酯或磺酰胺核苷酸间化学键的
用作核酸杂交探针的寡核苷酸；美国专利5,378,825、5,777,092、5,623,070、5,610,289和
5,602,240，其描述了包含3或4碳连接体部分代替磷酸二酯主链部分的寡核苷酸，用于改
善的核酸酶抵抗、细胞吸收和调节RNA表达；美国专利5,858,988，其描述了连接至寡核苷
酸2′-O位的疏水运载试剂以增强它们的膜渗透性和稳定性；美国专利5,214,136，其描述
了在5′末端与蒽醌缀合的具有增强的与DNA或RNA杂交、增强的核酸酶稳定性的寡核苷
酸；美国专利5,700,922，其描述了PNA-DNA-PNA嵌合体，其中DNA包含2′-脱氧-赤-异
戊烯呋喃糖核苷酸，用于增强的核酸酶抵抗、结合亲和性和激活RNA酶H的能力；以及美国
专利5,708,154，其描述了RNA与DNA的连接以形成DNA-RNA杂合体。

[0176] 6.聚醚和肽核酸

[0177] 在某些实施方案中，考虑了包含核苷或核苷酸衍生物或类似物的核酸可以用于本发明的方法和组合物中。非限定性实例是美国专利5,908,845中描述的“聚醚核酸”，其通过参考并入本文。在聚醚核酸中，一个或更多个核碱基连接至聚醚主链的手性碳原子上。

[0178] 另一个非限定性实例是描述于美国专利5,786,461、5,891,625、5,773,571、5,766,855、5,736,336、5,719,262、5,714,331、5,539,082和WO 92/20702中的“肽核酸”，也称作“PNA”、“基于肽的核酸类似物”或“PENAM”，每一文献通过参考并入本文。与分子如DNA和RNA相比，肽核酸通常具有增强的序列特异性、结合特性和对酶降解的抵抗(Egholm
等，1993；PCT/EP/01219)。肽核酸通常包含一个或更多个含有核碱基部分的核苷酸或核
苷、非5-碳糖的核碱基连接体部分，和/或非磷酸酯主链部分的主链部分。对于PNA所描
述的核碱基连接体部分的实例包括氮杂氮原子、酰胺基和/或脲基链(见例如美国专利
5,539,082)。对于PNA所描述的主链部分的实例包括氨乙基甘氨酸、聚酰胺、聚乙基、聚硫代酰胺、聚亚磺酰胺或聚磺酰胺主链部分。

[0179] 在某些实施方案中，核酸类似物例如肽核酸可以用于抑制核酸扩增，例如在PCRTM中，以减少假阳性和鉴别单碱基突变体，如美国专利5,891,625中所述。核酸类似物的其它修饰和用途在本领域是已知的，并且预期这些技术和核酸类似物类型可用于本发明中。在非限定性实例中，美国专利5,786,461描述了具有连接至PNA主链的氨基酸侧链的PNA以
增强分子的可溶性。在另一实例中，PNA的细胞吸收特性通过连接亲脂性基团增强。美国
申请系列号117,363描述了用于增强PNA的细胞吸收的数个烷基氨基部分。另一实例描述
于美国专利5,766,855、5,719,262、5,714,331和5,736,336中，其描述了包含天然和非天
然存在核碱基和烷基胺侧链的PNA，其与天然存在核酸相比系列特异性、可溶性和/或结合
亲和性改善。

[0180] 7.核酸制备

[0181] 可通过本领域普通技术人员已知的任何技术制备核酸，例如化学合成、酶促生产或生物学生产。合成核酸(例如合成寡核苷酸)的非限定性实例包括通过例如EP
266,032(通过参考并入本文)中所描述的使用磷酸三酯、亚磷酸酯或亚磷酰胺化学和固
相技术，或者通过由Froehler等，1986和美国专利5,705,629(每一文献通过参考并入本
文)中所描述脱氧核糖核苷H-膦酸酯中间体的体外化学合成产生的核酸。在本发明的方
法中，可以使用一种或更多种寡核苷酸。多种不同的寡核苷酸合成机制已经描述于例如美
国专利4,659,774、4,816,571、5,141,813、5,264,566、4,959,463、5,428,148、5,554,744、
5,574,146、5,602,244中，每一美国专利通过参考并入本文。

[0182] 酶促生产核酸的非限定性实例包括在扩增反应中例如PCRTM由酶产生核酸(见例如美国专利4,683,202和美国专利4,682,195，每一文献通过参考并入本文)，或者描述于
美国专利5,645,897中的寡核苷酸合成，其通过参考并入本文。生物学生产核酸的非限定
性实例包括在活细胞中生产重组核酸(即复制)，例如重组DNA载体在细菌中复制(见例
如，Sambrook等2001，通过参考并入本文)。

[0183] 8.核酸纯化

[0184] 核酸可以在聚丙烯酰胺凝胶上、氯化铯离心梯度上或者通过本领域普通技术人员已知的任何其它方法纯化(见例如，Sambrook等，2001，通过参考并入本文)。

[0185] 在某些实施方案中，本发明涉及为分离的核酸的核酸。如本文中所使用，“分离的核酸”指经分离无，或者无一种或更多种细胞的大多数总基因组核酸和转录核酸的核酸分子(例如RNA或DNA分子)。在某些实施方案中，“分离的核酸”指经分离无，或者无大多数
细胞成分或体外反应成分如大分子诸如脂类或蛋白质、小的生物分子等等的核酸。

[0186] 9.杂交

[0187] 如本文中所使用，“杂交”或“能够杂交”理解为意思是指形成双链或三链分子或者具有部分双链或三链性质的分子。术语“复性”如本文中所使用与“杂交”同义。术语“杂交”或“能够杂交”包括术语“严格条件”或“高严格性”和术语“低严格性”或“低严格性条件”。

[0188] 如本文中所使用“严格条件”或“高严格性”是允许包含互补序列的一个或更多个核酸链之间或之内杂交但妨碍随机序列杂交的那些条件。严格条件容忍核酸和靶链之间小的错配，如果存在的话。此类条件对于本领域普通技术人员而言是众所周知的，并优先用于需要高选择性的应用中。非限定性的应用包括分离核酸，例如基因或其核酸片段，或检测至少一种特异的mRNA转录物或其核酸片段等等。

[0189] 严格条件可以包括低盐和/或高温度条件，例如在大约50℃至大约70℃的温度下大约0.02M至大约0.15M NaCl提供的条件。应当理解，所期望严格性的温度和离子强度
部分地由一种或多种特定核酸长度、一种或多种靶序列的长度和核碱基、一种或多种核酸
的电荷组成和杂交混合物中甲酰胺、四甲基氯化铵或其它一种或多种溶剂的存在或浓度决
定。

[0190] 还应当理解，这些范围、组合物和杂交条件仅以非限定性实例的方式提到，并且对于特定杂交反应的所希望的严格性常常通过与一个或更多个阳性或阴性对照比较经验性确定。取决于所预期的应用，优选采用可变的杂交条件以达到核酸针对靶序列的可变程度
的选择性。在非限定性实例中，在严格条件下不与核酸杂交的相关靶核酸的鉴定或分离
可以通过在低温度和/或高离子强度下杂交实现。此类条件被称作“低严格性”或“低严
格条件”，并且低严格性的非限定性实例包括在大约20℃至大约50℃的温度范围下在大约
0.15M至大约0.9M NaCl下开展杂交。当然，本领域技术人员能够进一步修改低或高严格条
件以适应特定应用。

[0191] D.适体

[0192] 适体可以用于抑制Cripto/GRP78结合和/或信号。适体是选择性结合分子靶如蛋白质的单链核酸。适体可包含DNA、RNA和/或修饰核苷酸，虽然在某些实施方案中希望使
用DNA适体或包含抗酶降解以便在体内施用至受试者时增加半寿期的修饰核苷酸的适体。

[0193] 使用单链核酸(适体)作为蛋白质的亲和性分子的想法显示进展适中。见Tuerk和Gold，(1990)；Ellington和Szostak(1990)；以及Ellington和Szostak(1992)。概念
基于短寡聚体(20-80mer)序列在靶存在下折叠成以高亲和性和特异性结合靶的独特的三
维结构的能力。通过将组合化学与体外进化相组合的方法产生的适体通常称作SELEX(指
14
数富集的配体系统进化)。在蛋白质与DNA或RNA序列文库(有代表性地大约10 个分子
的复杂性)孵育之后，分离蛋白质-DNA复合体，扩增DNA，重复该过程直到样品富集有表现
出对目的蛋白质具有高亲和性的序列。由于选择压对靶为高亲和性，具有低纳摩尔亲和性
的适体可以得到。适体比基于蛋白质的亲和性试剂有优势，因为核酸具有增加的稳定性，再生容易(PCR或寡核苷酸合成)和用于检测和固化的修饰简单。利用机器人的高通量适体
生产方法也可以用于本发明中(Cox等，2002)。

[0194] 在适体生产方案中的数个改变(例如改变靶分配)可以用于本发明。未结合的DNA分子可以通过如下方式从靶蛋白上去除：1)在膜上过滤(Ellington和Szostak，1992)；
2)柱层析，其中使用共价键或者亲和标签将靶结合至基质上，例如琼脂糖上(Ylera等，
2002)；以及3)结合蛋白质至微量滴定板的孔中(Drolet等，1999)。用于本发明的适体的
生产方法还描述于美国专利6,423,493；美国专利6,515,120；美国专利6,180,348；美国
专利5,756,291以及美国专利7,329,742中。

[0195] E.小分子

[0196] 小分子也可用于抑制Cripto/GRP78结合和/或信号。在多种实施方案中，可以筛选一个或更多个小分子化学文库以鉴定选择性影响Cripto/GRP78相互作用的小分子。例
如，高通量筛选可以通过机器人自动进行以评价和/或鉴定可抑制Cripto/GRP78结合和/
或信号的小分子。在某些实施方案中，Cripto/GRP78结合的计算机模型设计可用于选择候
选小分子用于测试。

[0197] 不希望被任何理论所束缚，发明人构想，GRP78将以其作为蛋白伴侣的能力结合细胞表面上的Cripto。在该例中，GRP78将稳定Cripto分子或者促进对于发信号必需
的Cripto构象；因此，GRP78类似于对于数个癌基因的活性必需的具有蛋白伴侣功能的
HSP90。阻断HSP90的ATP结合位点的HSP90拮抗剂处于临床试验中。在GRP78的典型蛋
白伴侣功能对于其作为Cripto信号介导子功能必不可少的情况下，靶向GRP78 ATP结合结
构域的小分子可在临床上采用。例如，(-)-表没食子儿茶酚没食子酸酯(EGCG)是具有数
个抗癌特性的绿茶的主要成分。EGCG已经显示特异性结合GRP78并且通过抑制其结合ATP
的能力抑制其蛋白伴侣的功能(Svetlana P等Cancer Res.2006 66(18)9260-69)。因此可
筛选EGCG衍生物以确定这些化合物是否可以破坏Cripto/GRP78复合物的形成。

[0198] V.药物制剂

[0199] 本发明的药物组合物包含有效量的一种或更多种Cripto和/或GRP78靶向性试剂或溶解或分散于可药用载体内的另外的试剂。词语“可制药用或可药用”指当施用于动
物例如人时，视情况而定，不产生不利的、变态的或其它不良的反应的分子实体和组合物。
根据本公开，包含至少一种Cripto和/或GRP78靶向性试剂或另外的活性成分的药物组
合物的制备将是本领域技术人员已知的，如由Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版，University of the Sciences in Philadelphia所例证，其通过参考并入本文。此外，对于动物(例如人)施用，应当理解制剂应当满足FDA Office of Biological Standards所要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。

[0200] 如本文中所使用，“可药用载体”包括任何和全部的溶剂、分散介质、包衣剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延缓剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、诸如此类的材料及其组合，如本领域普通技术人员将理解的那样(见例如，Remington′s
Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company，1990，第1289-1329页，通过参考并入本文)。除了任何常规载体与活性成分不相容时，否则考虑其在治疗或药物组合物中使用。

[0201] 取决于其是以固体、液体还是气溶胶形式，以及对于诸如注射的施用途径其是否需要无菌，Cripto和/或GRP78靶向性试剂将包含不同类型的载体。本发明可以静脉内、
真皮内、动脉内、腹膜内、损害部内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、囊泡内、通过黏膜、心包内、脐内、眼内、经口、局部、部位、吸入(例如气溶胶吸入)、注射、灌注、连续灌注、直接的靶细胞局部灌注浴、通过导管、通过灌洗、在乳剂中、在脂质组合物中(例如脂质体)或者如本
领普通技术人员所已知的其它方法或前述方法的任何组合施用(见例如，Remington′s
Pharmaceutical Sciences，第19版，Mack Printing Company，1995，通过参考并入本文)。

[0202] 施用至动物患者的本发明组合物的实际剂量可以通过物理和生理因子如体重、疾病的严重性、待治疗疾病类型、先前或并行治疗措施、患者的特发症和施用途径确定。无论如何，负责施用的医师将确定对于组合物中一种或多种活性成分的浓度和各个受试者的一
次或多次的适当剂量。

[0203] 在某些实施方案中，药物组合物可包含例如，至少大约0.1％的活性化合物。在其它实施方案中，活性化合物可包含大约2％至大约75％之间的重量单位或大约25％至大约60％之间的重量单位，以及例如可从其导出的任何范围。在另外的非限定性实例中，剂量还可包含从大约1μg/kg/体重、大约5μg/kg/体重、大约10μg/kg/体重、大约50μg/kg/体
重、大约100μg/kg/体重、大约200μg/kg/体重、大约350μg/kg/体重、大约500μg/kg/
体重、大约1mg/kg/体重、大约5mg/kg/体重、大约10mg/kg/体重、大约50mg/kg/体重、大
约100mg/kg/体重、大约200mg/kg/体重、大约350mg/kg/体重、大约500mg/kg/体重至大
约1000mg/kg/体重或更高每次施用，以及可从其导出的任何范围。在从本文所列数值导出
的范围的非限定性实例中，大约5mg/kg/体重至大约100mg/kg/体重、大约5μg/kg/体重
至大约500mg/kg/体重的范围等可以施用，基于上面描述的数值。

[0204] 在某些实施方案中，单克隆抗体可以以每1-3周大约1-25mg/kg的剂量向受试者(例如人患者)施用。在某些实施方案中，siNA(例如siRNA)可以以大约1-10mg/kg的剂
量以大约每天至大约每周的间隔施用。

[0205] 在任何情况下，组合物可包含多种抗氧化剂以延缓一种或更多种成分的氧化。另外，阻止微生物的作用可以通过防腐剂例如多种抗菌剂和抗真菌剂实现，包括但不限于对
羟基苯甲酸酯(例如甲基对羟基苯甲酸酯、丙基对羟基苯甲酸酯)、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。

[0206] Cripto-和/或GRP78靶向性试剂可以以游离碱形式、中性形式或盐形式配制在组合物中。可药用盐，包括酸加成盐，例如与蛋白质性成分的游离氨基形成的那些，或与无机酸例如盐酸或磷酸，或有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸或苦杏仁酸形成的那些。与游离羧基形成的盐还可以衍生自无机碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；
或者有机碱例如异丙胺、三甲基胺、组氨酸或普鲁卡因。

[0207] 在其中组合物是液体形式的实施方案中，载体可以是溶剂或分散介质，包括但不限于，水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、脂类(例如甘油三酯、植物油、脂质体)及其组合。可通过下列方式维持适当流动性，例如使用包衣剂如卵磷脂；通过分散于例如液体多元醇或脂类的载体中维持所需要的颗粒大小；通过使用表面活性剂例如
羟基丙基纤维素；或此类方法的组合。在许多情况下，优选包括等渗试剂，例如糖、氯化钠或其组合。

[0208] 在其它实施方案中，在本发明中可以使用眼滴剂、鼻溶液或喷雾剂、气溶胶或吸入剂。此类组合物通常被设计成与靶组织类型相容。在非限定性实例中，鼻溶液通常是设计成以滴剂或喷雾剂向鼻道施用的水性溶液。鼻溶液如此制备以致于它们在许多方面与鼻分
泌物相似，以致于维持正常的纤毛作用。因此，在优选的实施方案中，水性鼻溶液通常是等渗的或者具有稍微的缓冲能力以维持pH为大约5.5至大约6.5。此外，抗微生物防腐剂，
类似于在眼制剂、药物或适当的药物稳定剂中使用的那些，根据需要可以包含在制剂中。例如，多种商业的鼻制剂是已知的并且包括药物例如抗生素或抗组织胺。

[0209] 在某些实施方案中，Cripto和/或GRP78靶向性试剂被制备成通过例如口服法途径施用。这这些实施方案中，固体组合物可以包括例如溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊(例如硬或软壳明胶胶囊)、缓释制剂、颊组合物、锭剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、薄片剂或其组合。口服组合物可以直接掺入到饮食食物中。用于口服施用的优选载体包括惰性稀释
剂、可同化的可食用载体或其组合。在本发明的其它方面中，口服组合物可以制备成糖浆剂或酏剂。糖浆剂或酏剂可包括例如至少一种活性剂、甜味剂、防腐剂、调味剂、染料、防腐剂或其组合。

[0210] 在某些优选的实施方案中，口服组合物可以包含一种或更多种粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、调味剂及其组合。在某些实施方案中，组合物可以包含一种或更多种下列试剂：粘合剂，例如西黄蓍胶、阿拉伯胶、谷类淀粉、明胶或其组合；赋形剂，例如磷酸二钙、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组合；崩解剂，例如谷类淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸或其组合；润滑剂，例如硬脂酸镁；甜味剂，例如蔗糖、乳糖、糖精或其组合；调味剂，例如薄荷油、冬青油、樱桃调味剂、橙香精等；或者前述试剂的组合。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料之外，其还可包含载体例如液体载体。多种其它材料可以作为包衣存在或者修饰剂量单位的物理性状。例如，片剂、丸剂或胶囊可以以虫胶、糖或者两者包衣。

[0211] 适用于其它方式施用的另外的制剂包括栓剂。栓剂是用于插入至直肠、阴道或尿道内的通常含药的多种重量和性状的固体剂量形式。在插入后，栓剂软化、熔化或者溶解在腔流体中。通常，对于栓剂，传统的栓剂可以包括例如聚烯烃二醇、甘油三酯或其组合。在某些实施方案中，栓剂可以从包含大约0.5％至大约10％，并且优选大约1％至大约2％范
围活性成分的混合物中形成。

[0212] 无菌可注射溶液通过将所需要量的活性化合物掺入到含有根据需要的多种上述其它成分的适当溶剂中，然后过滤除菌来制备。通常，分散剂通过将多种无菌活性成分掺入到包含基本分散介质和/或其它成分的无菌媒介物中来制备。在用于制备无菌可注射溶
液、混悬液或乳液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或者冷冻干燥技术，从其先前的无菌过滤液体介质得到活性成分和任何另外想要的成分的粉末。液体介质应当根
据需要被适当缓冲，并且在以足够的盐或葡萄糖注射之前，首先用液体稀释剂赋予等渗性。
还考虑了用于直接注射的高浓缩组合物的制备，其中构想使用DMSO作为溶剂以产生极其
快速的渗透、向小区域递送高浓度的活性试剂。

[0213] 组合物必须是在制造和储存条件下稳定的，并且防止微生物如细菌和真菌的污染作用。应当意识到，内毒素污染应当最低限度地保持在安全水平，例如小于0.5ng/mg蛋白。

[0214] 在特定的实施方案中，可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延缓吸收的试剂例如单硬脂酸铝、明胶或其组合实现。

[0215] VI.高增生性疾病

[0216] 可以使用破坏Cripto/GRP78相互作用的化合物治疗高增生性疾病，例如癌症。除了用于治疗癌症之外，破坏Cripto/GRP78相互作用的化合物可用于治疗其它高增生性疾
病，包括银屑病、纤维化、肿瘤血管发生、表皮增殖降低/疤痕、粥样斑、动脉粥样硬化、风湿性关节炎、炎症和自身免疫病。“高增生性疾病”如本文中所使用指导致或表征为细胞异常生长或繁殖的疾病。高增生性疾病在受试者中可表现损害，例如癌前病变、良性肿瘤和癌
症。

[0217] 多种癌症可以通过破坏癌细胞中Cripto/GRP78结合和/或相互作用治疗，例如通过将至少一些癌细胞与Cripto靶向性和/或GRP78靶向性化合物接触。可以以本发明的
化合物治疗或者通过本发明方法鉴定的癌症包括实体肿瘤、转移癌和/或非转移癌。癌症
可以起源于膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食道、胃肠道、齿龈、头、肾、肝脏、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫。在多个实施方案中，癌症可以被组织学分类为：
新生物、恶性；癌；癌，未分化的；巨细胞癌和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基细胞癌；毛基质癌；移行细胞癌；乳头移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管上皮癌；肝细胞癌；组合的肝细胞癌和胆管上皮癌；小梁性腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉内腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实质癌；类癌瘤，恶性；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性细胞癌；透明细胞腺癌；粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状或滤泡性腺癌；无囊包硬化腺癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；
皮肤附属器癌；大汗腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；
炎性癌；佩吉特病，乳腺的；腺泡细胞癌；腺鳞状癌；伴鳞状上皮化生的腺癌；胸腺瘤，恶性；
卵巢基质肿瘤，恶性；泡膜细胞瘤，恶性；粒层细胞瘤，恶性；男性母细胞瘤，恶性；支持细胞癌；间质细胞瘤，恶性；脂细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳腺外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；血管球瘤；恶性黑素瘤；无黑色素黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎横纹肌肉瘤；胞状横纹肌肉瘤；基质肉瘤；混合瘤，恶性；苗勒混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间叶瘤，恶性；勃勒纳肿瘤，恶性；叶状瘤，恶性；滑液肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺肿，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；kaposi肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁成骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性；
间质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；ewing肉瘤；牙源性肿瘤，恶性；造釉细胞性牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；造釉纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；神经胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；成星形细胞瘤；成胶质细胞瘤；少突胶质细胞瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层瘤；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；成视网膜细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；
颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金病；类肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；弥漫性大细胞性恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样肉芽肿病；其它指定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠病；白血病；
淋巴细胞白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞性白血病；髓细胞白血病；嗜碱细胞性白血病；嗜酸性白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓细胞肉瘤；或毛细胞白血病。

[0218] Cripto和GRP78在许多人肿瘤中广泛过表达。虽然如此，预期cancers of the乳腺和前列腺癌症对通过抑制Cripto/GRP78复合物的形成而抑制细胞增殖特别敏感。

[0219] A.组合治疗

[0220] 为了提高Cripto和/或GRP78靶向性试剂的有效性，希望将本发明的那些组合物和方法与在治疗高增生性疾病中有效的试剂，例如抗癌剂相组合。“抗癌剂”能够通过如下方式负向影响受试者中的癌症，例如通过杀死一种或等多种癌细胞、诱导一种或更多种癌
细胞的凋亡和/或坏死、降低一种或更多种癌细胞的生长率、降低转移灶的发生或数量、减少肿瘤大小、抑制肿瘤生长、减少向肿瘤或一种或更多种细胞的血液供应、改变肿瘤间质微环境、促进抗一种或更多种癌细胞或肿瘤的免疫反应、阻止或抑制癌症进展、或提高患癌症受试者的寿命。抗癌剂包括例如，化学治疗剂(化学治疗)、放射治疗剂(放射治疗)、手术
方法(外科手术)、免疫治疗剂(免疫治疗)、基因治疗剂(基因治疗)、激素治疗、其它生物
试剂(生物治疗)和/或备选的治疗剂。

[0221] 更普遍地，此类试剂将以有效杀死或抑制癌细胞增殖的与Cripto和/或GRP78靶向性试剂组合的量提供。该方法涉及将一种或多种细胞与一种或多种试剂和Cripto和
/或GRP78靶向性试剂接触，接触可以同时进行或者在当向细胞、组织或生物体分开施用
Cripto和/或GRP78靶向性试剂和试剂时产生想要的治疗益处的一定时间段内进行。这可
如下实现，即通过将细胞、组织或生物体与包含Cripto和/或GRP78靶向性试剂和一种或
更多种试剂两者的单一组合物或药物制剂接触，或者通过将细胞与两种或更多种不同组合
物或制剂接触，其中一种组合物包含Cripto和/或GRP78靶向性试剂并且其它种组合物包
含一种或更多种试剂。

[0222] 当术语“接触”和“暴露”适用于细胞、组织或生物体时，在本文用于描述这样的过程，即通过该过程Cripto和/或GRP78靶向性试剂和/或另一试剂例如化学治疗剂或放射治疗剂的治疗构建体被递送至靶细胞、组织或生物体或者被置于与靶细胞、组织或生物体
直接接触。为了实现细胞杀死或停滞，Cripto和/或GRP78靶向性试剂和/或一种或更多
种另外的试剂以有效杀死一种或多种细胞或者阻止它们分裂的组合量递送至一种或更多
种细胞。

[0223] Cripto和/或GRP78靶向性试剂可以从数分钟至数周的间隔早于、同时于和/或晚于一种或多种其它试剂。在Cripto和/或GRP78靶向性试剂和一种或多种其它试剂
分开施用至细胞、组织或生物体的实施方案中，通常确保有效的时间段没有在每次递送之
间期满，以致于Cripto和/或GRP78靶向性试剂和一种或多种试剂仍能够对细胞、组织或
生物体施加有利的组合作用。例如，在此类情况下，考虑了可以将细胞、组织或生物体以与Cripto和/或GRP78靶向性试剂基本同时(即小于大约一分钟内)与两种、三种、四种或
更多种治疗法接触。在其它方面中，一种或更多种试剂可以如下施用，即与Cripto和/或
GRP78靶向性试剂施用基本同时、之前和/或之后大约1分钟、大约5分钟、大约10分钟、大
约20分钟大约30分钟、大约45分钟、大约60分钟、大约2小时、大约3小时、大约4小时、
大约5小时、大约6小时、大约7小时大约8小时、大约9小时、大约10小时、大约11小时、
大约12小时、大约13小时、大约14小时、大约15小时、大约16小时、大约17小时、大约18
小时、大约19小时、大约20小时、大约21小时、大约22小时、大约22小时、大约23小时、
大约24小时、大约25小时、大约26小时、大约27小时、大约28小时、大约29小时、大约30
小时、大约31小时、大约32小时、大约33小时、大约34小时、大约35小时、大约36小时、
大约37小时、大约38小时、大约39小时、大约40小时、大约41小时、大约42小时、大约43
小时、大约44小时、大约45小时、大约46小时、大约47小时、大约48小时、大约1day、大约
2天、大约3天、大约4天、大约5天、大约6天、大约7天、大约8天、大约9天、大约10天、
大约11天、大约12天、大约13天、大约14天、大约15天、大约16天、大约17天、大约18
天、大约19天、大约20天、大约21天、大约1周、大约2周、大约3周、大约4周、大约5周、大约6周、大约7周或大约8周或更长以及可从其导出的任何范围内。

[0224] Cripto和/或GRP78靶向性试剂和一种或更多种试剂的多种组合方案可以采用。此类组合的非限定性实例显示如下，其中包含Cripto和/或GRP78靶向性试剂的组合物是
“A”并且试剂是“B”：

[0225] A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B

[0226] B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A

[0227] B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

[0228] Cripto和/或GRP78靶向性试剂按照用于施用化学治疗的一般方案，必要时考虑到毒性向细胞、组织或生物体的施用。预期治疗循环将按需要重复。在特定的实施方案中，考虑了多种另外的试剂可与本发明任何组合施用。

[0229] 1.化学治疗剂

[0230] 术语“化学治疗”使用药物治疗癌症。“化学治疗剂”用于指在癌症治疗中施用的化合物或组合物。化学治疗的一种亚型称作涉及化学治疗与生物治疗相组合的生物化学治疗。

[0231] 化学治疗剂包括，但不限于，5-氟尿嘧啶、博来霉素、白消安、喜树素、碳铂、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、环磷酰胺、放线菌素、柔红霉素、阿霉素、雌激素受体结合剂、表鬼臼毒素(VP16)、法呢基蛋白质转移酶抑制剂、吉西他滨、异环磷酰胺、氮芥、美法仑、丝裂霉素、诺维本、亚硝基脲、普卡霉素、丙卡巴肼、雷洛昔芬、他莫昔芬、紫杉醇、替莫唑胺(水性形式DTIC)、反铂、长春碱和甲氨蝶呤、长春新碱、或前述治疗剂的任何类似物或衍生物。这些试剂或药物以它们在细胞内的活性方式分类，例如是否并且在什么阶段它们影响细胞周期。备选地，试剂可以基于其直接交联DNA、嵌入至DNA或者通过影响核酸合成而诱导染色体和
有丝分裂畸变的能力表征。大多数化学治疗剂处于下列几类中：烷基化试剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、皮质类固醇激素、有丝分裂抑制剂和亚硝基脲、激素试剂、混合试剂及其任何类似物或衍生物变体。

[0232] 施用的化学治疗剂和方法、剂量等是本领域技术人员众所周知的(见例如the“Physicians Desk Reference”Goodman和Gilman的“The Pharmacological Basis
of Therapeutics”、“Remington’s Pharmaceutical Sciences”以及“The Merck Index，Eleventh Edition”，每一文献中的相关部分通过参考并入本文)，并且可以依据本公开与本发明组合。取决于所治疗受试者的情况，必要时改变剂量。无论如何，负责施用的人确定对于各个受试者的适宜剂量。特定化学治疗剂和剂量方案实例也在本文中描述。当然，本
文所述的所有这些剂量和试剂是示例性的，而不是限制性的，并且技术人员可以针对特定
患者或应用使用其它剂量或试剂。这些两点之间的任何剂量或可从其导出的范围也预期在
本发明中使用。

[0233] 2.放射治疗剂

[0234] 放射治疗剂包括引起DNA损伤的辐射和波，例如-辐射、X-射线、质子束治疗(美国专利5,760,395和4,870,287)、UV-辐射、微波、电发射、放射性同位素等等。治疗可以通过以上述形式的辐射照射局部的肿瘤部位实现。最有可能的是，所有这些试剂对DNA前体、DNA复制和修复以及染色体的装配和维持具有广范围的损伤。

[0235] 施用的化学治疗剂和方法、剂量等是本领域技术人员众所周知的，并且可以根据本文公开与本发明组合。例如，对于X-射线的剂量范围从50至200伦琴的每日剂量持续
一段时间(3至4周)，至2000至6000伦琴的单次剂量。对于放射性同位素的剂量范围可
很大程度上变化，这取决于同位素的半寿期、所发射辐射的强度和类型以及被肿瘤细胞的
吸收。

[0236] 3.外科手术

[0237] 大约60％的癌症患者将经历一些类型的外科手术，包括例如预防性、诊断或分期性、治疗和姑息性外科手术。外科手术，并且特别是治疗性外科手术，可以用于与其它治疗例如本发明和一种或更多种其它试剂相结合。

[0238] 治疗性外科手术包括其中全部或部分癌性组织被物理性去除、切下和/或破坏的切除术。进一步考虑，外科手术可去除、、切下或破坏浅表癌、初癌或附带量的正常组织。通过外科手术的治疗包括例如肿瘤切除术、激光外科手术、冷冻外科手术、电外科手术和显微镜控制的外科手术(Mohs外科手术)。肿瘤切除术指物理去除至少部分肿瘤。当部分或全
部癌性细胞、组织或肿瘤被切除时在身体内形成腔。

[0239] 肿瘤或外科手术区域的进一步处理可以通过灌注、直接注射或区域局部应用另外的抗癌剂实现。此类治疗可以重复，例如大约每1天、大约每2天、大约每3天、大约每4天、大约每5天、大约每6天或大约每7天、或大约每1周、大约每2周、大约每3周、大约每4
周、或大约每5周或大约每1月、大约每2月、大约每3月、大约每4月、大约每5月、大约每
6月、大约每7月、大约每8月、大约每9月、大约每10月、大约每11月或大约每12月。这
些治疗的剂量也是可变的。

[0240] 4.免疫治疗剂

[0241] 免疫治疗剂通常依赖于使用免疫效应子细胞和分子靶向和破坏癌细胞。免疫效应子可以是例如对肿瘤细胞表面上的一些标志物具有抗体特异性。抗体可独自充当治疗的效
应子或者它招募其它细胞实际实行细胞杀伤。抗体还可以与药物或毒素缀合(例如化学治
疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)并且仅仅充当靶向试剂。此类抗体结合物被称作免疫毒素并且是本领域众所周知的(见美国专利5,686,072，美国专
利5,578,706，美国专利4,792,447，美国专利5,045,451，美国专利4,664,911，以及美国专利5,767,072，每一文献通过参考并入本文)。备选地，效应子可以是携带直接或间接与肿
瘤细胞靶相互作用的表面分子的淋巴细胞。效应子细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。

[0242] 在免疫治疗的一个方面中，肿瘤细胞必须具有一些易于靶向的标志物，即其在大多数其他细胞上不存在。存在许多肿瘤标志物，并且这些标志物中许多可适用于在本发明
背景中用于靶向。共有的肿瘤标志物包括癌胚抗原、前列腺特异性抗原、泌尿肿瘤相关抗
原、胚胎抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化Lewis抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白受体、erb B和p155。

[0243] 5.基因治疗剂

[0244] 肿瘤细胞抗试剂例如化学治疗剂和放射治疗剂，代表着临床肿瘤学中的主要问题。当前癌症研究中的一个目标是通过组合此类试剂与基因治疗找到改善一种或更多种抗
癌试剂有效性的方法。例如，当单纯疱疹-胸腺嘧啶核苷激酶(HS-tK)基因通过反转录病毒
载体系统递送至脑肿瘤时成功地诱导了对抗病毒剂更昔洛韦的易感性(Culver等，1992)。
在本发明背景中，考虑了基因治疗同样也可与Cripto和/或GRP78靶向性试剂和/或其它
试剂联合使用。

[0245] 6.分子靶向治疗

[0246] 术语“靶向剂”意思是指用于通过靶向特异分子或信号途径治疗疾病的任何试剂(例如小分子和多肽，包括抗体)。抗Cripto和/或抗GRP78试剂与一种或更多种其它靶
向试剂的组合可通过靶向对于癌细胞至关重要的多个途径而改善对癌症的治疗。

[0247] VII.通过抑制Cripto/GRP78复合物形成促进神经元分化

[0248] 根据本发明抑制Cripto/GRP78复合物形成和/或功能还可用于促进干细胞的神经元分化。预期，实际上任何多能干细胞或细胞系，例如人胚胎干细胞或诱导的多能干细胞(iPS细胞)的分化可通过破坏Cripto/GRP78复合物形成和/或信号而被影响。例如，人
胚胎干细胞系H1、H9、hES2、hES3、hES4、hES5、hES6、BG01、BG02、BG03、HSF1、HSF6、H1、H7、H9、H13B和/或H14等可用于本发明中。还预期，随后可利用的干细胞系也可用于本发明
中。其它胚胎干细胞，例如哺乳动物、小鼠、灵长类等也可用于本发明中。

[0249] 如本领域技术人员所意识到的那样，通常缩写为iPS细胞或iPSC的诱导的多能干细胞是通过插入某些基因人工地从非多能细胞，有代表性的是成体体细胞衍生的一种多能
干细胞类型。据信，诱导的多能干细胞与天然多能干细胞如胚胎干细胞在许多方面相同，
包括某些干细胞基因和蛋白质的表达、染色质甲基化模式、倍增时间、胚状体形成、畸胎瘤形成、有活性嵌合体形成、以及潜能和可分化性，但是它们与天然多能干细胞相关的完全程度仍有待于评价。先前已经描述了IPS细胞(见例如Takahashi等，2006；Takahashi等，
2007；Yu等，2007)。

[0250] VIII.Cripto/GRP78复合物形成和功能的调节剂的筛选

[0251] 本发明进一步包括用于鉴定Cripto/GRP78相互作用功能，例如Cripto和GRP78结合并产生下游信号的能力的调节剂的方法。这些测定法可包括随机筛选大的候选物质的
文库；备选地，测定法可用于致力于根据结构特性选择的特定类型化合物，据信所述结构特性使得它们更适合调节Cripto/GRP78复合体的功能或形成。

[0252] 提高功能时意思是指可以测定Cripto与GRP78的结合和/或评价源自Cripto/GRP78复合体形成的一个或更多个下游信号(例如激活蛋白/Nodal/TGF-β信号)。例如，
可以测定在候选调节剂存在或缺乏下的Cripto/GRP结合。

[0253] 为了鉴定Cripto/GRP78复合体调节剂，通常将确定Cripto和GRP78在候选物质存在和缺乏下的功能，调节剂定义为改变Cripto/GRP78复合体功能或形成的任何物质。例
如，方法通常包括：

[0254] (a)提供候选调节剂；

[0255] (b)混合候选调节剂与分离的化合物或细胞，或适宜的试验动物；

[0256] (c)测量候选调节剂是否能改变或破坏步骤(c)的细胞或动物中Cripto/GRP78结合和/或下游信号；和

[0257] (d)比较在步骤(c)中测量的特征与在所述候选调节剂缺乏下化合物、细胞或动物的特征，

[0258] 其中所测量特征之间存在不同表明所述候选调节剂的确是化合物、细胞或动物的调节剂。

[0259] 在某些实施方案中，选择性破坏Cripto/GRP78结合和/或信号的候选调节剂可用于治疗高增生性疾病。可在无细胞系统中、分离的细胞中或者在生物体包括转基因动物中
开展测定。

[0260] 当然，应当理解，尽管没有找到有效的候选物，但是所有的本发明筛选方法本身是有用的。本发明提供筛选此类候选物的方法，不单单是发现它们的方法。

[0261] 1.调节剂

[0262] 如本文中所使用，术语“候选物质”指可有效抑制或增强Cripto/GRP78复合物形成或活性的任何分子。候选物质可以是蛋白质或其片段、小分子、甚至核酸分子。经证明
情况确实如此，即大多数有用的药物化合物将是结构上与N-20抗体相关的化合物、靶向
GRP78(例如SEQ ID NO：5)或Cripto(例如SEQ ID NO：4)的shRNA、从Cripto或GRP78衍
生的肽、Cripto的合成CFC结构域、可溶性ALK4ECD或其突变体(I70A、L75A、P77A)、ECGC
或结构上与靶向CFC结构域上GRP78结合位点的Cripto抗体相关的化合物。使用先导化
合物帮助开发改善的化合物被称作“推理性药物设计”并且不仅包括与已知抑制剂和激活
剂的比较，而且还包括关于靶分子结构的预测。

[0263] 推理性药物设计的目的是产生生物活性多肽或靶化合物的结构类似物。当提到产生此类类似物时，可能是产生这样的药物，即比天然分子更有效或更稳定，其对改变具有不同的易感性或者其会影响多种其它分子的功能。在一个方法中，可产生靶分子或其片段的
三维结构。这可通过x-射线晶体学、计算机建模或者通过两种方法的组合实现。

[0264] 使用抗体证实靶化合物激活剂或抑制剂的结构也是可能的。原则上，该方法得到药效团，随后的药物设计可以基于此药效团。通过产生针对功能性药理学活性抗体的抗独
特型抗体，完全绕开蛋白质晶体学是可能的。作为镜像的镜像，抗独特型的结合位点预期将是最初抗原的类似物。然后，抗独特型将用于从化学或生物性产生肽库中鉴定和分离肽。然后所选择的肽充当药效团。使用本文所述的用于产生抗体的方法，使用抗体作为抗原可产
生抗独特型抗体。

[0265] 另一方面，可以从多种商业来源简单地获得小分子文库，据认为该小分子文库满足用于有用药物的基本标准以“野蛮强制”鉴定有用化合物。筛选此类文库，包括组合产生的文库(例如肽文库)是筛选大量的对于活性相关(和不相关)化合物的快速且有效的方
式。组合方法还通过产生仿照活性设计的第二代、第三代和第四代化合物而不产生不良化
合物向它们自身提供潜在药物的快速进化。

[0266] 候选化合物可包括天然存在化合物的片段或部分，或可以作为已知化合物的有效组合发现，否则其将是无活性的。建议从天然来源如动物、细菌、真菌、植物来源包括叶和皮以及海洋样品分离的化合物可以作为候选物测定潜在有用的药物试剂的存在。应当理解，
待筛选的药物试剂还可从化学组合物或人造化合物衍生或合成。因此，应当理解，通过本发明鉴定的候选物质可以是肽、多肽、多核苷酸、小分子抑制剂或通过推理性药物设计从已知抑制剂或刺激剂设计的任何其它化合物。

[0267] 其它适宜的调节剂包括反义分子、核糖核酸酶和抗体(包括单链抗体)，它们当中每一个将是靶分子特异性的。在本文件的别处更详细地描述此类化合物。例如，结合翻译
或转录起始位点或者剪接点的反义分子将是理想的候选抑制剂。

[0268] 除了最初鉴定的调节性化合物外，发明人还考虑了其它立体化学相似的化合物可以配制成模拟调节剂结构的关键部分。包括肽调节剂的模拟肽的此类化合物可以以与初始
调节剂相同的方式使用。

[0269] 根据本发明的抑制剂可以是这样的抑制剂，即对Cripto/GRP78复合体上游、下游或直接对其施加抑制性或激活性效应。不管通过本筛选方法鉴定的抑制剂或激活剂的类型
如何，此化合物的抑制或激活效应导致与在不加入候选物质时所观察到的效应相比降低或
抑制Cripto/GRP78复合物形成或活性。

[0270] 2.体外测定

[0271] 运行的快速、廉价且简单的测定法是体外测定。此类测定通常使用分离的分子，可以快速且大数量运行，由此增加在短时间内可获得的信息量。可以使用许多种容器运行测定法，包括试管、板、皿和其它表面，例如试纸或珠。

[0272] 无细胞测定法的一个实例是结合测定法。虽然它不能直接解释功能，但是调节剂以特异方式结合靶分子的能力是具有相关生物学效应的强有力的证据。例如，因为立体的、变构的或电荷-电荷相互作用，所以分子与靶的结合它们自己本身会是抑制性的。靶可以
是在溶液中游离的、固定至支持物上的、表达于细胞表面中或上的。靶或化合物任一种可以被标记，由此允许测定结合。通常，靶将是标记的，这降低了加标签会干扰或增强结合的机会。可开展竞争性结合形式，其中试剂之一被标记，并且可以测定游离标签的量对结合标签的量以测定结合效应。

[0273] 用于高通量筛选化合物的技术描述于WO 84/03564中。大量的小肽测试化合物在固体物质上合成，例如塑料钉或一些其它表面。结合的多肽通过多种方法检测。

[0274] 3.细胞内测定

[0275] 本发明还考虑了在细胞中筛选化合物调节Cripto/GRP78复合物形成和/或功能的能力。对于此类筛选测定可采用多种细胞系，包括用于此目的的特别进行工程化改造的
细胞。例如，基于本文所述的观察，癌症细胞和/或干细胞可以与候选Cripto/GRP78复合
体调节剂接触。在其它实施方案中，细胞系可以被工程改造以过表达Cripto和GRP78以利
于筛选假定的Cripto/GRP78复合体调节剂。GRP78蛋白质是商业可获得的并且可以固定在
多孔板表面以允许开发基于ELISA的测定法来测定可溶性Cripto的结合和Cripto/GRP78
125
复合体调节剂的效应。备选地，发明人已经显示，可以测量可溶性 I-Cripto与表达GRP78
的完整细胞在细胞表面上的结合(例如见Kelber等)。还可在该测定法中筛选Cripto/
GRP78复合体调节剂以测量它们影响Cripto/GRP78结合和信号的能力。

[0276] 取决于测定法，可以需要培养。使用多种不同的生理测定法检查细胞。备选地，可开展分子分析，例如查看蛋白质表达、mRNA表达(包括全细胞或polyA RNA的差异展示)及其它。

[0277] 4.体内测定

[0278] 体内测定法涉及使用多种动物模型，包括已经被工程改造具有特定缺陷，或者携带有可以用于测量候选物质达到并影响生物体内不同细胞的能力的标志物的转基因动物。
由于其大小、操作容易以及对它们的生理学和基因构成信息的原因，小鼠是优选的实施方
案，特别是对于转基因学。然而，其它动物也是适宜的，包括大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、沙土鼠、北美土拨鼠、猫、狗、绵羊、山羊、猪、牛、马和猴类(包括黑猩猩、长臂猿和狒狒)。用于调节剂的测定法可以使用来自这些物种的动物模型开展。

[0279] 在此类测定中，一种或更多种候选物质施用至动物中，并且与没有以一种或多种候选物质处理的相似动物相比，一种或多种候选物质改变一个或更多个特性的能力鉴定为
调节剂。特征可以是上面关于特定化合物(例如酶、受体、激素)或细胞(例如生长、致瘤
性、存活)所讨论的那些，或者是更广的指征例如行为、贫血、免疫反应等。

[0280] 本发明提供用于筛选影响Cripto/GRP78复合物形成和/或功能的候选物质的方法。在这些实施方案中，本发明涉及用于测定候选物质抑制Cripto/GRP78复合物形成和
/或功能的能力的方法，通常包括步骤：向动物施用候选物质；和测定候选物质减少细胞增殖、高增生性疾病的发展或抑制、Cripto/GRP78复合物形成和/或信号的一个或更多个特
征的能力。

[0281] 以测试化合物对这些动物的治疗涉及向动物施用适宜形式的化合物。施用可以通过为临床或非临床目的采用的任何途径，包括但不限于口、鼻、颊甚至局部施用。备选地，施用可以通过气管内滴注法、支气管滴注法、真皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射。特别考虑的途径是全身静脉内注射、通过血液或淋巴液补充的部位施用、或直接向受累部位施
用。

[0282] 体内测定化合物的有效性将涉及多种不同标准。同样，测量毒性和剂量反应可以在动物中以比体外或细胞内测定意义更深远的方式开展。

[0283] IX.实施例

[0284] 包括下列实施例以表明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当意识到，在下列实施例中公开的技术代表着发明人发现的在实施本发明中工作良好的技术，并且因此
可以考虑构成其优选的实施方式。然而，根据本公开，本领域技术人员应当意识到，可以在不脱离本发明精神和范围的情况下对所公开的特定实施方案进行诸多修改，并仍得到相同
或相似的结果。

[0285] 实施例1

[0286] 材料和方法

[0287] 材料.NuPAGE凝胶、分子量标准和Cyquant细胞增殖测定试剂盒来自Invitrogen(San Diego，CA)。Sulfo-NHS-LC-生物素购自Pierce(Rockford，IL)。TGF-β1购自R&D systems(Minneapolis，MN)。抗Flag(M2)、抗HA(HA-7)、抗His(His-1)和抗总
钙黏着蛋白抗体以及抗Flag M2凝胶珠、Flag肽和毒胡萝卜内酯购自Sigma-Aldrich(St
Louis，MO)。抗GRP78(N-20和76-E6)、抗TβRII(C16)和蛋白质G-PLUS-琼脂糖珠来自
Santa Cruz(Santa Cruz，CA)。抗GRP78(KDEL)来自Stressgen bioreagents(Ann Arbor，
MI)。抗磷酸化Smad2、抗TβRI和抗总肌动蛋白购自Cell Signaling(Danvers，MA)。
p26-Flag表达构建体由Kuo Fen Lee(Peptide Biology Laboratories，Salk Institute)
馈赠。抗Cripto的抗体(6900)针对跨小鼠Cripto氨基酸81-97位并且在Cys 81和
Cys 90之间环化的肽产生。Smad2抗血清针对在Smad2和Smad3之间保守的跨人Smad3
氨基酸159-175位的肽产生。靶向Flag表位(6643)的多克隆抗血清针对2X Flag肽产
生。兔多克隆抗Cripto、抗Smad2/3和抗Flag抗血清由Joan Vaughan(Peptide Biology
Laboratories，Salk Institute)生产。

[0288] 重组人激活蛋白-A使用由J.Mather博士(Genentech，Inc.)慷慨提供的稳定表达激活蛋白-A的细胞系产生，并由Wolfgang Fischer(Peptide Biology Laboratory，
Salk institute)纯化。重组小鼠Nodal、人TGF-β1、人激活蛋白-B和小鼠Cripto购自
R&D Systems(Minneapolis，MN)。蛋白A-和G-琼脂糖和磷酸肌醇3-激酶(LY294002)
125
和MAPK或Erk激酶(PD98059)抑制剂购自Calbiochem(San Diego，CA)。 I-Cripto使
用如先前所描述的氯胺T方法制备(Vaughan，1993)。多克隆抗Cripto抗体(6900)在以
82 98
来自Cripto的表皮生长因子样结构域的肽( CPPSFYGRNCEHDVRKE (SEQ ID NO：1))免
疫的兔中产生。山羊IgG、抗GRP78(N-20)和抗磷酸化酪氨酸(PY99)购自Santa Cruz
Biotechnology，Inc.(Santa Cruz，CA)。抗磷酸化Smad2、抗Smad2/3、抗总肌动蛋白、抗磷酸化Akt、抗Akt、抗磷酸化GSK3b、抗磷酸化Erk1/2、抗Erk1/2、抗磷酸化Src(Y416)和
抗Src购自Cell Signaling Technologies，Inc.(Danvers，MA)。抗HA、抗Flag(M2)和抗
Flag(M2)琼脂糖购自Sigma(St.Louis，MO)。辣根过氧化物酶连接的抗小鼠、抗山羊、抗兔TM
IgG、3，3’，5’5-tetramethlbenzidine底物、化学发光底物(Supersignal )以及BCA蛋白质测定试剂盒从Pierce(Rockford，IL)得到。

[0289] 表达构建体、细胞系和瞬时转染.野生型和突变体小鼠Cripto-Flag表达构建体已经在先前描述(Gray等，2006)。还在慢病毒载体pCSC(Miyoshi等，1998)中产
生Cripto构建体用于慢病毒生产。在该研究中使用的慢病毒载体由Inder Verma(Salk
Institute)慷慨馈赠。TβRI-HA和TβRII-His表达构建体由Joan Massagué(Memorial
Sloan-Kettering Cancer Center，New York)馈赠。标准PCR技术用于产生在其C末端带
有血凝素(HA)表位的人GRP78构建体。293T细胞、P19细胞和HeLa细胞生长在DMEM培养
基中并且PC3细胞生长在-K12培养基中。培养基添加10％胎牛血清(293T、HeLa和PC3)
或7.5％胎牛血清(P19)以及青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺。对于瞬时转染，将293T细胞
7
铺于聚赖氨酸包被的15cm板中(～10 个细胞/板)，然后在第二天达到～40-60％汇合
时使用PEI转染试剂转染，如先前所描述(Harrison等，2004)。

[0290] 在实施例3中使用下列培养方案。HEK 293T细胞生长在Dulbecco改良Eagle培养基中，并且NCCIT细胞生长在RPMI 1640中。两种培养基添加有10％胎牛血清、青霉素、
链霉素和L-谷氨酰胺。MCF10A细胞生长于Dulbecco改良Eagle培养基-F-12(50∶50)
中，培养基添加有5％供体马血清、20ng/mL EGF、10μg/mL胰岛素、0.5μg/mL氢化可的松和100ng/mL霍乱毒素。

[0291] 对于瞬时转染，细胞40％和60％之间汇合的密度铺板并且对于NCCIT细胞使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)并且对于293T细胞使用Perfectin(Gene Therapy
Systems)根据厂商的说明书进行。对于病毒转导，如先前所述产生慢病毒(Miyoshi等，
1998)。将包含病毒的培养基适当稀释得到3至5的感染复数，用于产生包含递送载体的细
胞集合，并且通过使用荧光显微镜检测所感染细胞中的绿色荧光蛋白确定感染效率。

[0292] 质谱分析.将质量特异性条带从考马斯蓝染色的凝胶中切下。通过以40％水性正丙醇和50％水性乙腈处理将凝胶片进一步脱色。向脱色的凝胶片中，加入10μl碳酸氢
铵溶液中的100ng胰蛋白酶(20mM)。于37℃消化16h。将1微升上清液点在MALDI靶上
并与1μl的α-氰基-羟基桂皮酸饱和溶液混合。干燥后，在Bruker Ultraflex TOF/
TOF(Bruker Daltonics，Billerica，MA)上以阳性反射TOF模式分析样品。使用Mascot
algorithm(Matrix Science，London，UK)分析质量指纹数数据。

[0293] 荧光成像.293T细胞(35,000每孔)和P19细胞(500,000每孔)铺于12孔板中并在以聚赖氨酸预处理的盖玻片上生长过夜。细胞以KPBS洗涤，在4％多聚甲醛中固定然
后在缓冲液A(KPBS，添加有2％驴血清和0.2％Triton X-100)中透化。293T细胞以兔抗
Cripto(6900；1∶600)和山羊抗GRP78(N-20sc-1050；1∶400)处理，而P19细胞以相同的
抗Cripto(6900；1∶600)和抗GRP78(N-20sc-10501∶125)抗体以及小鼠抗总钙黏着蛋
白(C1821，Sigma，1/125)在缓冲液A中于4℃处理48小时。细胞以KPBS洗涤，然后分别用
抗兔、抗山羊和抗小鼠在缓冲液A中于室温处理1小时。在于KPBS中进一步洗涤之后，在
DAPI存在情况下将盖玻片封片并进行荧光检查。对于共焦成像，使用Leica TCS SP2 AOBS
共焦系统(Leica，Wetzlar，德国)。使用每一激发波长连续扫描收集图像以避免荧光团之
间的任何扩散。

[0294] 慢病毒shRNA载体的设计和细胞系感染.人GRP78基因内的靶序列使用S-fold程序(http://sfold.wadsworth.org/sirna.pl)鉴定和选择。短发夹RNA(shRNA)的设计
和慢病毒shRNA载体的生产如先前所述开展(Singer等，2005)。用于产生GRP78 1(G1)
shRNA的83-mer如下：5’-CTGTCTAGACAAAAAACCATACATTCAAGTTGATTCTCTTGAAATCAACTTGAAT
GTATGGTCGGGGATCTGTGGTCTCATACA-3’(SEQ ID NO：2)。对于病毒转导，慢病毒如先前所述产生(Miyoshi等，1998)。

[0295] 野生型Cripto-Flag表达构建体先前已经描述(Gray等，2006)。标准PCR技术用于产生在其C-末端代有HA表位的人GRP78构建体。Δ19-68GRP78-HA构建体使用PCR技术
产生，如先前所述(Harrison，CA 2003 JBC)。Cripto构建体还在慢病毒载体pCSC(Miyoshi HU 1998 J Virol)中产生用于慢病毒的生产和细胞系的感染。人Cripto或GRP78基因内
的靶序列使用Sfold程序(http://sfoldwadsworth.org/sirna.pl)鉴定和选择。短发夹
RNA(shRNA)的设计和慢病毒shRNA载体的生产基本上如先前所述开展(Singer O 2005 Nat
Neuro)。简言之，包含人Cripto或GRP78shRNA序列的83-mer寡核苷酸和T3寡核苷酸(5
’-CTCGAAATTAACCCTCACTAAAGGG-3’(SEQ ID NO：3))用于PCR扩增片段，然后被亚克隆入其中shRNA表达被H1启动子驱动的慢病毒载体中(Singer O 2005 Nat Neuro)。用于产生
Cripto shRNA和GRP78 shRNA载体的83-mer分别是5’-CTGTCTAGACAAAAACAATGACTCTGAAT
TAAAGTCTCTTGAACTTTAATTCAGAGTCATTGCGGGGATCTGTGGTCTCATACA-3’(SEQ ID NO：4)和5’-CTGTCTAGACAAAAAACCATACATTCAAGTTGATTCTCTTGAAATCAACTTGAATGTATGGTCGGGGATCTGTGGTCTC
ATACA-3’(SEQ ID NO：5)，并且先前已经验证(Gray等，2006；Shani等，2008)。

[0296] 细胞裂解液和免疫沉淀.如先前所述在RIPA缓冲液中制备细胞裂解液(Gray等，2006)。对于免疫沉淀试验，1-5mg蛋白质提取物通过蛋白质G-PLUS-琼脂糖珠于4℃预清除
2小时。预清除的提取物按所标明与40μl抗FLAG M2凝胶珠孵育或者20μl G-PLUS-琼
脂糖以15μl抗GRP78(KDEL)、10μl抗HA、或25μl抗His于4℃预清除2小时。随后以
RIPA缓冲液洗涤免疫沉淀物4次并以54K(50mM tris pH 7.9、150mM NaCl、0.5％Triton
X-100)缓冲液洗涤2次。然后通过如下任一种方式洗脱蛋白质，即通过在样品缓冲液中于
95℃加热珠子或者通过加入50μl Flag肽(1μg/μl)接着通过在样品缓冲液中加热去除
任何剩余的结合蛋白质。Western印迹

[0297] 细胞表面生物素化.Sulfo-NHS-LC-生物素在HDB中以0.5mg/ml新鲜制备然后储存在冰上直至使用。附着的完整细胞以冰冷的HDB漂洗两次然后与生物素溶液在冰上孵育
30分钟，使用足够的体积以完全覆盖细胞(例如对于6-孔板1ml/孔)。然后通过加入1M
Tris pH 7.5使生物素/H B溶液达到50mM Tris终浓度以淬灭生物素化反应。去除所得
到的溶液并在包含50mM Tris的HDB中漂洗细胞一次。然后细胞溶解于添加有标准蛋白酶
抑制剂的RIPA缓冲液中(50mM TrisHCl，pH 7.4/150mM NaCl/1％ NP40/0.5％脱氧胆酸盐
/0.1％SDS)。生物素化蛋白质通过SDS PAGE分离，印迹至硝酸纤维素上，并且然后在以抗
生物素蛋白-HRP和ECL处理后显色。

[0298] 细胞死亡测定.对于每一细胞群体，根据细胞的形态计数三个视野中的凋亡细胞，每一视野包含至少100个GFP阳性细胞。确定为细胞凋亡的细胞数除以视野中GFP阳
性细胞的总数，得到％凋亡细胞。

[0299] 蛋白质磷酸化.细胞在24孔板中生长至汇合，以无血清培养基漂洗并且血清饥饿4小时。如所标明，加入适宜抑制剂或阻断性抗体1小时。细胞以标明剂量的TGF-β配
体刺激60分钟或者以可溶性的Cripto刺激10分钟。通过加入添加有20mM NaF、500μM
焦磷酸钠、1mM NaOrthothanitate和标准蛋白酶抑制剂的50μL冰冷的放射免疫沉淀
(RIPA)缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.4，150mM NaCl，1％Nonidet P-40，0.5％脱氧胆酸
盐和0.1％SDS)收获细胞。然后向每一样品中加入15mL的4×SDS-PAGE上样缓冲液(含
二硫代苏糖醇)，并且蛋白质通过SDS-PAGE分离并且印迹在硝酸纤维素上。印迹以抗磷
酸化Smad2(1∶500)、抗Smad2/3(1∶1000)、抗磷酸化Akt(1∶500)、抗Akt(1∶500)、
抗磷酸化GSK3β(1∶500)、抗总肌动蛋白(1∶500)、抗磷酸化Erk1/2(1∶500)或抗
Erk1/2(1∶500)抗体处理，结合以缀合有辣根过氧化物酶的抗兔或小鼠IgG处理，并且使
用增强化学发光检测条带。

[0300] 如下开展Smad2磷酸化和Western印迹。以慢病毒稳定转染的HeLa细胞或PC3细胞以200,000个细胞/孔的密度铺于6孔板中。铺板48h后，细胞以HDB洗涤一次，在无
添加剂的培养基中饥饿4h，然后不再处理或者以TGF-β1处理～分钟。裂解细胞并且通过
如先前所述的Western印迹开展Smad2磷酸化测定(Gray等，2006)。

[0301] 细胞增殖测定和在软琼脂中的集落形成.PC3细胞以如上所述的pCSC慢病毒构建体稳定转染。细胞以500个细胞/孔的密度铺于96孔板中并且24h后细胞以10pM TGF-β1
处理或不处理。处理8天后，使用Cyquant细胞增殖试剂盒根据厂商的说明书测定细胞增
殖。为了测量在软琼脂中的集落形成，96孔板以50μl/孔表面层制备，孔表面层包含再悬
浮于PC3生长培养基中的0.6％琼脂(Nobel)。然后向每一孔中加入75μl/孔的包含1,000
个稳定感染PC3细胞的0.33％琼脂/PC3生长培养基，接着加入不同量TGF-β1，在琼脂固化
之前得到特定的终浓度。向孔中再加入100μl的含或不含TGF-β1的PC3生长培养基15
天，然后通过显微镜观察集落并计数。使用架在倒置Olympus CK40显微镜上的Canon EOS
400D照相机设置成最低放大倍数拍摄指定细胞的照片。

[0302] 细胞表面蛋白质检测.一式三份铺于24孔板中的完整细胞以Hepes解离缓冲液(HDB)洗涤，以3％牛血清白蛋白/HDB封闭，并在3％牛血清白蛋白/HDB中与抗
Cripto(6900；1∶200)、抗GRP78(N-20；1∶200)或适宜阴性对照一级抗体室温孵育2小
时。细胞以HDB洗涤并适宜的过氧化物酶缀合的二级抗体孵育。使用3’3’，5’5-四甲基联苯胺过氧化物酶底物测量特异性抗体染色，如先前所述(Gray等，2000；Kelber JA等2008 J.Biol.Chem.283(8)4490-500)。

[0303] Smad2-依赖的萤光素酶活性.如先前所述，萤光素酶测定使用A3-萤光素酶报告分子开展(Gray等，2003)。A3-萤光素酶报告分子构建体包含3拷贝的来自非洲爪蛙
(Xenopus laevis)Mix.2启动子的与基本的TATA和和萤光素酶报告分子基因连接的激活
5
蛋白应答元件。NCCIT细胞以1×10 个细胞/孔铺于聚-D-赖氨酸包被的24-孔板中，并
在～24小时后使用200ng A3-萤光素酶、400ngFAST2(FoxH1)、400ng CMV-β-半乳糖苷酶
和200ng空载体(pcDNA 3.0)以1.2μg DNA/孔一式三份转染(Lipofectamine 2000)。在
转染后～24小时处理细胞，然后在处理后～16小时收获。在冰上将细胞在增溶缓冲液(1％
Triton-X-100、25mM甘氨酰甘氨酸(pH 7.8)、15mM MgSO4、4mM EGTA和1mM二硫代苏糖醇)
中孵育30分钟，并且测量萤光素酶报告分子活性并向对于CMV-β-半乳糖苷酶标准化。

[0304] 免疫共沉淀.1×106HEK 293T细胞铺于10-cm板中。24小时后，使用Perfectin以12μg DNA/板(6μg载体和6μg Cripto-Flag、WT GRP78-HA、Δ19-68 GRP78-HA或6μg
Cripto-Flag和6μg WT GRP78-HA或Δ19-68GRP78-HA)转染细胞，并且在收获前将细胞再
孵育48小时。在冰上将细胞裂解并刮到包含标准蛋白酶抑制剂的0.8mL冷RIPA缓冲液中。
通过离心预清除细胞裂解物，并将75μL的总裂解物在4×SDS-PAGE上样缓冲液(含二硫
代苏糖醇)中加热和冷冻，其中剩余的裂解物与HA-或Flag(M2)-琼脂糖4℃孵育过夜。沉
淀的复合体以冷的RIPA缓冲液洗涤3次，每次1小时，从珠上洗脱，然后通过SDS-PAGE分
析并电转移至硝酸纤维素上，然后使用抗Flag、HA或GRP78(N-20)抗体进行Western印迹。

[0305] 细胞增殖.细胞以500(NCCIT)或200(MCF10A)个细胞/孔的密度铺于96孔板中，细胞一式四份根据指示以的阻断剂(山羊IgG或抗GRP78(N-20))和生长因子的组合处理，
或者不处理。处理后8天，使用CyQUANT细胞增殖试剂盒根据厂商说明书测量细胞增殖。

[0306] 细胞表面Cripto结合.细胞以4×105个细胞/孔铺于以聚-D-赖氨酸包被的24孔板中。铺板16小时后，在孔中室温开展对完整细胞的结合。细胞在Hepes解离缓冲
液(HDB)(12.5mM Hepes(pH 7.4)、140mM NaCl和5mM KCl)中洗涤，然后向每一孔中加入
200μl：200μl含0.1％牛血清白蛋白的结合缓冲液(HDB含5mM MgSO4、1.5mM CaCl2)、
10μl的结合缓冲液中不同稀释度的未标记竞争物(25.0μg/mL可溶性Cripto)和40μl
125 6
I-Cripto(1×10cpm/孔)。将板室温孵育2h，然后以HDB漂洗孔，并且细胞在1％SDS中
125
增溶并且使用计数器计数每一孔的 I-Cripto。

[0307] E-钙黏着蛋白表达和细胞粘附. MCF10A细胞以4×105个细胞/孔铺于6孔板中。24小时后细胞以山羊IgG或抗GRP78(N-20)预处理1小时，然后以400ng/mL可溶性
Cripto处理或者不处理。处理48小时后，细胞或者在包含标准蛋白酶抑制剂的冷RIPA缓
冲液中裂解或者分析细胞粘附特性。细胞裂解物通过SDS-PAGE分析并且电转移至硝酸纤
维素上，接着使用抗E-钙黏着蛋白或总肌动蛋白抗体进行Western印迹。为了定量细胞粘
5
附，～2×10 个细胞/孔一式四份铺于96孔板中并且于37℃孵育1小时。为分析所铺板
的细胞的总数，从每一孔中去除培养基并且使用CyQUANT细胞增殖试剂盒根据厂商的说明
书测量相对细胞数。使用从已经漂洗的板测量(CyQUANT)的相对细胞数计算粘附百分数。

[0308] 实施例2

[0309] GRP78和Cripto在细胞表面上形成复合体并且协同抑制TGF-β信号和增强细胞生长

[0310] Cripto和GRP78在胚胎发育过程中起着至关重要的作用并且促进肿瘤的表型。经验证这些蛋白质中每一个可独立地作为细胞表面肿瘤特异性治疗的体内靶标的事实突出
了这些蛋白质在肿瘤进展中的重要性。为了鉴定新的Cripto相互作用蛋白质，开展了使用
全长、膜锚定Cripto作为诱饵的蛋白质相互作用筛选。该筛选导致鉴定出GRP78，其是在癌症中负有重要责任的ER稳态的多功能调节剂。有趣的是，虽然GRP78通常定位于ER，但是
GRP78还选择性表达于肿瘤细胞的质膜上，并且本文所给出的资料表明Cripto在细胞表面
结合GRP78。资料表明，它们在无细胞体系中以不需要它们在ER内结合的方式相互作用。
最后，资料表明GRP78和Cripto协同减弱TGF-β-依赖性生长抑制效应和增强前列腺癌细
胞在软琼脂中的集落生长。这些结果一起表明，这两种蛋白质在细胞表面上形成复合体并
且由此通过抑制TGF-β信号赋予肿瘤细胞的生长优势。

[0311] 针对鉴定新Cripto结合蛋白的筛选导致鉴定出葡萄糖调节蛋白-78(GRP78)，它是促进蛋白质折叠和装配并协调未折叠蛋白质反应(UPR)的ER蛋白伴侣。GRP78在ER应激
的条件例如葡萄糖缺乏和低氧下被强烈地诱导并且在这些条件占优势的肿瘤微环境中高
度表达(Lee，2001；Lee，2007；Li和Lee，2006)。由GRP78启动子驱动的HSVTK自杀转基因向乳腺肿瘤细胞中的递送显示引起小鼠中相当大肿瘤的完全消除(Dong等，2004)。已经显
示GRP78在促进肿瘤细胞存活、化学抗性和恶性中负有重要的责任(Lee，2007；Li和Lee，
2006)。在纤维肉瘤B/C10ME细胞中使用反义核酸对GRP78诱导的抑制阻止这些细胞在裸
小鼠中形成肿瘤(Jamora等，1996)。同样，当GRP78杂合小鼠正常发育时，它们显示由于降低了GRP78水平的原因而抵抗转基因诱导的乳腺肿瘤生长(Dong等，2008)。虽然GRP78通
常限定于ER腔中，但是GRP78定位于肿瘤细胞的质膜，在此它具有与增强的细胞增殖、运动性和存活有关的受体功能(Pizzo ref)(Lee，2007；Li和Lee，2006)。

[0312] GRP78作为新Cripto结合蛋白的鉴定.为了鉴定新Cripto相关蛋白，发明人已经采用了其中Cripto用作诱饵“拉下”细胞膜上其结合配偶体的策略。发明人对来自以空载
体或Cripto-Flag转染的293T细胞的裂解物进行抗Flag免疫沉淀，接着以Flag肽特异性
洗脱所结合的蛋白质。由于其在温和条件下开展，该洗脱允许另外的纯化步骤。如通过银
染后观察，以～72kDa和～50kDa迁移的两种蛋白质与Cripto-Flag共沉淀(图1A，分别是
标记的a和b)。

[0313] 发明人接着使用质谱分析法鉴定这些Cripto相关蛋白。将～72kDa和～50kDa条带从凝胶上切下，进一步脱色并进行凝胶内胰蛋白酶消化。然后通过MALDI/TOF分析分
析样品并且使用Mascot 算法(Matrix Science，London，英国)表征质量指纹数据。对于
大约72kDA条带的55的高命中得分是GRP78，也称作BiP，并且在质量指纹中指定总共7个
肽，肽质量误差宽容度＜0.1Da(图1B)。在～50kDa的条带(蛋白质b)还没有最终鉴定
出。

[0314] GRP78具有多重功能，包括在介导ER中蛋白质折叠和应激反应中的突出作用(Lee，2001)。GRP78在肿瘤发生中负有重要的责任(Lee，2007)并且在本研究中发明人致
力于其在结合Cripto和调节其功能中的潜在作用。为了明确地验证GRP78作为特异性
Cripto结合配偶体的身份，发明人重复了上述的免疫共沉淀过程，并使用特异性抗GRP78
或抗Cripto抗体对所沉淀蛋白质进行Western印迹。如图1C中所示，GRP78存在于Flag
肽洗脱物中，表明其与Cripto特异性免疫共沉淀。

[0315] GRP78在细胞表面上结合Cripto.虽然认为GRP78主要作为ER相关蛋白质起作用(Lee，2001)，但是最近的数项研究已经证明在某些条件下GRP78还在癌细胞质膜上表
达(Lee，2007)。为了测试Cripto和GRP78是否在细胞表面相互作用，发明人以细胞不渗
透性生物素试剂标记完整细胞，并将所得到的细胞裂解物进行抗Flag免疫沉淀，接着用
Flag肽洗脱并用抗生物素蛋白检测生物素化蛋白质。发明人使用p75神经营养蛋白受体
的～26kDa跨膜片段作为阴性对照，称为p26-Flag。该无关蛋白质大小与Cripto类似并与
Cripto-Flag一起经历相同的过程。如图2A中所示，生物素化形式的GRP78和蛋白质b与
Cripto免疫共沉淀，但是不与p26免疫共沉淀，表明Cripto与GRP78和蛋白质b的结合是
特异性的。GRP78和Cripto被生物素化的事实表明它们在细胞表面上相互作用并且减少了
它们的结合依赖于GRP78的蛋白伴侣活性的可能性。

[0316] 为了进一步表征Cripto结合细胞表面GRP78的能力，发明人测试了在无细胞体系中来自一群体细胞的GRP78是否结合从单独一群细胞分离的成熟Cripto。293T细胞以载体
或Cripto-Flag感染，然后经受抗Flag免疫沉淀，接着彻底洗涤珠。与之相平行，以GRP78
感染的单独一群293T细胞经受细胞表面生物素化作用并且来自这些细胞的裂解物与珠孵
育，珠先前已经与载体或Cripto-Flag裂解物孵育。然后再次洗涤珠并且所结合的蛋白质
用Flag肽洗脱并经受使用抗生物素蛋白-HRP、抗GRP78或抗Cripto抗体的Western印迹。
如图2B中所示，Flag肽特异性洗脱Cripto-Flag和大部分的结合GRP78。此外，生物素化
(即细胞表面标记的)GRP78特异性地从先前接触Cripto-Flag裂解物的珠上洗脱，而未从
接触载体裂解物的珠中洗脱。这些结果表明，来自细胞表面的GRP78和Cripto之间的相互
作用在体外以不依赖于细胞或膜成分的方式发生。此外，由于生物素化GRP78和Cripto源
自分开的细胞群体，它们的相互作用不依赖于在翻译机器ER中的先前结合或GRP78的任何
蛋白伴侣功能。

[0317] Cripto拥有两个介导蛋白质-蛋白质相互作用的模块结构域、EGF样结构域和半胱氨酸丰富CFC结构域(Strizzi等，2005)。为了进一步探究Cripto和GRP78之间的相互
作用，发明人使用上面描述的方法(图2B)细胞表面上的标记GRP78是否结合缺乏EGF样结
构域(EGF)或CFC结构域(CFC)的Cripto突变体。在该实验中，发明人评价了来自一个细
胞群体的生物素化、HA标记GRP78结合来自分开的细胞群体的野生型和突变体形式Cripto
的能力。如在图2C中所示，细胞表面GRP78以相似程度结合野生型Cripto和Cripto EGF
突变体，但是不结合Cripto CFC突变体。因此，该结果表明，细胞表面来源的GRP78结合
Cripto的CFC结构域。

[0318] 在证明过表达的Cripto和GRP78在细胞表面上以依赖于Cripto的CFC结构域的特异方式结合之后，发明人接着测试了这两种蛋白质是否在内源环境下结合。据报导，
胚胎癌细胞系表达高水平的Cripto蛋白质并且发明人测试了小鼠胚胎癌P19细胞中内源
Cripto和内源GRP78是否相互作用。发明人以如上所述的膜不渗透性生物素处理这些细胞
并将裂解物用抗Cripto抗体或者作为阴性对照的兔IgG进行免疫沉淀。发明人使用以空
载体或Cripto-Flag感染的293T细胞作为免疫沉淀的阳性对照。如图2D中所示，对P19
细胞用抗Cripto进行免疫沉淀，接着使用抗GRP78进行Western印迹检测到对应于GRP78
的条带，而以非免疫IgG进行的沉淀没能得到这样的结果。此外，所沉淀的Cripto和GRP78
蛋白质是生物素化的，如通过用抗生物素蛋白-HRP检测到它们所证明，这表明它们来自于
细胞表面。使用过表达Cripto-Flag的293T细胞得到相似的结果，但是使用空载体细胞没
能得到相似的结果(图2D，右组)，这验证了抗Cripto抗体的特异性。因此，内源Cripto
和内源GRP78在小鼠胚胎癌P19细胞的细胞表面上特异性相互作用并且它们的相互作用不
需要任一蛋白质的过表达。

[0319] Cripto和GRP78在细胞表面上共定位.这些蛋白质的细胞定位通过免疫荧光和共焦显微镜评价。起初，以空载体感染或者以Cripto和GRP78共感染的293T细胞以抗Cripto
和抗GRP78抗体染色。在这些研究中，载体细胞表现出最小限度的、背景水平的Cripto染
色并且弱的GRP78染色源自内源蛋白质的存在。与此相比，过表达Cripto和GRP78的293T
细胞得到在细胞表面上显著共定位的两种蛋白质的显著的斑点染色。虽然斑点状结构的意
义仍未确定，该结果明显证明了在过表达的Cripto和GRP78在完整293T细胞质膜上的结
合。

[0320] 接着，发明人测试了当在P19细胞中以内源水平表达时，Cripto和GRP78是否同样在细胞表面上结合。在此，在天然P19细胞中容易地检测到Cripto和GRP78两者。使用用
作质膜标志物的抗总钙黏着蛋白抗体也将这些细胞染色。总体上，对于Cripto和GRP78的
染色看起来主要在天然的斑点/囊泡中，其部分地但基本上共定位。重要的是，包含Cripto和GRP78两者的数个斑点状结构表现出与将它们置于这些细胞质膜上的总钙黏着蛋白重
叠染色。Cripto和GRP78两者在膜上和囊泡结构中的共定位表明它们不仅在质膜上结合而
且在通常与细胞表面信号蛋白相关的内体/溶酶体运输和循环过程中结合。

[0321] Cripto相关的GRP78是使用shRNA靶向.在证明了Cripto和GRP78在细胞表面上结合共因子之后，发明人接着确定GRP78是否调节已知的Cripto功能。为此目的，发明
人开发了能够减少内源GRP78表达的短发夹RNA(shRNA)。GRP78被毒胡萝卜内酯诱导，这
是增加胞质钙水平、引起ER应激和触发凋亡的化合物。在毒胡萝卜内酯处理之后，对GRP78的诱导减轻ER应激和延缓细胞的凋亡反应(Jamora等，1996)。因此，发明人最初测试了靶
向GRP78的shRNA(G1)阻止毒胡萝卜内酯处理后GRP78诱导和功能的能力。如通过使用抗
GRP78抗体的Western印迹所显示，毒胡萝卜内酯明显诱导HeLa细胞中的GRP78表达并且
该诱导被G1shRNA阻断(图3A)。此外，如图3B中所示，与载体细胞相比，G1感染的HeLa
细胞显示出毒胡萝卜内酯诱导凋亡的显著增加，证明通过该shRNA敲低GRP78的功能后果。

[0322] 发明人接着致力于检查G1shRNA是否相似性地靶向与Cripto结合的细胞表面GRP78库。以空载体或G1shRNA感染的HeLa细胞随后以Cripto-Flag感染。然后将这些细
胞进行细胞表面生物素化，接着进行抗Flag免疫沉淀和使用Flag肽进行特异性洗脱，如先
前所述。所洗脱的蛋白质随后通过使用抗生物素蛋白-HRP、抗GRP78或抗Cripto抗体的
Western印迹分析。如在图3C中所示，在G1shRNA构建体存在下，与Cripto免疫共沉淀的
细胞表面生物素化GRP78的量相当大地减少。重要的是，这些结果表明G1shRNA可破坏细
胞表面上GRP78-Cripto复合体的功能。

[0323] 靶向减少GRP78表达增强TGF-β依赖性Smad2磷酸化.发明人先前已经证明，使用shRNA敲低HeLa细胞中的内源Cripto引起TGF-β诱导的Smad2磷酸化的增加(Gray
等，2006)。在此，发明人已经显示GRP78和Cripto在细胞表面上相互作用，增加Cripto和
GRP78一致工作以抑制TGF-β信号的可能性。在证明了G1shRNA有效靶向Cripto结合的
质膜上GRP78库之后，发明人接着测试了它是否类似于Cripto shRNA增强TGF-β信号。再
次地，在5μM毒胡萝卜内酯缺乏(图4A)或存在(图4B)存在下测试以空载体或G1感染的
相同HeLa细胞。在每一情况下，细胞以一定范围剂量的TGF-β1处理细胞并且监测所得到
的磷酸化Smad2和总Smad2水平。如在图4A中所示，在较低剂量下(例如1pM TGF-β1)，
与载体感染的细胞相比，G1shRNA细胞对TGF-β具有更大的响应性。在毒胡萝卜内酯处理
后，TGF-β剂量响应关系基本上向右移(图4B)。再次地，以G1感染的细胞对TGF-β具有
更大的敏感性，在10pM TGF-β1时检测到显著的磷酸化Smad2条带。有趣的是，G1shRNA对
敏化细胞对TGF-β的效应在毒胡萝卜内酯存在下比在其缺乏下意义更深远。这表明，毒胡
萝卜内酯对细胞表面GRP78的诱导引起TGF-β信号的抑制，这可被G1shRNA构建体阻断。

[0324] 为了测试毒胡萝卜内酯是否诱导被G1靶向的细胞表面GRP78，以载体或G1感染的相同的HeLa细胞以媒介物或毒胡萝卜内酯处理，然后经历细胞表面生物素化作用。为了
使生物素化GRP78可见，将细胞裂解物以抗GRP78抗体进行免疫沉淀，接着用抗生物素蛋
白-HRP进行Western印迹。如在图4C中所示，毒胡萝卜内酯处理诱导细胞表面上的GRP78
并且该诱导被G1shRNA构建体阻断。最后，作为另外的对照，发明人测试了GRP78敲低或诱
导是否导致I型和/或II型TGF-β信号受体水平的改变。如图4D中所示，G1shRNA存在
和毒胡萝卜内酯处理均不明显影响受体水平，一个例外是在毒胡萝卜内酯缺乏时，载体细
胞中TβRI水平稍微高于G1细胞中。然而，由于G1细胞中磷酸化Smad2水平高于载体细
胞中(图4A)，所以该差异与TGF-β信号无关。因此，GRP78似乎不会通过改变这些受体的
水平而影响TGF-β信号。总之，这些资料第一次表明，与内源Cripto相似，内源GRP78抑
制TGF-β信号。此外，这些发现与细胞表面GRP78-Cripto复合体在阻断TGF-β信号中的
新作用相一致。

[0325] GRP78不直接结合TGF-β信号受体.GRP78抑制TGF-β信号的发现增加了其通过直接结合I型和/或II型TGF-β信号受体而发挥此作用的可能性。发明人在上面已经
显示，内源细胞表面GRP78与293T细胞中过表达的Cripto和P19细胞中内源Cripto均
免疫共沉淀。在此，发明人还测试了GRP78是否相似性地与TβRI和TβRII免疫共沉淀。
293T细胞以p26-Flag、Cripto-Flag、TβRI-HA或TβRII-His转染并且表面蛋白质如前那
样被生物素化。这些蛋白质中的每一个作为诱饵被免疫沉淀，然后评价免疫复合体是否存
在GRP78。如在图5中所示，抗生物素蛋白-HRP组反映出这样的事实，即相似量的这些不
同的细胞表面诱饵蛋白质在这些pull down实验中被沉淀。然而，仅Cripto pull down的
内源GRP78被抗生物素蛋白-HRP和抗GRP78抗体均检测到(图5)。因此，在这些条件下，
细胞表面GRP78不结合TβRI或TβRII，而是表现出专一性地与Cripto结合。该结果表
明，GRP78通过其与任一信号受体的直接的、不依赖性的结合对TGF-β信号的效应不可能
发生。

[0326] Cripto和GRP78协同抑制TGF-β信号.已经显示TGF-β抑制人前列腺癌PC3细胞的贴壁依赖性和贴壁不依赖性生长(Wilding等，1989)。因此，发明人测试了Cripto和
GRP78是否一起工作改变这些细胞中的TGF-β效应。首先，发明人测试了Cripto和GRP78
对TGF-β依赖性Smad2磷酸化的效应。如图6A中所示，以10pM TGF-β1处理载体感染的
细胞引起Smad2磷酸化并且当GRP78或Cripto分别过表达时该效应被适当减弱。然而，当
细胞以Cripto和GRP78两者感染时，TGF-β效应以大得多的程度被抑制。然后定量在图
6A中出现的磷酸化Smad2条带的强度并针对响应的总Smad2水平进行标准化(图6B)。该
定量显示，在表达GRP78或Cripto的细胞中，TGF-β信号分别被抑制～40％和～43％。与
之相比，共表达GRP78和Cripto的细胞显示TGF-β-诱导的Smad2磷酸化减少～74％。接
着，发明人测试了Cripto和/或GRP78的过表达是否影响这些细胞中的TGF-β信号受体
的水平。如在图6C中所示，这些受体的水平没有被明显地改变(图6C)。这些资料加在一
起进一步支持GRP78作为TGF-β拮抗剂的新作用并且表明Cripto和GRP78协同起作用抑
制TGF-β信号。

[0327] 接着，发明人测量了10pM TGF-β1缺乏或存在下所感染PC3细胞群体的相对增殖率。如图6D中所示，用TGF-β1处理载体感染细胞降低增殖～58％，而对单独表达GRP78
或Cripto的处理分别降低增殖～42％和～19％。再次，当GRP78和Cripto在这些细胞中
一起表达时，它们具有更强的效应。有趣的是，在该情况下，TGF-β1处理实际上引起细胞增殖～31％(图6C)。重要的是，在此给出的数据证明，虽然GRP78和Cripto每一个减弱
TGF-β的抗增殖效应，但是它们的共表达允许它们的物理性相互作用从而产生使TGF-β
增强细胞生长的情况。

[0328] GRP78和Cripto协同阻断TGF-β的抗增殖效应.最后，发明人测试了在TGF-β1存在或缺乏下GRP78和Cripto对贴壁不依赖性生长的效应。将以空载体、GRP78、Cripto
或两者感染的相同的PC3细胞接种于存在增加剂量TGF-β1的软琼脂中并且允许集落生
长15天。如图7A中所示，TGF-β1以剂量依赖性方式抑制集落形成。为了突出TGF-β对
每一细胞群体的相对效应，同一数据还表示为针对在TGF-β1缺乏下的集落数量标准化的
在TGF-β1存在下的集落数量(图7B)。从这些资料中可以得出两个主要结论。首先，在
缺乏TGF-β处理情况下，表达GRP78或Cripto任一的细胞比载体细胞形成更多的集落并
且这这种增加在表达GRP78和Cripto两者的细胞极大地增强(图7A)。第二，当GRP78和
Cripto每一个具有单独阻断TGF-β的生长抑制性效果的一些能力时，则当它们一起表达
时具有大得多的能力(表7B)。共表达GRP78和Cripto减弱TGF-β的生长抑制性效应的
程度通过这些集落的照片进一步得到例证。如图7C中所示，100pM TGF-β1足以急剧降低
载体感染细胞的集落形成并且对单独表达Cripto或GRP78的细胞具有相似但更弱的抑制
效应。与之相反，表达GRP78和Cripto两者的细胞似乎是更加抗拒TGF-β的细胞抑制性
效应，如通过集落数量和大小所例证。再次，这些资料支持GRP78和Cripto在阻断TGF-β
对贴壁不依赖性生长的抑制中的协同作用。

[0329] 图7D描述GRP78和Cripto作为细胞表面结合配偶体起作用限制TGF-β依赖性生长抑制和促进细胞增殖的模式。数据表明，Cripto和GRP78以协同方式开展这些功能，推测是作为复合体，因为它们物理性相互作用并且因为它们的效应被协同增强。然而，资料没有完全排除这些蛋白质可部分地抑制TGF-β信号和它们自身引起增强的增殖的可能性。最
后，TGF-β除了具有活化细胞抑制性信号的能力之外，还报导在某些条件下TGF-β自身活
化存活途径。这与TGF-β仅在PC3细胞共表达Cripto和GRP78两者时引起PC3细胞增殖
增强的观察一致(图7D，虚线箭头)。

[0330] 实施例3

[0331] 细胞表面GRP78通过激活蛋白/Nodal/TGF-β和MAPK/PI3K途径介导干细胞和肿瘤细胞中的Cripto信号

[0332] Cripto和GRP78协同调节激活蛋白/Nodal/TGF-β信号

[0333] Cripto和GRP78每一个在胚胎发育过程中起着至关重要的作用并且两种蛋白质还促进肿瘤细胞增殖、存活和转移。上面将细胞表面GRP78鉴定为Cripto结合配偶体表明，这些蛋白质在正常胚胎发育和肿瘤进展中协同起作用。上面的实例显示Cripto和GRP78在
P19细胞中形成细胞表面复合体(Shani等，2008)。在此，发明人已经测试了对于Cripto对
NCCIT细胞中激活蛋白/Nodal/TGF-β信号的调节是否需要Cripto和GRP78之间的相互作
用。产生了感染有空载体或者稳定表达靶向Cripto和/或GRP78的shRNA的NCCIT种群。
这些shRNA相当大地降低NCCIT细胞中Cripto和GRP78蛋白质的水平，如通过Western印
迹(图8A)或测定细胞表面上蛋白质水平的完整细胞表面ELISA(图8B)所测定。重要的
是，敲低Cripto不影响细胞表面的GRP78水平并且反之亦然(图8B)。

[0334] 发明人使用这些细胞测试了敲低Cripto和/或GRP78是否会影响这些细胞中的激活蛋白-A-和Nodal-诱导的Smad2磷酸化。如在图1C中所示，激活蛋白-A-诱导的Smad2
磷酸化被敲低Cripto增强。这与Cripto抑制激活蛋白-A信号先前的证明(Gray等，2003；
Kelber等，2008)一致并且首次证明内源Cripto作为激活蛋白拮抗剂起作用。有趣的是，
在GRP78敲低细胞中和Cripto和GRP78均被敲低的细胞中，激活蛋白-A-依赖的Smad2磷
酸化被相似性地增强，这与这两种蛋白质在调节激活蛋白-A信号中的作用一致。与针对
激活蛋白-A所观察到的结果相反，敲低Cripto急剧降低Nodal-诱导的Smad2磷酸化而
敲低GRP78适度降低Nodal信号(图8D)。将Cripto和GRP78一起敲低导致Nodal-诱导
的Smad2磷酸化少于单独敲低Cripto所引起的磷酸化(图8D)。这些结果加在一起表明，
GRP78促进内源Cripto对激活蛋白-A和Nodal信号的相反效应。

[0335] 接着，发明人使用相同的细胞测试敲低Cripto和/或GRP78是否影响激活蛋白/Nodal/TGF-β对Smad2响应性萤光素酶报告分子构建体的诱导。如图8E中所示，以激活蛋
白-A、激活蛋白-B、TGF-β1或Nodal处理空载体感染的NCCIT细胞引起相似的低水平萤
光素酶诱导。敲低Cripto引起激活蛋白-A、激活蛋白-B和TGF-β1信号的增强和Nodal
信号的减弱。在稳定表达GRP78shRNA的细胞中观察到相似结果，这与GRP78在对由这些配
体引起的信号的Cripto依赖性调节中的作用相一致。与之相反，敲低Cripto和GRP78两
者引起急剧增加对激活蛋白-A、激活蛋白-B和TGF-β1的响应以及可检测的Nodal信号的
丧失(图8E)。发明人还使用相同的Smad2-依赖性萤光素酶报告分子进一步探究了293T
细胞中Cripto依赖性Nodal信号中对GRP78的需求。如图8F中所示，Cripto过表达促进
了这些细胞中的Nodal信号并且该信号在过表达的GRP78存在下被增强。此外，如图8G中
所示，当内源GRP78被敲低时，这些细胞中的Cripto-依赖性Nodal信号被减弱。这些结果
与上面的Smad2磷酸化资料一起强有力地支持了Cripto和GRP78在调节激活蛋白/Nodal/
TGF-β信号中的共同作用。

[0336] GRP78与Cripto共定位并且介导人ES细胞中的Cripto信号.

[0337] Cripto表达于人胚胎干细胞中(hES)，在其中已经显示Cripto在调节增殖、分化和多能性中具有关键性的作用。在此，发明人已经测试GRP78是否与Cripto共定位并调节
hES细胞中的Cripto功能。如图9A中所示，GRP78和Cripto均表达于H9hES细胞表面上，
如通过细胞表面ELISA所测量。发明人将H9细胞用Cripto和GRP78抗体进行免疫染色以
测试这些蛋白质是否在质膜上共定位并且，如图9B中所使，Cripto和GRP78每一个表现出
在细胞边缘附近的斑点状染色。重要的是，对这些蛋白质的染色显示出高程度的重叠，表明它们在细胞表面上共定位(图9B)。接着，发明人测试了抗GRP78抗体是否会阻断对激活蛋
白-A和Nodal信号的Cripto依赖性效应。该抗体(N-20，Santa Cruz)结合H9细胞中的
细胞表面GRP78(图9A)并且已经报导阻断GRP78受体功能(Davidson等，2005；Philippova
等，2008)。如图9C中所示，以N-20抗体处理H9细胞增加激活蛋白-A-诱导的Smad2磷酸
化和降低Nodal-诱导的Smad2磷酸化，表明其阻断Cripto影响由这些配体引起信号的能
力。与此相一致，以N-20抗体处理空载体感染的NCCIT细胞增强激活蛋白-A、激活蛋白-B
和TGF-β1信号并且降低Nodal信号(图9D)，而抗体处理Cripto敲低的细胞对这些配体
的信号无影响(图9E)。这些结果加在一起表明，细胞表面GRP78介导hES细胞中的Cripto
信号，并且与GRP78敲低相类似，以N-20抗体靶向GRP78阻断激活蛋白/Nodal/TGF-β信
号的Cripto依赖性调节。

[0338] 这些结果增加了Cripto和N-20抗体竞争性结合GRP78的可能性。由于N-20抗体靶向GRP78的前50个氨基酸内的表位，发明人产生了缺乏该区的GRP78突变体
(Δ19-68GRP78)并且测试了其结合Cripto的能力。图9F图解显示N-20表位的位置以及
缺失它的Δ19-68GRP78突变体。当使用N-20或HA抗体对过表达这些蛋白质的293T细
胞的裂解物进行Western印迹时，N-20抗体检测到野生型的GRP78，但是没有检测到N-20
表位缺失的Δ19-68GRP78突变体(图9F)。重要的是，如图9G中所示，虽然野生型GRP78
与Cripto免疫共沉淀，但是Δ19-68GRP78突变体不足以证明N-20抗体和Cripto共享对
GRP78的结合位点并表明它们竞争对GRP78的结合。

[0339] 靶向GRP78受体功能阻断NCCIT细胞中Cripto-依赖性MAPK/PI3K信号和有丝分裂发生

[0340] 接着，发明人测试了细胞表面GRP78是否介导可溶性Cripto-依赖性活化MAPK/PI3K途径。首先，发明人测试了敲低Cripto和/或GRP78对NCCIT细胞中Akt、GSK3β和
ERK1/2的可溶性Cripto依赖的磷酸化的影响。如10A中所示，空载体感染的细胞具有高的
基础磷酸化Akt水平，其不受可溶性Cripto剂量增加影响。与之相反，在表达Cripto shRNA的细胞中基础磷酸化Akt水平检测不到，并且可溶性Cripto处理以剂量依赖方式增加这些
细胞中的Akt磷酸化(图10A)。与之相反，当GRP78被敲低并且特别是当Cripto和GRP78
一起被敲低时，可溶性Cripto依赖的Akt磷酸化被阻断。可溶性Cripto依赖的GSK3β磷
酸化遵照对于Akt磷酸化所观察到的相同的方式，并且还可通过敲低GRP78急剧降低(图
10A)。最后，Cripto诱导的Akt和GSK3β的磷酸化被LY 2940002阻断并且因此依赖于
PI3K的活化(图10A)。

[0341] 发明人进一步测试了敲低Cripto和/或GRP78对可溶性Cripto依赖的ERK1/2磷酸化的影响。如图10B中所示，磷酸化ERK1/2的基础水平在空载体感染的NCCIT细胞中相
对高并且可溶性Cripto处理不增加这些细胞中的ERK磷酸化。与之相反，磷酸化的ERK1/2
在未处理的Cripto shRNA细胞中检测不到，但是以可溶性Cripto处理这些细胞引起显著
的ERK2(p42)磷酸化。这与表明可溶性Cripto触发ERK2磷酸化的先前结果(Kannan等，
1997)一致。与CriptoshRNA细胞相似，基础的磷酸化ERK水平在敲低GRP78的细胞中以及
在敲低Cripto和GRP78两者的细胞中低或检测不到(图10B)。然而，以Cripto处理这些
细胞不能够刺激ERK磷酸化，表明对于MAPK途径的Cripto依赖性活化和ERK2磷酸化需要
GRP78。这些结果与对于可溶性Cripto依赖性的Akt和GSK3β磷酸化所观察的结果相似，
表明GRP78在介导可溶性Cripto依赖性的PI3K和MAPK途径活化中起着相似的作用。

[0342] Cripto肿瘤生长因子活性与增加的细胞增殖(Strizzi等，2005)有关并且发明人测试了可溶性Cripto是否以GRP78依赖性方式促进NCCIT细胞的增殖。如在图10C中所
示，空载体感染的NCCIT细胞具有高的基础增殖率，其不被可溶性Cripto处理所影响。与
此相反，敲低Cripto，不管是单独敲低还是与敲低GRP78相组合相当大地降低NCCIT细胞
的增殖率。重要的是，可溶性Cripto处理相当大地增强Cripto敲低细胞的增殖，但是对
Cripto和GRP78均被敲低的细胞没有影响。该结果表明，与Cripto诱导的MAPK和PI3K信
号相似，Cripto的促增殖效应是GRP78依赖性的。

[0343] 发明人使用N-20抗体直接评价细胞表面GRP78在介导Cripto生长因子活性中的作用。最初，发明人测试了该抗体与可溶性Cripto竞争与稳定表达CriptoshRNA的NCCIT
125
细胞结合的能力。如图10D中所示， I-Cripto特异性地结合至这些细胞并且以剂量依赖
性方式被N-20抗体取代，而不被对照IgG取代。这些资料与在图9G中所呈现的结果一起
表明Cripto和N-20抗体直接竞争对GRP78上同一N-末端部位的结合。发明人继续测试
N-20抗体阻断表达CriptoshRNA的NCCIT细胞中Cripto依赖性Akt磷酸化的能力。如图
10E中所示，在这些细胞中可溶性Cripto依赖性Akt磷酸化几乎完全被N-20抗体阻断。发
明人进一步探究了Cripto敲低细胞的Cripto依赖性增殖是否可用N-20抗体阻断。的确，
如在图10F中所示，N-20抗体这些细胞的基础增殖率并且其惊人地完全阻断可溶性Cripto
处理的促增殖效应。这些数据一起表明，对于NCCIT细胞中可溶性Cripto依赖性MAPK/PI3K
信号和促有丝分裂效应需要Cripto与细胞表面GRP78的结合。

[0344] 细胞表面GRP78介导乳腺上皮细胞中Cripto肿瘤生长因子活性

[0345] Cripto在～80％的人乳腺癌中过表达并且促进乳腺上皮细胞中的肿瘤表型(Strizzi等，2005)。在此，发明人还测试了GRP78在介导缺乏内源Cripto表达的人乳腺上
皮细胞系MCF10A细胞中致癌的Cripto信号中的作用。为了开展这些研究，发明人产生了稳
定感染有空载体或Cripto的MCF10A细胞克隆。如图11A中所示，GRP78表达于空载体感染
125
的MCF10A细胞的表面上，如通过细胞表面ELISA所测量。此外，如图11B中所示， I-Cripto特异性地结合空载体感染的MCF10A细胞并且以剂量依赖方式被N-20抗体取代。可溶性
Cripto依赖的ERK/MAPK和PI3K/Akt途径的活化需要c-Src的上游活化(Bianco等，2003)
并且发明人测试了N-20抗体是否阻断Cripto依赖性的c-Src活化。如在图11C中所示，
可溶性Cripto引起载体感染的MCF10A细胞中c-Src的Y416磷酸化并且这可通过将细胞
与N-20抗体预孵育而被阻断。用可溶性Cripto对这些细胞的处理也引起Akt磷酸化(图
11D)。这些资料一起表明，Cripto与MCF10A细胞上的细胞表面GRP78的结合对于其活化
c-Src/MAPK/PI3K途径的能力是必需的。

[0346] 接着，发明人测试了Cripto促进MCF10A细胞中肿瘤表型的能力是否依赖于其结合细胞表面GRP78的能力。如在上面所提到，Cripto在载体感染的MCF10A细胞中的表达
水平检测不到，但是在Cripto感染的细胞中高表达(图11E)。如在图11F中所示，Cripto
在MCF10A细胞中过表达引起细胞增殖的急剧增加，这可通过用N-20GRP78抗体处理被相当
大地抑制。此外，如图11G中所示，用可溶性Cripto处理空载体感染的MCF10A细胞以通过
用N-20GRP78抗体共处理而被完全阻断的方式增加它们的增殖。这些资料表明，Cripto对
MCF10A细胞的促增殖性效应需要Cripto与细胞表面GRP78的结合。

[0347] Cripto过表达引起乳腺上皮细胞的迁移和侵袭并且促进EMT(Strizzi等，2004)。E-钙黏着蛋白表达的丧失是EMT的标志并且发明人已经测试了细胞表面GRP78是否介导人
乳腺上皮MCF10A细胞中E-钙黏着蛋白的Cripto依赖性下调。如图11H中所示，在用可溶
性Cripto处理空载体感染的MCF10A细胞后E-钙黏着蛋白表达被降低，并且在表达Cripto
的细胞中年检测不到。然而，用N-20GRP78抗体处理逆转载体细胞中年可溶性Cripto对
E-钙黏着蛋白水平的影响并且极大地挽救Cripto过表达细胞中的E-钙黏着蛋白表达(图
11H)。重要的是，Cripto过表达细胞中，E-钙黏着蛋白表达被N-20GRP78抗体的挽救几乎
完全被可溶性Cripto阻断，表明Cripto和N-20抗体功能性竞争对细胞表面GRP78的结合。
E-钙黏着蛋白介导上皮细胞中的细胞-细胞粘附并且其丧失与侵袭、转移癌有关。因此，发明人测量了稳定感染有空载体或Cripto的MCF10A细胞中的细胞粘附并且测试了N-20抗
体的效应。如图11I中所示，与载体细胞相比，Cripto过表达细胞中细胞粘附降低～50％，这与Cripto引起E-钙黏着蛋白下调的能力一致。虽然N-20抗体对载体感染的细胞的粘
附没有影响，其完全阻断Cripto依赖性细胞粘附的降低，在该效应中涉及GRP78(图11I)。
这些结果一起表明，Cripto与细胞表面GRP78的结合介导Cripto的肿瘤生长因子活性，包
括其促进细胞增殖、降低E-钙黏着蛋白表达和降低细胞粘附的能力。

[0348] Cripto和GRP78之间的细胞表面相互作用介导激活蛋白和Nodal的促增殖效应

[0349] 发明人已经提供证据表明，细胞表面Cripto/GRP78复合体调节激活蛋白/Nodal/TGF-β信号，并且在此发明人已经测试了Cripto和GRP78如何协同影响激活蛋白-A-和
Nodal-诱导的对细胞增殖的效应。如图12A中所示，激活蛋白-A和Nodal两者均增加空载
体感染的NCCIT细胞的增殖。敲低Cripto和/或GRP78阻断这些配体的促增殖效应并且，
有趣的是，引起激活蛋白-A而不是Nodal抑制细胞增殖。发明人测试了N-20抗体是否会具
有与Cripto和/或GRP78敲低相似的效应。的确，如图12B中所示，激活蛋白-A和Nodal
的促增殖效应在N-20抗体存在下被阻断并且激活蛋白-A再次从具有促增殖效应转向具有
细胞抑制性效应。接着，发明人测试了Cripto和GRP78是否相似性地影响激活蛋白-A和
Nodal对MCF10A细胞的增殖效应。如图12C中所示，激活蛋白-A相当大地抑制稳定转染有
空载体的MCF10A细胞的增殖，而Nodal没有作用。过表达Cripto的MCF10A细胞与空载体
细胞相比具有增加的增殖率并且生长不再被激活蛋白-A抑制。而是激活蛋白-A和Nodal
每一个增强这些细胞的增殖(图12C)。如图12D中所示，Cripto过表达引起对激活蛋白-A
和Nodal的促增殖响应的能力被使用N-20抗体处理细胞完全阻断并且该处理还引起激活
蛋白-A抑制MCF10A细胞的增殖。因此，Cripto和GRP78之间的细胞表面相互作用将激活
蛋白-A和Nodal转变成促增殖的细胞因子并且颠倒了激活蛋白-A的细胞抑制性效应。

[0350] 缺乏Cripto结合的GRP78突变体抑制经由EGF受体和PI3K的Cripto信号

[0351] 发明人假设，细胞表面GRP78促进经由EGF受体的Cripto信号，并且测试了GRP78、ErbB4和ErbB2在介导Cripto依赖性活化PI3K中的作用。为了研究该假设，发明
人使用PI3K可抑制性报告基因构建体，构建体包括与萤光素酶基因偶联的葡萄糖-6-磷酸
酶启动子(G6Pase-Lux)。Cripto处理对该报告基因构建体在以ErbB2或ErbB4转染的细
胞中的活性具有很小的影响或者没有影响，但是降低以ErbB2和ErbB4共同转染的细胞中
萤光素酶表达～50％(图13A)。与此相反，在转染的GRP78存在下，Cripto引起以ErbB4
转染的细胞中萤光素酶表达减少～30％并且在以ErbB4和ErbB2两者转染的细胞中几乎完
全阻断萤光素酶表达(图13B)。该结果表明，GRP78促进ErbB2和ErbB4下游PI3K途径的
Cripto活化并且与证明细胞表面GRP78介导Cripto依赖性Akt/PI3K信号的先前资料一
致。Cripto和GRP78之间复合物的形成对于该效应似乎是必需的，因为缺乏Cripto结合的
GRP78 D19-68突变体不促进经由ErbB2和ErbB4的信号(图13C)。而是，在转染的ErbB2
和ErbB4存在下GRP78 D19-68突变体完全阻断Cripto信号(比较图13A和13C)。该结
果表明，GRP78 D19-68突变体以显性失活方式起作用以阻止内源GRP78促进Cripto响应，
并且意味着该GRP78突变体作为具有治疗潜能的Cripto拮抗剂的可能作用。最后，如所预
测，PI3K抑制剂LY294002引起基础萤光素酶水平增加(～2倍)并且完全阻断Cripto诱
导的萤光素酶水平的降低(图13A-C)。

[0352] 细胞表面GRP78介导Cripto信号

[0353] 总体上，资料支持这样的模式(图14)，其中细胞表面Cripto/GRP78复合体作为抑制肿瘤阻抑制因子功能和活化增殖/存活途径的生长控制节点起作用。在一方面，Cripto
和GRP78协同抑制响应激活蛋白和TGF-β的细胞抑制性Smad2/3信号并且引起这些配体
采用促增殖效应。Cripto与细胞表面GRP78的结合对于与肿瘤细胞可塑性和致瘤性相关连
的Cripto依赖性Nodal信号也是必需的。在另一方面，Cripto与细胞表面GRP78的结合
对于Cripto肿瘤生长因子活性包括引起Src、ERK和Akt磷酸化以及促进殖、EMT和迁移的
能力是必需的。该模式突出了Cripto/GRP78复合体在促进肿瘤表型和靶向Cripto与细胞
表面GRP78之间相互作用的潜在治疗益处中的双重作用。该模式还表明了发明人的理解，
即Cripto与细胞表面GRP78的结合对于随后Cripto与ErbB2/ErbB4或激活蛋白/Nodal/
TGF-β/受体复合体的相互作用是必需的(图14A)。资料表明，Cripto/GRP78结合发生于
这些Cripto信号的每一“枝”的上游，并且因此破坏Cripto/GRP78复合物形成的试剂将抑
制致癌性Cripto对Smad2/3和MAPK/PI3K信号两者的效用(图14B)。

[0354] ***

[0355] 本文所公开并要求专利保护的所有组合物和方法可以根据本公开无需过度实验的情况下建立和实施。虽然本发明的组合物和方法已经以优选实施方案的方式描述，本领
域技术人员显而易见的是，可以对本文所述组合物和方法以及方法步骤或方法步骤的顺序
进行改变，而不脱离本发明的概念、精神和范围。更加具体而言，显而易见的是，化学或生理相关的某些试剂可以取代本文所述的试剂，并将得到相同或相似的结果。所有此类对本领
域技术人员而言显而易见的相似取代和修改认为处于如后附权利要求书所定义的本发明
的精神、范围和概念内。

[0356] 参考文献

[0357] 下列参考文献，以它们提供补充本文所述过程或其它细节的例证性过程或其它细节的程度明确地通过参考并入本文。

[0358] 美国专利3,817,837

[0359] 美国专利3,850,752

[0360] 美国专利3,939,350

[0361] 美国专利3,996,345

[0362] 美国专利4,196,265

[0363] 美国专利4,275,149

[0364] 美国专利4,277,437

[0365] 美国专利4,366,241

[0366] 美国专利4,472,509

[0367] 美国专利4,659,774

[0368] 美国专利4,664,911

[0369] 美国专利4,682,195

[0370] 美国专利4,683,202

[0371] 美国专利4,792,447

[0372] 美国专利4,816,571

[0373] 美国专利4,870,287

[0374] 美国专利4,938,948

[0375] 美国专利4,959,463

[0376] 美国专利5,021,236

[0377] 美国专利5,045,451

[0378] 美国专利5,141,813

[0379] 美国专利5,196,066

[0380] 美国专利5,206,347

[0381] 美国专利5,214,136

[0382] 美国专利5,223,618

[0383] 美国专利5,264,566

[0384] 美国专利5,378,825

[0385] 美国专利5,428,148

[0386] 美国专利5,446,137

[0387] 美国专利5,466,786

[0388] 美国专利5,470,967

[0389] 美国专利5,539,082

[0390] 美国专利5,539,082

[0391] 美国专利5,554,744

[0392] 美国专利5,574,146

[0393] 美国专利5,578,706

[0394] 美国专利5,602,240

[0395] 美国专利5,602,244

[0396] 美国专利5,610,289

[0397] 美国专利5,614,617

[0398] 美国专利5,623,070

[0399] 美国专利5,645,897

[0400] 美国专利5,652,099

[0401] 美国专利5,670,663

[0402] 美国专利5,672,697

[0403] 美国专利5,681,947

[0404] 美国专利5,686,072

[0405] 美国专利5,705,629

[0406] 美国专利5,708,154

[0407] 美国专利5,714,331

[0408] 美国专利5,714,606

[0409] 美国专利5,719,262

[0410] 美国专利5,736,336

[0411] 美国专利5,756,291

[0412] 美国专利5,760,395

[0413] 美国专利5,763,167

[0414] 美国专利5,766,855

[0415] 美国专利5,767,072

[0416] 美国专利5,773,571

[0417] 美国专利5,777,092

[0418] 美国专利5,786,461

[0419] 美国专利5,792,847

[0420] 美国专利5,858,988

[0421] 美国专利5,859,221

[0422] 美国专利5,872,232

[0423] 美国专利5,886,165

[0424] 美国专利5,891,625

[0425] 美国专利5,908,845

[0426] 美国专利6,180,348

[0427] 美国专利6,423,493

[0428] 美国专利6,506,559

[0429] 美国专利6,515,120

[0430] 美国专利6,573,099

[0431] 美国专利7,329,742

[0432] 美国专利Serial 117,363

[0433] 美国专利申请2002/0168707

[0434] 美国专利申请2003/0051263

[0435] 美国专利申请2003/0055020

[0436] 美国专利申请2003/0159161

[0437] 美国专利申请2004/0064842

[0438] 美国专利申请2004/0265839

[0439] Adewumi等，Nat.Biotechnol.，25：803-816，2007.

[0440] Adkins等，J.Clin.Invest.，112：575-87，2003.

[0441] Arap等，Cancer Cell，6：275-84，2004.

[0442] Atwell等，Mol.Immunol.，33(17-18)：1301-1312，1996.

[0443] Bernales等，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.，22：487-508，2006.

[0444] Bianco等，Cancer Res.，63：1192-1197，2003.

[0445] Bianco等，J.Biol.Chem.，274：8624-9，1999.

[0446] Bianco等，J.Cell Physiol.，190：74-82，2002b.

[0447] Bianco等，Mol.Cell Biol.，22：2586-2597，2002a.

[0448] Chen等，Breast Cancer Res.Treat.，59：81-90，2000.

[0449] Chen等，Development，133：319-329，2006.

[0450] Cheng等，Genes Dev.，17：31-36，2003.

[0451] Cox等，Comb.Chem.High Throughput Screen，5(4)：289-99，2002.

[0452] Culver等，Science，256(5063)：1550-1552，1992.

[0453] Davidson等，Cancer Res.，65：4663-4672，2005.

[0454] De Santis等，Cell Growth Differ.，8：1257-1266，1997.

[0455] Delpino and Castelli，Biosci.Rep.，22：407-20，2002.

[0456] Delpino等，Mol.Membr.Biol.，15：21-6，1998.

[0457] Dhillon等，Oncogene，26：3279-3290，2007.

[0458] Ding等，Nature，395：702-707，1998.

[0459] Dong等，Cancer Res.，68：498-505，2008.

[0460] Dong等，Hum.Gene Ther.，15：553-561，2004.

[0461] Drolet等，Comb.Chem.High Throughput Screen，2(5)：271-278，1999.

[0462] Dutertre和Teillaud，J.Soc.Biol.，200(4)：377-386，2006.

[0463] Ebert等，Cancer Res.，59：4502-4505，1999.

[0464] Egholm等，Nature，365(6446)：566-568，1993.

[0465] Ellington和Szostak，Nature，346(6287)：818-822，1990.

[0466] Ellington和Szostak，Nature，355(6363)：850-852，1992.

[0467] EP 266,032

[0468] Froehler等，Nucleic Acids Res.，14(13)：5399-5407，1986.

[0469] Gazit等，Cancer Res.，59：3100-6，1999.

[0470] Gonzalez-Gronow等，Cancer Res.，66：11424-11431，2006.

[0471] Gray等，Mol.Cell Biol.，26：9268-9278，2006.

[0472] Gray等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100：5193-5198，2003.

[0473] Harrison等，J.Biol.Chem.，279：28036-44，2004.

[0474] Hendrix等，Nat.Rev.Cancer，7：246-255，2007.

[0475] Hudson et al，.J.Immunol.Methods，231(1-2)：177-89，1999.

[0476] Jakobsen等，Cancer Res.，67：9507-9517，2007.

[0477] Jamora等，Proc.Natl.Acad Sci.USA，93：7690-7694，1996.

[0478] Kannan等，J.Biol.Chem.，272：3330-3335，1997.

[0479] Kelber等，J.Biol.Chem.，283：4490-4500，2008.

[0480] Kinoshita等，Cell，83：621-630，1995.

[0481] Kortt等，Biomol.Eng.，18(3)：95-108，2001.

[0482] Lee，Cancer Res.，67：3496-3499，2007.

[0483] Lee，Cancer Res.，67：3496-9，2007.

[0484] Lee，Methods，35：373-81，2005.

[0485] Lee，Trends Biochem.Sci.，26：504-510，2001.

[0486] Li和Lee，Curr.Mol.Med.，6：45-54，2006.

[0487] Liu等，Mol.Pharm.，4(3)：435-47，2007.

[0488] Luo等，Mol.Cell Biol.，26：5688-5697，2006.

[0489] Mao等，J.Biol.Chem.，281：8877-8887，2006.

[0490] Minchiotti，Oncogene，24：5668-5675，2005.

[0491] Mintz等，Nat.Biotechnol.，21：57-63，2003.

[0492] Misra等，Cell Signal，16：929-938，2004.

[0493] Misra等，J.Biol.Chem.，277：42082-7，2002.

[0494] Misra等，J.Biol.Chem.，280：26278-86，2005.

[0495] Misra等，J.Biol.Chem.，281：13694-13707，2006.

[0496] Mitra和Schlaepfer，Curr.Opin.Cell Biol.，18：516-23，2006.

[0497] Miyoshi等，J.Virol.，72：8150-7，1998.

[0498] Pardali和Moustakas，Biochim.Biophys.Acta，1775：21-62，2007.

[0499] PCT申请PCT/EP/01219

[0500] PCT申请WO 92/20702

[0501] Philippova等，Mol.Cell Biol.，28(12)：4004-17，2008.

[0502] Plückthun等Immunotechnology，3(2)：83-105，1997.

[0503] Postovit等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，105：4329-4334，2008.

[0504] Reddy等.，J.Biol.Chem.，278：20915-20924，2003.

[0505] Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.，Mack Printing Company，1289-1329，1990.

[0506] Robinson等，Br J Cancer.99(9)：1415-25，2008.

[0507] Salomon，Nat.Med.，12：1231，2006.

[0508] Sambrook等，In：Molecular cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001.

[0509] Schier，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.，19：589-621，2003.

[0510] Shani等，Mol.Cell Biol.，28：666-677，2008.

[0511] Shaw和Cantley，Nature，441：424-430，2006.

[0512] Shen和Schier，Trends Genet.，16：303-309，2000.

[0513] Shen，Development，134：1023-1034，2007.

[0514] Shen，J.Clin.Invest.，112：500-502，2003.

[0515] Shin等，J.Biol.Chem.，278：7607-16，2003.

[0516] Shukla等，Mol.Cancer Res.，6：509-516，2008.

[0517] Siegel和Massague，Nat.Rev.Cancer，3：807-21，2003.

[0518] Singer等，Nat.Neurosci.，8：1343-9，2005.

[0519] Strizzi等，J.Cell Physiol.，201：266-276，2004.

[0520] Strizzi等，Oncogene，24：5731-5741，2005.

[0521] Sun等，Am.J.Pathol.，167：585-597，2005.

[0522] Takahashi等，Cell，126(4)：663-676，2006.

[0523] Takahashi等，Cell，126(4)：663-76，2007.

[0524] Todorovska等，J.Immunol.Methods，248(1-2)：47-66，2001.

[0525] Topczewska等，Nat.Med.，12：925-932，2006.

[0526] Triantafilou和Triantafilou，Virology，317：128-35，2003.

[0527] Triantafilou等，J.Virol.，76：633-43，2002.

[0528] Tuerk和Gold，Science，249(4968)：505-510，1990

[0529] Vaughan，Endocrinol.，132(5)：2038-50，1993.

[0530] Watanabe等，J.Biol.Chem.，282(43)：31643-55，2007.

[0531] Wechselberger等，Oncogene，24(25)：4094-105，2005..

[0532] Wilding等，Mol.Cell Endocrinol.，62：79-87，1989.

[0533] Xing等，Cancer Res.，64：4018-4023，2004.

[0534] Xu等，Dev.Biol.，196：237-247，1998.

[0535] Xu等，Development，126：483-494，1999.

[0536] Yeo和Whitman，Mol.Cell，7：949-57，2001.

[0537] Ylera等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，290(5)：1583，2002.

[0538] Yu等，Science，318：1917-1920，2007.

[0539] Mintz PJ等Nat Biotechnol 2003 21(1)57-63.

[0540] Kim Y等Biochemistry 45(31)9434-44.

[0541] Jakobsen CG等Cancer Res 2007 67(19)9507-17.

[0542] Gonzalez-Gronow M等Cancer Res 2006 66(23)11424-31.

标题	发布/更新时间	阅读量
嗅鞘细胞增殖试剂的连续给药方案	2020-05-13	797
白蛋白产生和细胞增殖	2020-05-11	854
细胞增殖袋及细胞增殖装置	2020-05-11	302
一种干细胞增殖促进剂	2020-05-12	740
成纤维细胞增殖剂	2020-05-12	686
一种抑制卵巢癌细胞增殖的方法	2020-05-12	321
多能干细胞增殖促进剂	2020-05-11	675
分析细胞增殖性病症的方法和核酸	2020-05-13	37
抑制EGFR导致的癌症中细胞增殖的方法	2020-05-13	646
细胞增殖检测盒	2020-05-11	430

用于抑制CRIPTO/GRP78复合物形成和信号的组合物和方法

用于抑制CRIPTO/GRP78复合物形成和信号的组合物和方

技术领域

背景技术

发明内容

具体实施方式

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：