miR-21在诊治蛛网膜下腔出血中的应用
阅读：3发布：2022-08-12
专利汇可以提供miR-21在诊治蛛网膜下腔出血中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供miR-21在诊治蛛网膜下腔出血中的应用，属于属于 生物 医药和分子生物学技术领域。本发明探究间充质干细胞外泌体在SAH中的潜在 治疗 作用，特别是其对认知功能的作用。证明间充质干细胞外泌体可以减轻SAH后的早期脑损伤，提高认知功能。在机制上，证明其通过外泌体富含的miR-21在抑制神经元凋亡中起了重要的介导作用。本发明实际证明了间充质干细胞外泌体中的miR-21通过抑制神经元凋亡减轻了SAH后的脑损伤，并通过PTEN/Akt通路改善了神经行为，这为有认知 缺陷 风 险的SAH患者提供了潜在的新的恢复性治疗方法和策略，因此具有良好的实际应用之价值。，下面是miR-21在诊治蛛网膜下腔出血中的应用专利的具体信息内容。
1.检测miR-21表达水平的物质在制备检测、诊断或预测蛛网膜下腔出血进展试剂中的应用。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述蛛网膜下腔出血进展包括但不限于早期脑损伤和神经元凋亡。
3.一种用于检测、诊断或预测蛛网膜下腔出血进展的组合物，其特征在于，所述组合物包含基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测miR-21表达水平的物质。
4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3所述用于检测、诊断或预测的蛛网膜下腔出血进展的组合物。
5.miR-21相关生物材料在如下a)-c)至少一种中的应用：
a)缓解蛛网膜下腔出血的神经损害，或制备用于缓解蛛网膜下腔出血的神经损害的产品；
b)减轻蛛网膜下腔出血后早期脑损伤，或制备用于减轻蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的产品；
c)改善蛛网膜下腔出血导致的认知障碍，或制备用于改善蛛网膜下腔出血导致的认知障碍的产品。
6.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述蛛网膜下腔出血的神经损害包括脑水肿。
7.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述蛛网膜下腔出血后早期脑损伤包括神经元凋亡。
8.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述miR-21相关生物材料为miR-21，或者包含miR-21的物质，或者促进miR-21表达的物质；
优选的，所述包含miR-21的物质包括间充质干细胞外泌体；
优选的，所述能够促进miR-21表达的物质为任何促进miR-21表达的物质，进一步优选为miR-21模拟物(miR-21mimics)；转录成所述miR-21的DNA、含有所述DNA的表达盒、重组载体或重组细胞。
9.一种用于预防和/或治疗SAH的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的活性成分包含权利要求5-7任一项所述miR-21相关生物材料。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述预防和/或治疗是指能够减轻、抑制、改善或缓解下述任意一种或多种症状：
1)SAH的神经损害；
2)SAH后早期脑损伤；
3)SAH认知障碍；
其中，所述SAH的神经损害包括脑水肿；
所述SAH后早期脑损伤包括神经元凋亡。
miR-21在诊治蛛网膜下腔出血中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003] 蛛网膜下腔出血(SAH)是一种危及生命的神经系统疾病，具有较高的死亡率和致残率。随着神经外科诊疗技术的进步，许多病人可以存活下来，但完全难以恢复正常的认知功能，受认知障碍的困扰，从而使其生活质量下降。越来越多的证据表明早期脑损伤(EBI)是 SAH不良预后的重要原因之一。
[0004] 近期，间充质干细胞外泌体引起了许多关注，被认为是潜在的药物载体，同时有望替代基于间充质干细胞的细胞疗法。更重要的是，使用外泌体可以规避细胞治疗的致瘤性等潜在安全问题。外泌体可以通过其包含的蛋白、脂质、mRNA和非编码RNA等成分调节受体细胞的功能。间充质干细胞外泌体被证实可治疗肝损伤、肾损伤、急性心肌梗死等疾病。
[0005] 间充质干细胞疗法在20世纪初已被应用于卒中和创伤性脑损伤的治疗中。而且，许多研究表明间充质干细胞是通过外泌体发挥神经保护作用。例如Michael chopp等证明MSC外泌体可以被神经细胞接受，而且这些miR-133过表达的外泌体可以促进缺血性脑卒中神经功能恢复。然而，发明人发现，间充质干细胞疗法在SAH中研究不多，间充质干细胞外泌体的作用亦不清楚。
发明内容
[0006] 针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供间充质干细胞外泌体在诊治蛛网膜下腔出血中的用途。本发明探究间充质干细胞外泌体在SAH中的潜在治疗作用，特别是其对认知功能的作用。证明间充质干细胞外泌体可以减轻SAH后的早期脑损伤，提高认知功能。在机制上，证明其通过外泌体富含的miR-21在抑制神经元凋亡中起了重要的介导作用。
[0008] 经研究发现，SAH会导致miR-21表达上调，因此miR-21可以作为诊断SAH的生物指标，通过检测病人中miR-21表达水平，结合其他有效指标，医生可以对病人进行及时的SAH检测、诊断和预后判断，进而对SAH疾病和认知水平的损失进行有效控制。
[0009] 本发明的第二个方面，提供一种用于检测、诊断或预测蛛网膜下腔出血进展的组合物，其包含基于高通量测序方法和/或基于定量 PCR方法和/或基于探针杂交方法检测miR-21表达水平的物质。
[0010] 本发明的第三个方面，提供miR-21相关生物材料在如下a)-c) 至少一种中的应用：
[0011] a)缓解蛛网膜下腔出血的神经损害，或制备用于缓解蛛网膜下腔出血的神经损害的产品；
[0012] b)减轻蛛网膜下腔出血后早期脑损伤，或制备用于减轻蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的产品；
[0013] c)改善蛛网膜下腔出血导致的认知障碍，或制备用于改善蛛网膜下腔出血导致的认知障碍的产品。
[0014] 经试验证实，miR-21通过PTEN/Akt通路抑制神经元凋亡从而改善SAH认知障碍。
[0015] 本发明的第四个方面，提供一种用于预防和/或治疗SAH的药物组合物，其包含miR-21相关生物材料。
[0016] 在本发明中，“预防或治疗”指的是能够减轻SAH的神经损害 (包括脑水肿)，抑制SAH后早期脑损伤(EBI)过程中的神经元凋亡，改善SAH认知障碍，和缓解SAH后早期脑损伤中的一种或多种。本发明的有益技术效果：
[0017] 本发明探究了间充质干细胞外泌体在大鼠SAH模型中的作用。经试验证明间充质干细胞外泌体可以通过抑制凋亡来减轻SAH后的早期脑损伤，而且SAH使前额叶皮质和海马中的miR-21表达升高。通过外泌体二代测序和SAH病人的脑脊液高通量检测，发现间充质干细胞外泌体中富含的miR-21起到了神经保护作用，能减轻SAH后的认知障碍。机制上，通过miR-21敲减和MK2206阐明了其下游作用机制。综上，本发明证明间充质干细胞外泌体特别是其中的miR-21 是促进SAH患者康复，改善其认知障碍，提高生活质量的潜在治疗手段，具有良好的实际应用之价值。附图说明
[0019] 图1为间充质干细胞外泌体的分离与鉴定相关图，其中，图1A为 Nanosight粒径分析；图1B为外泌体指标TSG-101、CD9和细胞内质网Calnexin的Western电泳；图1C为间充质干细胞的相差显微镜下图像。
[0020] 图2为间充质干细胞外泌体能够减轻SAH后的脑损伤相关图，其中，图2A为大鼠的神经功能学评分；图2B为大鼠在SAH后的脑水肿情况(干湿重法)；图2C、D分别为大鼠在SAH后48小时的前额叶和海马的HE染色、尼氏染色。
[0021] 图3为本发明间充质干细胞外泌体能够减轻SAH后引起的认知障碍相关图，其中，图3A为水迷宫实验中的潜伏期；图3B为大鼠水迷宫实验典型路线；图3C为水迷宫实验中大鼠在进入目标象限的次数；图3D为去除隐匿平台后大鼠在该区域的停留时间。
[0022] 图4为本发明间充质干细胞外泌体被神经细胞、肝脏、肾脏和脾脏摄取相关图，其中，图4A为间充质干细胞外泌体被神经细胞摄取图；图4B为肝脏、肾脏和脾脏对间充质干细胞外泌体存在一定程度的摄取图。
[0023] 图5为本发明间充质干细胞外泌体能抑制SAH后的神经细胞凋亡相关图；其中，图5A为脑组织切片的Tunel实验；图5B为NeuN/caspase3 荧光染色；图5C为凋亡相关蛋白指标的Western电泳。
[0024] 图6为本发明间充质干细胞外泌体测序筛选功能miRNA相关图，其中，图6A为外泌体测序中miRNA的表达丰度；图6B为外泌体测序中高丰度miRNA所占比例；图6C为exRNA Atlas数据库中SAH病人脑脊液中前述miRNA的表达热图，图6D为有差异miRNA表达的点图。
[0025] 图7为本发明SAH诱导miR-21上调相关图，其中，图7A为前额叶中mir-21在SAH后时间梯度在表达趋势；图7B为海马组织mir-21 在SAH后时间梯度表达趋势；图7C为FISH检测大鼠SAH后的mir-21 表达；图7D为FISH定量分析。
[0026] 图8为本发明基于神经元培养的SAH体外模型中miR-21上调，并通过外泌体外排相关图，其中，图8A为SAH后神经元中miR-21表达；图8B为神经元培养上清中外泌体miR-21的表达。
[0027] 图9为本发明miR-21介导间充质干细胞外泌体对于SAH大鼠的神经保护作用相关图，其中，图9A为大鼠前额叶mir-21的表达检测；图9B为大鼠海马mir-21的表达检测；图9C为NeuN/Caspase3荧光染色；图9D为Tunel染色；图9E为凋亡相关指标的western检测；图 9F为western电泳定量分析。
[0028] 图10为本发明间充质干细胞外泌体通过miR-21/PTEN/Akt轴减轻 SAH后的神经损伤相关图，其中，图10A为脑组织切片HE染色；图10B为神经功能评分图；图10C为NeuN/Caspase3荧光染色；图 10D为Tunel染色图；图10E为凋亡相关指标的western检测；图10F 为western电泳定量分析。
具体实施方式
[0029] 应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0030] 需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0031] 现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032] 如前所述，间充质干细胞疗法在SAH中研究不多，间充质干细胞外泌体的作用亦不清。
[0033] 有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供检测miR-21表达水平的物质在制备检测、诊断或预测蛛网膜下腔出血进展试剂中的应用。
[0034] 本发明的又一具体实施方式中，所述蛛网膜下腔出血进展包括但不限于早期脑损伤、神经元凋亡。
[0035] 本发明的又一具体实施方式中，所述miR-21为成熟miR-21或者前体miR-21。
[0036] 经研究发现，SAH会导致miR-21表达上调，因此miR-21可以作为诊断SAH的生物指标，通过检测病人中miR-21表达水平，结合其他有效指标，医生可以对病人进行及时的SAH检测、诊断和预后判断，进而对SAH疾病和认知水平的损失进行有效控制。
[0037] 本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于检测、诊断或预测蛛网膜下腔出血进展的组合物，其包含基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测miR-21表达水平的物质。
[0038] 本发明的又一具体实施方式中，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括用于检测、诊断或预测的蛛网膜下腔出血进展的组合物；
[0039] 本发明的又一具体实施方式中，提供miR-21相关生物材料在如下a)-c)至少一种中的应用：
[0040] a)缓解蛛网膜下腔出血的神经损害，或制备用于缓解蛛网膜下腔出血的神经损害的产品；
[0041] b)减轻蛛网膜下腔出血后早期脑损伤，或制备用于减轻蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的产品；
[0042] c)改善蛛网膜下腔出血导致的认知障碍，或制备用于改善蛛网膜下腔出血导致的认知障碍的产品。
[0043] 本发明的又一具体实施方式中，所述蛛网膜下腔出血的神经损害包括脑水肿；
[0044] 本发明的又一具体实施方式中，所述蛛网膜下腔出血后早期脑损伤包括神经元凋亡；
[0045] 本发明的又一具体实施方式中，所述miR-21相关生物材料为 miR-21，或者包含miR-21的物质，或者能够促进miR-21表达的物质。
[0046] 本发明的又一具体实施方式中，所述包含miR-21的物质包括间充质干细胞外泌体。
[0047] 本发明的又一具体实施方式中，所述能够促进miR-21表达的物质可为任何能够促进miR-21表达的物质，如miR-21模拟物(miR-21 mimics)；能够转录成所述miR-21的DNA，含有所述DNA的表达盒、重组载体或重组细胞等。
[0048] 本发明的又一具体实施方式中，所述miR-21为成熟miR-21或者前体miR-21。经试验证实，miR-21通过PTEN/Akt通路抑制神经元凋亡从而改善SAH认知障碍。
[0049] 本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于预防和/或治疗SAH的药物组合物，其活性成分包含miR-21相关生物材料。
[0050] 本发明的又一具体实施方式中，所述miR-21相关生物材料为 miR-21，或者包含miR-21的物质，或者能够促进miR-21表达的物质。
[0051] 本发明的又一具体实施方式中，所述包含miR-21的物质包括间充质干细胞外泌体。
[0052] 本发明的又一具体实施方式中，所述能够促进miR-21表达的物质可为任何能够促进miR-21表达的物质，如miR-21模拟物(miR-21 mimics)；能够转录成所述miR-21的DNA，含有所述DNA的表达盒、重组载体或重组细胞等。
[0053] 本发明的又一具体实施方式中，所述miR-21为成熟miR-21或者前体miR-21。
[0054] 本发明的又一具体实施方式中，“预防或治疗”指的是能够减轻、抑制、改善或缓解下述任意一种或多种症状：
[0055] 1)SAH的神经损害；
[0056] 2)SAH后早期脑损伤；
[0057] 3)SAH认知障碍；
[0058] 其中，所述SAH的神经损害包括脑水肿；
[0059] 所述SAH后早期脑损伤包括神经元凋亡。
[0060] 以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。下述实施例1中所涉及的鼠源成熟miR-21为mo-miR-21-5p。
[0061] 实施例1
[0062] 方法与步骤
[0063] 1、间充质干细胞的培养
[0064] 骨髓来源的间充质干细胞购自赛业生物(苏州)并培养在含有 10％胎牛血清的a-MEM培养基中。为了提取外泌体，在细胞密度接近60-80％时，将细胞培养基换为无外泌体胎牛血清的培养基。继续培养48小时后，收集细胞上清，进行离心分离外泌体。提取后外泌体保存在-80℃冰箱中。
[0065] 2、大鼠SAH模型构建
[0066] SAH的血管内穿刺模型按常规方法构建，具体的，取300-320g 左右的成年雄性SD大鼠在腹腔注射水合氯醛麻醉后，解剖分离其左颈总动脉和相关属肢，然后将3-0单股尼龙缝合线插入被拉直的颈外动脉中，并进而伸入颈内动脉，穿刺动脉后退出。假手术组大鼠并不刺穿动脉，其余操作与SAH模型组相同。本实验遵守相关动物伦理保护规范，并经过山东大学齐鲁医院伦理委员会所批准。
[0067] 3、外泌体示踪实验
[0068] 外泌体在制造商说明书的指导下进行了PKH67的染色。简单来讲，MSC外泌体与4ul PKH67染料和1ml染色缓冲液共同孵育15分钟，然后加入2ml终止缓冲液，再次100,000g离心4小时，最后用PBS重悬。
[0069] 4、神经功能评分
[0070] SAH后48小时，根据改良的Garcia评分系统对大鼠的神经行为学功能进行了评价。简单来讲，评分包含六项内容：自发运动(0-3 分)，侧面触碰反应(1-3分)，胡须本体感觉(1-3分)，肢体对称性 (0-3分)，前肢伸展性(0-3分)，攀爬(0-3分)。分数越高，提示神经功能保持约完善。
[0071] 5、脑含水量测定
[0072] 大鼠脑在SAH后48小时快速从颅骨中剥离出来，进行称重，并在95℃加热48小时后再次称重。含水量计算公式为：(湿重-干重)/ 湿重×100％。
[0073] 6、Tunel实验
[0074] Tunel实验使用roche公司的细胞凋亡原位检测试剂盒。按照说明书，进行了染色和DAPI复染，然后用碧云天公司的荧光抗淬灭剂进行封片。
[0075] 7、RNA提取和PCR
[0076] 总RNA提取使用trizol试剂(invitrogen公司)。使用toyobo公司的ReverTra Ace qRT-PCR试剂盒将1μg RNA逆转录成cDNA，而后应用roche公司的SYBR PCR试剂配制PCR体系，在LightCycler 480PCR仪上进行了实时定量检测。内参选用U6，相对定量方法由 2-ΔΔCt计算而得到。
[0077] 8、Western实验
[0078] 蛋白浓度由碧云天公司的BCA蛋白定量试剂盒测定，30-50μg 的蛋白变形液被加到10％-12％的凝胶孔中，PVDF膜用来转模吸附蛋白并孵育一抗。所用一抗如下Bax(1:2000,Abcam),Bcl-2(1:1000, Abcam),cleaved caspase-3(1:500,Cell Signaling),phospho-Akt(Ser473) (1:500,Cell Signaling),Akt(1:1000；Cell Signaling),and phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10(PTEN)(1:500,Cell Signaling).GAPDH(1:2000,Sigma-Aldrich)。连接了过氧化物酶的山羊抗鼠或抗兔的二抗购自CST公司，最终PVDF膜在bio-rad公司的 ChemiDoc XRS+成像仪下显色。
[0079] 9、免疫荧光实验
[0080] 大鼠脑切片在4％多聚甲醛中固定15分钟，并用山羊血清封闭。而后滴加对应的一抗，孵育过夜。第二天，荧光二抗室温孵育1小时后，15分钟DAPI复染，置于徕卡公司的DMi8荧光显微镜下观察。
[0081] 10、原位杂交荧光实验
[0082] MiR-21荧光探针序列为5’-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’ (SEQ ID NO.1)，由上海吉玛公司合成，配合吉玛公司miRNA荧光原位杂交试剂盒使用。具体的，第一天，切片水化后，经蛋白酶K 室温消化20分钟，78℃变性溶液作用8分钟，而后37℃温箱中探针孵育过夜。第二天经NeuN抗体和荧光二抗复染后，置于徕卡荧光显微镜下观察。
[0083] 结果与讨论
[0084] 1、间充质干细胞外泌体减轻SAH的神经损害
[0085] 间充质干细胞外泌体提取自间充质干细胞提前去除外泌体的培养基，并用粒径分析和Western电泳检测外泌体蛋白标记.为了探究间充质干细胞外泌体的作用，在大鼠蛛网膜下腔出血模型建立1小时后，100μg外泌体通过尾静脉被缓慢注射到SAH大鼠体内，而对照组大鼠被注射等量的磷酸盐缓冲溶液。与对照组相比，外泌体注射组在SAH后48小时取得了更好的神经功能评分。脑水肿测定显示外泌体组脑水肿明显减轻。
[0086] 组织切片HE染色和尼氏染色，显示外泌体注射使SAH后早期脑损伤中的神经元损伤减弱，形态更为完整。
[0087] 2、间充质干细胞外泌体抑制早期脑损伤过程中的神经元凋亡
[0088] 为了探究间充质干细胞外泌体的神经保护作用，利用PKH67标记进行了外泌体示踪实验。人道处死大鼠后，进行了脑组织固定切片并进行了神经染色来确定外泌体的靶细胞。大部分外泌体被神经元所接收。同时，PKH67标记的外泌体也被肝脏、肾脏和脾脏等血流丰富的器官所接收。利用TUNEL实验检测了脑组织中的凋亡情况， MSC外泌体明显抑制了TUNEL阳性的凋亡细胞的数量。另外 caspase3和NeuN免疫荧光共染实验也证明了同样的间充质干细胞外泌体抑制凋亡效果。Western电泳显示在SAH大鼠模型中线粒体凋亡途径蛋白BAX上调，BCL2下调，而外泌体给药抑制了其表达的病理改变。
[0089] 3、miRNA测序筛选外泌体的靶点
[0090] MicroRNA是外泌体中重要的一类内容物，被认为在外泌体介导的细胞间通讯发挥了重要作用。因此，对间充质干细胞外泌体进行了高通量测序。根据表达丰度排序，包含miR-21在内的前七位miRNA 构成了miRNA总量的近60％，miR-21单独占22.5％。
[0091] 4、SAH后miR-21上调
[0092] 许多miRNA被证实在神经系统疾病中起了重要作用，miR-21的研究很多。使用PCR检测了miR-21在SAH后的表达变化情况。在 SAH后48小时又使用荧光原位杂交，验证了神经元中的miR-21表达上调。而间充质干细胞外泌体可促进受损脑区miR-21的表达。
[0093] 为了验证miR-21的重要性，在间充质干细胞中转染了 miR-21inhibitors尝试阻断其外泌体中的miR-21表达。TUNEL等实验证明miR-21inhibitors的外泌体的神经保护作用显著减弱。
[0094] 5、miR-21通过PTEN/Akt通路抑制神经元凋亡从而改善SAH 认知障碍[0095] 为了进一步阐明间充质干细胞外泌体的机制，使用mk2206来抑制akt活性。在mk2206的作用下，外泌体神经保护作用显著减弱。同时，进行水迷宫实验来评估认知功能。SAH后两周的大鼠，学习过程更慢，需要更长的时间找到隐藏在水中的平台。而外泌体给药的大鼠表现明显优于对照组大鼠。
[0096] 在本发明中，在SAH患者的脑脊液(CSF)中也发现miR-21的增加，并且与迟发性脑缺血(DCI)的发生相关。PTEN/Akt信号通路受miR-21的调节，促进各种疾病(包括SAH)的细胞存活率。磷酸化473-Akt水平在SAH之后EBI期间显著下降。Akt信号被激活，以回应SAH的启动，但其活性无法持续以保护神经元，并且miR-21 作为上游调节器参与这一过程。进一步的研究可以揭示SAH发病机制所涉及的详细机制，以开发基于miR-21/PTEN/Akt信号通路的新疗法。使用qRT-PCR，观察到前额叶皮层和海马的miR-21的表达水平在SAH之后先增加，但随后下降，这意味着CSF中的miR-21可能来自神经元，并中断miR-21或在神经元中补充miR-21可以通过 PTEN/Akt信号通路帮助保护神经元免受SAH后EBI。
[0097] 在本发明中，确定了间充质干细胞外泌体(MSC-Exo)在SAH 大鼠模型中的保护作用。MSC-Exo显著改善神经评分，缓解SAH引起的脑水肿。利用外体追踪，验证MSC-Exo被受损的神经元所利用以发挥其作用。此外，与SAH_PBS组相比，TUNEL测定和Cleaved caspase-3/NeuN双染色显示SAH_Exo组凋亡减少，而SAH_PBS组也证实了这一点。MSC-Exo增加Bcl-2表达，并抑制前额叶和海马中的Bax和Caspase-3表达，表明它通过抑制线粒体凋亡通路抑制细胞凋亡。为了研究MSC-Exo在SAH中神经保护作用的机理，采用 miRNA外体测序来识别特定的分子货物。根据exRNAAtlas的在线数据，确定miR-21是调节治疗效果的关键靶点。
[0098] 因此，使用miR-21抑制剂和MK2206用于探索所涉及的机制，研究发现其中任何一种都足以损害MSC-Exo的影响。此外，在莫里斯水迷宫测试中，使用MSC-Exo治疗的SAH大鼠比使用PBS治疗的大鼠表现出更好的认知功能。简而言之，本发明证明了MSC-Exo 中的miR-21通过抑制神经元凋亡减轻了SAH后的脑损伤，并通过 PTEN/Akt通路改善了神经行为，这为有认知缺陷风险的SAH患者提供了潜在的新的恢复性治疗方法和策略。
[0099] 本发明未尽事宜为公知技术。
[0100] 上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
[0101] SEQUENCE LISTING
[0102] <110>山东大学齐鲁医院
[0103] <120>miR-21在诊治蛛网膜下腔出血中的应用
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