一种酿酒酵母及其用途
阅读：983发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种酿酒酵母及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 工程 领域，特别涉及一种酿酒 酵母 及其用途。该菌株的保藏编号为：CGMCC No.13987。本发明提供的菌株能够适应含有 抑制剂 的环境、高温环境，在含有多种 纤维 素 乙醇 生产中产生的抑制剂的培养基中正常生长，并能够在 纤维素 水 解 液中表现出很好的生长优势，并实现高效的乙醇生产。，下面是一种酿酒酵母及其用途专利的具体信息内容。
1.一种酿酒酵母，其特征在于，其保藏编号为：CGMCC No.13987。
2.权利要求1所述的酿酒酵母作为木糖利用菌株的用途。
3.权利要求1所述的酿酒酵母作为高温耐受菌株的用途；所述高温不低于30℃。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述高温为35～45℃。
5.权利要求1所述的酿酒酵母作为乙醇发酵中抑制剂的耐受菌株的用途。
6.权利要求5所述的用途，其特征在于，所述抑制剂选自糠醛、苯酚或乙酸。
7.根据权利要求5或6所述的用途，其特征在于，所述抑制剂中糠醛的含量为1～1.5g/L，苯酚的含量为0.3～0.7g/L，乙酸的含量为5～6g/L。
8.权利要求1所述的酿酒酵母作为高温和乙醇发酵中抑制剂的耐受菌株的用途。
9.权利要求1所述的酿酒酵母在生产乙醇中的应用。
10.一种发酵生产乙醇的方法，其特征在于，取如权利要求1所述的酿酒酵母接种于发酵原料中发酵制得乙醇。
一种酿酒酵母及其用途
技术领域
背景技术
[0002] 在纤维素乙醇生产工艺中，酸法预处理由于其成本低廉和可操作性强，受到多数机构的青睐，被认为是最容易实现工业化的预处理方法，如稀酸预处理和蒸汽爆破预处理。然而，由于这些化学预处理的条件一般都是高温高压，所以会导致一些抑制性物质的产生，如呋喃类、弱酸类、酚类等。这些抑制性物质对后续发酵微生物有非常强烈的抑制作用，严重影响纤维素水解液的乙醇发酵产率和速率。在纤维素乙醇生产工艺中，稀酸预处理法被认为是最有潜力的纤维素预处理方法，但由于抑制剂的产生及其对微生物的毒害作用而使该方法的广泛应用受到限制。
[0003] 已有实验证明这些抑制剂抑制多种发酵微生物，包括大肠杆菌、运动发酵单胞菌、树干毕赤酵母和酿酒酵母等，其中，酿酒酵母是其中耐受能力最强的菌种之一。另外，酿酒酵母是在乙醇发酵中应用最广泛的菌株，酿酒酵母的优势包括：(1)葡萄糖的转化速率快，(2)产物专一性高，(3)对工业生产环境具有稳健性等。
[0004] 能够耐受纤维素水解液中的抑制剂的菌株的筛选和构建是纤维素乙醇生产研究中的一个重要问题。早期有研究表明，这些抑制剂主要抑制微生物的生长，而对发酵能力的影响比对生长的影响小的多。人们希望获得能耐受多种抑制剂的酿酒酵母菌株来实现纤维素乙醇生产中的原位脱毒和高效发酵，因为脱毒步骤会明显增加纤维素乙醇的生产成本，降低纤维素乙醇的市场竞争力。
[0005] 因此，提供一种能够在含有多种纤维素乙醇生产中产生的抑制剂的培养基中正常生长并具有很好的生长优势、实现乙醇高效生产的菌株具有重要的现实意义。
发明内容
[0006] 有鉴于此，本发明提供一种酿酒酵母及其用途。该菌株在含有多种纤维素乙醇生产中产生的抑制剂的培养基中正常生长，并能够在纤维素水解液中表现出很好的生长优势，并实现高效的乙醇生产。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0008] 本发明提供了一种酿酒酵母，其保藏编号为：CGMCC No.13987。
[0009] 本发明还提供了所述酿酒酵母作为木糖利用菌株的用途。
[0010] 本发明还提供了所述酿酒酵母作为高温耐受菌株的用途；所述高温不低于30℃。
[0011] 在本发明的一些具体实施方案中，所述高温为35～45℃，优选为40℃。
[0012] 本发明还提供了所述酿酒酵母作为乙醇发酵中抑制剂的耐受菌株的用途。
[0014] 在本发明的一些具体实施方案中，所述抑制剂中糠醛的含量为1～1.5g/L，苯酚的含量为0.3～0.7g/L，乙酸的含量为5～6g/L。
[0015] 在本发明的一些具体实施方案中，所述抑制剂中糠醛的含量为1.3g/L，苯酚的含量为0.5g/L，乙酸的含量为5.3g/L。
[0016] 本发明提供了所述酿酒酵母作为高温和乙醇发酵中抑制剂的耐受菌株的用途，及其同时耐受高温和乙醇发酵中抑制剂。所述高温不低于30℃，优选为35～45℃，更优选为40℃。所述抑制剂选自糠醛、苯酚或乙酸。所述抑制剂中糠醛的含量为1～1.5g/L，苯酚的含量为0.3～0.7g/L，乙酸的含量为5～6g/L。在本发明的一些具体实施方案中，所述抑制剂中糠醛的含量为1.3g/L，苯酚的含量为0.5g/L，乙酸的含量为5.3g/L
[0017] 本发明还提供了所述酿酒酵母在生产纤维素乙醇中的应用。
[0018] 本发明还提供了所述酿酒酵母在生产乙醇中的应用。
[0019] 本发明还提供了一种发酵生产乙醇的方法，取所述酿酒酵母接种于发酵原料中发酵制得乙醇。
[0020] 在本发明的一些具体实施方案中，所述酿酒酵母的种子培养基或发酵培养基包括：蛋白胨，15～25g/L；酵母粉，5～15g/L；木糖，15～25g/L；更具体的包括：蛋白胨，20g/L；酵母粉，10g/L；木糖，20g/L；121℃20min高温高压湿热灭菌；木糖单独灭制后添加。
[0021] 在一些具体实施方案中，所述种子培养基还包括30～50g/L的葡萄糖。在一些具体实施方案中，所述种子培养基还包括40g/L的葡萄糖。
[0022] 所述酿酒酵母的扩大培养的条件为：于25～35℃、200～250rpm培养20～30h；，更具体的为于30℃、220rpm培养24h；
[0023] 所述酿酒酵母的发酵生产的条件为：于25～45℃、100～200rpm条件下培养70～80h，更具体的为于30℃、150rpm条件下培养72h或者，于40℃、150rpm条件下培养72h。
[0024] 本发明提供了一种酿酒酵母，其保藏编号为：CGMCC No.13987。实验结果表明：本发明提供的菌株含有抑制剂的发酵培养基中30℃发酵时，在经过72h后开始进入稳定期，OD600是6.435，且糖耗剩余量为1.269g/l。而原始菌株仍处于对数期，OD600是3.94，且木糖剩余量为7.18g/l，与原始菌株相比，糖耗较高，生长较快。由此可知，E7-12菌株在含有抑制剂的条件下，表现出明显的生长优势，与原始菌株相比，能够适应含有抑制剂的环境，且展现出良好的木糖利用优势。
[0025] 本发明提供的E7-12菌株在不含抑制剂的混糖条件下30℃发酵时，在经过15h开始进入稳定期，OD600是14.025，且葡萄糖在9h时剩余4.50337g/L，不足5g/L。而原始菌株在15h仍处于对数期，OD600是8.43，且葡萄糖在9h剩余16.06737g/L。二者在木糖利用上几近相同。由此可知，E7-12菌株在不含抑制剂的混糖条件下，能够表现出明显的生长优势，能展现出良好的葡萄糖和木糖利用优势。
[0026] 本发明提供的E7-12菌株在不含抑制剂的混糖条件下40℃发酵时，在经过15h开始进入稳定期，OD600是9.765，且葡萄糖在9h时剩余0.04969g/L，不足1g/L，木糖含量在24h后剩余不足1g/L。而原始菌株在12h，OD600是3.77，且葡萄糖在9h剩余19.49938g/L，且在21h后，葡萄糖不再消耗，剩余量为8.97926g/L，原始菌株木糖含量在18h后不再消耗，剩余量为14.77384g/L。由此可知，E7-12菌株在高温的混糖条件下，能够表现出明显的生长优势，能展现出良好的葡萄糖和木糖利用优势；
[0027] 本发明提供的E7-12菌株在含抑制剂的混糖条件下40℃发酵时，在经过48h开始进入稳定期，OD600是14.025，且葡萄糖在24h消耗完毕，木糖含量在72h后剩余量为4.6797g/L，不足5g/L。而原始菌株在48h，OD600是8.43，且葡萄糖在24h葡萄糖剩余量为6.29134g/L，原始菌株木糖含量在72h，木糖含量为12.40712g/L，木糖剩余量远远高于E7。由此可知，E7-12菌株在含抑制剂的高温的混糖条件下，能够表现出明显的生长优势，能展现出良好的葡萄糖和木糖利用优势。
[0028] 综上所述，本发明提供的菌株能够适应含有抑制剂的环境、高温环境，在含有多种纤维素乙醇生产中产生的抑制剂的培养基中正常生长，并能够在纤维素水解液中表现出很好的生长优势，并实现高效的乙醇生产。
[0029] 生物保藏说明
[0030] 生物材料E7-12，分类命名：酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae，于2017年4月6日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13987。
附图说明
附图说明
[0032] 图1示验证构建出的菌株为二倍体菌株；
[0033] 图2示在摇瓶上E7-12菌株与原始S菌株在YPX混合抑制剂下的木糖消耗和乙醇产量曲线；
[0034] 图3示在摇瓶上E7-12菌株与原始S菌株在YPX混合抑制剂下的生长曲线；
[0035] 图4示E7-12菌株与原始S菌株在混糖培养基下，30℃糖耗曲线；
[0036] 图5示E7-12菌株与原始S菌株在混糖培养基下，30℃乙醇产量曲线；
[0037] 图6示E7-12菌株与原始S菌株在混糖培养基下，30℃菌株的生长曲线；
[0038] 图7示E7-12菌株与原始S菌株在混糖培养基下，40℃高温下菌株的糖耗曲线；
[0039] 图8示E7-12菌株与原始S菌株在混糖培养基下，40℃高温下菌株的乙醇产量曲线；
[0040] 图9示E7-12菌株与原始S菌株在混糖培养基下，40℃高温下菌株的生长曲线；
[0041] 图10示E7-12菌株与原始S菌株在混糖抑制剂培养基下，40℃高温下菌株的糖耗曲线；
[0042] 图11示E7-12菌株与原始S菌株在混糖抑制剂培养基下，40℃高温下菌株的乙醇产量曲线；
[0043] 图12示E7-12菌株与原始S菌株在混糖抑制剂培养基下，40℃高温下菌株的生长曲线。
具体实施方式
[0044] 本发明公开了一种酿酒酵母及其用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0045] 一种酿酒酵母的耐受多种抑制剂的菌株，其命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SyBE-SC02100032，简称E7-12。
[0046] 本发明的一株酿酒酵母的耐受多种抑制剂和高温的新菌株E7-12，是在对工业酿酒酵母双倍体(Saccharomyces cerevisiae)进行拆孢分离得到MATa 10#，经紫外线诱变后得到耐受抑制剂提升的菌株12#。再将其与木糖利用菌株E7进行杂交构建出二倍体木糖利用菌株。
[0047] 紫外线诱变策略是：将10#菌株的培养液(YEPD培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L)进行稀释后铺于含抑制剂的筛选培养基(添加抑制剂的YEPD培养基)，将铺好的平板距离15W紫外灯下56cm处照射7min，放于30℃培养箱中避光培养2天。
[0048] 菌株杂交的条件是：将筛选出的12#菌落接到5ml YPD液体培养基，培养条件是30℃,220rpm,8h。木糖利用菌株E7 5ml YPX液体培养基，培养条件是30℃,220rpm,8h。然后将12#菌落和E7以OD为0.5:0.5转接到新鲜的YPD液体培养基中,30℃,220rpm,6h。然后将
100ul涂布在YNBX固体平板上(6.7g/L酵母氮源，20g/L木糖)，挑取形态大的菌落进行酵母菌落PCR验证其为二倍体和单倍体，验证结果如图1所示。E7-12为二倍体菌株。
100ul涂布在YNBX固体平板上(6.7g/L酵母氮源，20g/L木糖)，挑取形态大的菌落进行酵母菌落PCR验证其为二倍体和单倍体，验证结果如图1所示。E7-12为二倍体菌株。
[0049] 该菌株在含有多种纤维素乙醇生产中产生的抑制剂的培养基中正常生长能够在纤维素水解液中表现出很好的生长优势。
[0050] 所述抑制剂为糠醛、苯酚和乙酸。
[0051] 所述抑制剂糠醛的含量为1.3g/L，苯酚的含量为0.5g/L，乙酸的含量为5.3g/L。
[0052] 本发明提供的菌株能够适应含有抑制剂的环境、高温环境，在含有多种纤维素乙醇生产中产生的抑制剂的培养基中正常生长，并能够在纤维素水解液中表现出很好的生长优势，并实现高效的乙醇生产。与原始菌株相比，本发明提供的菌株极显著(P＜0.01)提高了生长优势和木糖利用率，显著(P＜0.01)提高了乙醇的产量。
[0053] 本发明提供的一种酿酒酵母及其用途中所用原料及试剂均可由市场购得。
[0054] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0055] 实施例1 E7-12菌株的构建
[0056] 本发明的一株酿酒酵母的耐受多种抑制剂和高温的新菌株E7-12，是在对工业酿酒酵母双倍体(Saccharomyces cerevisiae)进行拆孢分离得到MATa 10#，经紫外线诱变后得到耐受抑制剂提升的菌株12#。再将其与木糖利用菌株E7进行杂交构建出二倍体木糖利用菌株。
[0057] 紫外线诱变策略是：将10#菌株的培养液(YPD培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L)进行稀释后铺于含抑制剂的筛选培养基(添加抑制剂的YPD培养基)，将铺好的平板距离15W紫外灯下56cm处照射7min，放于30℃培养箱中避光培养2天。
[0058] 菌株杂交的条件是：将筛选出的12#菌落接到5mlYPD液体培养基，培养条件是30℃,220rpm,8h。木糖利用菌株E7 5ml YPX液体培养基，培养条件是30℃,220rpm,8h。然后将E7-12和E7以OD为0.5:0.5转接到新鲜的YPD液体培养基中,30℃,220rpm,6h。然后将100ul涂布在YNBX固体平板上(6.7g/L酵母氮源，20g/L木糖)，挑取形态大的菌落进行酵母菌落PCR验证其为二倍体和单倍体，验证结果如图1所示。E7-12为二倍体菌株。
[0059] 实施例2 在摇瓶上比较E7-12菌株与原始菌株的生长
[0060] 1、试验材料：菌株E7-12由本实验室筛选构建的菌株；原始菌株E7实验室前期构建木糖利用菌株S.cerevisiae CGMCC NO.6634。
[0061] 2、试验方法：
[0062] 种子培养基：
[0063] E7-12菌株：蛋白胨，20g/L；酵母粉，10g/L；木糖，20g/L。121℃20min高温高压湿热灭菌。木糖单独灭菌后再混合。原始菌株：蛋白胨，20g/L；酵母粉，10g/L；木糖，20g/L。121℃20min高温高压湿热灭菌。木糖单独灭菌后再混合。
[0064] 发酵培养基：
[0065] 蛋白胨，20g/L；酵母粉，10g/L；木糖，20g/L。121℃20min高温高压湿热灭菌。木糖单独灭菌后再混合。发酵前加入抑制剂使其终浓度达到糠醛0.39g/L，苯酚0.15g/L，乙酸1.59g/L。
[0066] 将E7-12菌株和原始菌株S.cerevisiae CGMCC NO.6634分别接种于50mL种子培养基中，在30℃、220rpm培养24h，均以初始菌体浓度OD600＝1.0接种于有100mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，于30℃、150rpm条件下培养，使用722型分光光度计测定菌体生长曲线。
[0067] 3、试验结果：
[0068] 如图2(数据见表1、表2)、图3(数据见表3)所示，E7-12菌株在经过72h后开始进入稳定期，OD600是6.435，且糖耗剩余量为1.269g/l。而原始菌株仍处于对数期，OD600是3.94，且木糖剩余量为7.18g/l，与原始菌株相比，糖耗较高，生长较快。由此可知，E7-12菌株在含有抑制剂的条件下，表现出明显的生长优势，与原始菌株相比，能够适应含有抑制剂的环境，且展现出良好的木糖利用优势。
[0069] 表1
[0070]
[0071] 表2
[0072]
[0073] 表3
[0074]时间(h) E7(平均值 E7(方差) E7-12(平均值) E7-12(方差)
0 1 0 1 0
12 1.3 0.016831162 1.5 0.008412893
24 1.96 0.038667054 2.38 0.019185696
36 2.545 0.009934202 3.475 0.141245216
48 2.925 0.04850987 4.79 0.108942932
60 3.41 0.007488281 6.005 0.067346149
72 3.945 0.034033243 6.435 0.032194771
84 4.2 0.009014966 6.555 0
0 1 0 1 0
12 1.3 0.016831162 1.5 0.008412893
24 1.96 0.038667054 2.38 0.019185696
36 2.545 0.009934202 3.475 0.141245216
48 2.925 0.04850987 4.79 0.108942932
60 3.41 0.007488281 6.005 0.067346149
72 3.945 0.034033243 6.435 0.032194771
84 4.2 0.009014966 6.555 0
[0075] 4、结论：
[0076] 在含有抑制剂(浓度如上所述)条件下，原始菌株表现出较弱的生长发酵能力，而E7-11则能够适应抑制剂环境，实现在抑制剂环境下良好的生长及木糖利用优势。
[0077] 实施例3 混糖发酵在摇瓶上比较E7-12菌株与原始菌株的生长
[0078] 1、试验材料：菌株E7-12由本实验室筛选构建的菌株；原始菌株E7实验室前期构建木糖利用菌株S.cerevisiae CGMCC NO.6634。
[0079] 2、试验方法：
[0080] 种子培养基：
[0081] E7-12菌株：蛋白胨，20g/L；酵母粉，10g/L；葡萄糖，40g/L；木糖，20g/L。121℃20min高温高压湿热灭菌。木糖单独灭菌后再混合。原始菌株：蛋白胨，20g/L；酵母粉，10g/L；葡萄糖，40g/L,木糖，20g/L。121℃20min高温高压湿热灭菌。木糖单独灭菌后再混合。
[0082] 发酵培养基：
[0083] 蛋白胨，20g/L；酵母粉，10g/L；木糖，20g/L。121℃20min高温高压湿热灭菌。木糖单独灭菌后再混合。
[0084] 将E7-12菌株和原始菌株S.cerevisiae CGMCC NO.6634分别接种于100mL种子培养基中，在30℃、220rpm培养24h，均以初始菌体浓度OD600＝1.0接种于有100mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，于30℃、150rpm条件下培养，使用722型分光光度计测定菌体生长曲线。
[0085] 3、试验结果：
[0086] 如图4(数据见表4、表5)、图5(数据见表6、表7)、图6(数据见表8和表9)所示，E7-12菌株在经过15h开始进入稳定期，OD600是14.025，且葡萄糖在9h时剩余4.50337g/L，不足5g/L。而原始菌株在15h仍处于对数期，OD600是8.43，且葡萄糖在9h剩余16.06737g/L。二者在木糖利用上几近相同。由此可知，E7-12菌株在不含抑制剂的混糖条件下，能够表现出明显的生长优势，能展现出良好的葡萄糖和木糖利用优势。
[0087] 表4
[0088]E7 平均值 方差 平均值 方差
Time(h) glucose xylose
0 40.00036 0.07885 20.00005 0.08383
3 37.01875 0.04055 19.40058 0.26693
6 29.46476 0.24524 18.5254 0.02064
9 16.06737 0.20963 17.4517 0.00754
12 0.22162 0.01139 13.58468 0.02608
15 0 0 10.33839 0.0642
18 7.0758 0.05989
21 4.52437 0.01049
24 2.39534 0.00995
27 1.82073 0.06826
30 1.04652 0.01551
33 0.59829 0.02485
36 0.33385 0.06594
48 0.04558 0
Time(h) glucose xylose
0 40.00036 0.07885 20.00005 0.08383
3 37.01875 0.04055 19.40058 0.26693
6 29.46476 0.24524 18.5254 0.02064
9 16.06737 0.20963 17.4517 0.00754
12 0.22162 0.01139 13.58468 0.02608
15 0 0 10.33839 0.0642
18 7.0758 0.05989
21 4.52437 0.01049
24 2.39534 0.00995
27 1.82073 0.06826
30 1.04652 0.01551
33 0.59829 0.02485
36 0.33385 0.06594
48 0.04558 0
[0089] 表5
[0090]E7-12 平均值 方差 平均值 方差
Time(h) glucose xylose
0 40.00036 0.07885 20.028 0.08383
3 36.74827 0.20512 18.5829 0.29558
6 24.98851 0.07073 17.56887 0.2873
9 4.50337 0.47775 15.1358 0.03214
12 0 0 10.32205 0.01666
15 0 0 8.50197 0.08507
18 6.85626 0.13938
21 5.56897 0.12485
24 4.1368 0.10421
27 3.73997 0.0944
30 2.84232 0.07098
33 2.25037 0.09746
36 1.74438 0.08013
48 0.68494 0.0252
Time(h) glucose xylose
0 40.00036 0.07885 20.028 0.08383
3 36.74827 0.20512 18.5829 0.29558
6 24.98851 0.07073 17.56887 0.2873
9 4.50337 0.47775 15.1358 0.03214
12 0 0 10.32205 0.01666
15 0 0 8.50197 0.08507
18 6.85626 0.13938
21 5.56897 0.12485
24 4.1368 0.10421
27 3.73997 0.0944
30 2.84232 0.07098
33 2.25037 0.09746
36 1.74438 0.08013
48 0.68494 0.0252
[0091] 表6
[0092]E7 平均值 方差
Time(h) ethanol
0 0 0
3 2.2827 0.01726
6 5.21084 0.03678
9 11.06869 0.04655
12 20.11675 0.00707
15 22.03596 0.02914
18 23.62298 0.01256
21 25.23214 0.15042
24 25.90255 0.07077
27 25.90026 0.1033
30 26.15018 0.40677
33 26.73918 0.39304
36 26.48896 0.14568
48 26.53717 0.18103
Time(h) ethanol
0 0 0
3 2.2827 0.01726
6 5.21084 0.03678
9 11.06869 0.04655
12 20.11675 0.00707
15 22.03596 0.02914
18 23.62298 0.01256
21 25.23214 0.15042
24 25.90255 0.07077
27 25.90026 0.1033
30 26.15018 0.40677
33 26.73918 0.39304
36 26.48896 0.14568
48 26.53717 0.18103
[0093] 表7
[0094]E7-12 平均值 方差
Time(h) ethanol
0 0 0
3 2.32451 0.00538
6 7.26813 0.01568
9 17.28687 0.23149
12 22.00298 0.0722
15 22.93606 0.04381
18 23.48922 0.15677
21 24.31802 0.13729
24 24.65172 0.09119
27 24.66244 5.26461E-4
30 24.98204 0.05058
33 25.23967 0.06934
36 25.62597 0.0132
48 26.33749 0.11492
Time(h) ethanol
0 0 0
3 2.32451 0.00538
6 7.26813 0.01568
9 17.28687 0.23149
12 22.00298 0.0722
15 22.93606 0.04381
18 23.48922 0.15677
21 24.31802 0.13729
24 24.65172 0.09119
27 24.66244 5.26461E-4
30 24.98204 0.05058
33 25.23967 0.06934
36 25.62597 0.0132
48 26.33749 0.11492
[0095] 表8
[0096]E7 平均值 方差
Time(h) OD600
0 1 0
3 1.93 0.05
6 3.115 0.025
9 5.18 0.02
12 7.83 0.05
15 8.43 0
18 8.82 0.12
21 9.27 0.18
24 9.72 0.42
27 9.66 0.12
36 10.185 0.615
Time(h) OD600
0 1 0
3 1.93 0.05
6 3.115 0.025
9 5.18 0.02
12 7.83 0.05
15 8.43 0
18 8.82 0.12
21 9.27 0.18
24 9.72 0.42
27 9.66 0.12
36 10.185 0.615
[0097] 表9
[0098]E7-12 平均值 方差
Time(h) OD600
0 1 0
3 2.67 0.01
6 5.71 0.17
9 11 0.2
12 12.53 0.15
15 14.025 0.195
18 13.965 0.225
21 14.19 0.15
24 14.415 0.135
27 14.835 0.525
36 14.475 0.105
Time(h) OD600
0 1 0
3 2.67 0.01
6 5.71 0.17
9 11 0.2
12 12.53 0.15
15 14.025 0.195
18 13.965 0.225
21 14.19 0.15
24 14.415 0.135
27 14.835 0.525
36 14.475 0.105
[0099] 4、结论：
[0100] 在不含抑制剂的条件下，E7-12能够表现出明显的生长优势，能展现出良好的葡萄糖和木糖利用优势。
[0101] 实施例4 混糖发酵在摇瓶上比较E7-12菌株与原始菌株的生长
[0102] 1、试验材料：菌株E7-12由本实验室筛选构建的菌株；原始菌株E7实验室前期构建木糖利用菌株S.cerevisiae CGMCC NO.6634。
[0103] 2、试验方法：
[0104] 种子培养基：
[0105] E7-12菌株：蛋白胨，20g/L；酵母粉，10g/L；葡萄糖，40g/L,木糖，20g/L。121℃20min高温高压湿热灭菌。木糖单独灭菌后再混合。原始菌株：蛋白胨，20g/L；酵母粉，10g/L；葡萄糖，40g/L,木糖，20g/L。121℃20min高温高压湿热灭菌。木糖单独灭菌后再混合。
[0106] 发酵培养基：
[0107] 蛋白胨，20g/L；酵母粉，10g/L；木糖，20g/L。121℃20min高温高压湿热灭菌。木糖单独灭菌后再混合。
[0108] 将E7-12菌株和原始菌株S.cerevisiae CGMCC NO.6634分别接种于100mL种子培养基中，在30℃、220rpm培养24h，均以初始菌体浓度OD600＝1.0接种于有100mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，于40℃、150rpm条件下培养，使用722型分光光度计测定菌体生长曲线。
[0109] 3、试验结果：
[0110] 如图7(数据见表10、表11)、图8(数据见表12、表13)、图9(数据见表14和表15)所示，E7-12菌株在经过15h开始进入稳定期，OD600是9.765，且葡萄糖在9h时剩余0.04969g/L，不足1g/L，木糖含量在24h后剩余不足1g/L。而原始菌株在12h，OD600是3.77，且葡萄糖在9h剩余19.49938g/L，且在21h后，葡萄糖不再消耗，剩余量为8.97926g/L，原始菌株木糖含量在18h后不再消耗，剩余量为14.77384g/L。由此可知，E7-12菌株在高温的混糖条件下，能够表现出明显的生长优势，能展现出良好的葡萄糖和木糖利用优势。
[0111] 表10
[0112]E7 平均值 方差 平均值 方差
Time(h) glucose xylose
0 40.00036 0.07885 20.00005 0.08383
6 27.33518 0.40368 17.99691 0.03412
9 19.49938 0.38575 16.92407 0.08779
12 12.94972 0.31574 15.76895 0.02473
15 10.69749 0.18942 15.13612 0.03842
18 9.45085 0.20277 14.77384 0.06973
21 8.97926 0.01471 14.6636 0.02117
24 8.91216 0.32611 14.3851 0.12258
27 9.12391 0.12057 14.67693 0.09588
30 8.94344 0.10905 14.38811 0.1324
33 8.76286 0.28283 14.27746 0.0727
36 8.87936 0.20911 14.35644 0.0602
48 8.88251 0.23577 14.40335 0.06348
Time(h) glucose xylose
0 40.00036 0.07885 20.00005 0.08383
6 27.33518 0.40368 17.99691 0.03412
9 19.49938 0.38575 16.92407 0.08779
12 12.94972 0.31574 15.76895 0.02473
15 10.69749 0.18942 15.13612 0.03842
18 9.45085 0.20277 14.77384 0.06973
21 8.97926 0.01471 14.6636 0.02117
24 8.91216 0.32611 14.3851 0.12258
27 9.12391 0.12057 14.67693 0.09588
30 8.94344 0.10905 14.38811 0.1324
33 8.76286 0.28283 14.27746 0.0727
36 8.87936 0.20911 14.35644 0.0602
48 8.88251 0.23577 14.40335 0.06348
[0113] 表11
[0114]E7-12 平均值 方差 平均值 方差
Time(h) glucose xylose
0 40.00036 0.07885 20.00005 0.08383
6 17.78115 0.17833 17.11719 0.00648
9 0.04969 1.00044E-4 12.46175 0.00959
12 6.80614 0.01635
15 4.33112 0.03444
18 2.37767 0.04546
21 1.24231 0.04567
24 0.55312 0.05002
27 0.4155 0.0328
30 0.29173 9.12091E-4
33 0.20683 0.02779
36 0.0868 0.00718
48 0.23482 0.00691
Time(h) glucose xylose
0 40.00036 0.07885 20.00005 0.08383
6 17.78115 0.17833 17.11719 0.00648
9 0.04969 1.00044E-4 12.46175 0.00959
12 6.80614 0.01635
15 4.33112 0.03444
18 2.37767 0.04546
21 1.24231 0.04567
24 0.55312 0.05002
27 0.4155 0.0328
30 0.29173 9.12091E-4
33 0.20683 0.02779
36 0.0868 0.00718
48 0.23482 0.00691
[0115] 表12
[0116]E7 平均值 方差
Time(h) Ethanol
0 0 0
6 6.22055 0.12067
9 9.80778 0.14451
12 13.24192 0.1632
15 14.21794 0.09503
18 14.62005 0.05641
21 14.93453 0.02621
24 14.72966 0.03117
27 14.98515 0.22243
30 14.7086 0.25214
33 14.53581 0.07498
36 14.77603 0.16012
48 14.86519 0.04276
Time(h) Ethanol
0 0 0
6 6.22055 0.12067
9 9.80778 0.14451
12 13.24192 0.1632
15 14.21794 0.09503
18 14.62005 0.05641
21 14.93453 0.02621
24 14.72966 0.03117
27 14.98515 0.22243
30 14.7086 0.25214
33 14.53581 0.07498
36 14.77603 0.16012
48 14.86519 0.04276
[0117] 表13
[0118]E7-12 平均值 方差
Time(h) Ethanol
0 0 0
6 11.03823 0.03445
9 20.75095 0.02802
12 23.84387 0.02738
15 25.13343 0.03546
18 25.86882 0.06487
21 26.51915 0.07585
24 26.66777 0.34103
27 26.38968 0.23315
30 26.61207 0.31106
33 25.90113 0.25488
36 26.07407 0.02862
48 25.91222 0.06742
Time(h) Ethanol
0 0 0
6 11.03823 0.03445
9 20.75095 0.02802
12 23.84387 0.02738
15 25.13343 0.03546
18 25.86882 0.06487
21 26.51915 0.07585
24 26.66777 0.34103
27 26.38968 0.23315
30 26.61207 0.31106
33 25.90113 0.25488
36 26.07407 0.02862
48 25.91222 0.06742
[0119] 表14
[0120]E7 平均值 方差
Time(h) OD600
0 1 0
6 2.685 0.075
9 3.34 0.1
12 3.77 0.01
15 3.615 0.105
18 3.69 0.09
21 3.69 0.12
24 3.6 0.09
27 3.405 0.015
36 3.57 0.15
48 3.345 0.015
Time(h) OD600
0 1 0
6 2.685 0.075
9 3.34 0.1
12 3.77 0.01
15 3.615 0.105
18 3.69 0.09
21 3.69 0.12
24 3.6 0.09
27 3.405 0.015
36 3.57 0.15
48 3.345 0.015
[0121] 表15
[0122]E7-12 平均值 方差
Time(h) OD600
0 1 0
6 5.38 0.08
9 8.85 0.07
12 9.14 0.32
15 9.765 0.255
18 9.75 0.09
21 9.42 0.09
24 9.435 0.105
27 9.045 0.015
36 9.06 0.15
48 9.525 0.105
Time(h) OD600
0 1 0
6 5.38 0.08
9 8.85 0.07
12 9.14 0.32
15 9.765 0.255
18 9.75 0.09
21 9.42 0.09
24 9.435 0.105
27 9.045 0.015
36 9.06 0.15
48 9.525 0.105
[0123] 4、结论：
[0124] 在高温条件下，E7-12能够表现出明显的生长优势，能展现出良好的葡萄糖和木糖利用优势。
[0125] 实施例5 混糖发酵在摇瓶上比较E7-12菌株与原始菌株的生长
[0126] 1、试验材料：菌株E7-12由本实验室筛选构建的菌株；原始菌株E7实验室前期构建木糖利用菌株S.cerevisiae CGMCC NO.6634。
[0127] 2、试验方法：
[0128] 种子培养基：
[0129] E7-12菌株：蛋白胨，20g/L；酵母粉，10g/L；葡萄糖，40g/L,木糖，20g/L。121℃20min高温高压湿热灭菌。木糖单独灭菌后再混合。原始菌株：蛋白胨，20g/L；酵母粉，10g/L；葡萄糖，40g/L,木糖，20g/L。121℃20min高温高压湿热灭菌。木糖单独灭菌后再混合。
[0130] 发酵培养基：
[0131] 蛋白胨，20g/L；酵母粉，10g/L；木糖，20g/L。121℃20min高温高压湿热灭菌。木糖单独灭菌后再混合。发酵前加入抑制剂使其终浓度达到糠醛0.39g/L，苯酚0.15g/L，乙酸1.59g/L。
[0132] 将E7-12菌株和原始菌株S.cerevisiae CGMCC NO.6634分别接种于100mL种子培养基中，在30℃、220rpm培养24h，均以初始菌体浓度OD600＝1.0接种于有100mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，于40℃、150rpm条件下培养，使用722型分光光度计测定菌体生长曲线。
[0133] 3、试验结果：
[0134] 如图10(数据见表16、表17)、图11(数据见表18、表19)、图12(数据见表20和表21)所示，E7-12菌株在经过48h开始进入稳定期，OD600是14.025，且葡萄糖在24h消耗完毕，木糖含量在72h后剩余量为4.6797g/L，不足5g/L。而原始菌株在48h，OD600是8.43，且葡萄糖在24h葡萄糖剩余量为6.29134g/L，原始菌株木糖含量在72h，木糖含量为12.40712g/L，木糖剩余量远远高于E7。由此可知，E7-12菌株在高温的混糖条件下，能够表现出明显的生长优势，能展现出良好的葡萄糖和木糖利用优势。
[0135] 表16
[0136]E7-12 平均值 方差 平均值 方差
Time(h) glucose xylose
0 39.3127 0.23443 19.76149 0.15478
12 21.24351 0.7627 17.46089 0.35866
24 6.29134 0.20216 14.07728 0.98177
30 4.60741 0.04194 14.53486 0.03295
36 3.74298 0.07377 14.12665 0.01074
48 2.51748 0.00733 12.86986 0.82538
60 2.22644 0.18916 13.55135 0.0208
72 1.805 0.05594 12.40712 0.88572
84 1.70819 0.00895 12.27478 0.71121
96 1.59903 0.09335 12.5136 0.20088
108 1.56237 0.01773 12.33695 0.20471
120 1.4582 0.02399 12.51914 0.07774
Time(h) glucose xylose
0 39.3127 0.23443 19.76149 0.15478
12 21.24351 0.7627 17.46089 0.35866
24 6.29134 0.20216 14.07728 0.98177
30 4.60741 0.04194 14.53486 0.03295
36 3.74298 0.07377 14.12665 0.01074
48 2.51748 0.00733 12.86986 0.82538
60 2.22644 0.18916 13.55135 0.0208
72 1.805 0.05594 12.40712 0.88572
84 1.70819 0.00895 12.27478 0.71121
96 1.59903 0.09335 12.5136 0.20088
108 1.56237 0.01773 12.33695 0.20471
120 1.4582 0.02399 12.51914 0.07774
[0137] 表17
[0138]E7-12 平均值 方差 平均值 方差
Time(h) glucose xylose
0 39.3127 0.23443 19.7099 0.15478
12 1.39383 0.54884 14.68416 0.26051
24 0 0 8.70594 0.11384
30 7.32768 0.17064
36 6.55903 0.15099
48 5.58423 0.15267
60 5.07246 0.14283
72 4.6797 0.12953
84 4.18835 0.04914
96 4.15422 0.04248
108 4.00282 0.09983
120 4.02758 0.09646
Time(h) glucose xylose
0 39.3127 0.23443 19.7099 0.15478
12 1.39383 0.54884 14.68416 0.26051
24 0 0 8.70594 0.11384
30 7.32768 0.17064
36 6.55903 0.15099
48 5.58423 0.15267
60 5.07246 0.14283
72 4.6797 0.12953
84 4.18835 0.04914
96 4.15422 0.04248
108 4.00282 0.09983
120 4.02758 0.09646
[0139] 表18
[0140]E7 平均值 方差
Time(h) Ethanol
0 0 0
12 10.03623 0.06817
24 16.43685 1.0796
36 17.01976 0.45375
48 17.65743 0.6408
72 17.91833 1.74738
84 18.09587 1.14428
96 18.97861 0.22074
108 19.21427 0.20663
120 19.79732 0.99832
Time(h) Ethanol
0 0 0
12 10.03623 0.06817
24 16.43685 1.0796
36 17.01976 0.45375
48 17.65743 0.6408
72 17.91833 1.74738
84 18.09587 1.14428
96 18.97861 0.22074
108 19.21427 0.20663
120 19.79732 0.99832
[0141] 表19
[0142]E7-12 平均值 方差
Time(h) Ethanol
0 0 0
12 19.95399 0.04012
24 22.49729 0.21913
36 22.87434 0.25952
48 22.99435 0.17787
72 23.93371 0.29144
84 22.36588 0.77785
96 23.6333 0.15761
108 22.90605 0.29312
120 23.52915 0.00884
Time(h) Ethanol
0 0 0
12 19.95399 0.04012
24 22.49729 0.21913
36 22.87434 0.25952
48 22.99435 0.17787
72 23.93371 0.29144
84 22.36588 0.77785
96 23.6333 0.15761
108 22.90605 0.29312
120 23.52915 0.00884
[0143] 表20
[0144]E7 平均值 方差
Time(h) OD600
0 1 0
12 1.93 0.05
24 3.115 0.025
30 5.18 0.02
36 7.83 0.05
48 8.43 0
60 8.82 0.12
72 9.27 0.18
96 9.66 0.12
120 10.575 0.765
Time(h) OD600
0 1 0
12 1.93 0.05
24 3.115 0.025
30 5.18 0.02
36 7.83 0.05
48 8.43 0
60 8.82 0.12
72 9.27 0.18
96 9.66 0.12
120 10.575 0.765
[0145] 表21
[0146]E7-12 平均值 方差
Time(h) OD600
0 1 0
12 2.67 0.01
24 5.71 0.17
30 11 0.2
36 12.53 0.15
48 14.025 0.195
60 13.965 0.225
72 14.19 0.15
96 14.835 0.525
120 14.685 0.255
Time(h) OD600
0 1 0
12 2.67 0.01
24 5.71 0.17
30 11 0.2
36 12.53 0.15
48 14.025 0.195
60 13.965 0.225
72 14.19 0.15
96 14.835 0.525
120 14.685 0.255
[0147] 4、结论：
[0148] 在高温抑制剂条件下，E7-12能够表现出明显的生长优势，能展现出良好的葡萄糖糖和木糖利用优势。
[0149] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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