本发明涉及某些含酮基的亚磺酰氨基化合物的立体选择性微生物还原，用以形成相应的含羟基化合物。

Larsen和Lish（Larsen，A.A和Lish，P.M.（1964）Nature，203，1283-1284）报导了一系列在苯环上带烷基亚磺酰氨基的苯乙醇胺的生物活性。在该系列中，某些化合物具有肾上腺素能作用和抗肾上腺素能作用，包括α-肾上腺素能受体阻断或受体激发作用，β-肾上腺素能受体阻断或受体激发作用。D-（+）甲磺胺心定是一种β-阻断剂（Uloth，R.H.，Kirk，J.R.，Gould，W.A.，和Larsen，A.A.（1966）Sulfonanilides，9，88-96）。与其它的β-阻断剂不同，它具有第Ⅲ类防心律失常的性能（Lish，P.A.，Weikel，J.H.，和Dungan，K.W.（1965），J.Pharma.  and  Exper.Therapeutics，149，161-173）。诸如心得安和甲磺胺心定之类的β-肾上腺素能阻断药物已被化学分离成右旋和左旋旋光异构体，业已证实，D（+）异构体的活性是相应的L（-）异构体的50倍（Somani，P.，和Bachand，T.（1969），Eur.J.Pharma.，7，239-247）。因此，极其希望能有一种简便的立体选择方法，以便得到上述亚磺酰氨基化合物的纯的对映异构物。

使用酶和微生物来制造某些旋光化合物在现有技术中是已知的（例如见美国专利5，106，736;美国专利4，857，468;Akita，H等（1984）Chem.Pharm.Bull.，32（4），1342-1348;Hummel，W.（1990）Biotechnology  Letters，12（60），403-408;和Schneider，M.P.等，在Bioflavour′87（P.Schreiner编著）中483-529页，De  Grugter，Berlin（1988）。但是，迄今为止还未报道过象下面提到的某些含酮基化合物的立体选择性微生物/酶催化还原。

我们发现，某些酮（例如N-（4-（2-氯乙酰）苯基）-甲磺酰胺）通过立体选择性微生物还原形成相应的（+）-链烷醇。这些链烷醇本身是生物活性的，或者是合成某些心血管药物（例如D-（+）甲磺胺心定）的关键的手性中间体。

本发明提供了一种将含酮基的化合物立体选择性地酶催还原成相应的含羟基化合物的方法。

具体地说，本发明提供了一种制备式（Ⅰ）的旋光性链烷醇化合物的方法：

式中

R1是低级烷基、芳基或取代的芳基;

R2是一个有1到4个碳原子的亚烷基，它通过1到2个碳原子把-X和 连接起来;

Y是氢、卤素、羟基、硝基、低级烷氧基、苄氧基、取代的苄氧基、低级烷基、或R3SO2NH-，其中R3独立地具有和R1相同的意义;

X是氯、溴、碘、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基，或者是氨基、单烷基氨基或二烷基氨基的氢氯化物;

该方法包括：使通式（Ⅱ）的酮类化合物与能够对式Ⅱ化合物立体选择性地还原成式Ⅰ化合物起催化作用的酶或微生物接触

式中R1、X和Y的定义同前，R2是1到4个碳原子的亚烷基，通过1到2个碳原子把-X和 连接起来。

式Ⅰ化合物可在防心绞痛、抗心律失常和抗高血压等病症治疗中作为β-肾上腺素能阻断剂使用，或者作为制备这些药剂的中间体使用（例如见，美国专利3，351，584）。

本文中的“烷基”一词当单独使用或作为另一基团的一部分使用时，代表任意取代的、但是最好是未取代的直链和支链饱和烃基，优选在直链中有1到10个碳原子。这类未取代的基团实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、异己基、庚基、4，4-二甲基、戊基、辛基、2，2，4-三甲基戊基、壬基、癸基等。烷基可以被适当的取代基取代，即，能形成适用于本发明的化合物的取代基。烷基的取代基实例包括一个或多个、最好是三个或更少的氯基、溴基或碘基。

本文所用的“低级烷基”一词代表任意取代的、但是最好是未取代的基团，例如上述的在直链中有1到4个碳原子的烷基。

“低级烷氧基”一词代表通过一个氧键（-O-）键合的上述的低级烷基。术语“单烷基氨基”或“二烷基氨基”分别代表被一或二个上述烷基取代的氨基。

本文所用的芳基一词代表碳环芳基、最好是含有1或2个环和6到12个环碳原子。芳基的实例包括苯基、联苯基和萘基。术语“取代的芳基”和“取代的苄氧基”代表其中的一个或多个芳环被取代的基团。取代基实例包括一个或多个、最好是三个或更少的硝基、上述的烷基或上述的烷基的取代基。

本发明的方法具有产生特定对映性结果的优点。此方法主要是形成D（+）对映体而不是优选的和不优选的对映体的外消旋混合物。具体实施方案的其它优点包括，与多步的化学合成相比，只需一步特定对映性还原。另外，尤其是在环境温度和压力下催化还原时，可以达到酮化合物向相应醇化合物的优选对映体转化的高转化度，以及醇化合物的高的对映体纯度。

本发明中使用的酶或微生物可以是能够催化本文所说的立体选择性酶催还原的任何酶或微生物。这些酶或微生物可以以游离状态或固定在载体上的形式使用，例如以物理吸附或夹带的形式固定。

合适的酶，不管其来源或纯度如何，包括称作氧化还原酶或脱氢酶的那些酶。所用的酶可以是例如从微生物中分离出的酶，例如先将细胞悬浮液均化，接着通过分解、离心、二乙氨乙基纤维素色谱、硫酸铵分级、使用凝胶过滤介质的色谱例如Sephacryl（烯丙基葡聚糖和N，N′-亚甲基二丙烯酰胺的交联的共聚物）色谱以及离子交 换色谱例如Mono-Q（通过季胺基结合带负电的生物分子的阴离子交换剂）色谱进行分离。这些酶的实例包括L-2-羟基异己酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、酵母酶浓缩物（Sigma）和β-羟基丁酸脱氢酶，或是由下文提到的微生物衍生得到的那些酶。

关于微生物的使用，本发明的方法可以用能够催化本文所述立体选择性酶催还原的任何合适的微生物进行。例如。细胞可以以完整的湿细胞或干细胞的形式使用，例如冷冻干燥的、喷雾干燥的或加热干燥的细胞，或者是以处理过的细胞物质的形式使用，例如破裂的细胞或细胞提取物。合适的微生物包括细菌、酵母和霉菌的下列属：无色杆菌属、不动杆菌属、放线菌属、产碱杆菌属、节杆菌属、固氮菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属、黄杆菌属、甲基单胞菌属、分枝杆菌属、诺卡氏菌属、假单胞菌属、红球菌属、链霉菌属、黄单胞菌属、曲霉属、假丝酵母属、镰孢霉属、地丝菌属、汉逊酵母属、克勒克酵母属、青霉属、毕赤酵母属、根霉属、红酵母属、酵母属、木霉属、被孢霉属、小克银汉霉属、球拟酵母属和红假单胞菌属。

优选的微生物包括简单节杆菌、局限诺卡氏菌、鲑色诺卡氏菌、缠绕红球菌、玫瑰色红球菌、牝牛分枝杆菌、地中海诺卡氏菌、自养诺卡氏菌、马型红球菌、白假丝酵母、白地霉、高山被孢霉、巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、刺孢小克银汉霉、多孢球拟酵母、光滑球拟酵母和乙酸钙不动杆菌，特别是小球诺卡氏菌（例如ATCC  21505）、季也蒙假丝酵母（例如ATCC  20318）、红平红球菌（例如ATCC  4277）、酿酒酵母（例如ATCC  24702）、恶臭假单胞菌（例如ATCC  11172）、拉曼被孢霉（例如ATCC  38191）、费比恩汉逊酵母（例 如ATCC  58045）、多形汉逊酵母（例如ATCC  26012）、多孢木霉（例如ATCC  28014）、红球菌种（例如ATCC  21243）、ATCC  12975和ATCC  29675）、缠绕红球菌（例如ATCC  21950）、局限诺卡氏菌（例如ATCC  14887）、产糖芽霉菌（例如ATCC  16623）、布里马毛霉菌（例如ATCC  89778）和高山被孢霉（例如ATCC  36965）。

使用遗传工程化的生物体也在考虑之内。寄主细胞可以是任何细胞，例如大肠埃希氏杆菌，改性成含有一个或多个基因，用以表达能起本文所述催化作用的一种或多种酶。

特别优选使用汉逊酵母属的微生物，尤其是多形汉逊酵母种，特别是多形汉逊酵母ATCC  26012小种;费比恩汉逊酵母种，特别是费比恩汉逊酵母ATCC  58045小种;红球菌属，特别是红球菌种ATCC  21243和缠绕红球菌ATCC  21950种，以及诺卡氏菌属。“ATCC”一词是指所述微生物的保藏地美国典型培养物保藏中心（12301  Parklawn  Drive，Rockville，Maryland  20852）的登记号。还特别优选使用从这些生物体得到的细胞提取物或分离出的酶。当然，两种或更多的酶和/或微生物的组合也认为是在本发明的范围之内。

本发明的立体选择性酶催还原法可以在所用微生物的发酵之后进行（两步发酵和还原），或者与其同时进行，后一种情形也就是原位发酵和还原（一步发酵和还原）。在一步法中，微生物可以在合适的培养基中生长，直到微生物得到充分生长。然后可以向微生物培养基中加入式Ⅱ化合物，立体选择性酶催还原与发酵一起继续进行，最好是一直进行到完全转化。

在两步法中，可以使微生物在第一步里于合适的发酵介质中生 长，直到显示出所要求的酶（例如氧化还原酶）活性。接着，可以通过离心收取细胞，将收取的细胞悬浮在合适的缓冲溶液中制备微生物细胞悬浮液。可以使用诸如Tris-HCl、磷酸盐、乙酸钠等缓冲物。也可以用水来制备微生物细胞的悬浮液。在第二步中，可以将式Ⅱ化合物与微生物细胞悬浮液混合，微生物细胞悬浮液对化合物的立体选择性酶催还原起着催化作用。上述的还原反应最好进行到全部或者接近全部的式Ⅱ化合物都被立体选择性还原为止。

微生物的生长可以由本领域的普通技术人员使用合适的培养基来实现。用于生长微生物的合适的培养基包括能为微生物细胞的生长提供必需营养物的那些培养基。典型的用于微生物生长的培养基包含有必要的碳源、氮源和微量元素。也可以加入诱导物。这里所用的“诱导物”一词包括能促进在微生物细胞内形成所希望的酶（例如氧化还原酶）活性的任何化合物，例如含酮基的化合物。可以在微生物生长期间加入式Ⅰ化合物作为诱导物。

碳原可以包括糖，例如麦芽糖、乳糖、葡萄糖、果糖、丙三醇、山梨糖醇、蔗糖、淀粉、甘露糖醇、丙二醇等;有机酸，例如乙酸钠、柠檬酸钠等;氨基酸，例如谷氨酸钠等;以及醇，例如乙醇、丙醇等。

氮源可以包括N-Z胺A、玉米浆、大豆粉、牛肉提取物、酵母提取物、糖蜜、发面酵母、胰化胨、脱脂大豆粉、胨、酵母蛋白水解产物、硝酸钠、硫酸铵等。

微量元素可以包括磷酸盐和美、锰、钙、钴、镍、铁、钠及钾盐。

使用的培养基可以包括一种以上的碳源或氮源或其它营养物。

优选的培养基包括含有以下物质的水基介质（按重量%）：

培养基1

麦芽提取物  1%

酵母提取物  1%

胨  1%

葡萄糖  2%

pH7.0

培养基2

胨  0.3%

甘油  4%

麦芽提取物  1%

酵母提取物  1%

pH7.0

培养基3

琥珀酸钠  2%

麦芽提取物  1%

酵母提取物  1%

胨  0.3%

pH7.0

培养基的pH以调节到6至8左右为宜，最好是6.5，灭菌，例如在121℃下灭菌30分钟，然后调节到pH约为6.5至7.5，最好是7.0。

本发明的方法在适合形成所要求的式Ⅰ化合物的条件下进行。在微生物生长和进行立体选择性还原期间，不管是用酶还是用微生物进行，培养基的pH以保持在4.0至9.0之间为宜，最好是在6.0和8.0 之间。

温度是可供立体选择性还原过程使用的热能的量度，应当维持在确保有足够的能量供此过程利用的某个温度。适合本发明方法的温度范围是从约15℃至约60℃。优选的温度范围是从约25℃至约40℃。

对于实施本发明而言，压力无严格要求，为方便起见，通常采用大气压左右的压力。

本发明的方法最好是在有氧条件下进行。反应混合物的搅拌和充气影响立体选择性还原期间的可用氧量，这可以在一步法或两步法中的微生物生长期间于摇瓶培养器或发酵罐中进行。搅拌速度以从50至1000转/分为宜，最好是50至500转/分。充气速度以每体积培养基每分钟0.1至10体积空气（即0.1至10V/Vt）为宜，最好是每体积培养基每分钟约5体积空气（即，5V/Vt）。

式Ⅱ化合物的完全转化，从如上所述用微生物或酶开始处理式Ⅱ化合物算起，可能需要例如4到48小时左右，最好是12到24小时。

本发明的立体选择性酶催还原方法可以使用一种辅助因子，例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），尤其是当使用分离出的酶时。NADH随后可以再生和重新使用。可以使用另一种酶使NADH原位再生，例如甲酸脱氢酶。合适的氢供体包括分子氢、甲酸盐（例如碱金属或铵的甲酸盐）、次磷酸盐或者在紫精（例如甲基紫精）存在下的电化学还原。也可以不用另外的酶，而用例如乙醇或甲酸盐使NADH再生。

最好是使用水基液体作为反应介质，但是也可以使用有机液体，或者混溶或不混溶（两相）的有机/水基液体混合物。

最好是使用占化合物和反应介质总重量0.1%至25%的式Ⅱ化合物起始物。选择所用的酶或微生物相对于起始物的数量，以便能催化本发明的立体选择性酶催还原反应。

最好是使用的条件能达到反应产率大于约80%、最好是大于约90%，D（+）对映体的光学纯度约为60%或更大、大于约80%为佳、大于约90%更好、最好是大于约99%。

式Ⅱ化合物上的基团，例如羟基，可以任选地加以保护以便用于本发明的选择性酶催还原方法中;这些基团随后可以任选地去保护。

分离

本发明的立体选择性还原法的产物可以用已知方法分离和纯化，例如萃取、蒸馏、结晶、柱状色谱等。

从反应介质的剩余化合物中分离出所要求的式Ⅰ化合物的一种优选的方法是萃取。一种示例性的萃取技术，例如当产物是由全细胞悬浮液制得时，是用乙酸乙酯萃取含有上述悬浮液的反应介质，用盐水洗有机层，然后减压除掉溶剂，得到油状液体，将它在高效制备液相色谱中用C18（25微米）柱（2×10英寸）层析，得到所要的产物（式Ⅰ化合物）。

以下实施例将对本发明作出说明，但不应理解成是对本发明的限制。

实施例1

立体选择性酶催还原：使用各种品系的全细胞

以下酶催还原过程的底物是N-（4-（1-氧-2-氯乙烷）-甲烷）磺酰胺（化合物A），其结构如下：

所希望的产物（化合物B）是化学式如下的化合物：

其化学名称为（+）N-（4-（1-羟基-2-氯乙烷）甲烷）-磺酰胺。用于此还原过程中的微生物列在后面的表1中。

所用的微生物保存在液氮中的小瓶里。为进行接种物的常规培育，将一个小瓶接种到在500毫升烧瓶中的100毫升培养基1（其成分见上）中，在28℃和280转/分下于摇荡器上培育48小时。在微生物生长之后，将10毫升培养物接种到含100毫升培养基1的500毫升烧瓶中，在28℃和250转/分下在摇荡器上培育。

收取细胞，悬浮在pH6.0的100mM磷酸钾缓冲液中。制备10毫升20%w/v的细胞悬浮液。在细胞悬浮液中补加25毫克底物（化合物A）和750毫克葡萄糖，在28℃、150转/分下进行还原（“生物转化”）22-40小时。取1体积的样品用2体积的乙酸乙酯提取，分离出的有机相经过一个0.2微米LID/X过滤器过滤并收集。

用带有火焰电离检测器（FID）的Hewlett  Packard气相色谱仪分析样品中的底物和产物浓度。使用Hewlett  Packard  （Dalo  Alto，California）公司的熔融石英毛细管柱（交联的甲基硅氧烷、15米 长，膜厚0.33微米、内径0.32毫米），检测器温度250℃，注入温度190℃。起始炉温为195℃，最终炉温为205℃。温度以每分钟0.5℃的速度升高。使用50毫升/分的氦气作为载气。底物（化合物A）的保留时间为1.02分，相应的还原产物（化合物B）为9.6分。用手性高效液体色谱测定产物（化合物B）的光学纯度。在室温下使用Baker-bond  Chiralcel  OB柱。注入体积为20微升，流动相为含35%正丁醇的65%己烷，流量为0.5毫升/分，检测器波长230毫微米。R-（+）对映体的保留时间为16.32分，S-（-）对映体为13.63分。

使用各种微生物在培养基1上生长并遵照以上步骤所得的结果列在表1中。

表1

化合物A微生物还原成化合物B

反应时间  化合物B  化合物B的

微生物  (小时)  产率(%)  光学纯度(%)

产糖芽霉菌  ATCC  16623  48  73  75

多形汉逊酵母  ATCC  26012  20  95  99

布里马毛霉菌  ATCC  89778  48  34  70

高山被孢霉  ATCC  36965  20  35  80

多孢木霉  ATCC  28014  20  86  77

红平红球菌  ATCC  4277  20  63  68

红球菌属  ATCC  12975  22  44  60

红球菌属  ATCC  29675  22  53  95

红球菌属  ATCC  21243  22  64  97

缠绕红球菌  ATCC  21950  22  45  99

小球诺卡菌  ATCC  21505  22  63  78

局限诺卡菌  ATCC  14887  22  75  85

实施例2

使用全细胞：反应时间变化

如实施例1中所述，本方法的底物是化合物A，所希望的产物为化合物B。

多形汉逊酵母ATCC  26012的细胞在合并于500毫升烧瓶中的100毫升培养基1内生长。生长过程在25℃和280转/分下进行48小时。将100毫升培养物接种到装在发酵罐中的15升培养基2里（其成分见前）。在发酵罐中于25℃、每分钟充气15升和500转/分的搅速下生长60小时。自发酵罐中收取细胞用来将化合物A还原（“生物转化”）成化合物B。

将200克细胞悬浮在3升100mM的磷酸钾缓冲液（pH6.0）中，制得均匀的细胞悬浮液。向此细胞悬浮液中加入12克化合物A和120克葡萄糖，在22℃、160转/分下进行化合物A向化合物B的生物转化24小时，24小时后，再加入35克葡萄糖，在22℃和160转/分下再继续生物转化72小时。制得样品，按实施例1中所述确定产物产率和光学纯度。所得结果总结在后面的表中。

表2

反应时间  化合物B产率%  化合物B的光学纯度%

6  28  -

12  52  -

18  78  -

22  96  99

实施例3

使用细胞提取物和辅助因子

此方法的底物（化合物A）和所希望的产物（化合物B）与实施例1中所述的相同。

按照实施例2中所述使多形汉逊酵母ATCC  26012的细胞在培养基1和2上生长。

将150克细胞悬浮在pH6.0的1.5升0.2M磷酸钾缓冲液中。用微流化器在13000磅/平方英寸压力下将均化的细胞悬浮液在4℃下分裂。分裂的细胞悬浮液在12000转/分下离心30分钟。透明的上层清液（“细胞提取液”）用于化合物A向化合物B的生物转化。

在1升细胞提取液中补加2.5克底物（化合物A）、甲酸脱氢酶（500单位）、0.7mM  NAD（烟酰胺嘌呤二核苷酸）和25克甲酸钠。反应在pH6.0、搅速150转/分和22℃下进行。定期取样，按实施例1中所述分析反应产率和化合物B的光学纯度。所得结果总结在下面的表3中。

表3

反应时间(小时)  化合物B(克/升)  产率(%)  光学纯度(%)

24  2.3  90  99

在以上步骤中，用于化合物A向化合物B生物转化的NADH辅助因子，用甲酸脱氢酶NAD+和甲酸盐在生物转化的同时形成和再生，其情形如下图所示。

在化合物A完全转化成化合物B之后，将反应混合物调节到pH为7.0，用等体积的乙酸乙酯萃取3次。分离出有机相，用0.7M的碳酸氢钠洗2次。将分出的有机层在无水硫酸钠上干燥，减压除掉乙酸乙酯。所得的油状残余物在室温下真空干燥，回收到灰白色的固体，产率85%（分离的），光学纯度99%。