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用电流处理小体积的方法

阅读：1039发布：2020-12-05

专利汇可以提供用电流处理小体积的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种用电流处理生物材料的方法，其中该生物材料被加入到具有相对高离子强度的小体积缓冲溶液中。预设好持续时间的高电压脉冲会在缓冲溶液中产生强电场。将生物材料加入到最多50μl的离子强度至少为100mmol/l的缓冲溶液中。通过预设持续时间为至少10μs的至少一电压脉冲，在缓冲溶液中产生场强至少1kV/cm的电场。电压脉冲至少断开至少100μs的持续时间一次，然后再次接通。，下面是用电流处理小体积的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用电流处理生物材料的方法，包括
提供不超过50μl的离子强度为至少为100mmol/l的缓冲液，
往所述缓冲液中加入生物材料，
向所述缓冲溶液施加预设持续时间至少10μs的至少一次电压脉冲以产生场强为至少1kV/cm的电场，其中在预定时间后将所述电压脉冲断开一段预定持续时间至少一次接着再接通，所述预定持续时间至少为100μs，且其中，每当需要达到电压脉冲的预设持续时间时重复所述电压脉冲的中断和再接通。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述电压脉冲断开2-10次。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述电压脉冲至少一次断开的持续时间预设为200μs-2ms。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述持续时间为300μs、400μs、500μs、
600μs、700μs、800μs、900μs、1ms或1.5ms。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述包含生物材料的缓冲溶液的总体积为
1μl到50μl。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述体积为10-40μl。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述体积为15-25μl。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述体积为10-20μl。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电压脉冲产生了最高场强为10kV/cm的电场。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述场强为1-8kV/cm。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述场强为2-6kV/cm。
12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述场强为2-4kV/cm。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电压脉冲的预设持续时间最长为5ms。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述预设持续时间为20μs-2ms。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述预设持续时间最长为100-1000μs。
16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述预设持续时间最长为100-600μs。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电压脉冲在电压间隔5μs、10μs、
20μs、30μs、40μs、50μs、60μs、100μs或200μs后被断开。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电场由两个电极产生，两个电极间的距离为0.5-5mm。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述距离为1-4mm。
20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述距离为1.5-2mm。
21.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在横截面基本上是正方形、矩形或圆形的反应容器中处理所述生物材料。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述反应容器具有基本上为矩形的反应室，该反应室两侧由具有平行平面构造的两个电极所限定。

说明书全文

用电流处理小体积的方法

发明领域

[0001] 本发明涉及用电流处理生物材料的方法。具体是将生物材料加入具有相对高离子强度的小体积缓冲溶液中，和在所述缓冲溶液中，通过高电压脉冲产生一段预设持续时间的强电场。

[0002] 背景

[0003] 将生物活性分子例如DNA、RNA或蛋白质引入活细胞是分析这些分子的生物学功能的重要手段。将外来分子引入细胞的优选方法是电穿孔方法，它与化学方法相反，不依赖于其它生物活性分子的同时转运。电穿孔方法中，用短暂电流将外来分子从适合细胞的缓冲溶液中或从细胞培养介质中引入细胞。通过进行短暂的电脉冲使细胞膜对外来分子具有渗透性。此外，细胞悬液通常位于所谓的试管内，即在顶端开口的狭窄容器中，其内部由两对平行排列和彼此相对的侧壁所形成。所述内部可以容纳细胞悬液，即一般是待处理细胞悬浮于其中的水性缓冲溶液或细胞培养介质。这类试管通常在相对侧壁对的较低位置具有一对电极，能够施用电压。这些电极的放电会在电极之间透过细胞悬液产生电流，使核酸和其它分子转运进入细胞，或根据所选择的条件引起细胞融合。

[0004] 短暂施加强电场，即高电流密度进行短脉冲的结果是，还可以融合细胞、细胞衍生物、亚细胞颗粒和/或小囊泡。在该所谓的电融合中，首先例如通过不均匀电交变场使所述细胞接近并实现膜接触。接下来施加电场脉冲使膜组分之间相互作用，最终导致融合。对电融合而言，可以采用与用于电穿孔的那些装置类似的装置。

[0005] 电穿孔方法中，生物活性分子最初通过细胞膜上临时产生的“孔”进入胞质。在某些情况下，所述分子还可能已在胞质中执行了感兴趣的功能，接下来，在某些条件下，还可以进入细胞核。具体是，当生物活性分子只能在细胞核中执行感兴趣的功能时，例如如果要分析基因的表达，和具体说，如果使用未分裂的或仅仅是低分裂率的细胞，例如原代细胞时，则有利的是生物活性分子直接转运进入细胞核。

[0006] 从公开于US2004014220(以其全文纳入本文作为参考)的电穿孔方法中可知，在此种情况下，为了获得高转染率，必须通过高电压脉冲在缓冲溶液中产生至少10μs预设持续时间的场强为至少2kV/cm的强电场。

[0007] 依靠高电流处理生物材料的方法也可从US2005064596中获知，以其全文纳入本文作为参考。该文所公开的方法中，将所述生物材料加入离子强度为至少200mmol/l的缓冲溶液中来确保细胞死亡率低而转染率高。

[0008] 主要是在不得不在尽可能短的时间内同时检测大量的反应批次的生物化学和药物学应用中，具体是在HT分析中(HT＝高通)，需要提供数量尽可能多的反应室，例如96或384。本文中使用的反应容器通常是指多孔板，微量滴定板或多个孔。这些容器中的各反应室(‘孔’)相对较小，从而只可容纳小体积。而且，使用较小的样品体积往往利于节约缓冲液和细胞材料。此外，尤其是对于昂贵的细胞材料，例如原代细胞，通常只能获得少量细胞。
因此在某种必须处理小样品体积的情况下，经常会有上述需求。

[0009] 当在液体中产生强电场时必然会带来的副作用是电水解。在最轻微的情况下，可以通过电极表面形成的气泡继而形成泡沫而注意到发生了电解。极端情况下，由于产生的顶替效应引起电极间区域内的样品飞溅而会发生爆发式气体形成(下文中指“飞溅”)。后者常引起样品损失或至少引起在预期时间内样品未留在电场内。从而，样品飞溅定性和/或定量地损害试验结果或样品处理结果，而且对结果的再现性产生消极影响。因此，在必须在电场中处理生物细胞的各种应用中，尤其是在电穿孔时，电解会产生不良副作用。

[0010] 理论上，可以通过减小电导率而降低飞溅发生的概率。然而，没有坚硬的细胞壁的高等细胞，通常仅能存活于具有特定摩尔渗透压浓度的溶液中。通常，电解质也是能使溶液具有或多或少的高电导率的有效等渗溶质。例如，为了完成电穿孔，通常有需要将离子引入细胞悬液，如US2005064596所公开(以其全文纳入本文作为参考)，这样做也是有利的。因此，出于实际的考虑，通过减小电导率来降低飞溅概率有其局限性。因此，这种情况下，可以预期会有不同程度的电解。

[0011] 因此，飞溅的发生是一种随机事件。这意味着该事件仅能通过概率来描述。根据所述条件，不需要的飞溅发生的频率可以，例如，低于5％，但也可以高于95％。因此，当在高电流密度下采用小体积时，飞溅发生的概率尤其高。为了开发一种针对该生产状况的方法，要解决的问题是用合适的方法来降低概率，例如，用户用这个方法将概率控制到低于1％。

[0012] 因此，本发明要解决的问题是提供一种前述类型的方法，其中，电极间区域样品不希望的飞溅的频率显著降低。

[0013] 发明概述

[0014] 本发明方法解决了该问题，其中，将生物材料加入离子强度至少约100mmol/l的至多约50μl的缓冲溶液中，通过至少一次电压脉冲在至少10μs的预设持续时间内产生场强至少约1kV/cm的电场。将电压脉冲断开至少一次，持续时间至少约100μs，和接着再接通。从而使电压脉冲的预设持续时间符合未被断开的脉冲实际持续时间，即符合电流实际流通的总净时间。因此，由于电压脉冲断开时的额外时间段，脉冲的总持续时间因此而延长，因此，电压脉冲从释放到结束，即直到达到预设持续时间，实际上比预设持续时间要长。根据本发明方法，在预定时间后将所述电压脉冲断开一段预定持续时间，然后再接通。每当需要达到电压脉冲的预设持续时间时就重复这个过程。因此必须以足够的频率断开所述电压，以使缓冲溶液中产生的气体减少到足以防止电极间区域样品飞溅的程度。而且，各次断开的持续时间要足够长，以防止电极间区域样品飞溅。因此，通过断开电压脉冲，可以在所述条件下显著降低飞溅频率，而维持所用方法的效率，具体是转染效率。

[0015] 例如在电穿孔时，不需要的飞溅的频率一方面取决于电流密度(场强x特定电导率)和施加电场期间的时间间隔。因此电流密度和时间间隔与电解每份样品体积所产生气体的量直接相关。场强和时间间隔决定了实现例如，高转染效率或将分子直接转运进核所需的条件。这两个参数之一比最佳细胞类型特异性条件低常会使检测结果定性和/或定量地降低。因此，不可能减小这些参数之一或只可能在限制程度内减小。另一方面，飞溅概率负取决于样品体积(质量)。这种依赖性起因于较大体积的惰性较大。短时窗口内，试管凹口内更可能存在较大体积。因此，等效条件下的小体积尤其经常会发生飞溅。因此，飞溅问题对HT领域的方法起着特殊作用。然而，对于特殊应用，尤其是高通量领域，不能增加样品体积。一方面，自动化液体处理系统无法处理大量的体积增加的样品，或仅仅是费用增加，另一方面，考虑到有关的费用，可获得的细胞材料量(和可能的试剂)常常要受到限制。而且，使用大体积就其它原因而言也可能是不利的。细胞浓度降低会使例如电穿孔期间的细胞存活率或电融合期间的效率从之前的某点变成显著更遭的结果。因此，尤其是采用HT方法时，实际上不能选择增加体积。因此，本发明方法在预定条件下能有效和可靠地显著降低飞溅发生的频率。

[0016] 本发明的一有利实施方式中，将所述电压脉冲断开2-10次，包括3、4、5、6、7、8和/或9次。因此，断开次数取决于预设条件，具体是电流密度、脉冲持续时间和所提供的体积。针对各次运用和/或采用的细胞类型，通常需要根据经验确定最佳断开次数。但这种凭经验确定还是在技术人员能力范围内。

[0017] 根据本发明，对至少一次断开可以预设的持续时间为约200μs-约2ms，优选约300μs、约400μs、约500μs、约600μs、约700μs、约800μs、约900μs、约1ms或约
1.5ms。只要断开间隔不超过某个长度，就可以防止样品飞溅而不对方法结果质量产生负作用。因此，针对各次运用和/或采用的细胞类型，通常需要根据经验分别确定最佳断开持续时间和/或断开。但这种凭经验确定在技术人员能力范围内。降低飞溅发生概率所需的持续时间尤其还取决于预设条件，即电流密度、脉冲持续时间和所提供的体积。

[0018] 含有生物材料的缓冲溶液的体积可以是，例如，总量在约1-50μl，优选约10-40μl，特别优选约15-25μl，具体是约10-20μl。而且，所采用的体积通常取决于所提供的生物材料和/或化学工程条件。

[0019] 本发明另一有利实施方式中，所述电压脉冲产生电场的最大场强为约10kV/cm，优选约1-8kV/cm，尤其优选约2-6kV/cm，具体约2-4kV/cm。这种高电压脉冲尤其适合于真核细胞的电穿孔，具体是将核酸引入细胞核中。

[0020] 本发明再一有利实施方式中，所述电压脉冲的预设持续时间最长为约5ms，优选约20μs-约2ms，尤其优选约100-约1000μs，具体是约100-约600μs。因此，预设持续时间是没有断开的电压脉冲的预定长度，即分别是实际施加电流和电流流通的时间段。预设持续时间通常是对各次运用和/或采用的细胞类型而言是最佳的凭经验决定的值。具体说，可以预计由本发明方法提供的电压脉冲的断开引起效率稍微降低，在某些情况下，可以通过例如在某一限度内将预设持续时间延长超出经验决定值以外而改善这种效率的降低。
用这种方式，在个例中，有可能弥补断开电压脉冲可能带来的负作用。

[0021] 本发明有利实施方式中，还提供了大约在电压间隔约5μs、约10μs、约20μs、约30μs、约40μs、约50μs、约60μs、约100μs或约200μs之后断开电压脉冲。可以在第一个电压间隔或一个或多个后续电压间隔时运用。因此，电压间隔分别是施加电压和在缓冲溶液中产生电场的时间段，它之后或之前是断开间隔。某些条件下，通过缩短一个或多个电压间隔，可以进一步降低飞溅概率和/或将其降到最低。

[0022] 根据本发明，可以在两个电极之间产生电场。在本发明一特别有利的实施方式中，两个电极之间的距离可以是约0.5-5mm，优选约1-4mm，具体约1.5-2mm。任何情况下，电极间的距离大小根据所采用的反应容器的几何学构造而定，这样所提供的缓冲溶液体积足以弄湿电极间区域。

[0023] 本发明有利实施方式中，进一步提供的是，在具有基本上是方形、矩形或圆形的横截面的反应容器中处理生物材料。而且，所述反应容器可以具有基本上是矩形的反应室，其侧面由具有平行平面结构的两个电极所限定。

[0024] 以下通过以实施例的方式参考附图来更具体地描述本发明。

[0025] 附图简述

[0026] 图1是基于电压、高通量Nucleofector (HT-β，德国埃麦克萨股份公司(AmaxaGmbH))、20μl细胞悬液体积、1.5mm试管缺口宽度、203mmol/l缓冲溶液离子强度(电导率：11.3mS/cm)的飞溅频率的条形图，黑色阴影部分显示各个样品的飞溅频率，n＝样品数。

[0027] 图2是基于脉冲持续时间、高通量Nucleofector (HT-β，德国埃麦克萨股份公司)、20μl细胞悬液体积、1.5mm试管缺口宽度、129mmol/l缓冲溶液离子强度(电导率7.2mS/cm)的飞溅频率的条形图，黑色阴影部分显示各个样品的飞溅频率，n＝样品数。

[0028] 图3是基于电压脉冲的断开持续时间、高通量Nucleofector (HT-β，德国埃麦克萨股份公司)、20μl细胞悬液体积、1.5mm试管缺口宽度、203mmol/l缓冲溶液离子强度(电导率：11.3mS/cm)的飞溅频率的条形图，黑色阴影部分显示各个样品的飞溅频率，n＝样品数。

[0029] 图4是基于未断开的电压间隔的最长持续时间、高通量Nucleofector (HT-β，德国埃麦克萨股份公司)、20μl细胞悬液体积、1.5mm试管缺口宽度、203mmol/l缓冲溶液离子强度(电导率11.3mS/cm)的飞溅频率的条形图，黑色阴影部分显示各个样品的飞溅频率，n＝样品数。

[0030] 图5是基于电导率和/或缓冲溶液离子强度、高通量Nucleofector (HT-β，德国埃麦克萨股份公司)、20μl细胞悬液体积、1.5mm试管缺口宽度、缓冲溶液离子强度的飞溅频率的条形图，黑色阴影部分显示各个样品的飞溅频率，n＝样品数，缓冲液1：离子强度203mmol/l和电导率11.3mS/cm，缓冲液2：离子强度129mmol/l和电导率7.2mS/cm。

[0031] 图6是基于细胞悬液体积、高通量Nucleofector (HT-β，德国埃麦克萨股份公司)、1.5mm试管缺口宽度、129mmol/l缓冲溶液离子强度电导率7.2mS/cm)的飞溅频率的条形图，黑色阴影部分显示各个样品的飞溅，n＝样品数。

[0032] 图7是基于细胞悬液体积、高通量Nucleofector (HT-β，德国埃麦克萨股份公司)、1.5mm试管缺口宽度、203mmol/l缓冲溶液离子强度电导率11.3mS/cm)的飞溅频率的条形图，黑色阴影部分显示各个样品的飞溅频率，n＝样品数。

[0033] 图8是基于电压脉冲断开持续时间、高通量Nucleofector (HT-β，德国埃麦克萨股份公司)、1.5mm试管缺口宽度、203mmol/l缓冲溶液离子强度(电导率11.3mS/cm)的5
转染效率的条形图，为了检测转染效率，相应地将2×10 个HEK293细胞加入20μl缓冲溶液中，再加入0.1μg的pEGFP-C1(美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen))和暴露于
4kV/cm的电场中，然后将细胞加入带有100μg/ml 链霉素、100U/ml青霉素和10％马血清(ATCC)的极限必需伊格尔培养基(ATCC)中，在加湿培养箱中在37℃和5％CO2下培养24小时，最后用流式细胞术(FACSCalibur，碧迪公司(Becton Dickinson))检测样品的GFP表达，显示各个GFP表达细胞的百分比双倍值，条形图正文涉及场暴露的断开；所有数据都用μs表示，开始和结束时的数字表示未断开电压间隔的持续时间，水平线之间的数字表示它们之间的断开持续时间(P＝间歇)。

[0034] 图9是基于电压脉冲断开持续时间、高通量Nucleofector (HT-β，德国埃麦克萨股份公司)、1.5mm试管缺口宽度、203mmol/l缓冲溶液离子强度(电导率11.3mS/cm)的5
转染效率的条形图，为了检测转染效率，相应地将2×10 加卡特E6.1(jurkat E6.1)细胞加入20μl缓冲溶液中，再加入1μg的pmaxGFP(埃麦克萨)和暴露于1.25kV/cm的电场中，然后将细胞加入带有100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素和10％FCS(ATCC)的RPMI-1640培养基(ATCC)中，在加湿培养箱中在37℃和5％CO2下培养24小时，最后用流式细胞术(FACSCalibur，碧迪公司)检测样品的GFP表达，显示各个GFP表达细胞的百分比双倍值，条形图正文涉及场暴露的断开；所有数据都用μs表示，开始和结束时的数字表示未断开电压间隔的持续时间，水平线之间的数字表示它们之间的断开持续时间(P＝间歇)。

[0035] 各种和优选实施方式详述

[0036] 图1显示基于电压的飞溅频率的条形图，比较了分别在有和没有断开的情况下进行的两种不同的电压脉冲所得的结果。第一种电压脉冲在外部施加电压为800V时的预设持续时间为100μs。这样提供了可以从电压和电极间距离计算出的约为4kV/cm的场强。第二种电压脉冲的预设持续时间也是100μs，但施加电压是1000V，场强可以由电压计算得到，为约5kV/cm。这两种电压脉冲在40μs(T1最大)后被分别断开两次，即在40μs后将脉冲断开，然后再接通，又一个40μs后再次断开和最后在电压间隔20μs时结束，从而达到总预设持续时间100μs。断开的持续时间分别为800μs(T1间歇)。总体上，各电压脉冲由3次电压间隔和2次断开间隔组成，脉冲的完整持续时间加起来总共有1700μs。这很清楚，在预设条件下施加较低电压和/或场强的电压脉冲不会引起样品喷溅，即在这种情况下，样品不会飞溅。相反，较高电压和/或场强的电压脉冲会引起样品喷溅(第三条)。
可以通过两次断开电压脉冲(最后的条)可以防止该不希望的飞溅。因此，本图显示，一方面，在其它条件恒定时，随场强的升高，飞溅概率增加，另一方面，即使在非常高的场强下，也可以通过断开电压脉冲而防止样品从反应容器中喷溅。至少通过断开脉冲可以显著降低发生飞溅的概率。

[0037] 图2显示基于脉冲持续时间的飞溅频率的条形图，采用强度为700V(3.5 kV/cm场强)的电压脉冲，预设持续时间分别增加为200、350、400和600μs。图中显示飞溅频率百分比随脉冲持续时间的增加而增加。在600μs的最长预设持续时间下，按本发明所述断开电压脉冲，可以有效防止样品的飞溅。为此，电压脉冲在200μs(T1最大)后分别断开2次，即在200μs后断开脉冲，然后再接通，又一个200μs后再次断开，最后在电压间隔再次达到200μs时结束，从而达到总预设持续时间600μs。断开持续时间相应为2.5ms(T1间歇)。总体上，各电压脉冲是由3次电压间隔和2次断开间隔组成，脉冲的总持续时间加起来总共5.6ms。这清楚说明了在电压脉冲的预设持续时间相对长时，引起样品飞溅的概率高(第四条)。可以通过两次断开电压脉冲来防止不希望的飞溅(最后的条)。因此，一方面，在其它条件恒定时，飞溅概率随脉冲持续时间的增加变得更高；另一方面，即使在相对长的预设持续时间时，也可以通过断开电压脉冲而防止样品从反应容器中喷溅出来。

[0038] 图3显示基于电压脉冲断开持续时间的飞溅频率的条形图。该实施例中清楚显示了至少在特定的运用和/或条件下，通过延长断开的持续时间，可以进一步减少样品飞溅。采用不断开(第一条)、断开11次×每次400μs(第二条)或断开11次×每次800μs(第三条)的电压为700V(3.5kV/cm场强)的电压脉冲和600μs的预设持续时间。断开的脉冲由长度各50μs的12次电压间隔(T1最大)和各为400μs或800μs的11次断开间隔(T1间歇)组成。如果在这些条件下没有根据本发明断开电压脉冲，每次测试和/或每个样品均会发生飞溅。在断开持续时间为400μs时，约70％的样品同时发生飞溅，然而，在这些条件下，通过是断开持续时间加倍可以完全防止飞溅。自然状态下，缓冲溶液中的物质间的关系随断开时间的增加而‘平静’下来，因此，在断开后的电压间隔期间，样品中不会再形成气体。

[0039] 图4显示基于未断开电压间隔的最大持续时间的飞溅频率的条形图。本试验实际在与如图3所示试验相同的条件下进行，区别在于断开持续时间(T1间歇)保持恒定在400μs，而电压间隔的最大长度(T1最大)即产生电场的持续时间发生了变化。当对T1最大＝100μs和T1最大＝40μs的试验进行比较时，结果清楚显示电压间隔(即直到电压脉冲被断开时的时间段)缩短，飞溅概率降低。而且，本实施方式中，多个因素表明在40-50μs间存在阈值，即此例中，飞溅概率对T1最大不成正比关系。

[0040] 图5显示基于电导率和/或缓冲溶液离子强度的飞溅频率的条形图。当采用较高离子强度的缓冲液(缓冲液1：离子强度203mmol/l和电导率11.3mS/cm)时，飞溅的风险明显高于采用较低离子强度的缓冲液(缓冲液2：离子强度129mmol/l和电导率7.2mS/cm)发生飞溅的风险。然而，这两个所示实施例中，还是可以按照本发明通过断开电压脉冲来防止飞溅。

[0041] 图6和7分别显示基于细胞悬液体积的飞溅频率的条形图。这两张图清楚显示了细胞悬液和/或缓冲溶液的体积越小，飞溅概率越高。就这点而言，图6实施例显示，甚至在采用的体积非常小的应用中仍可以将飞溅概率实际减少到零。

[0042] 图8和9分别显示基于电压脉冲断开持续时间的转染效率的条形图。令人惊奇的是，转染效率没有受本发明电压脉冲断开的负面影响。本方法的效率总是维持在大致同样高的水平，而不管电压脉冲是否断开：断开(第2-5个双柱)或未断开(第1和第6个双柱)。

[0043] 总体上，显示了在其它所述条件(场强和/或电流密度、电压脉冲预设持续时间、缓冲溶液体积)下，为了充分防止飞溅的发生和/或样品从反应容器中喷溅的概率，电压间隔不可以超过特定未断开长度。这样，在其它预设条件下的飞溅问题可通过断开脉冲和/或使电压间隔不超过关键未断开长度而得以解决。因此，断开电压脉冲会显著降低飞溅概率，而不会削弱方法的质量，此情况下尤其指转染效率。

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