技术领域
[0001] 本
发明涉及生物医药行业，具体为将医疗器械技术与医药生物技术协同创新，针对大面积
皮肤缺损这一严重影响
生活质量的多发病进行
治疗的细分市场，提供一种间充质干细胞结合生物材料的微球及智能喷洒系统。
背景技术
[0002] 伤口的愈合是一个复杂的动态过程，包括
炎症、增生和重塑等不同阶段并相互重叠。较大面积的皮肤缺损的危害：一是原发病或缺损面积过大导致伤口难以愈合进而引起继发感染等并发症，二是慢性炎症等因素会导致上皮向间充质转化(epitheLiaL-mesenchymaL transition)(Li et aL.,2016)，出现局部
纤维化并产生瘢痕，影响表观外貌和正常功能。因此，理想的
治疗方案应兼顾
加速伤口愈合并减少瘢痕等并发症产生。但迄今为止，尚未有真正恢复皮肤结构和重建功能的人工皮肤产品问世。现有产品常会出现血流循环建立不良、抗机械压
力和
摩擦力差、难以整合到局部微环境、易形成瘢痕和免疫排斥等种种
缺陷。干细胞是一类具有自我增殖能力和多向分化潜能的细胞，在人体的多个组织和器官都已经分离得到了不同类型的干细胞。随着干细胞研究的深入和技术的进步，目前干细胞成为皮肤修复治疗的最有希望的方向。干细胞不仅可以原位替代组织损伤丢失的细胞，更可以分泌多种细胞因子调节局部微环境，拮抗伤口疤痕形成。
[0003] 间充质干细胞(mesenchymaL stem ceLLs，MSC)是目前细胞移植治疗的理想选择。较其它细胞类型而言，间充质干细胞具有不可比拟的优点：(1)其体外扩增能力强，易于获得足够数目的干细胞进行下一步移植治疗；(2)具有跨胚层分化的能力，是目前所知能提供皮肤多层结构天然修复的最佳细胞来源；(3)具有免疫调节功能，可降低伤口部位的炎性反应，同时，低免疫原性使异体移植成为可能；(4)具有强大的旁分泌功能，可分泌多种细胞因子和生长因子促进修复过程。动物实验表明，MSC局部移植显著加快皮肤伤口的愈合速度，并显著对抗伤口纤维化和疤痕形成，显示出巨大的临床应用前景(Akram et aL.,2013)。早在2005年，Ichioka就报道了一例应用骨髓基质干细胞治疗一例慢性腿部溃疡病例，在移植后两周创面开始显现修复迹象，并出现了健康的肉芽组织(Ichioka et aL.,2005)。2008年Yoshikawa联用人工皮肤(PeLnac)和骨髓基质干细胞治疗20例患有慢性下肢伤口的病人，
16例病人伤口显示全部愈合(Yoshikawa et aL.,2008)。此类干细胞相关临床实验在全球开展已近6000例，很多都取得了其它治疗方法无法达到的疗效。
[0004] 但细胞替代治疗的普遍问题是细胞分化效率及移植后存活率低，主要影响因素有：1)从体外2D培养条件到体内3D组织微环境及组织成分的改变；2)
机体对移
植物的免疫排斥和炎性反应；3)体外二维培养过程中细胞缺乏与细胞或细胞外基质间相互作用；4)
收获细胞过程中的酶消化或机械损伤等。三维立体培养及生物材料的发展为解决细胞治疗中这些问题提供了新的有力工具。与传统的二维平面培养体系相比，三维培养可以最大程度的模拟体内环境，增加细胞间通讯连接，又能实现细胞培养条件可控，提高分化效率。通过在生物材料上接枝或固定细胞外基质成分或其它蛋白分子则可有效增加干细胞移植后的存活率。本项目根据皮肤伤口特点精准设计、开发新型智能型生物材料，并制备相应的细胞3D培养微球，形成与喷洒系统相匹配的“子弹”，提高移植干细胞的分化和存活效率，提高干细胞治疗皮肤伤口的疗效。由于细胞类产品的脆弱性以及干细胞提取过程的复杂性和高难度，干细胞的价格昂贵，而且根据个人体质和年龄的差异性，能够获得的活效干细胞数量有限，因此，与干细胞相匹配的喷洒
给药系统十分必要。
发明内容
[0005] 针对
现有技术中存在的不足之处，本发明的目的在于提供一种间充质干细胞结合生物材料的微球及智能喷洒系统，不仅制备了3D干细胞培养微球，而且提供了用于该微球
喷涂的智能喷洒系统，以提高移植干细胞的分化和存活效率，增强干细胞治疗皮肤伤口的疗效。
[0006] 本发明提供了一种间充质干细胞结合生物材料的微球，所述微球的制备过程如下：
[0007] 1)制备临床用级别的间充质干细胞，保存待用；
[0009] 3)在所述海藻酸钠材料上接枝或
固化蛋白成分，得到被修饰的海藻酸钠材料；
[0010] 4)将所述被修饰的海藻酸钠材料与所述间充质干细胞的细胞悬液相混合，将该
混合液通过三维微球发生装置滴入氯化
钙溶液中；
[0011] 5)待海藻酸钠材料与
氯化钙充分交联后，抽离氯化钙溶液，并用培养液清洗，即得到所述间充质干细胞结合生物材料的微球。
[0012] 优选的是，步骤2)中所述的部分氧化的海藻酸钠材料是采用高碘酸钠氧化法制备，操作过程如下：
[0013] S1、用去离子
水配制0.25moL/L高碘酸钠溶液，避光储存备用；
[0014] S2、用去离子水配制浓度为1％的海藻酸钠溶液,并加入适量所述高碘酸钠溶液，置于
冰上避光震荡反应1-1.1小时；
[0015] S3、向体系中加入适量乙二醇用于终止氧化反应，20-30分钟后再加入适量的
氯化钠和无水
乙醇，析出海藻酸钠水凝胶；
[0016] S4、将所述海藻酸钠水凝胶溶解于去离子水中，并置于
透析袋中72小时至透析干净；其中，每天换水3-5次；
[0017] S5、将透析袋中的海藻酸钠溶液倒入容器中，
冷冻干燥，即得到部分氧化的海藻酸钠材料。
[0018] 优选的是，步骤3)中所述接枝或固化蛋白成分的操作过程如下：
[0019] S1、将所述部分氧化的海藻酸钠材料用去离子水配制成20g/L的溶液，并加入1-1.5mL/L
醋酸、0.06-0.08mmoL/L水杨
醛或者其衍生物，在4℃下避光振荡反应2小时；
[0020] S2、向前述溶液中加入适量待接枝或固化的蛋白成分，避光震荡反应2-2.5小时，使所述蛋白成分与部分氧化的海藻酸钠通过腙键接枝或固化；随后加入0.2-0.25mmoL/L
硼氢化钠在常温下震荡反应1-1.5小时；
[0021] S3、向溶液中加入3倍体积去离子水，并在4℃下置于透析袋中48-72小时至透析干净，得到接枝或固化蛋白成分的海藻酸钠材料，冷冻干燥保存。
[0022] 优选的是，所述接枝或固化蛋白成分的海藻酸钠材料在使用时用去离子水配成3％的水溶液，并用0.22μm
过滤器过滤除菌。
[0023] 优选的是，所述蛋白成分具有自由的
氨基，选自细胞外基质、表皮生长因子等多肽或者
抗体类蛋白成分。
[0024] 优选的是，制备的所述间充质干细胞结合生物材料的微球在细胞培养液中放入CO2
培养箱中进行培养。
[0025] 本发明还提供了一种间充质干细胞结合生物材料的智能喷洒系统，包括：
[0026] 运输系统，由
蠕动泵和磁力
转子组成，用于无菌输送所述微球；
[0027] 推注系统，由
电压微泵、
喷嘴和
喷枪组成，用于固定或手持喷洒所述微球；
[0028]
监控系统，由流量监控和
温度监控组成；
[0029]
支撑系统，由主控板、电源和制成结构组成，用于控制整个喷洒系统。
[0030] 优选的是，所述流量监控通过流量
传感器和
电路板实现；其中，所述
电路板具有
数模转换和
模数转换功能。
[0031] 优选的是，所述温度监控通过温度传感器、加热单元、制冷单元和电路板实现；其中，所述加热单元选用
电阻丝，所述制冷单元选用
半导体制冷器，所述电路板具有数模转换和模数转换功能。
[0032] 本发明的有益效果是：本发明中所涉及的间充质干细胞结合生物材料的微球及智能喷洒系统，首先选用海藻酸钠作为载体生物材料，并对其进行部分氧化处理；随后通过腙键固载带自由氨基的蛋白成分，其中通过对海藻酸钠进行特殊处理，即部分氧化、添加氢氧化锂作为
碱性催化剂、使用水杨醛或其衍生物以辅助因子，有效提高了材料对含氨基的蛋白成分的固定效率；然后用硼氢化钠还原腙键得到C-N单键，使蛋白成分的固载更加稳定长久；最后以固载蛋白成分的材料与干细胞混合制备细胞3D培养微球，能最大程度的模拟体内环境，增加细胞间通讯连接，使细胞培养条件可控，提高了分化效率，有效增加干细胞移植后的存活率，提高干细胞治疗皮肤伤口的疗效。由于细胞类产品的脆弱性，在移植过程中极易被损失破坏，因此本案中还提供了与该微球相匹配的喷洒给药系统，本系统以结合干细胞的微球作为“子弹”，准确高效的喷洒至患处，避免了不必要的损失和浪费。
附图说明
[0033] 图1为海藻酸钠材料接枝或固化蛋白成分的过程示意图；其中，灰色椭圆为蛋白成分；
[0034] 图2为间充质干细胞结合生物材料的微球喷洒系统的示意图。
具体实施方式
[0035] 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照
说明书文字能够据以实施。
[0036] 应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
[0037] 以下通过具体
实施例进一步说明本发明。但实施例的具体细节仅用于解释本发明，不应理解为对本发明总的技术方案的限定。
[0038] 步骤一、制备临床用级别脂肪干细胞，体外鉴定其功能并完成质控；
[0039] 其中，所有操作和所用
试剂均参照cGMP指南和中国《干细胞通用要求》规定，并在按照GMP标准设计的高洁净级细胞生产车间内完成，脂肪组织来源于外科或抽脂手术，进入工作间前先进行各种文件及外观标记的检查；在生物安全柜中洗涤脂肪组织、去除筋膜并剪碎，之后用胶原酶-NB6消化30分钟，中止后离心弃上清，沉淀重悬后300目滤网过滤，计数后按8×104个/cm2的接种
密度接种入培养瓶。培养液为DMEM中加入灭活处理过的患者自体血清或药用级别胎
牛血清；在细胞达到85-90％连续性后，进行TrypLE传代并根据需求进行再次传代或冷冻保存细胞。
[0040] 脂肪干细胞生产质控为尽可能的保证干细胞制剂的安全性、避免污染、免疫反应和其它副反应等，在细胞培养过程中，尽可能的避免动物来源的添加物，如无法避免则必须使用符合GMP标准的临床用或药用等级制剂。所有质检步骤形成标准化流程(standard operating practice，SOP)并记录在案。在培养前、中及移植前分别选取适当指标，做
微生物、传染性
疾病、细胞状态、核型分析和干细胞表面标志物分析。
[0041] 步骤二、制备智能生物材料；本案中可以通过以下几种方式：(1)在水凝胶材料上接枝或固定细胞外基质成分或表皮生长因子等多肽或者抗体类蛋白成分，为移植细胞创造更好的局部微环境，海藻酸钠被高碘酸钠部分氧化产生醛基，而多肽或抗体类蛋白成分含有自由的氨基，醛基与氨基可发生席夫碱反应进行接枝，之后通过硼氢化钠还原可进一步固定蛋白成分到海藻酸钠材料上，据此将蛋白成分接枝到三维培养微球材料上；(2)制备可降解海藻酸钠微球，使用高碘酸钠氧化法制备部分氧化的海藻酸钠，通过调节氧化程度控制微球结构在体内自降解，降低移植过程中的损伤，提高移植效率；(3)层层自组装技术微囊化移植细胞，依据静电
吸附原理制备海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)或海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠(ACA)微囊，让小分子营养物质穿透的同时阻止炎性大分子攻击微囊内移植细胞，在促进移植细胞存活的同时协助避开移植反应的免疫反应高发期。
[0042] 根据实际情况，本
申请选择使用方式(1)中的方法先制备部分氧化的海藻酸钠材料，再在所述海藻酸钠材料上接枝或固化蛋白成分，得到被修饰的海藻酸钠材料。
[0043] 具体为，制备部分氧化的海藻酸钠材料：
电子天平称取0.2675g高碘酸钠，加入5mL去离子水，配制成0.25M高碘酸钠溶液置于
铝箔包覆的10mL离心管中避光储存，备用；取三支50mL离心管并编号，分别称取0.5g海藻酸钠加入50mL去离子水中制得浓度为1％的海藻酸钠水溶液；在编号分别为abc的三支离心管中分别加入1000μL、500μL、250μL的0.25M高碘酸钠水溶液，在冰上避光震荡反应1小时，1小时后向三支离心管中分别加入200μL乙二醇用于终止氧化反应；20分钟后再向各离心管中加入0.15g氯化钠，再向各离心管中加入等体积的无水乙醇使得部分氧化的海藻酸钠得以析出，加入少许去离子水溶解，置于透析袋中透析72小时，每天换水3至5次；待水凝胶透析干净，将透析袋中的部分氧化的海藻酸钠水溶液分装至50mL离心管中，放至-80摄氏度
冰箱，待完全冷冻后，得到氧化程度不同的三种海藻酸钠材料，用冻干仪将材料冻干。
[0044] 海藻酸钠通过高碘酸钠部分氧化后会产生醛基，醛基可与蛋白成分的自由氨基形成腙键，之后通过硼氢化钠还原成稳定的C-N单键，这样蛋白成分会稳定接枝固定在材料表面，在细胞培养过程中无需再次在培养基中添加细胞因子，这样既保证了细胞因子持续的刺激
信号，又可延长其使用活性，同时节约了实验成本。在部分氧化的海藻酸钠材料上接枝或者固化蛋白成分的具体方法为：
[0045] S1、将
粘度为17mPa.S的部分氧化的海藻酸钠材料用去离子水配制成20g/L的溶液，并加入1.2mL/L醋酸、0.06mmoL/L水杨醛，在4℃下避光振荡反应2小时；
[0046] S2、向前述溶液中加入6g/L生长因子作为蛋白成分，避光震荡反应2小时，使所述生长因子与部分氧化的海藻酸钠通过腙键接枝或固化；随后加入0.2mmoL/L硼氢化钠在常温下震荡反应1.2小时；
[0047] S3、向溶液中加入3倍体积去离子水，并在4℃下置于透析袋中50小时，得到接枝或固化生长因子的海藻酸钠材料，冷冻干燥保存。
[0048] 步骤三、制备间充质干细胞-海藻酸钠三维微球，海藻酸钠可与二价阳离子胶联形成水凝胶；将接枝生长因子的海藻酸钠材料用去离子水配成3％的水溶液，并用0.22μm过滤器过滤除菌后与间充质干细胞的细胞悬液混合，通过控制3D微球发生装置的电压大小以及液面高度，使混有细胞的海藻酸钠溶液以一定的速率缓慢滴入CaCl2溶液中，待海藻酸钠与CaCl2充分胶联后，将CaCl2溶液抽离，并用培养液清洗，三维胶质细胞微球可用于下一步的移植实验。其中，3D微球发生装置的操作步骤如下：
[0049] (1)在注射参数栏下拉表中选用合适的夹具以适配不同规格的
注射器，1mL、2.5mL、5mL可选；
[0050] (2)在杀菌栏根据操作界面结合自己需求选择自动杀菌模式或手动杀菌模式(点按紫外灯触摸按钮进行紫外灯的
开关控制杀菌时间)；
[0051] (3)杀菌模式选择结束后，将配套的
钢针、管路连接并固定在仪器上；
[0052] (4)用合适的一次性注射器吸取生物材料和细胞的混悬液，将注射器固定在夹具上，并连接液体管路；
[0053] (5)将盛有CaCl2溶液的培养皿置于前
门支持板上并关门；
[0054] (6)选取
触摸屏左侧
电机运动模
块控制竖直电机运动，调整钢针末端至距液面合适距离；
[0055] (7)点按高压电源触控按钮，打开高压模块；
[0056] (8)在电压参数栏键入合适的高压参数；
[0057] (9)在容积参数栏键入所需进行三维培养的溶液体积，须小于等于注射器总量程及注射器吸入量；
[0058] (10)在速度参数栏键入高精密水平步进电机的运动速度。
[0059] (11)按下水平电机推进箭头按钮，箭头灯亮，三维培养系统开始工作；
[0060] (12)微球成型操作结束后开门将培养皿中溶液小心吸去，并用生理盐水清洗3次，最后添加细胞培养液放入CO2培养箱中进行培养。
[0061] 本实施例还提供了一种用于间充质干细胞结合生物材料的微球的智能递送系统，包括：
[0062] 运输系统，由
蠕动泵和磁力转子组成，用于无菌输送所述微球；
[0063] 推注系统，由电压微泵、喷嘴和喷枪组成，用于固定或手持喷洒所述微球；
[0064] 监控系统，由流量监控和温度监控组成；流量监控通过流量传感器和电路板实现；其中，所述电路板具有数模转换和模数转换功能；所述温度监控通过温度传感器、加热单元、制冷单元和电路板实现；其中，所述加热单元选用电阻丝，所述制冷单元选用半导体制冷器，所述电路板具有数模转换和模数转换功能；
[0065] 支撑系统，由主控板、电源和制成结构组成，用于控制整个喷洒系统。
[0066] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的
修改。因此在不背离
权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出的实施例。
