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发酵

阅读：16发布：2020-05-12

专利汇可以提供发酵专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及用于减少对培养基进行发酵以制备靶物质中的滞后时间的方法，其中所述靶物质不是酸乳并且其中所述发酵导致形成酸或乙醇，所述方法包括以下步骤：向合适的培养基提供包含释放酸或乙醇的微生物的发酵起子培养物；向所述培养基添加马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂；培养所述微生物；以及获得所述靶物质。已发现，向发酵进料中添加马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂显著减少发酵的滞后时间。本发明还涉及包含马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂的发酵食品产品，其不是酸乳。，下面是发酵专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于减少对培养基进行发酵以制备靶物质中的滞后时间的方法，其中所述靶物质不是酸乳并且其中所述发酵导致形成酸或乙醇，所述方法包括以下步骤：向合适的培养基提供包含释放酸或乙醇的微生物的发酵起子培养物；向所述培养基添加马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂；培养所述微生物；以及获得所述靶物质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵导致形成乙醇。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述发酵起子培养物包含来自以下属的微生物：酵母属(Saccharomyces)、念珠菌属(Candida)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、德克拉酵母属(Dekkera)或酒香酵母属(Brettanomyces)。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述培养基是包含植物材料的液体培养基。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述靶物质选自：啤酒、果酒、香槟、起泡酒、苹果酒、蜂蜜酒、威士忌、清酒或生物乙醇。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵导致形成酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述发酵起子培养物包含来自以下属的微生物：醋杆菌属(Acetobacter)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、微球菌属(Micrococcus)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、考克氏菌属(Kocuria)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、青霉属(Penicillium)或明串珠菌属。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述靶物质是选自乳酪、法式鲜奶油、酸奶油、香肠、泡菜、腌菜或醋的食品产品。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述靶物质是乳酸或乙酸。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中游离营养肽的量限制所述微生物的生长。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂的浓度为5g/l至0.001g/l。
12.可通过权利要求1至11中任一项获得的发酵食品产品，其中所述食品产品不是酸乳，所述食品产品包含马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂。

说明书全文

发酵

[0001] 本发明属于发酵领域。发酵是利用微生物的代谢活性来产生物质的公知技术。自古以来就使用发酵来增加食品产品的使用寿命。这可以通过选择以这样的产品为食料并释放使环境不太吸引其他微生物之化合物的微生物来实现。为此，发酵进料通常包含碳化合物和氮化合物以及其他足以使微生物生存和增殖的营养物。在添加微生物并经过一段时间之后，发酵进料变得富含由微生物释放的化合物，这时其变成食品产品，例如酸乳(yogurt)、乳酪(cheese)、果酒(wine)、啤酒或香肠。

[0002] 释放醇(alcohol)的微生物被用于排斥其他微生物并保持食品质量，和/或用于制备酒精饮料。因此，植物材料如谷物、稻米或浆果(其中重要的是葡萄)已通过发酵过程被转化为例如啤酒、威士忌、清酒或果酒。公知多种类型的酵母可用于这个目的，例如如来自酵母属(Saccharomyces)或念珠菌属(Candida)的酵母。

[0003] 另外，发酵过程的使用还为了分离微生物产生的化合物，而不是原样获得食品产品。在该情况下，靶产物不是例如啤酒、乳酪或香肠形式的完全转化发酵进料，而是微生物释放的化合物。为此，需要在发酵之后将化合物从混合物中分离，所述混合物还包含碳化合物和氮化合物、微生物以及许多其他组分。这一过程在例如生物乙醇的生产中得到有效的应用，其中利用植物材料来进料产生乙醇的微生物，在此之后将产生的乙醇从进料中分离。在此过程中使用的典型微生物是来自例如酵母属的属的酵母，但是公知发酵单胞菌属(Zymomonas)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种也用于这个目的。

[0004] 还公知，释放酸的微生物被用于包含乳的进料培养物，产生例如比乳保质期更长的乳酪。类似地，释放酸的微生物允许通过形成例如香肠、泡菜(sauerkraut)或腌菜(pickle)来增加肉类或蔬菜的保质期。公知用于食品生产的释放酸的微生物的一些实例是来自以下属的微生物：曲霉属(Aspergillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)和醋杆菌属(Acetobacter)。

[0005] 在典型的发酵过程中，可以分三个阶段。第一阶段开始于将微生物与发酵进料合并时。微生物适应其新环境，并开始吸收营养物，例如肽、氨基酸、维生素和矿物质。在这一阶段，微生物产生细胞分裂和生长，消耗能量，以及制造储存材料、构件或营养物所需的酶，以适应其新环境。然而，在这一阶段，几乎没有生长，或几乎没有任何其他可视指示表明在发酵中发生任何事件。因此，将这一阶段称为滞后期。

[0006] 即使看似什么都没有发生，但滞后期对于发酵过程是非常重要的，因为微生物在这一阶段适应其环境，这对其健康很重要。微生物群的健康决定所得产物的质量。

[0007] 当微生物已适应其环境时，开始第二阶段。以非底物限制性生长为特征的这一阶段被称为指数期。在指数期期间，微生物开始通过细胞分裂生长，并且因此呈指数倍增。在这一阶段，微生物由于其代谢特征而通常产生溢出产物，其中例如有酸和/或醇。

[0008] 在指数期结束时，合适营养物的量经常减少，使得发酵混合物不再能够维持指数生长。因此，生长减慢，并且发酵进入稳定期。在这一阶段，尽管细胞分裂仍在发生，但生长不再呈指数，并且发酵混合物慢慢地在所有现有化合物之间达到平衡。如果所有的情况都是合适的，这产生具有均衡风味和气味的高质量食品产品，或高度富含目的化合物的混合物。

[0009] 这些阶段所需的时间高度不同，并且取决于所使用微生物的类型、发酵进料的类型、温度和许多其他参数。鉴于这些不同的阶段，靶物质(其中有食品产品(不包括酸乳)和化合物如乙醇)的产生通常是一个分批过程。如分批过程中常见的，一个重要的成本因素是产物准备所需的时间。

[0010] 生产时间的一个重要因素是滞后期。在此阶段期间，准备实际的发酵过程。除为微生物生长创造足够的培养基条件之外，对目的产物的制备毫无贡献，并且因此较短的滞后时间将对发酵过程的经济性产生巨大影响。然而，滞后期对于决定微生物群的健康是非常重要的，微生物群的健康进而对所设想产品的质量具有重要影响。将通过滞后期并使发酵过程到达指数期所需的时间称为滞后时间。

[0011] 以前曾尝试减少滞后时间。一种选择是采用半连续发酵过程，其中使微生物适应生产阶段并长时间保持在指数期。然而，这并不适合许多过程，因为稳定期对于决定产品的最终味道和/或质量是很重要的，而在这样的半连续过程中，这一阶段被绕过。

[0012] 此外，还可以添加已经适应发酵的培养基条件的称为起子培养物(starter culture)的微生物混合物。然而，这产生不同的问题，因为在小规模预混微生物进料中，难以复制全规模发酵罐的环境。可以使用较大体积的预培养物(接种物)，但这对生产过程和预培养阶段的成本具有很大影响。因此，优选的是用有限量的起子培养物以可靠的方式减少滞后时间，与这种技术可以实现的相比可能甚至进一步地减少滞后时间。

[0013] 对于减少滞后时间，还可以向预混合物中添加额外的容易转运且能量有益的营养物，如例如额外的肽。然而，这造成额外的成本和问题，例如异味和着色。

[0014] 发明概述

[0015] 本发明涉及用于减少对培养基进行发酵以制备靶物质的滞后时间的方法，其中所述靶物质不是酸乳，并且其中所述发酵导致形成酸或乙醇，所述方法包括以下步骤：向合适的培养基提供包含释放酸或乙醇的微生物的发酵起子培养物；向所述培养基添加马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂；培养所述微生物；以及获得所述靶物质。已发现，向发酵进料中添加马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂显著减少发酵的滞后时间。马铃薯蛋白质的所需量足够低而不会影响靶物质的味道，并且在分批和半连续过程二者中都发生滞后时间的减少。本发明还涉及包含马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂的发酵食品产品，其不是酸乳。附图说明

[0016] 图1：通过添加0.1％LMW使酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在YPD20和YPD100中的生长达到OD0.4的时间减少。每个条代表至少三种不同的培养物。误差条是标准偏差。

[0017] 图2：Solanic PPII蛋白对胰蛋白酶的抑制。

[0018] 图3a和3b：在具有和不具有0.1％马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂下酿酒酵母(S.cerevisiae)的示例性生长曲线，其显示在添加马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂之后滞后时间减少。滞后时间通过对数据的对数图进行分析来确定。这一分析未在图中示出。在肽较丰富的生长培养基中，效果降低。

[0019] 发明详述

[0020] 本发明涉及用于减少对培养基进行发酵以制备靶物质的滞后时间的方法，其中所述靶物质不是酸乳，并且其中所述发酵导致形成酸或乙醇，所述方法包括以下步骤：向合适的培养基提供包含释放酸或乙醇的微生物的发酵起子培养物；向所述培养基添加马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂；培养所述微生物；以及获得所述靶物质。已发现，向发酵进料中添加少量的马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂(例如马铃薯蛋白酶抑制剂分离物(“potato protease inhibitor isolate，PPII”))显著减少发酵的滞后时间，这在发酵产品的生产中具有经济效益。马铃薯蛋白质的所需量足够低而不会影响靶物质的味道，并且在分批和半连续过程二者中都发生滞后时间的减少。在本发明的背景下，滞后时间的减少也可以称为“刺激活性”(stimulating activity，SA)。本发明可以适用于较宽的pH和温度范围。

[0021] 本发明的方法涉及用于减少对培养基进行发酵以制备靶物质的滞后时间的方法，其中所述靶物质不是酸乳。在下文中，术语“食品产品”或“靶物质”总是被理解为不包括酸乳，无论是否明确提及。

[0022] 在该背景下，酸乳可以被定义为通过乳发酵而获得的酸性的白色黏性但可流动的乳制品，所述乳例如如牛乳、山羊乳、绵羊乳、牦牛乳、母马乳、驯鹿乳、驼鹿乳、水牛乳、驴乳和/或骆驼乳，优选牛乳，所述乳制品已进行使用包含存在于开菲尔(Kefir)中的生物体的起子培养物的发酵，所述生物体例如乳酸菌和酵母，以及乳杆菌属、乳球菌属、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)，例如双乙酰乳球菌(Lactococcus diacetylactis)和乳脂明串珠菌(Leuconostoc cremoris)的混合物。在酸乳中，黏性一般由胞外多糖的存在引起，而不是像其他发酵乳制品中一样由使蛋白质沉淀引起。由乳获得酸乳的培养时间和条件是公知的，并且除其他因素之外还依赖于所使用微生物的类型和酸乳的类型。存在不是酸乳的其他发酵乳制品类型，例如如乳酪、酸奶油(sour cream)、法式鲜奶油(crème fraiche)、奶渣(quark)和发酵乳清(fermented whey)。

[0023] 培养基中为微生物之食料的这些组分是发酵的底物。这被称为发酵进料、发酵液或者作为一个整体称为培养基。培养基一般还包含可以有助于发酵或加工的其他化合物，其中有盐。培养基通常是水性的。培养基可以是食品物质，在这种情况下，培养基中含有底物。在例如食品产品的发酵中就是这种情况，其中培养基可以是例如奶油(cream)或凝乳(curd)。或者，培养基可以是其中已添加多种组分作为底物的水性培养基。这样的组分可以包括作为底物的氮源、磷源和碳源。氮源可以优选地包含氨、硝酸盐、氨基酸、肽和/或蛋白质。碳源优选地是甘油三酯或碳水化合物，例如糖、糖醇、淀粉和/或纤维素。磷源优选地是无机单磷酸盐、焦磷酸盐或多磷酸盐，含磷碳水化合物，磷脂，或核苷酸。

[0024] 在本发明中，靶物质可以是培养基发酵后的总所得培养基。这在靶物质是食品产品的情况下常常如此。或者，靶物质可以是培养基发酵后的总所得培养基中包含的组分。在后一种情况下，优选地随后将靶物质从所得培养基中分离。这在靶物质是化合物如已醇或酸的情况下常常如此。

[0025] 即，本发明涉及用于减少对培养基进行发酵以制备靶物质的滞后时间的方法，其中所述靶物质不是酸乳，并且其中所述发酵导致形成酸或乙醇。通过微生物形成酸或乙醇在本领域是已知的，并且如何应用这样的形成以通过发酵获得靶物质是公知的。

[0026] 优选地，靶物质是食品产品，更优选利用导致形成乙醇的发酵产生的食品产品。或者，本发明涉及导致形成酸、优选乳酸和/或乙酸的发酵。在一些优选实施方案中，这样的发酵产生包含所述酸的食品产品。在一些替代实施方案中，靶物质是酸，优选乳酸或乙酸作为靶物质。

[0027] 优选地，本发明应用于其中微生物的生长是肽限制性的发酵过程。用于本发明范围的肽是由5至30个氨基酸组成的小蛋白质片段；这样的片段也称为“营养肽”。这样的肽在溶液中游离存在，因此其也可以被称为“游离营养肽”。

[0028] 肽限制性发酵是这样的发酵，其中游离营养肽的浓度受到限制，但是其中其他必需营养物如(微量)矿物质、碳水化合物和蛋白质是可以自由获得的。因此，肽限制性发酵是其中存在于发酵液中游离营养肽的量限制微生物的生长的发酵。当营养肽被蛋白酶/肽酶降解为氨基酸的速率高于由蛋白质形成营养肽的速率时，发生这种肽限制。可以通过观察少量肽的添加对生长和滞后时间的影响来测试发酵是否是肽限制性的。当营养肽的添加不能使发酵显著更快时，则发酵不是肽限制性的。当营养肽的添加确实使发酵更快时，则发酵可以被称为肽限制性的。

[0029] 这意味着发酵速率取决于可用营养肽的浓度。在肽限制性发酵的情况下，没有足够的营养肽来维持或适应微生物的指数生长。这导致滞后时间的增加。

[0030] 在本发明的方法中，发现添加相对少量的马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂减少滞后时间，对于肽限制性发酵而言特别如此，并且在有充足的蛋白质可供利用的情况下特别如此。

[0031] 出乎意料的是，特别是在涉及肽限制性发酵的方法中，滞后时间减少。公知，决定发酵滞后时间的一个重要因素是蛋白质在培养基中降解成具有5至30个氨基酸的小营养肽。这种转化通过广泛多种蛋白酶实现。蛋白酶抑制剂的公知功能是抑制蛋白酶，有效地抑制负责将蛋白质降解为营养肽的蛋白酶。因此，预期添加蛋白酶抑制剂(无论何种来源)由于蛋白质的酶促降解更慢并且与之相关联地，营养肽的形成更慢而将导致滞后时间增加。然而，现在发现，事实上情况相反，添加马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂导致滞后时间减少而不是增加。

[0032] 在本发明的背景下，滞后时间被定义为微生物适应新环境(培养基)所需的持续时间。其是滞后期所需的持续时间。

[0033] 可以使用代谢指标或监测生物质形成的指标通过多种方法对发酵过程进行监测。例如，在与气体的形成相关的发酵的情况下，气体产生(例如CO2或甲烷)可以是合适的代谢输出参数。或者，光密度(600nm处的OD，OD600)可以提供提供对所存在微生物的量进行量化的合适输出参数。此外，在显著发酵产物例如如靶物质与培养基具有不同密度的情况下，培养基的密度可以是合适的。这在例如导致形成醇的发酵中如此。在导致形成酸的发酵的情况下，pH可以提供合适的输出参数。技术人员可以想出许多方法来确定发酵的进展，并确定滞后期所需的时间。

[0034] 发酵一般根据输出参数(例如光密度、气体形成、培养基的密度或pH)的S形曲线进行，这在本领域是公知的。在本发明中，通过由平滑S-曲线的二阶导数计算其拐点来测定达到指数生长期的中点的时间。或者，当使用pH作为代谢进程的指标时，取在指数曲线的一半的pH值，并记录直到达到该pH的时间。滞后时间的减少可以通过比较未添加马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂的发酵与其中添加适量马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂的相同发酵的滞后时间来确定。绝对滞后时间减少通常被量化为减少的小时数，而相对滞后时间减少被量化为“％”。

[0035] 天然马铃薯蛋白质可以暂时被分为三类：(i)马铃薯糖蛋白(patatin)家族，高度同源的酸性43kDa糖蛋白(马铃薯蛋白质中的40wt.％至50wt.％)；(ii)5至25kDa的碱性蛋白酶抑制剂(马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂)，其在分离后被称为马铃薯蛋白酶抑制剂分离物或“PPII”(马铃薯蛋白质中的30wt.％至40wt.％)；以及(iii)其他蛋白质，大多数是高分子量蛋白质(马铃薯蛋白质中的10wt.％至20wt.％)(Pots等,J.Sci.Food.Agric.1999,79,1557-1564)。

[0036] PPII基于其分子量可以被分为不同的组。不同的蛋白酶抑制剂组被鉴定为蛋白酶抑制剂I(分子量为约39kDa)、羧肽酶抑制剂(分子量为约4100Da)、蛋白酶抑制剂IIa和IIb(分子量为约20.7kDa)和蛋白酶抑制剂A5(分子量为约26kDa)。这些不同蛋白酶抑制剂组在总马铃薯蛋白质中的比例取决于马铃薯品种。

[0037] 在本发明的范围内，马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂包含任意马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂，或不同马铃薯蛋白质的任意混合物，其包括如上限定的一种或更多种马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂或抑制剂组。马铃薯蛋白酶抑制剂分离物(PPII)是包含马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂的分离物。根据本发明的马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂优选地基本上是天然的。

[0038] PPII可以以任何已知的方式获得，例如通过例如沉淀、吸收、在60℃至80℃下最多半小时的热分级、膜分离、用硫酸铵或饱和脂肪酸或其他组分沉淀、过滤技术如超滤或凝胶过滤。热分级产生天然马铃薯蛋白酶抑制剂分离物，因为热使马铃薯汁中存在的大部分其他蛋白质变性，而马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂相对热稳定，使得其在热处理中留存下来并且可以被分离。

[0039] 优选地，在本发明中使用PPII。这可以优选地如WO2008/069650中所述获得，其内容通过引用并入本文，其中对从马铃薯果汁(potato fruit juice，PFJ)或马铃薯果水(potato fruit water，PFW)中分离蛋白酶抑制剂的详尽说明进行了描述。

[0040] 该过程需要在7至9的pH下对马铃薯果汁进行通过二价金属阳离子的絮凝，并将絮凝的马铃薯果汁离心，从而形成上清液。随后，对上清液进行膨胀床吸附色谱，其使用吸附剂在小于11的pH和5℃至35℃的温度下操作，所述吸附剂能够与马铃薯蛋白质结合，从而将天然马铃薯蛋白质吸附到吸附剂。与一定量天然马铃薯蛋白质结合的柱材料包括混合模式吸附剂，例如如Amersham StreamlineTMDirect CST I(GE Healthcare)、Fastline吸附剂(Upfront Chromatography A/S)、大孔吸附剂和离子交换吸附剂。或者，如欧洲专利申请12175944.3中公开的包含配体的吸附剂被高度优先地用于分离适合在本发明中使用的PPII。

[0041] 最后，用洗脱剂从吸附剂中洗脱至少一种天然马铃薯蛋白质分离物。该方法尤其产生高纯度的分离的PPII，其是天然的而存在极少的变性蛋白质，并且以稳定的溶解性为特征。

[0042] 马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂的量可以根据以下中所述的方法通过测量对胰蛋白酶的抑制来确定：Spelbrink等,The Open Food Science Journal2011(5)第42-46页“Quantitative Determination Trypsin Inhibitory Activity in Complex Matrices”或ISO 14902:2001E“Animal Feed Stuffs-Determination of soya products”。

[0043] 作为使用马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂(例如PPII)的替选方案，可以使用从PPII中分离的进一步纯化的蛋白质级分。优选的蛋白质级分：

[0044] ο在pH8下可溶，

[0045] ο具有pKa<8，

[0046] ο具有TIA和CTIA活性二者，但在80℃下热处理30分钟后两种活性均不能留存。尽管如此，在高至至少90℃下滞后时间减少能力保持完好，并且分子量为17.5至18.2kDa。

[0047] TIA活性根据以下中所述的方法通过测量蛋白质对胰蛋白酶的抑制作用来确定：Spelbrink等,The Open Food Science Journal 2011(5)第42-46页“Quantitative Determination Trypsin Inhibitory Activity in Complex Matrices”或ISO 14902:
2001E“Animal Feed Stuffs-Determination of soya products”。

[0048] CTIA活性通过测量蛋白质对胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)的抑制作用来确定。所使用的方法与针对TIA所描述的方法基本上相同，但需要较高的酶剂量来补偿胰凝乳蛋白酶的较低比活度。

[0049] 使用马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂的一个优点是，其大部分是非常热稳定的。马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂分离物中负责滞后时间减少的活性级分在高至60℃、优选70℃、更优选80℃并且最优选90℃的温度下保持其天然状态至少15分钟、优选至少90分钟的时间。这允许在发酵过程中的不同点添加马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂。

[0050] 马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂可以在添加起子培养物之前、之后或期间添加到培养基中，或者其可以间接地添加到培养基中，例如通过添加到起子培养物中或添加到将要添加至培养基中的另一组分中。此外，其可以添加到发酵进料中，所述发酵进料稍后将在其中在发酵之前对发酵进料进行加热的过程中变为培养基或变为培养基的一部分。例如在需要在发酵前进行巴氏灭菌或灭菌的过程中就是这种情况，这在许多发酵如上限定的食品产品的过程中很常见。

[0051] 本发明的另一个优点是马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂如所述以非常低的浓度在发酵过程中发挥功能。特别地，在根据本发明的发酵过程中添加少于1g/l，优选少于0.5g/l，更优选少于0.1g/l，甚至更优选少于0.05g/l的马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂足以减少滞后时间。根据本发明，减少发酵的滞后时间需要至少0.01g/l，优选0.005g/l，更优选0.001g/l的极少量马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂。

[0052] 优选的马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂浓度为例如5g/l至0.001g/l，优选5g/l至0.05g/l，更优选5g/l至0.01g/l，例如1g/l至0.01g/l。在此情况下，马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂的浓度表示为每升培养基的马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂克数。

[0053] 在这些浓度下，马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂不赋予靶物质以味道，这是一个附加优势，特别是当靶物质是食品产品时。进一步补充地，这些低浓度的马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂对靶物质的感官特性没有可检测的影响。

[0054] 本发明的另一个优点是马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂在发酵过程中在宽pH范围内发挥功能。特别地，培养基的pH可以为高至6.7，优选8.0，更优选高至10.0。另外，该pH可以为低至4，优选低至3，更优选低至2。马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂在宽pH范围内的稳定性是有利的，因为其允许通过发酵对不同pH的培养基进行处理。此外，其还使其中释放酸的发酵在整个发酵期间从马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂的添加受益。

[0055] 此外，本发明的一个独特优点是马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂是非变应原性的。这意味着，其可以用于由对其他蛋白质过敏的人操作的发酵过程。此外，这也意味着，其可以用于其中靶物质是食品产品的发酵过程，其中食品产品可以被具有过敏症的人食用而没有过敏性休克的风险。

[0056] 此外，马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂的一个优点是：这种蛋白质的溶液、优选水溶液在多至至少10g/L、优选50g/L、更优选250g/L的浓度下是澄清的或至少基本上不混浊的。这些浓度优选地是在2至5、优选2至4、更优选2.5至3.5的溶液pH下实现的。马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂的澄清或基本上不混浊的溶液允许靶物质的常规过滤灭菌和有吸引力的外观，特别是当靶物质是食品产品时。

[0057] 在本发明的背景下，发酵起子培养物是组成适合于获得某种类型的发酵的包含如上限定的一种或更多种微生物的培养物。起子培养物可以包含单一微生物类型，或者其可以包含两种或更多种微生物。

[0058] 发酵起子培养物中存在的用于通过发酵制备靶物质的微生物是释放酸或乙醇的微生物。这样的微生物是公知的。通常，微生物选自细菌、酵母、真菌和藻类的组，优选为细菌、酵母或真菌。

[0059] 例如，合适的细菌可以来自乳杆菌目(Lactobacillales)，其是包含乳酸菌的革兰氏阳性菌，所述乳酸菌包含以下属：链球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、肉杆菌属(Carnobacterium)、明串珠菌属和片球菌属；或者合适的细菌可以来自双歧杆菌目(Bifidobacteriales)。然而，本发明的细菌并不限于这些实例。

[0060] 合适的真菌例如被归类为酵母的真菌例如来自酵母菌目(Saccharomycetales)，并且包括来自以下属的物种：酵母属、酒香酵母属(Brettanomyces)、克勒克酵母属(Kloeckera)和念珠菌属。然而，本发明的酵母并不限于这些实例。

[0061] 优选的酵母包括来自酵母属的酵母，例如酿酒酵母。

[0062] 例如，另一些真菌包括例如如来自以下属的物种：青霉属(Penicillium)、被孢霉属(Mortierella)、曲霉属、镰孢霉属(Fusarium)(例如镶片镰孢霉(Fusarium venenatum))、根霉属(Rhizopus)和伞菌属(Agaricus)。然而，本发明的真菌不限于这些实例。

[0063] 一般来说，用于本发明方法的合适微生物选自以下纲：杆菌纲(Bacilli)、放线菌纲(Actinobacteria)或酵母纲(Saccharomycetes)。优选地，合适的微生物选自乳杆菌目、双歧杆菌目和酵母菌目，更优选地选自链球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和酵母属。

[0064] 优选的是根霉属、曲霉属、毛霉属(Mucor)、淀粉霉属(Amylomyces)、拟内孢霉属(Endomycopsis)、酵母属、异常汉逊酵母(Hansenula anomala)、乳杆菌属和醋杆菌属。

[0065] 培养基必须适合发酵类型、靶物质和有关微生物的类型。因此，培养基可以是液体的或固体的、半固体的、颗粒状的或黏性的，并且其必须包含合适的营养物作为底物，其中例如有蛋白质和/或碳水化合物。合适的营养物在本领域中是公知的，并且可以是微生物生长所需的任何组分，例如蛋白质、肽、脂质、微量化合物、微量元素、矿物质和碳水化合物，例如淀粉、多糖和糖。

[0066] 培养微生物是在合适的培养条件下进行的。发酵期间的培养条件可以是已知用于适合目的靶物质的发酵培养物的培养条件。培养条件可以是需氧的或厌氧的，并且如果是需氧的话，可以涉及低通气、常规通气或高通气。培养可以是固态培养或液态培养，并且可以以任何规模在分批或半连续加工方法中进行。

[0067] 发酵期间的温度可以为-10℃至+60℃、优选13℃至45℃而不等。优选地，温度保持不变。pH可以为pH 2至10、优选4至6.7而不等。培养时间高度可变，并且取决于培养类型且特别地取决于靶物质。技术人员很清楚用于具体靶物质的合适培养时间。因此，培养时间可以为0.5小时至10年或更久而不等。

[0068] 氧水平可以从不存在(厌氧发酵)到存在(需氧发酵)而不同。加工既可以是搅拌的，也可以是静止的。

[0069] 马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂的添加可以发生在发酵前的任何时间。这样的添加可以如下进行：将马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂作为经过滤或经巴氏灭菌的蛋白质浓缩溶液与培养基合并，然后添加起子培养物，或者可替选地，将起子培养物与天然马铃薯蛋白质合并，并将该混合物与培养基合并。或者，所有组分可以单独添加，或与培养基的另外成分组合添加，根据情况而定。培养基的这样的另外成分可以包括例如碳水化合物、微量矿物质、主体矿物质(bulk mineral)、蛋白质或肽。

[0070] 在一个非常优选的实施方案中，马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂可以在加热步骤之前添加到培养基中。这在需要在添加起子培养物之前加热培养基，例如进行巴氏灭菌或灭菌时是有利的。由于马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂的有利热稳定性，马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂甚至在这样的加热后仍保持其天然状态，使得甚至在加热后仍保持其天然生化功能并减少发酵的滞后时间。

[0071] 马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂(优选地在天然状态下)的添加具有减少发酵的滞后时间的效果。相对于其中未添加马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂的相同发酵方法，滞后时间显著减少，根据培养物和培养基，例如减少至少10％，优选至少25％，更优选至少50％，更优选至少60％，并且最优选至少90％。

[0072] 获得(或“收获”)靶物质可以采取本领域已知用于在发酵后分离靶物质的任何形式。特别地，完全食品产品可以通过收获培养基来获得。所述完全食品产品可以适当地进行一个或更多个后处理。或者，可以从发酵培养物中分离靶物质，例如通过蒸馏、过滤、萃取或本领域已知的其他手段来分离靶物质，并且任选地通过任何已知手段进一步纯化。这样，可以以足够的纯度获得靶物质。

[0073] 导致形成乙醇的发酵

[0074] 在本发明的一个实施方案中，发酵导致形成乙醇(酒精)。优选地，如果发酵方法导致形成乙醇，则靶物质是果酒或起泡酒、啤酒、威士忌、苹果酒、蜂蜜酒、清酒或生物乙醇。优选的靶物质是果酒、啤酒和生物乙醇，最优选啤酒。在另一些优选实施方案中，优选的靶物质是食品产品。

[0075] 该实施方案中的优选微生物来自以下属：酵母属、念珠菌属、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、德克拉酵母属(Dekkera)或酒香酵母属，优选酵母属。哪种类型的发酵使用哪种微生物导致形成乙醇是基本常识。

[0076] 该实施方案中的优选培养基包含植物材料作为底物，例如食品级谷物、稻米、豆类、蜂蜜或果实(优选浆果，更优选葡萄)，在产生基于乙醇的食品产品的发酵中优选谷物或浆果。在一些非常优选的实施方案中，包含植物材料的培养基是液体培养基。

[0077] 导致形成乙醇的发酵一般可以如下实现。所述发酵包括：在培养基中提供发酵起子培养物，所述发酵起子培养物包含来自以下属的一种或更多种微生物：酵母属、念珠菌属、接合酵母属、德克拉酵母属或酒香酵母属，所述培养基包含植物材料，优选食品级谷物、稻米、豆类、蜂蜜或果实，所述植物材料包含碳水化合物。将培养基与马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂合并以减少滞后时间，并将微生物在培养基中培养以获得食品产品。

[0078] 优选地，在发酵主要针对产生乙醇的一个实施方案中，发酵是厌氧的。在例如发酵谷物、稻米、豆类、蜂蜜或果实以产生啤酒、威士忌、清酒、蜂蜜酒、果酒或生物乙醇中，就是这种情况。

[0079] 如果靶物质是果酒或起泡酒(包括香槟)，则合适的起子培养物包含酵母属。在这种情况下，合适的培养基包含浆果或浆果汁、优选葡萄汁或其他果汁作为底物。可以将果实压碎、压榨或浸泡以获得作为培养基的果汁。任选地，可以对果汁进行酶促处理以增加游离糖含量或去除不期望的物质。

[0080] 如果靶物质是啤酒，则合适的起子培养物包含酵母属，例如卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)或巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。在这种情况下，合适的培养基包含麦芽汁或其他富含碳水化合物的谷物提取物作为底物。麦芽汁是由谷物经过捣碎以将复杂的碳水化合物转化为糖而制成的。优选地，谷物包含作为酶的来源的大麦。任选地，碳水化合物转化酶可以外源添加。可以向麦芽汁中添加酒花和/或其他香草和香料。

[0081] 如果靶物质是威士忌，则合适的起子培养物包含酵母属。在这种情况下，合适的培养基包含麦芽汁或其他富含碳水化合物的谷物提取物作为底物。合适的发酵后处理包括例如蒸馏。

[0082] 如果靶物质是苹果酒，则合适的起子培养物包含酵母属。在这种情况下，合适的培养基包含苹果或苹果汁作为底物。

[0083] 如果靶物质是蜂蜜酒，则合适的起子培养物包含酵母属。在这种情况下，合适的培养基包含蜂蜜作为底物。

[0084] 如果靶物质是清酒，则合适的起子培养物包含曲霉属，优选米曲霉(Aspergillus oryzae)，和酵母属。在这种情况下，合适的培养基包含稻米作为底物。

[0085] 如果靶物质是生物乙醇，则培养基优选地包含氮源、磷源和碳源作为底物。所述氮源可以优选地包含氨、硝酸盐、氨基酸、肽和/或蛋白质。所述碳源优选地是甘油三酯或碳水化合物，例如糖、糖醇、淀粉和/或纤维素。所述磷源优选地是无机单磷酸盐、焦磷酸盐或多磷酸盐，含磷碳水化合物，磷脂，或核苷酸。

[0086] 在例如可以用作生物燃料(生物乙醇)的乙醇的情况下，合适的微生物包括酵母属、酵单胞菌属和裂殖酵母属。在这种情况下，培养基优选地包含植物材料作为底物，其可以是任何类型的，例如如玉米秆、麦秆、甘蔗、马铃薯、木薯和玉蜀黍。

[0087] 乙醇可以通过蒸馏或反渗透、膜过滤或冷冻浓缩、优选蒸馏在培养基发酵后从总所得培养基中分离。还优选地通过已知方法纯化乙醇，以获得尽可能纯的乙醇。

[0088] 导致形成酸的发酵

[0089] 在本发明的另一个实施方案中，发酵导致形成酸。优选的酸包括乳酸和乙酸。优选地，如果发酵方法导致形成酸，则靶物质是乳酪、法式鲜奶油、酸奶浴、香肠、泡菜、腌菜或醋。在一些优选实施方案中，导致形成酸的发酵的靶物质是食品产品。在一些替代非食品实施方案中，靶物质是作为化合物的酸，优选乳酸或乙酸。在该实施方案中，优选地在发酵后分离酸。

[0090] 如果靶物质是乳酪，则合适的起子培养物包含可商购获得的多种乳酸菌混合物。一个实例是乳酸乳球菌和乳脂乳球菌的混合物。另一些实例是以下属的细菌：乳杆菌属、链球菌属或丙酸杆菌属(Propionibacter)。

[0091] 在这种情况下，合适的培养基包含各种类型的乳制品，例如奶油、凝乳或乳清作为底物，例如如由以下获得的乳制品：牛乳、山羊乳、绵羊乳、牦牛乳、母马乳、驯鹿乳、驼鹿乳、水牛乳、驴乳和/或骆驼乳，优选牛乳，或者可替选地大豆乳和/或杏仁乳和/或其他富含蛋白质的植物提取物。

[0092] 如果靶物质是法式鲜奶油，则培养物优选包含乳球菌属和/或乳杆菌属，优选乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)和/或乳酸乳球菌双乙酰生物变种(Lactococcus lactis biovar.Diacetylactis)。或者，可以使用奶油内源性酶。合适的培养基包含奶油，并且优选地培养基由奶油组成。在这种情况下，奶油是如上限定的乳制品，优选由牛乳获得的乳制品。

[0093] 如果靶物质是酸奶油，则培养物包含乳球菌属或乳杆菌属物种，而培养基包含奶油作为底物，并且优选地由奶油组成。在这种情况下，奶油是如上限定的乳制品，优选由牛乳获得的乳制品。

[0094] 如果靶物质是香肠，则合适的起子培养物包含乳杆菌属(例如植物乳杆菌(Lb plantarum)、清酒乳杆菌(Lb sakei)、Lb farmicis、弯曲乳杆菌(Lbcurvatus))、微球菌属(Micrococcus)、乳球菌属、链球菌属、葡萄球菌属(木糖葡萄球菌(S.xylosus)和肉葡萄球菌(S.carnosus))、考克氏菌属、明串珠菌属和片球菌属(例如乳酸片球菌(P.acidilacti)和戊糖片球菌(P.pentosaceus))或酵母(如例如德巴利酵母属(Debaryomyces spp.))。与熟化有关并用于接种的霉菌物种包括卡门柏青霉(Penicillium camembertii)、娄地青霉(P.rocquefortii)和纳地青霉(P.nalgiovense)，并且从例如Chr.Hansen(BactofermTM)获得。在这种情况下，合适的培养基包含作为底物的(切碎的)肉类，优选(切碎的)牛肉、鹿肉、马肉、水牛肉、猪肉、禽肉或鱼肉；盐和任选地糖、GDL(葡萄糖酸-δ-内酯)、柠檬酸、蒜以及香草和香料。

[0095] 如果靶物质是泡菜，则合适的起子培养物包含明串珠菌属、乳杆菌属和片球菌属。在这种情况下，合适的培养基包含碎甘蓝、盐和任选地葛缕子、芹菜和莳萝籽或其他香草和香料。

[0096] 如果靶物质是腌菜，则合适的起子培养物包含乳杆菌属和/或乳球菌属。在这种情况下，合适的培养基包含蔬菜块以及蔬菜片，或完整的蔬菜。合适的蔬菜种类包括甘蓝、甜菜、黄瓜、橄榄和豆类。

[0097] 如果靶物质是醋，则合适的起子培养物包含醋杆菌属物种。在这种情况下，合适的培养基包含果酒、苹果酒或蜂蜜酒。

[0098] 食品产品作为靶物质

[0099] 在根据本发明的发酵方法中，发酵导致形成酸或乙醇。在靶物质是食品产品的情况下，培养基优选地仅包含食品级组分。还优选地，如果靶物质是食品产品，则培养基包含氮源、磷源和碳源作为底物，所述来源优选地由食品级乳制品、肉类、蔬菜和/或酒精液体提供。

[0100] 在靶物质是食品产品的情况下，通常在发酵后以完全混合物获得食品产品。然而，不排除需从发酵混合物中分离的食品产品，其中有泡菜、腌菜、醋、威士忌、白兰地、干邑和其他蒸馏的酒精饮料。

[0101] 在靶物质是食品产品的情况下，起子培养物可以包含单一微生物，或者其可以包含两种或更多种不同的微生物，这对于特定的食品产品来说是已知的。技术人员很清楚在添加到合适组成的培养基中之后产生预定食品产品的包含多种微生物的起子培养物。

[0102] 任选地，可以在发酵后对食品产品进行后处理，例如添加添加剂、着色剂、味道增强剂或其他成分；或者例如另外的热处理，例如烘焙、蒸馏、灭菌或巴氏灭菌；或者适当的尺寸化，其中有切割和/或成型；以及适当的黏度调节。

[0103] 本发明同样涉及包含马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂的如上限定的发酵食品产品，其中所述食品产品不是酸乳。该实施方案中的马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂可以是天然的或变性的。特别优选的食品产品是果酒、啤酒、面团、面包、苹果酒、蜂蜜酒、乳酪、酸奶油、法式鲜奶油、香肠、泡菜或腌菜，优选果酒、啤酒、面团、苹果酒、蜂蜜酒、乳酪、酸奶油、法式鲜奶油、香肠、泡菜或腌菜，更优选乳酪、面团、酸奶油、法式鲜奶油、香肠或泡菜。

[0104] 为了清楚且简明地描述，本文将特征描述为相同或单独实施方案的一部分，然而应理解，本发明的范围可以包括具有全部或一些所述特征的组合的实施方案。

[0105] 现在将通过以下非限制性实施例对本发明进行举例说明。

[0106] 实施例1：一般发酵模型中的滞后时间减少

[0107] 建立了一般发酵模型，在所述发酵模型中通过添加PPII来对不同微生物测试滞后时间减少。该模型包含两种不同的培养基：MRS-Bouillon(MRSB，可商购获得的标准培养基)和所谓的MRSC，其是一种与MRSB实际上具有相同成分但作为酪蛋白肽的替代向培养基中添加酪蛋白酸盐(C)的培养基。MRSB中的肽一般由5至30个氨基酸组成。根据微生物的需要，MRSB培养基可以是肽限制性体系或非肽限制性体系。受试起子培养物包含单一菌株微生物培养物(ATCC培养物)或具有多于一种类型微生物的培养物。

[0108] MRSB培养基通过将以下组分溶解在850mL去矿物质水中并将pH调节至6.5来制备。10g酪蛋白胨(“CP”)、胰蛋白酶消化物(Fluka 70172)、10g肉类提取物(Fluka 70164)、5g酵母提取物(“YE”,Fluka 92144)、20g葡萄糖(Merck 1.08342)、1g Tween-80(Merck
822187)、2g K2HPO4(Merck 1.05104)、5g乙酸钠(Merck 1.06267)、2g柠檬酸(NH4)2(SigmaAldrich 09833)、0.2g MgSO4-7H2O(SigmaAldrich M5921)、0.05g MnSO4-H2O(SigmaAldrich M7634)。

[0109] 在MRSC培养基中，酪蛋白胨被10g酪蛋白酸盐(Fonterra 385)代替。在溶解组分后，将总体积调节至1000mL，调节pH，并通过高压釜对所得液体进行灭菌。

[0110] 在MRSC培养基中，部分(营养)肽被酪蛋白酸盐形式的全蛋白替代。这样做是为了证明，PPII的蛋白酶抑制活性并不抑制微生物能够将酪蛋白酸盐降解成营养肽所需的蛋白酶。当PPII抑制微生物的蛋白酶时，预期延长的滞后时间。微生物的蛋白酶大部分是膜结合的，并且在这一步骤中产生的肽被直接转运到微生物细胞中。因此，预期肽酶在该培养基中的影响不会如MRSB培养基中那样大。预期，MRSC培养基的肽限制性小于MRSB培养基。

[0111] 对于一些培养物，使用YPD培养基作为MRSB的替代物。YPD如下制备：将20g酪蛋白胨(“CP”)、胰蛋白酶消化物(Fluka 70172)、10g酵母提取物(“YE”,Fluka 92144)、20g葡萄糖(Merck 1.08342)溶解在1L的总体积中，并通过高压釜对所得液体进行灭菌。

[0112] 在MRSB和MRSC培养基或YPD培养基中对单一菌株培养物(ATCC培养物)进行测试。对于所有受试ATCC培养物的概况，参见表1。表2给出了MRSB、MRSC和YPD培养基中的受试培养物以及观察到的时间减少的概况。

[0113] 从经稀释的静止过夜培养物以100μL的总体积在置于ThermoScientific MultiSkan Go读板器中的膜密封微量滴定板中在周期性地每分钟摇动10秒的同时在30℃下培养培养物。通过记录600nm处的吸光度来监测生长，并通过比较在添加和未添加马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂的培养基中的生长来确定滞后时间减少。

[0114] 表1：不同的发酵起子培养物

[0115]

[0116] 在MRSB或YPD培养基中添加PPII后，所有受试培养物均表现出滞后时间减少。在大多数情况下，最佳剂量是0.50wt.％PPII蛋白的终浓度，但在最终配方中在0.05％PPII蛋白或甚至在0.01％PPII蛋白的极低剂量下就已显示出明显的效果。在MRSC培养基中，在这些实验中没有观察到发酵时间的延长。这证实以下假设：PPII不抑制微生物的蛋白酶。然而，预期在非肽限制性体系中也可能发生滞后时间的减少。在MRSB培养基中，在添加PPII后所有培养物都表现出滞后时间减少。

[0117] 表2还示出了以小时计(hr.)以及以百分比计(*％)的获得的时间减少。

[0118]

[0119] 这些数据支持以下观点：PPII通过抑制微生物的肽酶活性来减少滞后时间而对微生物生长具有刺激活性。所有肽限制性体系(MRSB和YPD培养基)都表现出显著的时间减少。较为丰富的MRSC培养基显示出较低的刺激作用。所述的所有MRSB和MRSC实验都多重进行(n≥4)。

[0120] 实施例2：发酵体系是否是肽限制性的确定

[0121] 在具有两种不同肽浓度的培养基(YPD 100(每升包含10g酵母提取物(YE)、20g酪蛋白胨(CP)和20g葡萄糖)和YPD 20(每升包含2g YE、4g CP和20g葡萄糖))中分析酿酒酵母(ATCC 9763)的生长以观察当存在较少肽时LMW的刺激活性是否更强。这指示生长是肽限制性的。从经稀释的静止过夜培养物以100μL的总体积在置于ThermoScientific MultiSkan Go读板器中的膜密封微量滴定板中在周期性地每分钟摇动10秒的同时在30℃下培养培养物。通过测量OD600对生长进行分析，并且达到OD 0.4的时间减少是LMW的刺激活性的量度。事实上，观察到向培养基中添加0.1％LMW对酿酒酵母的生长的刺激作用，并且在具有较少肽的培养基中，这种作用更大。

[0122] 在图1中，绘制了与没有LMW的培养物相比达到OD 0.4的时间减少。当向低肽培养基中添加0.1％LMW时看到约2小时的时间减少(从约9小时到7小时)，而在存在较多肽(YPD 100)的情况下，作用较小(约1小时，从5小时到4小时)。如通过Student t检验确定的，测量的时间减少是显著的(p<0.05)。在附图中示出了每种条件下的示例性生长曲线。因此，LMW对酿酒酵母在YPD中的生长具有刺激作用，并且该作用在肽限制性条件下是最强的。

[0123] 实施例3：刺激剂的纯化和表征

[0124] 为了找出LMW马铃薯蛋白质的哪个亚级分负责滞后时间的减少，基本上根据Pouvreau的方法(L.Pouvreau,H.Gruppen,SR Piersma,LAM van den Broek,GA van Koningsveld,AGJ Voragen J.Agric.Food Chem 2001,49,第2864-2874页“Relative Abundance and Inhibitory Distribution of Protease Inhibitors in Potato Juice from cv.Elkana”)对马铃薯蛋白质浓缩物进行分级。

[0125] 将PPII浓缩物(AVEBE)用去矿物质水稀释至1％蛋白质溶液，并将pH设为8.0。通过在环境温度下以5000g离心10分钟去除不溶物。将上清液装载到包含Source 30Q树脂(GE Healthcare)的15×2.6cm柱上并使用0至0.6M线性NaCl梯度洗脱。这产生8个离散的蛋白质级分，其被标记为F1至F8。

[0126] 根据实施例1中的方法对所有级分测试刺激活性。这揭示，级分F1和F6表现出强滞后时间减少，表明活性成分在这些级分中。根据这些实验，级分F2、F3、F4、F7和F8表现出较少的滞后时间减少，并且F5根本未显示出滞后时间减少。因此，F5中不存在活性成分。刺激剂在实验条件下与柱结合的事实揭示，其在pH 8.0下是水溶性的并且等电点为8.0或更低。

[0127] 在变性的还原条件下根据制造商的说明在Experion自动化电泳系统(BioRad)上确定各级分的分子量。包含强刺激活性的级分F1和F6共有数个MW条带，但这些中只有一个在不含任何刺激活性的级分F5中不存在：出现在17.5和18.2kDa之间的一个条带(表4)。因此，由此可见该条带的存在指示强刺激活性。

[0128] 表3：分级成8个级分F1-F8的马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂以及每种级分的滞后时间减少作用

[0129]

[0130] 通过实施例4中所述的方法对蛋白酶抑制活性进行确定。这揭示，蛋白质级分F1和F6包含胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶抑制活性二者(TIA和CTIA二者皆有)，但是在80℃下热处理30分钟后两种活性均未留存。

[0131] 实施例4：用于本发明的马铃薯蛋白质蛋白酶抑制剂可以是天然的

[0132] 30g/L偶氮酪蛋白(SigmaAldrich，A2765)贮存溶液如下制备：将该蛋白质在50℃下溶解于包含5mM CaCl2(SigmaAldrich,C3881)的100mM pH 5.0柠檬酸盐缓冲液中，并冷却回至37℃。将包含蛋白酶活性的冻干真菌裂解物溶解于1mM HCl溶液中。将PPII溶解于pH 3.0乙酸盐溶液中。

[0133] 从PPII溶液中，以使最高样品浓度在孵育之后信号损失约50％的方式制备一系列稀释液。从每种稀释液中，将125μL与25μL真菌蛋白酶溶液在eppendorf杯中混合，或与25μL去矿物质水混合作为对照。蛋白水解反应的阳性对照和阴性对照使用125μL去矿物质水，而不是样品材料。向这些混合物中添加225μL温热偶氮酪蛋白，然后在37.0℃下孵育30分钟。然后，通过添加150μL的15％w:v三氯乙酸(“TCA”)溶液使反应淬灭。添加偶氮酪蛋白的顺序与添加TCA的顺序相同，以确保所有样品的孵育时间相等。

[0134] 通过使用Thermo Scientific 转子在Heraeus Multifuge 1S-R中以15,000g在40℃下离心10分钟来除去未水解的偶氮酪蛋白和其他不溶物。将100μL上清液通过小心吸移转移至微量滴定板，并补充100μL的1.5M NaOH溶液。然后，在BioRad Model 680微板阅读仪上分析该板在450nm处的吸光度。

[0135] 将吸光度相对于该板中样品材料的量作图。所得线的斜率使用最小二乘法通过线性回归获得，并且指示损失的吸光度量/样品材料量。不存在样品的阳性对照指示已知量的蛋白酶溶液产生的最大吸光度。因此，通过将斜率除以阳性对照的吸光度，获得表示为抑制的蛋白酶量/样品材料量的胰蛋白酶抑制活性(参见图2)。

[0136] 由此可见，本实验所使用的PPII可以是天然的。

[0137] 实施例5：在存在马铃薯蛋白酶抑制剂的情况下通过酿酒酵母的麦芽发酵[0138] 由麦芽提取物和面包酵母制备两批啤酒。为了便于光谱分析，选择格外浅色的麦芽提取物。将150g/L的Arsegan优质麦芽提取物(5010012，Munton(UK))添加到自来水中并搅拌直到溶解形成麦芽汁。

[0139] 将10mL的酿酒酵母(ATCC 9763)过夜培养物添加到已预加热至30℃的4L麦芽汁中。将麦芽汁分成两个两升的级分。一个级分作为对照保存，而向另一级分补充0.1wt.％的马铃薯蛋白酶抑制剂(Solanic 306P，Avebe)。监测发酵的细胞密度(表示为在620nm处的光密度)、液体密度(如通过比重计测量的)和二氧化碳的产量(表示为每分钟的气泡数)。由于酒精的密度小于水的密度，因此溶液的密度是发酵反应进展的量度。产生的CO2的体积与酒精产生速率直接相关，并且因此提供反应速率的指示。当细胞密度超过OD620为2时，用去矿物质水稀释等分试样以进行适当的测量。将报告的值针对这一稀释进行校正。

[0140] 表4：在不存在和存在0.1wt.％马铃薯蛋白酶抑制剂的情况下通过酿酒酵母的麦芽汁发酵的细胞密度、溶液密度和CO2产生速率

[0141]

[0142] 马铃薯蛋白酶抑制剂的存在使得细胞密度更高，溶液密度的下降更快，并且CO2产生速率提高。用马铃薯蛋白酶抑制剂制备的啤酒的气味以明显的果香为特征，这与缺乏这一特性的参考啤酒形成对比。

[0143] 从这些结果可以看出，整个发酵过程更快，这由滞后时间减少引起。在这些条件下滞后时间减少约2小时。

[0144] 实施例6：使用马铃薯蛋白酶抑制剂的泡菜发酵

[0145] 使用配备有磨碎器盘的厨房食品加工机将白甘蓝(在当地购买)磨碎成细片。将由此获得的甘蓝片用15克食盐/kg甘蓝处理。该处理通过渗透压增加使液体从叶片中抽提出，从而形成发酵培养基。向该液体补充等量的水以便于pH测量。将仍包含甘蓝片的发酵培养基分成相等的两份，使一份保持原样，而向另一份补充1g/L马铃薯蛋白酶抑制剂(Solanic 206P，Avebe)。将两批并行孵育，同时通过经校准的pH记录仪每15分钟测量pH。表5中示出了从6.0的起始pH达到4.0的pH所需的时间。

[0146] 表5：在马铃薯蛋白酶抑制剂下内源性微生物将pH从6.0降低至4.0所需的时间[0147]

[0148] 泡菜发酵是一系列复杂的反应，其中一组微生物按顺序生长，从每一种制备用于下一物种的培养基。由于在不同的时间涉及多个物种，因此该系列难以根据滞后时间来描述。尽管如此，马铃薯蛋白酶抑制剂的存在使达到4.0的pH所需的时间减少7小时，或减少总时间的20％。

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