技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物技术领域，特别涉及调节宿主免疫功能、改善胃肠道营养与菌群平衡、提高营养物质利用的酿酒酵母。
背景技术
[0002] 酵母培养物是在特定工艺条件下由酵母在特制的培养基上经过充分的厌
氧发酵干燥后所制成的一种微生态制品。它是由酵母细胞代谢产物、经过发酵后变异的培养基以及少量酵母细胞所构成，营养丰富。酵母培养物益生作用主要表现在调节宿主免疫功能、改善胃肠道营养与菌群平衡、提高营养物质利用，进而促进动物生长性能。
[0003] Harrison、周联高等众多研究者均已证实酵母培养物对
反刍动物瘤胃发酵、生产性能具有较好的效果。酵母培养物的作用机制不同于单纯酵母菌制剂，其作用效果的好坏主要取决于菌种的优劣，优良的菌种可使培养物中活性物质更丰富，从而效果更明显。酵母菌产品作用效果的差异很大程度上取决于所用菌株的差异，其次是发酵工艺。优良的酵母菌株是反刍动物微生态制剂研究与应用的
基础。在传统曲剂神曲和酸面团中，酵母菌是主要有益菌。张丽霞等分离出神曲中4种酵母菌，其中有酿酒酵母。杨
雪娟等从酸面团中分离到一株优良酿酒酵母Sy22，可单独发酵面团。将这些自然发酵出现的菌种应用于现代酵母培养物的制备上，不仅具有一定科学创新意义，而且为国内微生态制剂的研究和发展提供一些帮助和思路，研制新型酵母培养物，对我国
饲料添加剂领域具有重大意义。
发明内容
[0004] 本发明的一个目的是酿酒酵母JI1401，并利用分离的新菌种制备一种复合酵母培养物。
[0005] 本发明所述的酵母JI1401是从酸面团中分离得到，酵母JI1401菌落呈乳白色，表面光滑，边缘整齐。细胞为圆形或卵圆形，单端出芽，无假菌丝，1～4个子囊孢子。所述的酵母具有典型的酿酒酵母生化特征：可发酵
葡萄糖、
蔗糖、麦芽糖、半乳糖，
棉子糖；不发酵乳糖、海藻糖及可溶性
淀粉。可同化葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖，不同化乳糖、
纤维二糖、
柠檬酸、木糖、山梨醇、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、
琥珀酸、可溶性淀粉。可同化(NH4)2SO4，不同化KNO3。
[0006] 该酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株JI1401，该菌株2015年9月30日保藏在中国
微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.11470.保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0007] 采用酿酒酵母JI1401制备的酵母培养物的制备方法，包括以下工艺：
[0008] 1)
种子液制备：将分离到的酿酒酵母接种于液体培养基中，得到种子液。
[0009] 2)液体有氧扩繁发酵：将种子液接种于液体培养基中，进行有氧扩繁，得到液体发酵溶液。
[0010] 3)固体厌氧发酵：将液体发酵液接种于固体培养基上，厌氧发酵，得到培养物。
[0011] 4)将固体培养物自然
风干，
粉碎，得到酵母培养物。
[0012] 所述1)种子液培养基为YPD培养基，即葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏10g，溶于1L
水中，自然PH，115℃灭菌20min。所述2)液体培养基为
麦芽汁液体培养基，购买于北京德天智诚科技有限公司。所述3)固体培养基为面粉30g，麸皮70g，
豆粕2g。
[0013] 本发明的又一目的是提供上述酵母培养物在保育猪生产中的应用。
[0014] 实验表明：本发明酵母培养物可提高日增重和采食量，降低料重比，显著提高
能量和干物质消化率。显著提高肠道乳酸菌数量和降低大肠杆菌数量，使仔猪腹泻率显著降低。说明该酵母培养物可以作为一种有效的微生态制剂，以维持肠道微生物平衡，起到促生长作用。
具体实施方式
[0015] 下面结合
实施例对本发明进行进一步说明。
[0016] 实施例1
[0017] 本发明所采用的均为常规方法，
试剂均通过商业途径获得。
[0018] 酿酒酵母JI1401的获得
[0019] (1)酿酒酵母的分离和筛选
[0020] 将酸面团10g分别加入200ml YPD液体培养基中，无菌条件下30℃培养24h后，摇匀，用无菌生理盐水梯度稀释，选取10-6、10-7、10-83个稀释度，准确吸取0.1ml稀释液均匀涂布于YPD固体培养基上，30℃恒温
培养箱中培养48h，从曲剂中挑取一种类似酿酒酵母的典型单菌落于YPD液体培养基中，30℃下培养24h后划线分离2～3次，将纯培养物转YPD固体斜面培养基上培养12h后，置于4℃低温
冰箱保藏。
[0021] (2)菌种的鉴定
[0022] 生化鉴定：将12.5％豆芽汁分装于含杜氏小管的试管中，灭菌之后，向其中加入经煮沸过得10％糖液，使糖液浓度达到2％。再用接种环将菌种接入发酵管中，每种糖三个平行，以不加糖、不接菌的试管为空白对照，30℃培养，观察试管中气泡量。利用无
碳源基础培养基和无氮源基础培养基，倒入菌悬液，混匀后倒入培养皿中，待
凝固后将测试碳源放其表面，30℃培养观察碳源周围是否形成生长圈。结果显示，分离到的酵母可发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖，棉子糖；不发酵乳糖、海藻糖及可溶性淀粉。可同化葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖，不同化乳糖、纤维二糖、柠檬酸、木糖、山梨醇、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、琥珀酸、可溶性淀粉。可同化(NH4)2SO4，不同化KNO3。根据糖发酵、碳氮源同化试验鉴定， 可初步判定酵母为酿酒酵母，命名为JI1401。
[0023] 分子鉴定：采用珠磨法进行细胞破壁提取DNA，以制备的DNA为模板，ITS1 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3为引物，进行PCR扩增，反应体系为50uL：10×Buffer 5μL、dNTP 4μL、MgCl2 4μL、引物(10μM)各1μL、模板DNA40-50ng、Ex Tag(Takara，大连)1.5U、灭菌超纯水补齐至50uL，反应条件为95℃5min；95℃1min，55℃1min，72℃1.5min，35个循环；72℃10min。利用琼脂糖凝胶
电泳对扩增产物进行检测，扩增
片段约为850bp左右，对扩增PCR使用NCBI
数据库(nucleotide collection)进行blast比对，得出比对结果，显示JI1401与酿酒酵母同源性达到99％，可确定为酿酒酵母。
[0024] 上述实验结果表明，所分离到的菌种JI1401为酿酒酵母。
[0025] 实施例2
[0026] 酵母培养物的制备
[0027] 种子液制备：配制500ml蒸馏水、10g葡萄糖、5g蛋白胨、5g酵母膏组成的YPD培养基，自然PH，分装两份，115℃灭菌20min，然后接种纯化好JI1401菌株于液体培养基中，30℃，200r/min摇床培养12h，即得种子液。
[0028] 液体有氧扩繁：先将两瓶装有50ml/250ml的麦芽汁液体培养基于121℃灭菌20min，之后按照5％的添加量，将步骤1中的两种种子液分别添加到麦芽汁培养基中进行发酵，30℃，200r/min摇床发酵24h。
[0029] 固体厌氧发酵：将70g麸皮、30g面粉、2g豆粕倒入1L锥形瓶内，添加蒸馏水使
含水量达到60％，混匀后121℃灭菌20min，待放凉后，按10％的添加量将步骤2中制得的发酵液，加到固体培养基中，用无菌玻璃棒搅拌均匀，密封
瓶口，放于30℃静置发酵48h。
[0030] 将所制得的酵母培养物均匀散于瓷盘中，放于室温，自然风干。粉碎过40-60目筛，即为复合酵母培养物。
[0031] 实施例3
[0032] 酵母培养物对仔猪生长性能的影响应用
[0033] 选择健康、平均体重为(15.7±0.26)kg的“杜×长×大”三元杂交生长猪90头，按体重、性别基本一致的原则随机分为2组，每组3个重复，每个重复15头。对照组饲喂基础日粮；酵母培养物组饲喂基础日粮+5g/kgYC，试验期为35d。测定指标有平均日增重、平均日采食量、料重比、腹泻率、表观消化率以及肠道微生物。
[0034]
[0035] 实验结果表明，在仔猪日粮中添加YC可提高平均日增重7.2％，提高平均日采食量1.74％，降低料重比5.45％(P＞0.05)。显著提高了仔猪对能量和干物质的消化率，且显著增加肠道乳酸菌数量和降低大肠杆菌数量，从而使仔猪腹泻率显著降低(P＜0.05)。
