双启动子级联调控基因表达载体及其构建方法与应用
阅读：434发布：2023-02-03
专利汇可以提供双启动子级联调控基因表达载体及其构建方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种双启动子级联调控基因表达载体及其构建方法与应用。所述双启动子级联调控基因表达载体携带有核酸构建体，所述核酸构建体包含两个具有级联调控关系的基因表达盒，表达盒I由诱导型启动子驱动，表达盒II由强启动子驱动；其中，所述诱导型启动子受特定物质诱导表达，其下游基因编码可调控所述强启动子表达的调控元件；所述强启动子的下游基因为目的基因。本发明双启动子级联调控模式的成功建立，不仅为提高基因工程菌对环境污染物的灵敏度提供一种新方法和新思路，同时，级联调控模式对于报告基因表达的高效放大作用也使得这种模式可应用于启动子的筛选分析或 蛋白质 的相互作用等研究中，为基因表达调控研究提供新的技术便利。，下面是双启动子级联调控基因表达载体及其构建方法与应用专利的具体信息内容。
1.一种核酸构建体，其特征在于，其包含两个具有级联调控关系的基因表达盒，分别为表达盒I、表达盒II；所述表达盒I由诱导型启动子驱动，所述表达盒II由强启动子驱动；
其中，所述诱导型启动子受特定物质诱导表达；
所述诱导型启动子的下游基因编码可增强或开启所述强启动子表达的调控元件；
所述强启动子的下游基因为目的基因。
2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述诱导型启动子的下游基因为T7 RNA聚合酶基因；所述强启动子为T7启动子，或者其他对调控元件具有高度专一性的、可以被调控元件开启表达的强启动子；
所述目的基因包括报告基因；优选地，所述报告基因选自荧光蛋白类基因、β-半乳糖苷酶基因或荧光素酶基因，更优选荧光蛋白类基因，最优选绿色荧光蛋白基因。
3.根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述诱导型启动子包括可由特定环境污染物调控的启动子，优选砷诱导型启动子、镉诱导型启动子或铅诱导型启动子。
4.根据权利要求3所述的核酸构建体，其特征在于，所述表达盒I包含砷诱导型启动子Pars和T7 RNA聚合酶基因，所述表达盒II包含T7启动子和荧光报告基因；
其中，所述砷诱导型启动子Pars的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5.含有权利要求1-4任一项所述核酸构建体的生物材料，所述生物材料包括重组DNA、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。
6.双启动子级联调控基因表达载体，其特征在于，所述表达载体携带有权利要求1-4任一项所述的核酸构建体；和/或
所述表达载体还包括抗性基因、复制子及T7溶菌酶基因；优选地，所述抗性基因选自氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因或氯霉素抗性基因，更优选氯霉素抗性基因；所述复制子选自pMB1复制子、CoE1复制子、pSC101复制子或p15A复制子，更优选p15A复制子；所述T7溶菌酶基因来自pLysS质粒或pLysE质粒，更优选pLysS质粒。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述核酸构建体的两个基因表达盒结构如下：
表达盒I：砷诱导型启动子Pars-T7 RNA聚合酶基因-rrnBT1T2终止子；
表达盒II：T7启动子-荧光报告基因-T7终止子。
8.权利要求7所述表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、As-T7R-BTT载体的构建
A1、设计并合成如SEQ ID NO:2所示的含有砷诱导型启动子Pars的DNA片段，将所述DNA片段构建到pUC57质粒的SacI和HindIII酶切位点之间，得到载体pUC-As；
A2、从含有rrnBT1T2终止子的载体上扩增得到rrnBT1T2终止子序列，将所述rrnBT1T2终止子序列构建到pUC-As的PstI和SphI酶切位点之间，得到载体As-BTT；
A3、从含有T7 RNA聚合酶基因的载体上扩增得到T7 RNA聚合酶基因序列，将所述T7 RNA聚合酶基因序列构建到As-BTT的NocI和PstI酶切位点之间，得到As-T7R-BTT载体；
B、pET-17b-sfGFP载体的构建
从含有绿色荧光蛋白sfGFP基因的载体上扩增得到绿色荧光蛋白sfGFP基因序列，将所述绿色荧光蛋白sfGFP基因序列构建到pET-17b质粒的NheI和EcoRI酶切位点之间，得到pET-17b-sfGFP载体；
C、As-T7R-sfGFP载体的构建
C1、以pLysS质粒为模板，利用引物F1和R1扩增得到p15A-T7 Lysozyme DNA片段；以As-T7R-BTT载体为模板，利用引物F2和R2扩增得到As-T7R-BTT DNA片段；将上述两个片段进行重组反应，得到质粒p15A-AS-T7R；
C2、以pET-17b-sfGFP为模板，利用引物F3和R3扩增得到T7-sfGFP DNA片段；用BglII和SacI双酶切p15A-AS-T7R，回收得到的大片段与T7-sfGFP DNA片段进行重组反应，得到As-T7R-sfGFP载体；
其中，引物F1和R1、引物F2和R2、引物F3和R3的序列分别如SEQ ID NO:3-8所示。
9.权利要求1-4任一项所述核酸构建体、权利要求5所述生物材料、权利要求6或7所述表达载体，或者按照权利要求8所述方法构建得到的表达载体的以下任一应用：
1)用于环境监测；
2)用于制备环境监测的检测试剂或试剂盒；
3)用于制备生物传感器；
4)用于启动子的筛选。
10.用于环境监测的全细胞生物传感器，其特征在于，其是将权利要求6或7所述表达载体，或者按照权利要求8所述方法构建得到的表达载体导入真核或原核表达系统中得到的。
双启动子级联调控基因表达载体及其构建方法与应用
技术领域
背景技术
[0002] 某些微生物长期生活在含有某种化学物质的环境中，在其基因组中含有对该化学物质的特异诱导基因、降解基因或抗性基因。将报告基因与这些基因融合，以诱导基因、降解基因或抗性基因作为启动子来调控报告基因的表达，然后导入选定的合适的宿主菌，构成用于环境监测的基因工程菌。当针对的化学物质作用于基因工程菌时，可诱导启动报告基因表达，根据报告基因的表达情况就可以判断出环境污染物的浓度变化或生物毒性。
[0003] 许多环境污染物是无阈化合物(即接触就对人体有危害)，在环境中也是微量存在，不易监测，因此，在筛选和构建这类用于环境监测的微生物菌株时，灵敏性、准确性和简便性一直是研究的重点。在这类基因工程菌的构建中，启动子和报告基因是关键因素，启动子决定了基因工程菌对于环境污染物的敏感性和特异性，选用的报告基因决定了检测的简便性。现有研究中，大多采用单一的启动子系统调控报告基因的表达，这些特异性启动子系统诱导蛋白表达的能力远远低于常用的强效启动子如tac启动子、PL启动子、T7启动子等。例如，在T7表达系统中，诱导表达后仅几个小时目的蛋白就可占到细胞总蛋白的50％以上，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白。如果能够通过级联调控方式，将对污染物有响应的特异启动子与这些强效启动子关联起来，通过特异启动子开启强效启动子，再由强效启动子启动报告基因的表达，则报告基因的表达也将被放大，从而提高基因工程菌对污染物的灵敏性。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种双启动子级联调控基因表达载体及其构建方法与应用。
[0005] 本发明构思如下：利用基因重组技术成功构建了一个双启动子级联调控荧光蛋白表达载体，在该载体中将对污染物砷有响应的特异启动子(Pars)与强效表达启动子T7关联起来，通过砷特异启动子开启强效T7启动子，再由T7启动子启动报告基因绿色荧光蛋白基因的表达，这种级联调控方式在实验中证实可以放大报告基因的表达并对诱导剂表现出更快、更高的响应性。
[0006] 为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种核酸构建体，其包含两个具有级联调控关系的基因表达盒，分别为表达盒I、表达盒II；所述表达盒I由诱导型启动子驱动，所述表达盒II由强启动子驱动。
[0007] 其中，所述诱导型启动子受特定物质(环境中的特定物质)诱导表达；
[0008] 所述诱导型启动子的下游基因(该下游基因与诱导型启动子可操作地连接)编码可增强或开启所述强启动子表达的调控元件；
[0009] 所述强启动子的下游基因为目的基因，如荧光报告基因。
[0010] 本发明中，所述特定物质包括可导致环境污染的物质，如砷离子。
[0011] 优选地，所述诱导型启动子的下游基因为T7RNA聚合酶基因。所述强启动子为T7启动子，或者其他对调控元件具有高度专一性的、可以被调控元件开启表达的强启动子。
[0012] 所述目的基因包括报告基因；优选地，所述报告基因选自荧光蛋白类基因、β-半乳糖苷酶基因或荧光素酶基因等，更优选荧光蛋白类基因，最优选绿色荧光蛋白基因。
[0013] 所述诱导型启动子包括可由特定环境污染物调控的启动子，优选砷诱导型启动子、镉诱导型启动子或铅诱导型启动子。
[0014] 当所述特定物质为砷离子时，所述表达盒I包含砷诱导型启动子Pars和T7RNA聚合酶基因，所述表达盒II包含T7启动子和荧光报告基因。
[0015] 其中，所述砷诱导型启动子Pars的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0017] 第三方面，本发明提供一种双启动子级联调控基因表达载体，所述表达载体携带有所述的核酸构建体。
[0018] 所述表达载体还包括抗性基因、复制子及T7溶菌酶基因。
[0019] 优选地，所述抗性基因选自氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因或氯霉素抗性基因，更优选氯霉素抗性基因。
[0020] 优选地，所述复制子选自pMB1复制子、CoE1复制子、pSC101复制子或p15A复制子，更优选p15A复制子。
[0021] 优选地，所述T7溶菌酶基因来自pLysS质粒或pLysE质粒，更优选pLysS质粒。
[0022] 进一步地，本发明所述双启动子级联调控基因表达载体上携带的核酸构建体，其包含的两个基因表达盒结构如下：
[0023] 表达盒I：砷诱导型启动子Pars-T7RNA聚合酶基因-rrnBT1T2终止子；
[0024] 表达盒II：T7启动子-荧光报告基因-T7终止子。
[0025] 其中，rrnBT1T2终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
[0026] 第四方面，本发明提供所述双启动子级联调控基因表达载体(As-T7R-sfGFP)的构建方法，包括以下步骤：
[0027] A、As-T7R-BTT载体的构建
[0028] A1、设计并合成如SEQ ID NO:2所示的含有砷诱导型启动子Pars的DNA片段，将所述DNA片段构建到pUC57质粒的SacI和HindIII酶切位点之间，得到载体pUC-As；
[0029] A2、从含有rrnBT1T2终止子的载体上扩增得到rrnBT1T2终止子序列，将所述rrnBT1T2终止子序列构建到pUC-As的PstI和SphI酶切位点之间，得到载体As-BTT；
[0030] A3、从含有T7RNA聚合酶基因的载体上扩增得到T7RNA聚合酶基因序列，将所述T7RNA聚合酶基因序列构建到As-BTT的NocI和PstI酶切位点之间，得到As-T7R-BTT载体；
[0031] B、pET-17b-sfGFP载体的构建
[0032] 从含有绿色荧光蛋白sfGFP基因的载体上扩增得到绿色荧光蛋白sfGFP基因序列，将所述绿色荧光蛋白sfGFP基因序列构建到pET-17b质粒的NheI和EcoRI酶切位点之间，得到pET-17b-sfGFP载体；
[0033] C、As-T7R-sfGFP载体的构建
[0034] C1、以pLysS质粒为模板，利用引物F1和R1扩增得到p15A-T7Lysozyme DNA片段；以As-T7R-BTT载体为模板，利用引物F2和R2扩增得到As-T7R-BTT DNA片段；将上述两个片段进行重组反应，得到质粒p15A-AS-T7R；
[0035] C2、以pET-17b-sfGFP为模板，利用引物F3和R3扩增得到T7-sfGFP DNA片段；
[0036] 用BglII和SacI双酶切p15A-AS-T7R，回收得到的大片段与T7-sfGFP DNA片段进行重组反应，得到As-T7R-sfGFP载体。
[0037] 其中，引物F1和R1、引物F2和R2、引物F3和R3的序列分别如SEQ ID NO:3-8所示。
[0038] 构建得到的As-T7R-sfGFP载体的全序列如SEQ ID NO:9所示。
[0039] 第五方面，本发明提供所述核酸构建体、含有所述核酸构建体的生物材料、所述双启动子级联调控基因表达载体，或者按照上述方法构建得到的双启动子级联调控基因表达载体的以下任一应用：
[0040] 1)用于环境监测，特别是环境污染物监测；
[0043] 4)用于启动子的筛选。
[0044] 第六方面，本发明提供一种用于环境监测的全细胞生物传感器，其是将所述双启动子级联调控基因表达载体，或者按照上述方法构建得到的双启动子级联调控基因表达载体导入真核或原核表达系统中得到的。
[0045] 借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
[0046] 本发明双启动子级联调控模式的成功建立，不仅为提高基因工程菌对环境污染物的灵敏度提供一种新方法和新思路。同时，级联调控模式对于报告基因表达的高效放大作用也使得这种模式可应用于启动子的筛选分析或蛋白质的相互作用等研究中，为基因表达调控研究提供新的技术便利。附图说明
[0047] 图1为本发明实施例1中T7RNA聚合酶基因片段的PCR扩增片段电泳图。其中，Lane M(DNA Marker)：500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp，2500bp，3000bp，4000bp(由下至上)；Lane 1:T7RNA聚合酶基因片段的PCR扩增片段。
[0048] 图2为本发明实施例1中rrnBT1T2终止子片段的PCR扩增片段电泳图。其中，Lane M(DNA Marker)：500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp，2500bp，3000bp，4000bp(由下至上)；Lane 1:rrnBT1T2片段的PCR扩增片段。
[0049] 图3为本发明实施例1中 19-T-rrnBT1T2质粒酶切鉴定图。其中，Lane M(DNA Marker)：100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp(由下至上)；Lane1:酶切位点为PstI+SphI。
[0050] 图4为本发明实施例1中As-BTT质粒PCR鉴定电泳图。其中，Lane M(DNA Marker)：100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp(由下至上)；Lane 1:rrnBT1T2的PCR扩增片段。
[0051] 图5为本发明实施例1中As-T7R-BTT载体酶切鉴定图。其中，Lane M(DNA Marker)：100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp，3000bp，5000bp(由下至上)；Lane 1:
酶切位点为NcoI+PstI；Lane 2:Plasmid DNA。
酶切位点为NcoI+PstI；Lane 2:Plasmid DNA。
[0052] 图6为本发明实施例1中sfGFP基因的PCR扩增片段电泳图。其中，Lane M(DNA Marker)：100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp(由下至上)；Lane 1:sfGFP基因的PCR扩增片段。
[0053] 图7为本发明实施例1中 19-T-sfGFP质粒酶切鉴定图。其中，Lane M(DNA Marker):100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp，3000bp，5000bp(由下至上)；Lane 1:酶切位点为SpeI+EcoRⅠ。
[0054] 图8为本发明实施例1中pET-17b-sfGFP质粒酶切鉴定图。其中，Lane M(DNA Marker):100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp，700bp，800bp，900bp，1000bp，1200bp，1500bp，2000bp，2500bp，3000bp，3500bp，4000bp，5000bp，6000bp，8000bp，10000bp(由下至上)；Lane 1:酶切位点为XbaI+EcoRI。
[0055] 图9为本发明实施例1中p15A-As-T7R质粒酶切鉴定图。其中，Lane M(DNA Marker):100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp，3000bp，5000bp(由下至上)；Lane 1:酶切位点为XhoI+XbaI；Lane 2:Plasmid DNA。
[0056] 图10为本发明实施例1中As-T7R-sfGFP载体酶切鉴定图。其中，Lane M(DNA Marker):500bp，1000bp，1500bp，2000bp，3000bp，4000bp，5000bp，6000bp，8000bp，10000bp；Lane 1:酶切位点为BglII+SacI；Lane 2:Plasmid DNA。
[0057] 图11为本发明实施例1中载体As-T7R-sfGFP的构建流程图。
[0058] 图12为本发明实施例2中转化菌株诱导2h和4h的OD600值。
[0059] 图13为本发明实施例2中单启动子载体菌砷诱导2h和4h的荧光强度。
[0060] 图14为本发明实施例2中双启动子载体菌砷诱导2h和4h的荧光强度。
具体实施方式
[0061] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0062] 实施例1双启动子级联调控荧光蛋白基因表达载体As-T7R-sfGFP的构建
[0063] 本实施例中，先将T7RNA聚合酶基因克隆至由砷启动子Pars调控表达的载体中的砷启动子Pars下游，然后将荧光蛋白基因克隆至pET-17b载体的T7启动子下游，再将T7启动子-荧光蛋白基因序列克隆至砷载体中，最终构成了由砷诱导表达的、双启动子级联调控的荧光蛋白强表达重组载体。
[0064] 1.1砷启动子-T7RNA聚合酶基因载体(As-T7R-BTT载体)构建
[0065] 1.1.1T7RNA聚合酶基因片段的PCR扩增及T/A克隆
[0066] (1)E.coli BL21(DE3)基因组的提取：取过夜培养的E.coli BL21(DE3)菌液1.5ml，采用细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱法)(北京普博欣生物科技有限责任公司)提取E.coli BL21(DE3)基因组(具体操作见使用说明书)。
[0067] (2)T7RNA聚合酶基因片段的PCR扩增：以E.coli BL21(DE3)基因组为模板，扩增T7RNA聚合酶基因片段，2652bp。采用Premix ExTaq试剂(TaKaRa公司)，扩增体系25μL，上游引物序列为5’-CATGCCATGGCTATGAACACGATTAACATCGCTAAGA(NcoI)，下游引物序列为5’-AACTGCAGTTACGCGAACGCGAAGTC(PstI)，PCR扩增参数设置为：94℃预变性3min；94℃30s，56℃30s，72℃2min30s(25个循环)；72℃10min。扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。
[0068] (3)T7RNA聚合酶基因片段的纯化回收：采用琼脂糖凝胶电泳纯化并回收T7RNA聚合酶基因片段；
[0069] (4)构建质粒 -T1-T7RNAP：将回收的T7RNA聚合酶基因片段与 -T1载体(北京全式金生物技术有限公司)连接构建质粒 -T1-T7RNAP(连接的具体
操作见使用说明书)； -T1-T7RNAP中T7RNAP序列经测序验证序列正确。
操作见使用说明书)； -T1-T7RNAP中T7RNAP序列经测序验证序列正确。
[0070] 1.1.2pUC-As载体的构建
[0071] (1)序列设计：自主设计DNA序列(SEQ ID NO:2，662bp)，该DNA序列中含有砷的启动子(Pars)序列及其调控基因序列(参照GenBank Accession No.X16045.1设计)、多克隆酶切位点和核蛋白体结合位点。
[0072] (2)pUC-As载体的构建：采用全基因合成法合成上述662bp的DNA片段(生工生物工程(上海)股份有限公司)并将其克隆至pUC57质粒(生工生物工程(上海)股份有限公司)的Sac I和Hind III酶切位点之间，最终构建成pUC-As载体。合成基因序列的准确性和克隆酶切位点的准确性全部经过测序验证。
[0073] 1.1.3As-BTT(pUC57-As-BTT)载体的构建
[0074] 1.1.3.1rrnBT1T2终止子片段的PCR扩增及T/A克隆
[0075] (1)rrnBT1T2片段的PCR扩增：以pBV220质粒(中国预防医学科学院病毒研究所)为模板扩增rrnBT1T2片段，472bp。采用Premix ExTaq试剂(TaKaRa公司)，扩增体系25μL，上游引物序列为5’-AACTGCAGAGCTTCTGTTTTGGCGGATG(PstI)，下游引物序列为5’-ATGCATGCCATGAGCGGATACATATTTGAATG(SphI)，PCR扩增参数设置为：94℃预变性3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s(25个循环)；72℃10min。扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。
[0076] (2)rrnBT1T2片段的纯化回收：采用琼脂糖凝胶电泳纯化并回收rrnBT1T2片段；
[0077] (3)构建质粒 19-T-rrnBT1T2：将回收的rrnBT1T2片段与 19-T载体(TaKaRa公司)连接构建质粒 19-T-rrnBT1T2(连接的具体操作见TaKaRa公司的使用说明书)；
[0078] (4)酶切鉴定：采用PstI和SphI双酶切质粒 19-T-rrnBT1T2可以得到rrnBT1T2片段，酶切鉴定电泳结果如图3所示。
[0079] 1.1.3.2As-BTT载体的构建
[0080] (1)酶切处理：pUC-As载体和质粒 19-T-rrnBT1T2分别用PstI和SphI双酶切处理，琼脂糖凝胶电泳回收纯化目的条带；
[0081] (2)构建As-BTT载体:连接体系25μL，包括2.5μL10×T4DNA连接酶缓冲液，100ng酶切pUC-As载体后的回收片段，100ng酶切 19-T-rrnBT1T2后的回收片段，1μL T4DNA连接酶(TaKaRa公司)，16℃连接20小时。
[0082] (3)转化质粒As-BTT：用连接产物转化E.coli DH 5α，涂布在含氨苄青霉素(50μg/mL，下同)的LB琼脂板上，37℃过夜培养。挑单克隆菌落于含氨苄青霉素的液体LB中(体积5mL)，在37℃下200～250r/min过夜培养。
[0083] (4)PCR鉴定：取1.5mL菌液进行质粒小量提取，用灭菌去离子超纯水25倍稀释原质粒作为PCR模板，通过PCR验证可以扩增出rrnBT1T2片段，电泳结果如图4所示。
[0084] 1.1.4砷启动子-T7RNA聚合酶基因载体(As-T7R-BTT载体)构建
[0085] (1)线性化载体制备：As-BTT载体分别用NcoI和PstI双酶切处理，琼脂糖凝胶电泳回收纯化目的条带；
[0086] (2)目的DNA片段的制备：以 -T1-T7RNAP质粒为模板，扩增T7RNA聚合酶基因片段，2652bp。采用Pfu DNA聚合酶(苏州泓迅生物科技股份有限公司)，扩增体系50μL，上游引物序列为5’-GTTGTGGATCCAAGAAGGAGATATACCATGGCTATGAACACGATTAACA(NcoI)，下游引物序列为5’-TCTCTCATCCGCCAAAACAGAAGCTCTGCAGTTACGCGAACGCGAAGTC(PstI)，PCR扩增参数设置为：98℃预变性1分钟；98℃变性15秒，60℃退火30秒，延伸72℃1分钟(共30个循环)；后延伸72℃5分钟；琼脂糖凝胶电泳回收纯化目的条带。
[0087] (3)构建As-T7R-BTT载体：重组反应体系冰上配置，总体积20μL，含DNA片段和线性化载体共10μL(体积比1：1)及2×重组酶反应液(苏州泓迅生物科技股份有限公司)10μL，50℃反应60分钟，然后冰上冷却。
[0088] (4)转化及鉴定：取10μL重组反应液转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布在含氨苄青霉素的LB琼脂板，37℃过夜培养。挑单克隆菌落于含氨苄青霉素的液体LB中(体积5mL)，在37℃下200-250r/min过夜培养。取过夜培养菌液提取质粒，酶切鉴定电泳结果如图5所示。
[0089] 1.2pet-17b-sfGFP载体的构建
[0090] 1.2.1绿色荧光蛋白sfGFP基因片段的PCR扩增及T/A克隆
[0091] (1)sfGFP基因片段的PCR扩增：以sfGFP质粒(上海林渊生物科技有限公司)为模板，扩增sfGFP基因片段，717bp。采用Premix ExTaq试剂(TaKaRa公司)，扩增体系25μL，上游引物序列为5’-GACTAGTATGCGTAAAGGCGAAGAGCTG(SpeI)，下游引物序列为5’-GGAATTCTCATTTGTACAGTTCATCCATACCATG(EcoRI)，PCR扩增参数设置为：94℃预变性3min；94℃30s，58℃30s，72℃45s(25个循环)；72℃10min。扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图6所示。
[0092] (2)sfGFP基因片段的纯化回收：采用琼脂糖凝胶电泳纯化并回收sfGFP基因片段；
[0093] (3)构建质粒 19-T-sfGFP：将回收的sfGFP基因片段与 19-T载体(TaKaRa公司)连接构建质粒 19-T-sfGFP(连接的具体操作见TaKaRa公司的使用说明书)；
[0094] (4)酶切鉴定：采用SpeI和EcoRⅠ双酶切质粒 19-T-sfGFP可以得到sfGFP片段，酶切鉴定电泳结果如图7所示。
[0095] 1.2.2pET-17b-sfGFP载体的构建
[0096] (1)酶切处理：质粒pET-17b(Novagen公司)用NheI和EcoRI双酶切处理，质粒19-T-sfGFP用SpeI和EcoRI双酶切处理，凝胶电泳回收纯化目的条带；
[0097] (2)构建pET-17b-sfGFP载体:连接体系25μL，包括2.5μL10×T4DNA连接酶缓冲液，100ng酶切pET-17b载体后的回收片段，100ng酶切 19-T-sfGFP后的回收片段，1μL T4DNA连接酶(TaKaRa公司)，16℃连接20小时。
[0098] (3)转化质粒pET-17b-sfGFP：用连接产物转化E.coli DH 5α感受态细胞，涂布在含氨苄青霉素(50μg/mL，下同)的LB琼脂板上，37℃过夜培养。挑单克隆菌落于含氨苄青霉素的液体LB中(体积5mL)，在37℃下200-250r/min过夜培养。
[0099] (4)酶切鉴定：取1.5mL菌液进行质粒小量提取，用XbaI和EcoRI双酶切质粒，所得条带与预期一致，电泳结果如图8所示。电泳结果证明所得质粒为目的质粒pET-17b-sfGFP。
[0100] 1.3双启动子级联调控荧光蛋白基因表达载体As-T7R-sfGFP载体的构建
[0101] 1.3.1p15A-AS-T7R的构建
[0102] (1)线性化载体制备：以pLysS质粒(Novagen公司)为模板，扩增p15A-T7Lysozyme片段，3356bp。采用Pfu DNA聚合酶(苏州泓迅生物科技股份有限公司)，扩增体系50μL，上游引物序列为5’-TATGTATCCGCTCATGGCATGCGCTAGCCTCGAGCCTCAGGCATTTGAGAAGCACAC(XhoI)，下游引物序列为5’-GCGGACTAGTAGATCTGCTAGCGAGCTCGACGTCCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCC(SacI)，PCR扩增参数设置为：98℃预变性1分钟；98℃变性15秒，60℃退火30秒，延伸72℃1分钟30秒(共30个循环)；后延伸72℃5分钟；凝胶电泳回收纯化目的条带。
[0103] (2)目的DNA片段的制备：以AsB-T7R-BTT质粒为模板，扩增AsB-T7R-BTT片段，3770bp。采用Pfu DNA聚合酶(苏州泓迅生物科技股份有限公司)，扩增体系50μL，上游引物序列为5’-GGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGGACGTCGAGCTCGCTAGCAGATCTACTAGTCCGC(SacI)，下游引物序列为5’-ACCGTGTGCTTCTCAAATGCCTGAGGCTCGAGGCTAGCGCATGCCATGAGCGG(XhoI)，PCR扩增参数设置为：98℃预变性1分钟；98℃变性15秒，60℃退火30秒，延伸72℃1分钟30秒(共30个循环)；后延伸72℃5分钟；凝胶电泳回收纯化目的条带。
[0104] (3)构建p15A-AS-T7R载体：重组反应体系冰上配置，总体积20μL，含DNA片段和线性化载体共10μL(体积比1：1)及2×重组酶反应液(苏州泓迅生物科技股份有限公司)10μL，50℃反应60分钟，然后冰上冷却。
[0105] (4)转化及鉴定：取10μL重组反应液转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布在含氯霉素(25μg/ml，下同)的LB琼脂板，37℃过夜培养。挑单克隆菌落于含氯霉素的液体LB中(氯霉素终浓度25μg/ml，体积5mL)，在37℃下200～250r/min过夜培养。取过夜培养菌液提取质粒，利用XhoI和XbaI双酶切鉴定质粒，所得条带与预期一致，电泳结果如图9所示。电泳结果证明所得质粒为目的质粒p15A-AS-T7R。
[0106] 1.3.2As-T7R-sfGFP载体
[0107] (1)线性化载体制备：p15A-AS-T7R分别用BglII和SacI双酶切处理，凝胶电泳回收纯化目的条带；
[0108] (2)目的DNA片段的制备：以pET-17b-sfGFP载体质粒为模板，扩增T7-sfGFP基因片段，1083bp。采用Pfu DNA聚合酶(苏州泓迅生物科技股份有限公司)，扩增体系50μL，上游引物序列为5’-ATAACTTGGAATTCCCGCGGACTAGTAgatctcgatcccgcgaaattaatacg(BglII)，下游引物序列为5’-GGCGCCATCTCCTTGCATGGACGTCGAGCTCTAAGAAACCATTATTATC(SacI)，PCR扩增参数设置为：98℃预变性1分钟；98℃变性15秒，60℃退火30秒，延伸72℃1分钟(共30个循环)；后延伸72℃5分钟；凝胶电泳回收纯化目的条带。
[0109] (3)构建As-T7R-sfGFP载体：重组反应体系冰上配置，总体积20μL，含DNA片段和线性化载体共10μL(体积比1：1)及2×重组酶反应液(苏州泓迅生物科技股份有限公司)10μL，50℃反应60分钟，然后冰上冷却。
[0110] (4)转化及鉴定：取10μL重组反应液转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布在含氯霉素的LB琼脂板，37℃过夜培养。挑单克隆菌落于含氯霉素的液体LB中(体积5mL)，在37℃下200-250r/min过夜培养。取过夜培养菌液提取质粒，利用BglII和SacI双酶切鉴定质粒，所得条带与预期一致，电泳结果如图10所示。电泳结果证明所得质粒为目的质粒As-T7R-sfGFP。
[0111] 质粒As-T7R-sfGFP的构建流程图见图11。
[0112] 实施例2双启动子级联调控荧光蛋白基因表达载体As-T7R-sfGFP的荧光蛋白表达能力分析
[0113] 2.1双启动子级联调控荧光蛋白基因表达载体As-T7R-sfGFP转化菌株
[0114] 将实施例中构建得到的双启动子级联调控荧光蛋白基因表达载体As-T7R-sfGFP转入E.coli TOP10感受态细胞中，将已转化的感受态细胞涂布在含氯霉素的LB琼脂培养基上，将平板置于室温直至液体被吸收。倒置平皿，于37℃培养，12～16小时后可出现菌落。所得菌落克隆即为双启动子级联调控荧光蛋白基因表达载体As-T7R-sfGFP转化菌株。
[0115] 2.2双启动子级联调控荧光蛋白基因表达载体As-T7R-sfGFP的荧光蛋白表达能力检验
[0116] 测定方法：分别挑取单克隆菌落于含氯霉素的液体LB培养基中37℃振摇(200rpm)培养过夜，次日早上，以2％比例接种于新的含氯霉素的液体LB培养基中，37℃振摇培养至OD600至0.5～0.8时(紫外-可见分光光度计测定)，将菌液分成2份，一份菌液(诱导菌)加入砷终浓度为0.1μmol/L的砷诱导剂溶液(亚砷酸钠水溶液，利用灭菌去离子超纯水稀释亚砷酸钠标准溶液制备)，另一份菌液(非诱导菌)加入灭菌去离子超纯水代替砷诱导剂溶液。以开始加入砷诱导剂的时间为0h，在加入诱导剂培养2h和4h时，分别检测菌液的OD600和荧光强度值(用多功能酶标仪测定)。结果见图12-图14(图中标注的单启动子载体菌是由砷诱导型启动子Pars直接调控荧光蛋白表达的载体的转化菌株，双启动子载体菌是双启动子级联调控荧光蛋白基因表达载体As-T7R-sfGFP的转化菌株)。
[0117] 由结果可见，在加入诱导剂培养2h和4h时，各菌株的OD600值都与相应的非诱导菌株差别不大。荧光强度检测结果显示，加入诱导剂2h后，双启动子级联调控荧光蛋白基因表达载体转化菌的荧光强度已经比其非诱导菌株呈现出明显的升高，增幅达到21.64％；而单启动子荧光蛋白基因表达载体转化菌的荧光强度在诱导2h时仍然与其非诱导菌株相近，未表现出明显变化，在诱导4h后的荧光强度检测中才表现出明显的上升。
[0118] 从荧光蛋白表达强度来看，由双启动子级联调控荧光蛋白基因表达载体转化菌的荧光强度比由单启动子荧光蛋白基因表达载体转化菌要高出两个数量级，提示这种双启动子级联调控荧光蛋白基因表达模式确实可以更充分的利用宿主菌资源更高效的表达更多的荧光蛋白。
[0119] 以上实验结果说明，双启动子级联调控荧光蛋白基因表达载体的荧光蛋白表达可以经砷诱导剂调控，这种级联调控方式确实可以放大报告基因的表达并对诱导剂表现出更快、更高的的响应性，双启动子级联调控模式的可行性得到验证。这种双启动子级联调控模式的建立不仅能够为提高基因工程报告菌对环境污染物的灵敏度提供一种新方法和新思路，同时，级联调控模式对于报告基因表达的高效放大作用也使得这种模式可能应用于启动子的筛选分析或蛋白质的相互作用等研究中，为基因表达调控研究提供新的技术便利。
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