一种水稻光温敏核雄性不育基因tms3650及其分子标记和应用
阅读：3发布：2022-07-03
专利汇可以提供一种水稻光温敏核雄性不育基因tms3650及其分子标记和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种 水 稻光温敏核雄性不育基因tms3650及其分子标记和应用，属于基因工程技术领域。通过图位克隆的方法，tms3650被精细 定位 在水稻3号 染色 体上，位于分子标记RM15915和RM15937之间470.39kb的区段内。该基因与标记RM15931共分离，与标记RM15915和RM15937紧密连 锁 。tms3650的突变使水稻表现出长日高温不育，短日低温可育的光温敏感表型。tms3650的精细定位及紧密连锁标记的开发为水稻光温敏两系不育系的选育提供了新的不育基因源和分子辅助选择手段，在两系不育系选育中应用潜 力 巨大。，下面是一种水稻光温敏核雄性不育基因tms3650及其分子标记和应用专利的具体信息内容。
1.一种水稻光温敏核雄性不育基因tms3650，其特征在于，其定位在水稻3号染色体上，位于分子标记RM15915和RM15937之间470.39kb的区段内。
2.含有权利要求1所述水稻光温敏核雄性不育基因tms3650的生物材料，所示生物材料为表达盒、表达载体、宿主细胞。
3.与权利要求1所述水稻光温敏核雄性不育基因tms3650紧密连锁的分子标记，其特征在于，其为RM15915、RM15931或RM15937。
4.与水稻光温敏核不育性状相关的分子标记，其特征在于，含有分子标记：RM15915、RM15931和RM15937。
5.如权利要求3或4所述的分子标记，其特征在于，
所述RM15915由SEQ ID NO.1-2所示引物扩增得到；
所述RM15931由SEQ ID NO.3-4所示引物扩增得到；
所述RM15937由SEQ ID NO.5-6所示引物扩增得到。
6.一种试剂盒，其特征在于，含有以下任一或多个引物组：
引物组1：SEQ ID NO.1-2所示引物、引物组2：SEQ ID NO.3-4所示引物、引物组3：SEQ ID NO.5-6所示引物。
7.权利要求1所述水稻光温敏核雄性不育基因tms3650、或权利要求2所述的生物材料、或权利要求3-5任一所述的分子标记、或权利要求6所述的试剂盒在检测水稻光温敏核雄性不育基因tms3650、或该基因的基因型中的应用。
8.权利要求1所述水稻光温敏核雄性不育基因tms3650、或权利要求2所述的生物材料、或权利要求3-5任一所述的分子标记、或权利要求6所述的试剂盒在制备转基因植物、或作物改良育种、制种中的应用。
9.权利要求1所述水稻光温敏核雄性不育基因tms3650、或权利要求2所述的生物材料、或权利要求3-5任一所述的分子标记、或权利要求6所述的试剂盒在筛选或检测具有光温敏核雄性不育表型水稻中的应用。
10.如权利要求7-9任一所述的应用，其特征在于，
当使用RM15915标记引物进行扩增时，如果只出现200bp的条带，说明被检测材料是tms3650纯合基因型，具有光温敏雄性不育表型；如果只出现191bp的条带，说明被检测材料是tms3650纯合基因型，不具有光温敏雄性不育表型；如果同时出现200bp和191bp，的条带，说明被检测材料是tms3650杂合基因型，不具有光温敏雄性不育表型；
当使用RM15931标记引物进行扩增时，如果只出现156bp的条带，说明被检测材料带是tms3650纯合基因型，具有光温敏雄性不育表型；如果只出现150bp的条带，说明被检测材料是tms3650纯合基因型，不具有光温敏雄性不育表型；如果同时出现156bp和150bp条带，说明被检测材料是tms3650杂合基因型，不具有光温敏雄性不育表型；
当使用RM15937标记引物进行扩增时，如果只出现171bp的条带，说明被检测材料带是tms3650纯合基因型，具有光温敏雄性不育表型；如果只出现151bp的条带，说明被检测材料是tms3650纯合基因型，不具有光温敏雄性不育表型；如果同时出现171bp和151bp的条带，说明被检测材料是tms3650杂合基因型，不具有光温敏雄性不育表型。
一种水稻光温敏核雄性不育基因tms3650及其分子标记和
应用
技术领域
背景技术
[0002] 水稻是全球一半以上人口的主粮，提高水稻产量有助于帮助人类彻底摆脱饥饿问题。杂交水稻利用了水稻的杂种优势现象，使水稻的产量、抗性和适应性都有了较大提高。从上世纪60年代袁隆平先生提出利用水稻的雄性不育性生产杂交水稻开始，中国的杂交水稻经历了从三系到两系杂交稻的发展。三系杂交稻利用核质互作不育系进行杂交稻育制种，而两系杂交稻利用光温敏不育系进行杂交稻育制种。相对于三系不育系，两系不育系恢复系广、配组更为自由，大大简化了生产和繁殖过程，应用潜力巨大。
[0003] 光温敏雄性不育系，其育性受到温度和光照长度的影响。按照对光温条件反应的不同，光温敏不育系可以分为四类：1)光敏不育系，在长日照下不育，短日照下可育；2)反光敏不育系，在短日照下不育，长日照下可育；3)温敏不育系，在高温下不育，低温下可育；4)反温敏不育系，在低温下不育，高温下可育。一般而言，光敏不育系的育性也受到温度的影响，而温敏不育系的育性并不受光照的影响。粳稻品种农垦58s和籼稻品种安农s-1是研究和应用最广泛的光温敏雄性不育系，目前生产上应用的光温敏不育系大部分都是这两个品种的衍生系。
[0004] 为了更好地利用两系不育系，有必要分离控制光温敏雄性不育性的基因并阐明其分子作用机理。据不完全统计，目前己鉴定了20多个光温敏感型不育基因，其中，有pms3、tms5、csa、tms9-1、ugp1和ugp2等6个基因已被克隆，tms-1、rpms-1和rtms-1等15个基因已完成了定位。虽然众多的水稻光温敏核不育基因被定位或克隆，但对于调控水稻光温敏核不育性状的分子基础依然知之甚少。目前生产上使用的光温敏不育系多带有tms5和pms3基因。
发明内容
[0005] 本发明的目的是丰富现有技术中的光温敏核不育基因数量，提供一种水稻光温敏核雄性不育基因tms3650及其紧密连锁的标记和应用。
[0006] 本发明在前期研究工作中，用钴60辐射10公斤93-11种子得到M0代。辐射后的种子种植于海南省临高县试验田，成熟后分单株收种，共获得M1代材料约6500份。选种子量较多的3617个M1代材料种植成株系，每个株系种50个单株。分别在分蘖期、孕穗期、抽穗期、开花期、灌浆期筛选株型、穗型、育性、产量等各种类型突变体，并收种保存。在其中3650号家系中发现一种突变体表现为雄性不育，被命名为tms3650。该突变体呈现长日高温不育，短日低温可育的光温敏雄性不育表型，该表型由突变后的TMS3650单基因控制。
[0007] 本发明通过图位克隆的方法，将基因TMS3650精细定位在第3染色体短臂上的两个标记RM15915和RM15937之间470.39KB的染色体片段内，并且本发明还发现该片段与标记RM15931共分离，与标记RM15915和RM15937紧密连锁。
[0008] 因此本发明提供了一种水稻光温敏核雄性不育基因tms3650，该基因定位在水稻3号染色体上，位于分子标记RM15915和RM15937之间470.39kb的区段内，该区段中含有水稻光温敏核雄性不育基因tms3650。
[0009] 本发明提供了含有所述水稻光温敏核雄性不育基因tms3650的生物材料，所示生物材料为表达盒、表达载体、宿主细胞。
[0010] 本发明提供了与tms3650共分离的分子标记，其为RM15931，本领域技术人员能够理解分子标记RM15931与所述水稻光温敏核雄性不育基因TMS3650共分离。
[0012] 所述共分离标记RM15931的序列由如SEQ ID NO.3所示正向引物和如SEQ ID NO.4所示反向引物扩增得到。共分离标记RM15931的引物在以93-11或TMS3193突变体基因组DNA为模板时能扩增出一条156bp的条带，在以明恢63基因组DNA为模板时能扩增出一条150bp的条带。
[0013] 本发明提供了与tms3650紧密连锁的分子标记，其为RM15915或RM15937，本领域技术人员能够理解分子标记RM15915或RM15937与所述水稻光温敏核雄性不育基因tms3650紧密连锁。
[0014] 本发明发现在RM15915序列覆盖的范围内，93-11和明恢63基因组序列存在AATAATAAT共9个碱基的插入缺失。所述紧密连锁标记RM15915可由如SEQ ID NO.1所示正向引物与如SEQ ID NO.2所示反向引物共同扩增得到。扩增RM15915的引物在以93-11或TMS3193突变体基因组DNA为模板时能扩增出一条200bp的条带，在以明恢63基因组DNA为模板时能扩增出一条191bp的条带。
[0015] 本发明发现在RM15937序列覆盖的范围内，93-11和明恢63基因组序列存在AGAGAGAGAGAGAGAGAGAG共20个碱基的插入缺失。该紧密连锁标记RM15937的序列由如SEQ ID NO.5所示正向引物和如SEQ ID NO.6所示反向引物扩增得到。RM15937的引物在以93-11或TMS3193突变体基因组DNA为模板时能扩增出一条171bp的条带，在以明恢63基因组DNA为模板时能扩增出一条151bp的条带。
[0016] 基于本发明的发现，本发明提供了用于检测所述水稻光温敏核雄性不育基因tms3650的分子标记，其为以下任一分子标记：RM15915、RM15931和/或RM15937。
[0017] 所述RM15915由SEQ ID NO.1-2所示引物扩增得到；所述RM15931由SEQ ID NO.3-4所示引物扩增得到；所述RM15937由SEQ ID NO.5-6所示引物扩增得到。
[0019] 引物组1：SEQ ID NO.1-2所示引物、引物组2：SEQ ID NO.3-4所示引物、引物组3：SEQ ID NO.5-6所示引物。
[0020] 本发明进一步提供了水稻光温敏核雄性不育基因tms3650、或含有该基因的生物材料、或上述分子标记RM15915、RM15931和/或RM15937、或上述试剂盒在检测水稻光温敏核雄性不育基因tms3650、或该基因的基因型中的应用。
[0021] 本发明提供了水稻光温敏核雄性不育基因tms3650、或含有该基因的生物材料、或上述分子标记RM15915、RM15931和/或RM15937、或上述试剂盒在制备转基因植物、或作物改良育种、制种中的应用。
[0022] 本发明提供了水稻光温敏核雄性不育基因tms3650、或含有该基因的生物材料、或上述分子标记RM15915、RM15931和/或RM15937、或上述试剂盒在制备隐性雄性核不育的转基因植物中的应用。
[0023] 本发明提供的上述应用中，具体操作时，当使用RM15915标记引物进行扩增时，如果只出现200bp的条带，说明被检测材料是tms3650纯合基因型，具有光温敏雄性不育表型；如果只出现191bp的条带，说明被检测材料是tms3650纯合基因型，不具有光温敏雄性不育表型；如果同时出现200bp和191bp，的条带，说明被检测材料是tms3650杂合基因型，不具有光温敏雄性不育表型；
[0024] 当使用RM15931标记引物进行扩增时，如果只出现156bp的条带，说明被检测材料带是tms3650纯合基因型，具有光温敏雄性不育表型；如果只出现150bp的条带，说明被检测材料是tms3650纯合基因型，不具有光温敏雄性不育表型；如果同时出现156bp和150bp，的条带，说明被检测材料是tms3650杂合基因型，不具有光温敏雄性不育表型；
[0025] 当使用RM15937标记引物进行扩增时，如果只出现171bp的条带，说明被检测材料带是tms3650纯合基因型，具有光温敏雄性不育表型；如果只出现151bp的条带，说明被检测材料是tms3650纯合基因型，不具有光温敏雄性不育表型；如果同时出现171bp和151bp的条带，说明被检测材料是tms3650杂合基因型，不具有光温敏雄性不育表型。
[0026] 本发明还提供了所述tms3650基因及与tms3650紧密连锁的分子标记在筛选水稻光温敏不育系中的应用。在tms3650突变体与其它水稻品种或材料的杂交、回交或自交后代中，当使用RM15915、RM15931和/或RM15937标记引物进行扩增时，如果只出现200bp、156bp或171bp的条带，说明被检测材料带是tms3650纯合基因型，具有光温敏雄性不育表型；如果只出现191bp、150bp或151bp的条带，说明被检测材料是tms3650纯合基因型，不具有光温敏雄性不育表型；如果同时出现200bp和191bp，或156bp和150bp，或171bp和151bp的条带，说明被检测材料是tms3650杂合基因型，不具有光温敏雄性不育表型。
[0027] 本发明将一个新的水稻光温敏核雄性不育基因tms3650定位在一个470.39kb的染色体片段内，并与分子标记RM15931共分离，和与分子标记RM15915、RM15937紧密连锁。tms3650的鉴定为两系不育系的选育提供了新的基因资源，RM15915、RM15931和RM15937等标记的开发可以高效准确的对tms3650进行筛选，从而提高以tms3650为不育基因的两系不育系的选育效率。
[0028] 本发明的有益效果在于：
[0029] (1)本发明定位到了一个新的水稻光温敏隐性核雄性不育基因，为两系不育系选育提供了新的基因资源。
[0030] (2)tms3650突变体体是辐射诱变得来，可直接用于杂交水稻选育和不育系改良，为两系不育系选育提供了新的材料基础，经济价值巨大。
[0032] 图1的a显示3650家系中可育植株的花粉碘-碘化钾溶液染色结果；
[0033] 图1的b显示海南临高早造长日高温条件下tms3650突变体的花粉碘-碘化钾溶液染色结果；图1的c显示海南陵水冬季短日低温条件下tms3650突变体的花粉碘-碘化钾溶液染色结果。
[0034] 图2的A显示tms3650基因在染色体上的位置；图2的B显示tms3650基因的粗定位结果；图2的C显示tms3650基因精细定位的结果及紧密连锁标记的位置。
[0035] 图3是用紧密连锁标记RM15915检测tms3650和明恢63的F3群体中不育株的基因型。泳道1、2分别为tms3650、明恢63；泳道对应的60个样本为tms3650和明恢63的F3分离群体不育单株。
[0036] 图4是用紧密连锁标记RM15937检测tms3650和明恢63的f3群体中不育株的基因型。泳道1、2分别为tms3650、明恢63；泳道对应的30个样本为tms3650和明恢63的F3分离群体不育单株。
[0037] 图5是用共分离标记RM15931检测tms3650和明恢63的F3群体中不育株的基因型。泳道1、2分别为tms3650、明恢63；泳道对应的32个样本为tms3650和明恢63的F3分离群体不育单株。
[0038] 图6是用标记RM15915检测不同品种和这些品种与tms3650的F1杂交种的基因型。泳道1-12分别为亲本tms3650、野香B、9311、明恢63、中花11、GD-7S、隆科638S、特B、博II B、H28B、R51084、M3650，泳道13-22为F1杂交种tms3650/野香B、tms3650/9311、tms3650/明恢
63、tms3650/中花11、tms3650/GD-7S、tms3650/隆科638S、tms3650/特B、tms3650/博II B、tms3650/H28B、tms3650/R51084。
63、tms3650/中花11、tms3650/GD-7S、tms3650/隆科638S、tms3650/特B、tms3650/博II B、tms3650/H28B、tms3650/R51084。
[0039] 图7是用标记RM15937检测不同品种和这些品种与tms3650的F1杂交种的基因型。A图中泳道1-9分别为亲本tms3650、野香B、9311、明恢63、GD-7S、隆科638S、博II B、H28B、R51084，B图中泳道1-7为F1杂交种tms3650/野香B、tms3650/明恢63、tms3650/GD-7S、tms3650/隆科638S、tms3650/博II B、tms3650/H28B、tms3650/R51084。
[0040] 图8是用标记RM15931检测不同品种和这些品种与tms3650的F1杂交种的基因型。A图中泳道1-9分别为亲本tms3650、野香B、9311、明恢63、GD-7S、隆科638S、博II B、H28B、R51084，B图中泳道1-7为F1杂交种tms3650/野香B、tms3650/明恢63、tms3650/GD-7S、tms3650/隆科638S、tms3650/博II B、tms3650/H28B、tms3650/R51084。
具体实施方式
[0042] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0043] 实施例1水稻光温敏核雄性不育突变体tms3650的表型和遗传分析
[0044] 1)tms3650突变体的筛选
[0045] 2013年6月用钴60辐射10公斤93-11种子得到M0代。辐射后的种子种植于海南省临高县试验田，成熟后分单株收种，共获得M1代材料约6500份。2014年春，选种子量较多的3617个M1代材料种植成株系，每个株系种50个单株。分别在分蘖期、孕穗期、抽穗期、开花期、灌浆期筛选株型、穗型、育性、产量等各种类型突变体，并收种保存。在其中3650号家系中发现一种突变体表现为雄性不育，被命名为tms3650。
[0046] 2)tms3650突变体的表型分析
[0047] 在临高正季栽培条件下，用碘-碘化钾溶液(0.6％ki，0.3％i2，w/w)对3650家系不同植株的花粉进行染色分析。如图1的a所示，可育植株的花粉粒绝大部分大而圆，并且被染成蓝黑色。而tms3650突变体的花粉粒小而皱缩，并且不能被染色(如图1的b)。此外，可育植株套袋自交后正常结实，而tms3650突变体套袋自交后不结实。而以水稻品种93-11为父本给tms3650突变体授粉则可以结实。这些结果表明该tms3650突变体在长日高温条件下表现出雄性不育表型。将tms3650突变体的稻兜在2015年冬季种植于海南省陵水县提蒙镇，安排稻蔸在1-2月抽穗(经查询当时平均温度为17-24℃)。对抽穗后的花粉粒进行碘-碘化钾溶液(0.6％kI，0.3％I2，w/w)染色，结果表明花粉粒大而饱满，并被染成蓝黑色(图1的c)，说明tms3650突变体的雄性育性在短日低温条件下发生了转育，是一个光温敏雄性不育突变体。
[0048] 3)tms3650突变体的遗传分析
[0049] 在长日高温条件下种植tms3650的M4代分离群体90株，其中64株育性正常，26株表2
现雄性不育，可育与不育株分离比符合3:1(χ＝0.54，p>0.05)。用tms3650突变体与93-11回交，在回交后代一个110株的F3分离群体中，79株育性正常，31株不育，可育与不育株分离比也符合3:1(χ2＝0.44，p>0.05)。上述结果表明tms3650的雄性不育性状受由一对隐性单基因控制。
现雄性不育，可育与不育株分离比符合3:1(χ＝0.54，p>0.05)。用tms3650突变体与93-11回交，在回交后代一个110株的F3分离群体中，79株育性正常，31株不育，可育与不育株分离比也符合3:1(χ2＝0.44，p>0.05)。上述结果表明tms3650的雄性不育性状受由一对隐性单基因控制。
[0050] 实施例2光温敏雄性不育基因tms3650的初步定位
[0051] 使用极端性状混合池分析法(bulked segregant analysis)和隐性群体分析法(recessive-class analysis)对tms3650基因进行定位。以明恢63为父本与tms3650突变体杂交构建了一个F2群体，分离出了61个不育株。利用301对均匀分布于12条染色体上的SSR标记筛选93-11与明恢63之间具有多态性的标记，筛选得到64对具有多态性的SSR标记，多态性较低，表明明恢63与93-11在基因组序列上差异较小。分别构建所述F2群体的可育株和不育株的混合基因池，利用所述64对多态性标记对所述可育基因池与不育基因池进行分析。结果表明3号染色体上的SSR标记RM055和RM293与tms3650的突变表型存在连锁关系。进一步利用上述连锁标记逐个分析明恢63和tms3650的F2群体中的不育株的基因型，最终确定目标基因初步定位于SSR标记RM055和RM293之间，由此将tms3650初定位于3号染色体上(图2的A)。通过在SSR标记RM055和RM293之间继续筛选多态性标记，得到RM15900、RM15915、RM15947。tms3650基因与RM055、RM15900、RM15915、RM15947和RM293标记之间的交换单株分别为18个，2个，1个，0个，5个(图2的B)。
[0052] 实施例3水稻光温敏雄性不育基因tms3650的精细定位
[0053] 在上述粗定位结果的基础上，使用隐性群体分析法(recessive-class analysis)进行精细定位。利用连锁标记挑选F2群体中的tms3650杂合单株发展了一个F3群体，包含1112个单株，其中分离出不育株260株。同时，在标记RM15915和RM15947之间进一步开发了3个多态性标记(图2的C)。其中，用于检测分子标记RM15915的引物如SEQ ID NO.1-2所示；用于检测分子标记RM15931的引物如SEQ ID NO.3-4所示；用于检测RM15937的引物如SEQ ID NO.5-6所示。利用这些标记逐个检测F3群体中分离出不育株的基因型，发现在RM15915标记处只有2个不育株扩出了200bp和191bp的条带，而其它不育株都只扩出了200bp的条带(图
3)。这说明在260个不育单株中，有258个单株只扩增出了200bp条带，即具有200bp纯合带型时，有99.2％(258/260)的植株都表现出光温敏雄性不育表型。
3)。这说明在260个不育单株中，有258个单株只扩增出了200bp条带，即具有200bp纯合带型时，有99.2％(258/260)的植株都表现出光温敏雄性不育表型。
[0054] 而在RM15937标记处只有1个不育株扩出了一条151bp的条带，而其它不育株都只扩出了171bp的条带(图4)。这也说明在具有171bp纯合带型时，有99.6％(259/260)的植株都表现出光温敏雄性不育表型。
[0055] 标记RM15931在标记RM15915和RM15937之间(图2的C)，在标记RM15931处所有不育株都只扩增出了一条156bp的带型(图5)。这些结果说明tms3650基因定位在标记RM15915和RM15937之间470.39kb的染色体片段内并且与标记RM15931共分离。
[0056] 实施例4 RM15915、RM15937和RM15931在不同品种中的多态性
[0057] 为了验证RM15915、RM15937和RM15931三个标记在指示tms3650突变体光温敏雄性不育表型上的特异性，本发明分析了在多个品种中三个标记的多态性。这些品种包括两系不育系GD-7S、隆科638S，三系保持系野香B、特B、博II B、H28B，恢复系9311、明恢63、R51084，常规品种中花11。tms3650与这些品种的杂种F1均没有光温敏不育表型。图6显示，RM15915除了在tms4430和9311中扩增出200bp条带外，在其它亲本中只扩增出了207bp条带或不同于200bp和207bp的多态性条带，在tms3650与其它亲本的F1杂种中同时扩增出了200bp和包含双亲另一亲本的条带，说明RM15915可以在不同品种中特异性标记tms4430的光温敏雄性不育表型。图7显示，RM15937除了在tms3650和9311中扩增出171bp条带外，在其它亲本中只扩增出了151bp条带，在tms3650与其它亲本的F1杂种中同时扩增出了171bp和
151bp条带，说明RM15937可以在不同品种中特异性标记tms3650的光温敏雄性不育表型。图
8显示，RM15931除了在tms3650和9311中扩增出156bp条带外，在其它亲本中只扩增出了
150bp条带，在tms3650与其它亲本的F1杂种中同时扩增出了156bp和150bp条带，说明RM15931可以在不同品种中特异性标记tms3650的光温敏雄性不育表型。
151bp条带，说明RM15937可以在不同品种中特异性标记tms3650的光温敏雄性不育表型。图
8显示，RM15931除了在tms3650和9311中扩增出156bp条带外，在其它亲本中只扩增出了
150bp条带，在tms3650与其它亲本的F1杂种中同时扩增出了156bp和150bp条带，说明RM15931可以在不同品种中特异性标记tms3650的光温敏雄性不育表型。
[0058] 实施例5利用tms3650基因转育新的光温敏不育系
[0059] 用tms3650突变体与育性正常的受体，如野香B和博IIB，进行杂交、回交和自交，并在此过程中用分子标记进行tms3650基因和遗传背景选择，最终获得野香B和博IIB背景下带有纯合tms3650突变基因的隐性核不育系。具体实施步骤如下：
[0060] 1、以受体亲本，如野香B和博IIB，为父本与tms3650杂交获得F1。
[0061] 2、以F1为母本与受体亲本，如野香B和博IIB，回交获得BC1F1。
[0062] 3、种植BC1F1，分别使用引物序列如SEQ ID NO.1-2、或SEQ ID NO.3-4、或SEQ ID NO.5-6的引物对检测tms3650基因型，选择tms3650杂合基因型，即PCR扩增产物的条带同时出现200bp和191bp条带，或同时出现156bp和150bp条带，或同时出现171bp和151bp条带。
[0063] 4、使用一组基因型(例如200个)在tms3650突变体和轮回亲本之间存在多态性，且分布均匀的分子标记(包括但不限于SSR、SNP、INDEL、EST、RFLP、AFLP、RAPD、SCAR类型标记)，对步骤3中选出的单株进行遗传背景鉴定，选取与轮回亲本基因型相似度高(如大于88％相似度，或2％中选率等)的植株。
[0064] 5、用步骤4中选出的植株与受体亲本，如野香B和博IIB，回交获得BC2F1。
[0065] 6、种植BC2F1，重复步骤3和步骤4，选出tms3650基因型杂合，遗传背景回复率高(如大于98％，或2％中选率等)的植株，收自交种BC2F2。
[0066] 7、种植BC2F2，重复步骤3和步骤4，选出tms3650基因型杂合，遗传背景纯合率最高的植株，收自交种BC2F3。BC2F3后代中分离的tms3650纯合株即tms3650基因的光温敏不育系。
[0067] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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