[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2009年4月20日提交的美国临时专利申请序号61/171,077；2009年4月22日提交的61/171,831；和2009年6月29日提交的61/221,519的优先权，其在此通
过引用整体并入。

[0003] 本发明涉及通过同时水解和发酵糖和寡聚物从生物质制备有用的发酵终产物。本发明还涉及发展用于有效预处理和以高转化效率(产率)转化木质纤维素生物质成终产物
的方法。

[0004] 各种形式的生物质由于其大量可用性和低成本而具有作为乙醇制备的可再生原料的潜力。然而，依然存在对利用可用于产生发酵终产物例如乙醇和其他化合物或生物燃
料的原料的低成本的强大方法的未满足的需求。

[0005] 生物质发酵产生生物燃料例如醇(例如甲醇、乙醇、丁醇或丙醇)可以提供对世界能源问题的急需解决方案。木质纤维素生物质具有纤维素和半纤维素两种主要组分。这些
组分的水解产生己糖(C6)和戊糖(C5)。生物质转化效率高度依赖于可被用于生物质到燃
料转化过程的生物体利用的碳水化合物范围。具体说，不能利用己糖(例如纤维素二糖、葡萄糖)和戊糖(例如阿拉伯糖、木糖)二者来转化成乙醇可能极大限制可从给定量生物质
产生的生物燃料或其他化学品的总量。因此，为了获得木质纤维素生物质到乙醇的高转化
效率(产率)，重要的是能够成功将己糖和戊糖二者发酵成乙醇。

[0006] 然而，戊糖(木糖和阿拉伯糖)的发酵依然是从生物质制备乙醇的技术瓶颈。该限制可以导致低效率、发酵反应中低最大可实现的生物燃料滴度和低生物燃料制备率的乙
醇制备。而且，生物质中碳水化合物含量的大部分可能通过预处理过程中戊糖的溶解而损
失。一般而言，较低的产率和低生产率导致较高的生产成本，这可以转化为不可能被微生物的其他特征所抵消的竞争缺点。

[0007] 发明概述

[0008] 一方面，本发明提供了通过用第一微生物发酵包含己糖和戊糖的木质纤维素生物质来制备一种或多种发酵终产物的方法，其中所述第一微生物同时水解和发酵所述木
质纤维素生物质以产生发酵终产物。在一个实施方案中，发酵终产物的至少一种是乙
醇，并且其中乙醇以至少约45g/L的滴度被制备。在另一个实施方案中，所述第一微生
物是梭状芽胞杆菌属菌株。在另一个实施方案中，所述梭状芽胞杆菌属菌株是植物发酵
梭状芽胞杆菌(Clostridium phytofermentans)。在另一个实施方案中，所述方法还包
括使用第二微生物发酵己糖和戊糖。在另一个实施方案中，所述第二微生物是酿酒酵
母(Saccharomyces cerevisiae)、热梭状芽胞杆菌(C.thermocellum)、丙酮丁醇梭状芽
胞杆菌(C.acetobutylicum)、噬纤维梭状芽胞杆菌(C.cellovorans)或运动发酵单胞菌
(Zymomonas mobilis)。在另一个实施方案中，所述己糖包括选自由纤维素、半纤维素、淀粉、甘露聚糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和甘露糖组成的组的碳水化合物。在另一个实施方案中，所述戊糖包括选自由木聚糖、半纤维素、木糖和阿拉伯糖组成的组的碳水化合
物。在另一个实施方案中，所述植物发酵梭状芽胞杆菌是非重组或重组微生物。在另一个
实施方案中，所述植物发酵梭状芽胞杆菌包括一种或多种异源多核苷酸。在另一个实施方
案中，在所述第一微生物生长过程中向培养基添加一种或多种包括己糖或戊糖的培养基补
充物。在另一个实施方案中，所述己糖或戊糖相对于被所述第一微生物转化为其他化合物
的糖量来添加。在另一个实施方案中，所述方法还包括预处理所述生物质。在另一个实施
方案中，所述预处理包括蒸汽爆发或热水浸提、暴露于酸或碱条件。在另一个实施方案中，所述方法包括添加发酵培养基补充物，其中所述发酵培养基补充物是脂肪酸、表面活性剂、螯合剂、微生物、矿物质、pH调节剂、酵母提取物和盐。在另一个实施方案中，所述第一微生物同时发酵所述己糖和戊糖。在另一个实施方案中，所述方法包括添加一种或多种酶，其中所述一种或多种酶不是衍生自第一微生物。在另一个实施方案中，所述一种或多种酶是纤
维素酶、半纤维素酶、半乳糖醛酸酶、果胶酸裂合酶、糖酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、和内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡糖苷酶、淀粉酶、肌醇六磷酸酶或漆酶。在另一个实施方案中，所述己糖和戊糖包括麦芽糖浆、玉米浸渍液体、蒸馏干燥颗粒或玉米浸渍固体。在另一个实施方案中，所述方法还包括批量添加生物质固体的生物质补料分批发酵。在另一个实施方案中，所述生物质固体使用滤网回收。在另一个实施方案中，所述滤网包括多个直径约150-250
微米的孔。

[0009] 另一方面，本发明公开了通过在包含木质纤维素生物质的培养基中培养植物发酵梭状芽胞杆菌菌株而制备的生物燃料产物；其中所述植物发酵梭状芽胞杆菌同时水解和发
酵所述木质纤维素生物质。

[0010] 另一方面，本发明公开了制备乙醇的方法，所述方法包括以下步骤：在包含木质纤维素生物质的培养基中培养植物发酵梭状芽胞杆菌菌株；其中所述植物发酵梭状芽胞杆菌同时水解和发酵所述木质纤维素生物质；以大于约45g/L的产率制备乙醇。在一个实施方
案中，所述方法还包括在所述植物发酵梭状芽胞杆菌的生长过程中向培养基添加一种或多
种培养基补充物，其中所述培养基补充物的一种或多种包含一种或多种己糖和/或戊糖化
合物，并且一种或多种糖化合物相对于被所述植物发酵梭状芽胞杆菌转化为其他化合物的
糖量来添加。

[0011] 另一方面，本发明公开了用于制备发酵终产物的系统，包括：发酵容器；木质纤维素生物质；和同时水解和发酵所述木质纤维素生物质的第一微生物；其中所述发酵容器适于提供适合同时水解和发酵所述木质纤维素生物质的条件。在一个实施方案中，还包括包
含己糖和戊糖的培养基补充物。在另一个实施方案中，所述第一微生物是梭状芽胞杆菌属
菌株。在另一个实施方案中，所述梭状芽胞杆菌属菌株是植物发酵梭状芽胞杆菌。在另一
个实施方案中，所述植物发酵梭状芽胞杆菌包括一种或多种异源多核苷酸。在另一个实施
方案中，所述生物质在与所述第一微生物接触之前通过蒸汽爆发或热水浸提、暴露于酸或
碱条件来预处理。在另一个实施方案中，经预处理的生物质进一步用非衍生自所述第一微
生物的一种或多种酶处理。在另一个实施方案中，所述己糖和戊糖包括玉米浸渍固体、玉米浸渍液体、麦芽糖浆、木聚糖、纤维素、半纤维素、果糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖或木糖的一种或多种。在另一个实施方案中，所述发酵培养基还包括非衍生自所述第一微生物的一种
或多种酶。在另一个实施方案中，所述发酵培养基还包括选自由脂肪酸、表面活性剂、螯合剂、维生素、矿物质、pH调节剂、酵母提取物和盐组成的组的发酵培养基补充物。在另一个实施方案中，所述系统还包括第二微生物。在另一个实施方案中，所述第二微生物是酿酒酵母、热梭状芽胞杆菌、丙酮丁醇梭状芽胞杆菌、噬纤维梭状芽胞杆菌或运动发酵单胞菌。

[0012] 附图简述

[0013] 本发明的新特征在所附权利要求书中精确提出。通过参考提出其中利用本发明原理的示例性实施方案的下文详述和附图将获得对本发明特征和优点的更好理解，附图中：

[0014] 图1描绘了在约15天的时段内加入发酵反应的处理的生物质固体的累积总量。

[0015] 图2是描绘通过根据本文描述的尺寸减少和碱处理的玉米秸秆生物质的碳水化合物组成的饼形图。

[0016] 图3A-3B描绘在指示时间点发酵反应的糖和乙醇浓度曲线。图3A描绘了同时发酵纤维素二糖和木糖的糖和乙醇浓度曲线。图3B描绘同时发酵葡萄糖和木糖的糖和乙醇
浓度曲线。

[0017] 图4描绘了在指示时间点发酵反应中指示的己糖(葡萄糖，纤维素二糖)和戊糖(木糖)的标准化摄取和利用。

[0018] 图5描绘了在指示的时间点木糖、纤维素二糖和淀粉同时发酵为乙醇的糖和乙醇浓度曲线。

[0019] 图6描绘了在指示的时间点葡萄糖、木糖和阿拉伯糖同时发酵为乙醇的糖和乙醇浓度曲线。

[0020] 图7描绘了同时发酵淀粉、纤维素、木聚糖和纤维素二糖的乙醇浓度曲线。

[0021] 图8描绘了通过首先用酸在升高的温度和压力下在水解设备中处理生物质而从生物质产生发酵终产物的方法。

[0022] 图9描绘了通过将生物质装入发酵容器而从生物质产生发酵终产物的方法。

[0023] 图10公开了产生己糖或戊糖或寡聚体的预处理，其然后不经加工或进一步加工并单独或一起发酵。

[0024] 图11是用于转化植物发酵梭状芽胞杆菌的质粒pIMPT1029的图谱。

[0025] 通过引用并入

[0026] 本说明书提及的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用并入，如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确且单独地指明通过引用并入。

[0027] 发明详述

[0028] 以下描述和实例详细地示例说明本发明的实施方案。本领域技术人员将发现有许多涵盖在其范围内的本发明的变体和修饰。因此，优选实施方案的描述不应被认为限制本
发明的范围。

[0029] 定义

[0030] 除非不同地表征，本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。

[0031] 术语“约”相对于参考数值包括该值的加或减15％。例如，量“约10”包括8.5至11.5的量。

[0032] 本文使用的术语″燃料”或“生物燃料”具有本领域技术人员已知的普通含义，并且可以包括一种或多种适合作为液体燃料、气体燃料、反应物、化学原料的一种或多种化合物，包括但不限于烃、氢、甲烷、生物柴油、羟基化合物，例如醇(例如乙醇、丁醇、丙醇、甲醇、等等)和羰基化合物例如醛和酮(例如，丙酮、甲醛、1-丙醛、等等)。

[0033] 本文使用的术语“发酵终产物”或“终产物”具有其本领域技术人员已知的普通含义，并且可以包括一种或多种生物燃料、化学添加剂、加工辅剂、食物添加剂、有机酸(例如乙酸、乳酸、甲酸、柠檬酸等)、有机酸的衍生物例如酯(例如蜡酯、甘油酯、等等)和其他功能化合物，包括但不限于1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、乳酸、甲酸、乙酸、琥珀酸、丙酮酸、酶例如纤维素酶、多糖酶、脂肪酶、蛋白酶、木质酶和半纤维素酶，并且可以作为纯化合物、混合物、或不纯或稀释形式存在。发酵终产物的其他实例包括但不限于1，4-二酸(琥珀酸、富马酸和苹果酸)、2，5呋喃二羧酸、3羟基丙酸、天冬氨酸、葡糖二酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸、3-羟基丁内酯、甘油、山梨糖醇、木糖醇/阿拉伯糖醇、丁二醇、丁醇、甲烷、甲醇、乙烷、乙烯、乙醇、n-丙烷、1-丙烯、1-丙醇、丙醛、丙酮、丙酸、n-丁烷、1-丁烯、1-丁醇、丁醛、丁酸、异丁醛、异丁醇、2-甲基丁醛、2-甲基丁醇、3-甲基丁醛、3-甲基丁醇、2-丁烯、2-丁醇、2-丁酮、2，3-丁二醇、3-羟基-2-丁酮、2，3-丁二酮、乙苯、乙烯苯、2-苯基乙醇、苯乙醛、1-苯基丁烷、4-苯基-1-丁烯、4-苯基-2-丁烯、1-苯基-2-丁烯、1-苯基-2-丁醇、
4-苯基-2-丁醇、1-苯基-2-丁酮、4-苯基-2-丁酮、1-苯基-2，3-丁二醇、1-苯基-3-羟
基-2-丁酮、4-苯基-3-羟基-2-丁酮、1-苯基-2，3-丁二酮、n-戊烷、乙基苯酚、乙烯
基苯酚、2-(4-羟基苯基)乙醇、4-羟基苯基乙醛、1-(4-羟基苯基)丁烷、4-(4-羟基苯
基)-1-丁烯、4-(4-羟基苯基)-2-丁烯、1-(4-羟基苯基)-1-丁烯、1-(4-羟基苯基)-2-丁
醇、4-(4-羟基苯基)-2-丁醇、1-(4-羟基苯基)-2-丁酮、4-(4-羟基苯基)-2-丁酮、
1-(4-羟基苯基)-2，3-丁二醇、1-(4-羟基苯基)-3-羟基-2-丁酮、4-(4-羟基苯基)-3-羟
基-2-丁酮、1-(4-羟基苯基)-2，3-丁二酮、吲哚基乙烷、吲哚基乙烯、2-(吲哚-3-)乙醇、n-戊烷、1-戊烯、1-戊醇、戊醛、戊酸、2-戊烯、2-戊醇、3-戊醇、2-戊酮、3-戊酮、4-甲基戊醛、4-甲基戊醇、2，3-戊二醇、2-羟基-3-戊酮、3-羟基-2-戊酮、2，3-戊二酮、2-甲基戊烷、4-甲基-1-戊烯、4-甲基-2-戊烯、4-甲基-3-戊烯、4-甲基-2-戊醇、2-甲基-3-戊
醇、4-甲基-2-戊酮、2-甲基-3-戊酮、4-甲基-2，3-戊二醇、4-甲基-2-羟基-3-戊酮、
4-甲基-3-羟基-2-戊酮、4-甲基-2，3-戊二酮、1-苯基戊烷、1-苯基-1-戊烯、1-苯
基-2-戊烯、1-苯基-3-戊烯、1-苯基-2-戊醇、1-苯基-3-戊醇、1-苯基-2-戊酮、1-苯
基-3-戊酮、1-苯基-2，3-戊二醇、1-苯基-2-羟基-3-戊酮、1-苯基-3-羟基-2-戊酮、
1-苯基-2，3-戊二酮、4-甲基-1-苯基戊烷、4-甲基-1-苯基-1-戊烯、4-甲基-1-苯
基-2-戊烯、4-甲基-1-苯基-3-戊烯、4-甲基-1-苯基-3-戊醇、4-甲基-1-苯基-2-戊
醇、4-甲基-1-苯基-3-戊酮、4-甲基-1-苯基-2-戊酮、4-甲基-1-苯基-2，3-戊二醇、
4-甲基-1-苯基-2，3-戊二酮、4-甲基-1-苯基-3-羟基-2-戊酮、4-甲基-1-苯基-2-羟
基-3-戊酮、1-(4-羟基苯基)戊烷、1-(4-羟基苯基)-1-戊烯、1-(4-羟基苯基)-2-戊烯、
1-(4-羟基苯基)-3-戊烯、1-(4-羟基苯基)-2-戊醇、1-(4-羟基苯基)-3-戊醇、1-(4-羟
基苯基)-2-戊酮、1-(4-羟基苯基)-3-戊酮、1-(4-羟基苯基)-2，3-戊二醇、1-(4-羟
基苯基)-2-羟基-3-戊酮、1-(4-羟基苯基)-3-羟基-2-戊酮、1-(4-羟基苯基)-2，
3-戊二酮、4-甲基-1-(4-羟基苯基)戊烷、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-2-戊烯、4-甲
基-1-(4-羟基苯基)-3-戊烯、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-1-戊烯、4-甲基-1-(4-羟基苯
基)-3-戊醇、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-2-戊醇、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-3-戊酮、4-甲
基-1-(4-羟基苯基)-2-戊酮、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-2，3-戊二醇、4-甲基-1-(4-羟
基苯基)-2，3-戊二酮、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-3-羟基-2-戊酮、4-甲基-1-(4-羟基
苯基)-2-羟基-3-戊酮、1-吲哚-3-戊烷、1-(吲哚-3)-1-戊烯、1-(吲哚-3)-2-戊烯、
1-(吲哚-3)-3-戊烯、1-(吲哚-3)-2-戊醇、1-(吲哚-3)-3-戊醇、1-(吲哚-3)-2-戊酮、
1-(吲哚-3)-3-戊酮、1-(吲哚-3)-2，3-戊二醇、1-(吲哚-3)-2-羟基-3-戊酮、1-(吲
哚-3)-3-羟基-2-戊酮、1-(吲哚-3)-2，3-戊二酮、4-甲基-1-(吲哚-3-)戊烷、4-甲
基-1-(吲哚-3)-2-戊烯、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-戊烯、4-甲基-1-(吲哚-3)-1-戊烯、
4-甲基-2-(吲哚-3)-3-戊醇、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-戊醇、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-戊
酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-戊酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2，3-戊二醇、4-甲基-1-(吲
哚-3)-2，3-戊二酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-羟基-2-戊酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-羟
基-3-戊酮、n-己烷、1-己烯、1-己醇、己醛、己酸、2-己烯、3-己烯、2-己醇、3-己醇、2-己酮、3-己酮、2，3-己二醇、2，3-己二酮、3，4-己二醇、3，4-己二酮、2-羟基-3-己酮、3-羟基-2-己酮、3-羟基-4-己酮、4-羟基-3-己酮、2-甲基己烷、3-甲基己烷、2-甲基-2-己
烯、2-甲基-3-己烯、5-甲基-1-己烯、5-甲基-2-己烯、4-甲基-1-己烯、4-甲基-2-己
烯、3-甲基-3-己烯、3-甲基-2-己烯、3-甲基-1-己烯、2-甲基-3-己醇、5-甲基-2-己
醇、5-甲基-3-己醇、2-甲基-3-己酮、5-甲基-2-己酮、5-甲基-3-己酮、2-甲基-3，4-己
二醇、2-甲基-3，4-己二酮、5-甲基-2，3-己二醇、5-甲基-2，3-己二酮、4-甲基-2，3-己二醇、4-甲基-2，3-己二酮、2-甲基-3-羟基-4-己酮、2-甲基-4-羟基-3-己酮、5-甲
基-2-羟基-3-己酮、5-甲基-3-羟基-2-己酮、4-甲基-2-羟基-3-己酮、4-甲基-3-羟
基-2-己酮、2，5-二甲基己烷、2，5-二甲基-2-己烯、2，5-二甲基-3-己烯、2，5-二甲
基-3-己醇、2，5-二甲基-3-己酮、2，5-二甲基-3，4-己二醇、2，5-二甲基-3，4-己二酮、
2，5-二甲基-3-羟基-4-己酮、5-甲基-1-苯基己烷、4-甲基-1-苯基己烷、5-甲基-1-苯
基-1-己烯、5-甲基-1-苯基-2-己烯、5-甲基-1-苯基-3-己烯、4-甲基-1-苯基-1-己
烯、4-甲基-1-苯基-2-己烯、4-甲基-1-苯基-3-己烯、5-甲基-1-苯基-2-己醇、5-甲
基-1-苯基-3-己醇、4-甲基-1-苯基-2-己醇、4-甲基-1-苯基-3-己醇、5-甲基-1-苯
基-2-己酮、5-甲基-1-苯基-3-己酮、4-甲基-1-苯基-2-己酮、4-甲基-1-苯基-3-己
酮、5-甲基-1-苯基-2，3-己二醇、4-甲基-1-苯基-2，3-己二醇、5-甲基-1-苯基-3-羟
基-2-己酮、5-甲基-1-苯基-2-羟基-3-己酮、4-甲基-1-苯基-3-羟基-2-己酮、4-甲
基-1-苯基-2-羟基-3-己酮、5-甲基-1-苯基-2，3-己二酮、4-甲基-1-苯基-2，3-己二
酮、4-甲基-1-(4-羟基苯基)己烷、5-甲基-1-(4-羟基苯基)-1-己烯、5-甲基-1-(4-羟
基苯基)-2-己烯、5-甲基-1-(4-羟基苯基)-3-己烯、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-1-己烯、
4-甲基-1-(4-羟基苯基)-2-己烯、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-3-己烯、5-甲基-1-(4-羟
基苯基)-2-己醇、5-甲基-1-(4-羟基苯基)-3-己醇、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-2-己醇、
4-甲基-1-(4-羟基苯基)-3-己醇、5-甲基-1-(4-羟基苯基)-2-己酮、5-甲基-1-(4-羟
基苯基)-3-己酮、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-2-己酮、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-3-己
酮、5-甲基-1-(4-羟基苯基)-2，3-己二醇、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-2，3-己二醇、5-甲
基-1-(4-羟基苯基)-3-羟基-2-己酮、5-甲基-1-(4-羟基苯基)-2-羟基-3-己酮、
4-甲基-1-(4-羟基苯基)-3-羟基-2-己酮、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-2-羟基-3-己
酮、5-甲基-1-(4-羟基苯基)-2，3-己二酮、4-甲基-1-(4-羟基苯基)-2，3-己二酮、4-甲
基-1-(吲哚-3-)己烷、5-甲基-1-(吲哚-3)-1-己烯、5-甲基-1-(吲哚-3)-2-己烯、5-甲
基-1-(吲哚-3)-3-己烯、4-甲基-1-(吲哚-3)-1-己烯、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-己烯、
4-甲基-1-(吲哚-3)-3-己烯、5-甲基-1-(吲哚-3)-2-己醇、5-甲基-1-(吲哚-3)-3-己
醇、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-己醇、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-己醇、5-甲基-1-(吲
哚-3)-2-己酮、5-甲基-1-(吲哚-3)-3-己酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-己酮、4-甲
基-1-(吲哚-3)-3-己酮、5-甲基-1-(吲哚-3)-2，3-己二醇、4-甲基-1-(吲哚-3)-2，
3-己二醇、5-甲基-1-(吲哚-3)-3-羟基-2-己酮、5-甲基-1-(吲哚-3)-2-羟基-3-己
酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-羟基-2-己酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-羟基-3-己酮、5-甲
基-1-(吲哚-3)-2，3-己二酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2，3-己二酮、n-庚烷、1-庚烯、1-庚
醇、庚醛、庚酸、2-庚烯、3-庚烯、2-庚醇、3-庚醇、4-庚醇、2-庚酮、3-庚酮、4-庚酮、2，3-庚二醇、2，3-庚二酮、3，4-庚二醇、3，4-庚二酮、2-羟基-3-庚酮、3-羟基-2-庚酮、3-羟基-4-庚酮、4-羟基-3-庚酮、2-甲基庚烷、3-甲基庚烷、6-甲基-2-庚烯、6-甲基-3-庚
烯、2-甲基-3-庚烯、2-甲基-2-庚烯、5-甲基-2-庚烯、5-甲基-3-庚烯、3-甲基-3-庚
烯、2-甲基-3-庚醇、2-甲基-4-庚醇、6-甲基-3-庚醇、5-甲基-3-庚醇、3-甲基-4-庚
醇、2-甲基-3-庚酮、2-甲基-4-庚酮、6-甲基-3-庚酮、5-甲基-3-庚酮、3-甲基-4-庚
酮、2-甲基-3，4-庚二醇、2-甲基-3，4-庚二酮、6-甲基-3，4-庚二醇、6-甲基-3，4-庚二酮、5-甲基-3，4-庚二醇、5-甲基-3，4-庚二酮、2-甲基-3-羟基-4-庚酮、2-甲基-4-羟
基-3-庚酮、6-甲基-3-羟基-4-庚酮、6-甲基-4-羟基-3-庚酮、5-甲基-3-羟基-4-庚
酮、5-甲基-4-羟基-3-庚酮、2，6-二甲基庚烷、2，5-二甲基庚烷、2，6-二甲基-2-庚烯、
2，6-二甲基-3-庚烯、2，5-二甲基-2-庚烯、2，5-二甲基-3-庚烯、3，6-二甲基-3-庚烯、
2，6-二甲基-3-庚醇、2，6-二甲基-4-庚醇、2，5-二甲基-3-庚醇、2，5-二甲基-4-庚醇、
2，6-二甲基-3，4-庚二醇、2，6-二甲基-3，4-庚二酮、2，5-二甲基-3，4-庚二醇、2，5-二甲基-3，4-庚二酮、2，6-二甲基-3-羟基-4-庚酮、2，6-二甲基-4-羟基-3-庚酮、2，5-二甲基-3-羟基-4-庚酮、2，5-二甲基-4-羟基-3-庚酮、n-辛烷、1-辛烯、2-辛烯、1-辛
醇、辛醛、辛酸、3-辛烯、4-辛烯、4-辛醇、4-辛酮、4，5-辛二醇、4，5-辛二酮、4-羟基-5-辛酮、2-甲基辛烷、2-甲基-3-辛烯、2-甲基-4-辛烯、7-甲基-3-辛烯、3-甲基-3-辛烯、
3-甲基-4-辛烯、6-甲基-3-辛烯、2-甲基-4-辛醇、7-甲基-4-辛醇、3-甲基-4-辛醇、
6-甲基-4-辛醇、2-甲基-4-辛酮、7-甲基-4-辛酮、3-甲基-4-辛酮、6-甲基-4-辛酮、
2-甲基-4，5-辛二醇、2-甲基-4，5-辛二酮、3-甲基-4，5-辛二醇、3-甲基-4，5-辛二酮、
2-甲基-4-羟基-5-辛酮、2-甲基-5-羟基-4-辛酮、3-甲基-4-羟基-5-辛酮、3-甲
基-5-羟基-4-辛酮、2，7-二甲基辛烷、2，7-二甲基-3-辛烯、2，7-二甲基-4-辛烯、2，
7-二甲基-4-辛醇、2，7-二甲基-4-辛酮、2，7-二甲基-4，5-辛二醇、2，7-二甲基-4，5-辛二酮、2，7-二甲基-4-羟基-5-辛酮、2，6-二甲基辛烷、2，6-二甲基-3-辛烯、2，6-二甲基-4-辛烯、3，7-二甲基-3-辛烯、2，6-二甲基-4-辛醇、3，7-二甲基-4-辛醇、2，6-二
甲基-4-辛酮、3，7-二甲基-4-辛酮、2，6-二甲基-4，5-辛二醇、2，6-二甲基-4，5-辛二酮、2，6-二甲基-4-羟基-5-辛酮、2，6-二甲基-5-羟基-4-辛酮、3，6-二甲基辛烷、3，
6-二甲基-3-辛烯、3，6-二甲基-4-辛烯、3，6-二甲基-4-辛醇、3，6-二甲基-4-辛酮、3，
6-二甲基-4，5-辛二醇、3，6-二甲基-4，5-辛二酮、3，6-二甲基-4-羟基-5-辛酮、n-壬
烷、1-壬烯、1-壬醇、壬醛、壬酸、2-甲基壬烷、2-甲基-4-壬烯、2-甲基-5-壬烯、8-甲
基-4-壬烯、2-甲基-5-壬醇、8-甲基-4-壬醇、2-甲基-5-壬酮、8-甲基-4-壬酮、8-甲
基-4，5-壬二醇、8-甲基-4，5-壬二酮、8-甲基-4-羟基-5-壬酮、8-甲基-5-羟基-4-壬
酮、2，8-二甲基壬烷、2，8-二甲基-3-壬烯、2，8-二甲基-4-壬烯、2，8-二甲基-5-壬烯、
2，8-二甲基-4-壬醇、2，8-二甲基-5-壬醇、2，8-二甲基-4-壬酮、2，8-二甲基-5-壬酮、
2，8-二甲基-4，5-壬二醇、2，8-二甲基-4，5-壬二酮、2，8-二甲基-4-羟基-5-壬酮、2，
8-二甲基-5-羟基-4-壬酮、2，7-二甲基壬烷、3，8-二甲基-3-壬烯、3，8-二甲基-4-壬
烯、3，8-二甲基-5-壬烯、3，8-二甲基-4-壬醇、3，8-二甲基-5-壬醇、3，8-二甲基-4-壬酮、3，8-二甲基-5-壬酮、3，8-二甲基-4，5-壬二醇、3，8-二甲基-4，5-壬二酮、3，8-二甲基-4-羟基-5-壬酮、3，8-二甲基-5-羟基-4-壬酮、n-癸烷、1-癸烯、1-癸醇、癸酸、2，
9-二甲基癸烷、2，9-二甲基-3-癸烯、2，9-二甲基-4-癸烯、2，9-二甲基-5-癸醇、2，9-二甲基-5-癸酮、2，9-二甲基-5，6-癸二醇、2，9-二甲基-6-羟基-5-癸酮、2，9-二甲基-5，
6-癸二酮、n-十一烷、1-十一烯、1-十一醇、十一醛、十一酸、n-十二烷、1-十二烯、1-十二醇、十二醛、十二酸、n-十二烷、1-十二烯、1-十二醇、十二醛、十二酸、n-十三烷、1-十三烯、1-十三醇、十三醛、十三酸、n-十四烷、1-十四烯、1-十四醇、十四醛、十四酸、n-十五烷、1-十五烯、1-十五醇、十五醛、十五酸、n-十六烷、1-十六烯、1-十六醇、十六醛、十六酸、n-十七烷、1-十七烯、1-十七醇、十七醛、十七酸、n-十八烷、1-十八烯、1-十八醇、十八醛、十八酸、n-十九烷、1-十九烯、1-十九醇、十九醛、十九酸、二十烷、1-二十烯、1-二十醇、二十醛、二十酸、3-羟基丙醛、1，3-丙二醇、4-羟基丁醛、1，4-丁二醇、3-羟基-2-丁酮、
2，3-丁二醇、1，5-戊二醇、高柠檬酸、高异柠檬酸、b-羟基己二酸、戊二酸、戊二酸半醛、戊二醛、2-羟基-1-环戊酮、1，2-环戊二醇、环戊酮、环戊醇、(S)-2-乙酰乳酸、(R)-2，3-二羟基-异戊酸、2-氧代异戊酸、异丁酰-CoA、异丁酸、异丁醛、5-氨基戊醛、1，10-二氨基癸烷、1，10-二氨基-5-癸烯、1，10-二氨基-5-羟基癸烷、1，10-二氨基-5-癸酮、1，10-二氨基-5，6-癸二醇、1，10-二氨基-6-羟基-5-癸酮、苯基苯基乙醛、1，4-二苯基丁烷、1，
4-二苯基-1-丁烯、1，4-二苯基-2-丁烯、1，4-二苯基-2-丁醇、1，4-二苯基-2-丁酮、
1，4-二苯基-2，3-丁二醇、1，4-二苯基-3-羟基-2-丁酮、1-(4-羟基苯基)-4-苯基丁
烷、1-(4-羟基苯基)-4-苯基-1-丁烯、1-(4-羟基苯基)-4-苯基-2-丁烯、1-(4-羟基苯
基)-4-苯基-2-丁醇、1-(4-羟基苯基)-4-苯基-2-丁酮、1-(4-羟基苯基)-4-苯基-2，
3-丁二醇、1-(4-羟基苯基)-4-苯基-3-羟基-2-丁酮、1-(吲哚-3)-4-苯基丁烷、1-(吲
哚-3)-4-苯基-1-丁烯、1-(吲哚-3)-4-苯基-2-丁烯、1-(吲哚-3)-4-苯基-2-丁醇、
1-(吲哚-3)-4-苯基-2-丁酮、1-(吲哚-3)-4-苯基-2，3-丁二醇、1-(吲哚-3)-4-苯
基-3-羟基-2-丁酮、4-羟基苯基乙醛、1，4-二(4-羟基苯基)丁烷、1，4-二(4-羟基苯
基)-1-丁烯、1，4-二(4-羟基苯基)-2-丁烯、1，4-二(4-羟基苯基)-2-丁醇、1，4-二
(4-羟基苯基)-2-丁酮、1，4-二(4-羟基苯基)-2，3-丁二醇、1，4-二(4-羟基苯基)-3-羟
基-2-丁酮、1-(4-羟基苯基)-4-(吲哚-3-)丁烷、1-(4-羟基苯基)-4-(吲哚-3)-1-丁
烯、1-二(4-羟基苯基)-4-(吲哚-3)-2-丁烯、1-(4-羟基苯基)-4-(吲哚-3)-2-丁醇、
1-(4-羟基苯基)-4-(吲哚-3)-2-丁酮、1-(4-羟基苯基)-4-(吲哚-3)-2，3-丁二醇、
1-(4-羟基苯基-4-(吲哚-3)-3-羟基-2-丁酮、吲哚-3-乙醛、1，4-二(吲哚-3-)丁烷、1，
4-二(吲哚-3)-1-丁烯、1，4-二(吲哚-3)-2-丁烯、1，4-二(吲哚-3)-2-丁醇、1，4-二
(吲哚-3)-2-丁酮、1，4-二(吲哚-3)-2，3-丁二醇、1，4-二(吲哚-3)-3-羟基-2-丁酮、
琥珀酸半醛、己烷-1，8-二羧酸、3-己烯-1，8-二羧酸、3-羟基-己烷-1，8-二羧酸、3-己酮-1，8-二羧酸、3，4-己二醇-1，8-二羧酸、4-羟基-3-己酮-1，8-二羧酸、岩藻依聚糖、碘、叶绿素、类胡萝卜素、钙、镁、铁、钠、钾、磷酸盐、乳酸、乙酸、甲酸、类异戊二烯和聚异戊二烯包括橡胶。

[0034] 本文使用的术语″发酵″具有本领域技术人员已知的普通含义，并且可以包括在适合的微生物培养基中或之上培养微生物或微生物组。微生物可以是需氧菌、厌氧菌、兼性厌氧菌、异养生物、自养生物、光合自养生物、光合异养生物、化学异养生物和/或化学异养生物。细胞活性，包括细胞生长，可以是生长需氧的、微需氧的或厌氧的。细胞可以处于任何生长期，包括滞后期(或传导期)、指数期、过渡期、稳定器、衰亡期、休眠期、营养期、孢子形成期、等等。

[0035] 本文使用的术语″植物多糖″具有其本领域技术人员已知的普通含义，并且可以包括糖和糖衍生物的一种或多种碳水化合物聚合物以及糖聚合物的衍生物和/或植物物
质中存在的其他聚合物材料。示例性的植物多糖包括木质素、纤维素、淀粉、果胶和半纤维素。其他多糖是壳多糖、磺化多糖，例如藻酸、琼脂糖、角叉藻聚糖、金属卟啉、红藻胶和海萝聚糖。一般而言，多糖具有两个或多个糖单元或者糖单元的衍生物。糖单元和/或糖单元的衍生物可以规则模式或其他方式重复。糖单元可以是己糖单元或戊糖单元或这些的组合。
糖单元的衍生物可以是糖醇、糖酸、氨基糖、等等。多糖可以是直链的、支链的、交联的或其混合物。一种或一类多糖可以与另一种或一类多糖交联。

[0036] 本文使用的术语″可发酵糖″具有其本领域技术人员已知的普通含义，并且可以包括可被微生物用作碳源的一种或多种糖和/或糖衍生物，包括这些化合物的单体、二聚
体和多聚体，包括这些化合物的两种或多种。在一些情况下，在引入分解的材料之前，生物体可以分解这些聚合物，例如通过水解。示例性的可发酵糖包括但不限于葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、纤维素二糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖和果糖。

[0037] 本文使用的术语″糖化″具有其本领域技术人员已知的普通含义，并且可以包括植物多糖转化为可被生物体就近利用的低分子量物类。对于一些生物体，这将包括将最多
约七个单体单元以及类似大小链的糖衍生物和糖和糖衍生物组合转化为单糖、二糖、三糖
和寡糖。对于一些生物体，允许的链长可以更长(例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19或20个单体单元或更多)，并且对于一些生物体，允许的链长可能更短(例如1、2、3、4、
5、6个单体单元)。

[0038] 本文使用的术语“生物质”具有其本领域技术人员已知的普通含义，并且可以包括可被转化成生物燃料、化学品或其他产物的一种或多种生物材料。生物质的一个示例性来源是植物物质。植物物质可以是例如木本植物物质、非木本植物物质、纤维材料、木质纤维素材料、半纤维材料、碳水化合物、果胶、淀粉、菊粉、果聚糖、葡聚糖、玉米、玉米秸秆、糖甘蔗、草、柳枝稷、竹材、海藻、海甘蓝、椰子、麻风树、黄麻和这些衍生的材料。植物物质可以进一步参考现有化学物类例如蛋白、多糖和油来描述。多糖包括各种单糖和单糖衍生物的聚
合物，包括葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、等等。植物物质还包括农业废物副产物或侧线馏分，例如苹果渣、玉米浸渍液体、玉米浸渍固体、玉米秸秆、玉米釜馏物、玉米棒、玉米粒、蒸馏颗粒、蒸馏溶质、甘蔗渣、蒸馏颗粒、废胎面胶、凸点塑料、发酵废物、木片、锯末、木粉、木浆、纸浆、纸浆废液稻草、废弃杂物、污水、种子饼、外壳、稻壳、叶、草碎片、玉米秸秆、(玉米碎片)和食物残羹。这些材料可以来自农场、水生环境、森林、工业源、家庭、等等。
生物质的另一种非限制性实例是动物有机物质，包括例如牛奶、肉、脂肪、骨粉、动物加工废物和动物废物。″原料″常用语指用于例如本文描述的那些过程的生物质。

[0039] 本文使用的术语″培养基″具有其本领域技术人员已知的普通含义，并且可以包括可溶和不溶物质、悬浮物质、细胞和培养基的组合的全部内容，例如发酵反应的全部内容可以称为发酵培养基。

[0040] 本文使用的术语″生产率″具有其本领域技术人员已知的普通含义，并且可以包括在给定时间、给定体积中产生的感兴趣的物质的量。单位可以是例如克/升-小时，或者
质量、体积和时间的一些其他组合。在发酵中，生产率常用于表征产物可以在给定发酵体积中制成的速度。体积可以参考发酵容器的总体积、发酵容器的工作体积或者被发酵的培养
基的实际体积。该短语的上下文将指示本领域技术人员预期的含义。生产率(例如g/L/d)
不同于“滴度”(例如g/L)，因为生产率包括时间术语，并且滴度类似于浓度。

[0041] 本文使用的术语″生物催化剂″具有其本领域技术人员已知的普通含义，并且可以包括一种或多种酶和/或微生物，包括溶液、悬液、和酶和微生物的混合物。在一些上下文中，该词语指酶或微生物发挥特定功能的可能用途，在其他上下文中，该词语指两者的组合用途，而在其他上下文中，该词指两者中的仅一种。该短语的上下文将指示本领域技术人员预期的含义。

[0042] 本文使用的术语″转化效率″或“产率”具有其本领域技术人员已知的普通含义，并且可以包括从底物量得到的产物量。该术语可以表示为来自起始底物量的产物的百分比产量。对于从葡萄糖生产乙醇，净反应被普遍接受为：

[0043] C6H12O6→2C2H5OH+2CO2

[0044] 且理论最大转化效率或产率为51％(wt.)。通常，转化效率参考理论最大值，例如″理论最大值的80％″。在将葡萄糖转化为乙醇的情况下，该表述将指示41％(wt.)的
转化效率。该短语的上下文将指示本领域技术人员预期的底物和产物。对于包含例如生物
质中存在的不同碳源(木聚糖、木糖、葡萄糖、纤维素二糖、阿拉伯糖纤维素、半纤维素等)的混合物的底物，生物质至乙醇的理论最大转化效率是由每种碳源的相对浓度衡量的个体
碳源组分的最大转化效率的平均值。在一些情况下，理论最大转化效率基于假定的糖化效
率来计算。仅作为例子，假定包含10g纤维素的碳源，理论最大转化效率可以通过假设纤维素糖化为约75％重量的可同化碳源葡萄糖来计算。在该实例中，10g纤维素可以提供7.5g
葡萄糖，这可以提供约7.5g*51％或3.8g乙醇的最大理论转化效率。在其他情况下，糖化步骤的效率可以被计算或测定(即，测量)。本发明预期的糖化效率包括对于任何碳水化合物
碳源比单一单糖亚基大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或约100％。

[0045] ″预处理″或″预处理的″在本文用来指任何机械、化学、热、生化过程或这些过程以组合步骤或顺序进行的组合，这实现了生物质的破坏或膨胀以使生物质更容易受到酶和/或微生物的攻击。在一些实施方案中，预处理可以包括去除或破坏木质素以使植物生
物质中的纤维素和半纤维素聚合物更容易被纤维素酶和/或微生物利用，例如通过用酸或
碱处理。在一些实施方案中，预处理可以包括使用一种类型的微生物以使植物多糖更容易
被另一种类型微生物接近。在一些实施方案中，预处理还可以包括纤维素和/或半纤维素
材料的破坏或膨胀。蒸汽爆发和氨纤维膨胀(或爆发)(AFEX)是公知的热/化学技术。可
以使用水解，包括利用酸和/或酶的方法。还可以使用其他热、化学、生物化学、酶技术。

[0046] 本文使用的术语″补料分批″或″补料分批发酵″具有其本领域技术人员已知的普通含义，并且可以包括其中营养物、其他培养基组分或生物催化剂(包括例如酶、新鲜生物体、胞外培养基、等等)在培养期间添加至发酵罐但在发酵结束之前不从发酵罐收集
培养基的培养微生物的方法，但它也可以包括其中收获一部分发酵罐体积并然后向发酵罐
中剩余培养基添加新鲜培养基的″自我接种″或″部分收获″技术，其中至少一部分的接
种物是留在发酵罐中的培养基。在一些实施方案中，补料分批过程可以用短语例如″细胞
强化补料分批″来表示。该短语可以包括其中添加营养物和微生物细胞的操作或其中添加
不含大量营养物的微生物细胞的操作。更概括的短语“补料分批”也涵盖这些操作。其中
使用这些短语的任何一个的上下文将指示本领域技术人员考虑的技术。

[0047] 本文使用的术语″肌醇六磷酸(盐)″具有本领域技术人员已知的普通含义，可以包括肌醇六磷酸、其盐及其组合形式以及这些的组合。

[0048] 本文使用的术语″糖化合物″具有其本领域技术人员已知的普通含义，并且可以包括单糖，包括但不限于己糖和戊糖；糖醇；糖酸；糖胺；含有通过共价或离子键直接或间接连接在一起的这些的两种或多种的化合物；及其混合物。本说明书包括二糖；三糖；寡
糖；多糖；和任何长度的支链和/或直链的糖链。

[0049] a.介绍

[0050] 生物质是可再生能量源，其可以被生物发酵以产生终产物，例如移动发动机便携燃料(例如醇、乙醇、有机酸、乙酸、乳酸、甲烷或氢)或用于其他商业目的的化合物。生物质包括农业残渣(玉米秸秆、草、禾杆、谷壳、甘蔗渣、等等)、动物废物(来自牛、家禽和肥猪的粪肥)、藻类、木质材料(木料或树皮、锯末、林区废料和磨屑)、城市废物(废纸、回收的卫生纸、碎料等等)、能源作物(杨树、柳树、柳枝稷、苜蓿、草原须芒草、等等)。木质纤维生物质具有纤维素和半纤维素作为两种主要组分。为达到木质纤维生物质向终产物(产率)
的高发酵效率，重要的是提供预处理，以除去和/或脱毒至少一部分木质素含量并使纤维
素和半纤维素更容易酶促水解。

[0051] 最近，已经实现了纤维素和半纤维素中聚合己糖和戊糖转化为乙醇。参见English等人的美国专利号4,349,628；还参见等人的美国专利号4,400,470；Ingram等人的美国专利号5,000,000；Ingram等人的美国专利号5,028,539；和Ingram等人的美国专利号
5,162,516，其全部通过引用并入本文。

[0052] 在一些实施方案中，从生物质产生燃料是一个两步骤过程，包括酶促水解，随后发酵。生物质的酶促水解可以使用可商业途径获得的水解酶混合物、衍生自特定生物体或生物体组的酶、废弃发酵培养基、或碳水化合物降解或糖化酶的任何来源来实现。在一个实施方案中，用于处理生物质的酶包括但不限于木聚糖酶、内切-1，4-β-木聚糖酶、木糖苷酶、β-D-木糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶、糖酶、葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、内切-1，4-β-葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、淀粉酶、纤维二糖水解酶、外切纤维二糖水解酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、果胶酸裂合酶、半乳糖醛酸酶、漆酶淀粉酶、蛋白酶、壳多糖酶、果胶酶或角蛋白酶。

[0053] 用于生物质的处理、生物质的预处理、生物质的酶处理或生物质准备用于发酵或转化为有用终产物的其他方法和组合物由以下提供：美国专利申请号20090053770、
20070031918、20070031953、20090053777、20090042259、20090042266、20090004698、
20090004692、20090004706、20090011474、20090011484、20080227161、20080227162、
20080044877、20080182323、20070148751、20060246563和美国专利号5865898、5628830、
5693296、5837506和6090595，其每一个在此通过引用整体并入。生物质的酶处理导致高
分子量碳水化合物聚合物降解成较小寡糖，并且在一些情况下最终降解成单聚体己糖和戊
糖。在第二步，这些糖使用例如酵母或细菌菌株被发酵成终产物(例如，醇、乙醇、有机酸、乙酸、乳酸、甲烷或氢)。

[0054] 在其他实施方案中，水解和发酵过程被组合成单个步骤。在一些情况下，这可以通过减少资金和操作成本，例如通过最大限度减小对外部酶处理的需求而提供比两步过程更经济的过程。在其他实施方案中，己糖和戊糖两者转化为终产物与仅己糖或仅戊糖的转化、或者与主要转化戊糖而基本上不转化己糖或主要转化己糖而基本上不转化戊糖的过程相
比，可以提供提高的每克生物质的终产物产率。已经报道常用的酵母(酿酒酵母)、真菌和
细菌种能够容易地将己糖(葡萄糖)转化为乙醇。然而，戊糖(木糖和阿拉伯糖)的发酵
依然是从生物质生产乙醇的技术瓶颈。一些研究者已经使用遗传技术获得发酵单胞菌、大
肠杆菌、酵母菌和其他酵母的重组体。

[0055] 本发明提供了使用微生物例如植物发酵梭状芽胞杆菌或其他梭状芽胞杆菌种的方法，其在某些实施方案中能够同时水解和发酵木质纤维生物质。在一个实施方案中，微生物同时发酵己糖和戊糖成分以产生发酵终产物。在另一个实施方案中，植物发酵梭状芽胞
杆菌或其他梭状芽胞杆菌种可以通过其产生能够水解多糖和高级糖为低分子量糖、寡糖、
二糖和单糖的酶的能力而提供用于将生物质转化为乙醇或其他发酵终产物(例如醇、有机
酸、乙酸、乳酸、甲烷或氢)的有用优点。在一些实施方案中，微生物(例如植物发酵梭状芽胞杆菌或其他梭状芽胞杆菌种)可用于本文描述的方法以进行水解高分子量的含糖生物
质和/或高级糖或多糖为低级糖和发酵来自纤维素以及半纤维素的寡糖、二糖和单糖成为
一种或多种发酵终产物(包括但不限于乙醇、甲烷、氢和其他化合物，例如有机酸，包括甲酸、乙酸和乳酸)的组合步骤。本文描述的方法还提供微生物例如植物发酵梭状芽胞杆菌
或其他梭状芽胞杆菌种在包括以下的条件下生长、培养、发酵等等：升高的乙醇浓度、高糖浓度、低糖浓度、利用可溶性碳源和厌氧条件。

[0056] 在一个实施方案中，植物发酵梭状芽胞杆菌或其他梭状芽胞杆菌种优先发酵寡聚体而非单糖。该代谢特征可以被用来减少生物质预处理的时间和严重度。例如，导致寡聚
体而非单糖释放的较不强烈的酸处理减少预处理过程的时间和化学品成本。这可以导致生
产发酵终产物的总成本较小。在这种过程中较少的糖被降解，由此添加生物质较高的糖含
量和增加的乙醇或其他化学产物的产率。

[0057] 在一些实施方案中，本发明提供了发酵方法，例如连续发酵方法、分批发酵方法或补料分批发酵方法(例如，恒定体积或可变体积)。在一些实施方案中，所述方法提供了用微生物例如植物发酵梭状芽胞杆菌或其他梭状芽胞杆菌种发酵生物质。在一些情况下，提
供补料分批发酵方法用于使用微生物例如植物发酵梭状芽胞杆菌或其他梭状芽胞杆菌种
从生物质(例如玉米秸秆或本文提供的任何生物质)生产乙醇。在一个实施方案中，方法
提供了5至200g/L的乙醇滴度，具有约0.5至20g/L/d的生产率。在另一个实施方案中，
方法提供了约0.1-1克乙醇/克发酵罐中加载的生物质的乙醇产率。在一些实施方案中，
方法提供了发酵终产物(例如醇、乙醇、甲醇、有机酸、乙酸、乳酸、甲烷或氢)的理论最大可能产率的约45％-99.5％或更大的收率。

[0058] 在一个实施方案中，方法提供了至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、4、142、
43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、
68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、
93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120 125、130、135、140、145、150，160、170、180、
190或200g/L或更多的乙醇滴度，具有约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19或20g/L/d或更高的生产率。在另一个实施方案中，方法提供了约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1g或更多乙醇/g发酵罐中加载的生物质的乙醇产率。在一些实施方案中，提供了发酵终产物(例如醇、乙醇、有机酸、乙酸、乳酸、甲烷或氢)的理论最大可能产率的至少约50％、60％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高的产率。

[0059] b.方法

[0060] 发酵

[0061] 以下描述和实施例详细地示例说明了本发明的某些优选实施方案。本领域技术人员将理解，存在许多由其范围涵盖的变化和调整。因此，优选实施方案的描述不应被认为限制本发明的范围。

[0062] 提供用于发酵生物质和随后生产有用的终产物的方法，所述终产物包括但不限于醇、乙醇、有机酸、乙酸、乳酸、甲烷或氢或其他化学品。在一些实施方案中，生物质(例如玉米秸秆)在发酵之前被加工或预处理。在一个实施方案中，预处理方法包括但不限于生物
质粒度减小，例如粉碎、磨碎、切碎、压碎、研磨或磨粉。在一些实施方案中，生物质粒度减小可以包括尺寸分离方法，例如筛分，或者本领域已知的根据尺寸分离材料的其他适合方法。
在一个实施方案中，尺寸分离可以提供提高的产率。在一些实施方案中，精细粉碎的生物
质(例如，直径小于约8mm，例如8、7.9、7.7、7.5、7.3、7、6.9、6.7、6.5、6.3、6、5.9、5.7、5.5、
5.3、5、4.9、4.7、4.5、4.3、4、3.9、3.7、3.5、3.3、3、2.9、2.7、2.5、2.3、2、1.9、1.7、1.5、1.3、
1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1mm的颗粒)与较大颗粒的分离允许较大颗粒被回收回尺寸减小过程，从而增加被加工的生物质的最终产率。

[0063] 在一些实施方案中，预处理方法可以包括在高或低pH条件下的处理。高或低pH处理包括但不限于使用浓酸或浓碱的处理，或使用稀酸或稀碱的处理。用于在本发明方法
中处理生物质的碱性组合物包括但不限于苛性碱，例如苛性石灰、苛性苏打、苛性钾、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙或氧化钙。在一些实施方案中，适用于处理生物质的碱量范围是每克待处理生物质0.01g至3g碱(例如苛性碱)。在一些实施方案中，适用于处理生物质
的碱量包括但不限于每克待处理生物质约0.01g碱(例如苛性碱)、0.02g、0.03g、0.04g、
0.05g、0.075g、0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g、0.75g、1g、2g或约3g碱(例如苛性碱)。

[0064] 在另一个实施方案中，生物质可以在升高的温度和/或压力下预处理。在一个实施方案中，生物质在20℃至400℃的温度范围预处理。在另一个实施方案中，生物质在
约20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、80℃、90℃、100℃、120℃、
150℃、200℃、250℃、300℃，350℃、400℃或更高的温度下预处理。在另一个实施方案中，升高的温度通过使用蒸汽、热水或热气体来提供。在一个实施方案中，蒸汽可以被注射入含生物质的容器。在另一个实施方案中，蒸汽、热水或热气可以被注射入容器套，使得它加热但不直接接触生物质。

[0065] 在另一个实施方案中，生物质可以在升高的压力下处理。在一个实施方案中，生物质在约1psi至约30psi的压力范围预处理。在另一个实施方案中，生物质在约1psi、2psi、3psi、4psi、5psi、6psi、7psi、8psi、9psi、10psi、12psi、15psi、18psi、20psi、22psi、24psi、
26psi、28psi、30psi或更高压力下预处理。在一些实施方案中，生物质可以通过注射蒸汽进入含有生物质的容器而用升高的压力处理。在其他实施方案中，生物质可以在碱或酸处理
或本文提供的任何其他处理方法之前或之后被处理至真空条件。

[0066] 在一个实施方案中，碱或酸预处理的生物质被洗涤(例如用水(热的或冷的)或其他溶剂例如醇(例如乙醇))、用酸、碱或缓冲剂(例如，磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐或碳酸盐)中和pH，或者在发酵之前干燥。在一个实施方案中，干燥步骤可以在真空下进行以增
加水或其他溶剂的蒸发速率。可选地或附加地，干燥步骤可以在例如约20℃、25℃、30℃、
35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、80℃、90℃、100℃、120℃、150℃、200℃、250℃、
300℃或更高的升高温度下进行。

[0067] 在本发明一些实施方案中，预处理步骤包括固体回收步骤。固体回收步骤可以在预处理(例如，酸或碱预处理)期间或之后，或者在干燥步骤之前。在一些实施方案中，本
发明方法提供的固体回收步骤包括使用滤网、滤器、筛或膜来分离液体和固体成分。在一个实施方案中，适合的滤网孔直径尺寸范围约0.001微米至8mm，例如约0.005微米至3mm或
约0.01微米至1mm。在一个实施方案中，滤网孔尺寸具有约0.01微米、0.02微米、0.05微
米、0.1微米、0.5微米、1微米、2微米、4微米、5微米、10微米、20微米、25微米、50微米、75微米、100微米、125微米、150微米、200微米、250微米、300微米、400微米、500微米、750微米、1mm或更大的孔径。

[0068] 在一个实施方案中，补料分批发酵对处理的生物质进行以产生发酵终产物(例如，醇、乙醇、有机酸、乙酸、乳酸、甲烷或氢)。在一个实施方案中，发酵过程包括使用一种或多种微生物同时水解和发酵生物质，所述微生物例如梭状芽胞杆菌属菌株、木霉
菌属菌株、酵母菌属菌株、发酵单胞菌属菌株、或适合发酵生物质的另一种微生物。在
另一个实施方案中，发酵过程包括使用以下微生物同时水解和发酵生物质：植物发酵
梭状芽胞杆菌、解木素梭状芽胞杆菌(Clostridium algidixylanolyticum)、解木聚
糖梭状芽胞杆菌(Clostridium xylanolyticum)、噬纤维梭状芽胞杆菌(Clostridium
cellulovorans)、解纤维梭状芽胞杆菌(Clostridium cellulolyticum)、热梭状芽胞杆
菌(Clostridium thermocellum)、约氏梭状芽胞杆菌(Clostridium josui)、溶纸莎草
梭状芽胞杆菌(Clostridium papyrosolvens)、产纤维二糖梭状芽胞杆菌(Clostridium
cellobioparum)、Clostridium hungatei、纤 维 素 梭 状 芽 胞 杆 菌 (Clostridium
cellulosi)、粪堆梭状芽胞杆菌(Clostridium stercorarium)、白蚁梭状芽胞杆菌
(Clostridium termitidis)、热粪梭状芽胞杆菌(Clostridium thermocopriae)、速生
梭状芽胞杆菌(Clostridium celerecrescens)、解多糖梭状芽胞杆菌(Clostridium
polysaccharolyticum)、波氏梭状芽胞杆菌(Clostridium populeti)、缓纤维梭状芽胞
杆菌(Clostridium lentocellum)、Clostridium chartatabidum、阿氏梭状芽胞杆菌
(Clostridium aldrichii)、Clostridium herbivorans、解纤维素醋弧菌(Acetivibrio
cellulolyticus)、溶纤维素拟杆菌(Bacteroides cellulosolvens)、解糖热解纤维素菌
(Caldicellulosiruptor saccharolyticum)、白色瘤胃球菌、生黄瘤胃球菌、产琥珀酸丝
状杆菌、溶纤维真杆菌(Eubacterium cellulosolvens)、溶纤维丁酸弧菌、Anaerocellum thermophilum、解纤维素嗜盐菌(Halocella cellulolytica)、热解糖热厌氧杆菌
(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)、Sacharophagus degradans、或解糖
热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticum)。

[0069] 在一个实施方案中，用于发酵生物质的一种或多种微生物是野生型微生物。野生型微生物是基本类似于获自天然环境的分离株的那些微生物，并且包括在实验室环境中繁
殖的分离株。在另一个实施方案中，一种或多种微生物被繁殖和/或根据期望特征来筛选。
筛选或繁殖方法可以包括用包含是或类似于发酵终产物生产中利用的碳源的碳源的培养
基生长。期望特征包括但不限于增加的生物质糖化、增加的特定发酵终产物生产、增加的乙醇生产、增加的对乙醇的耐受性、增加的酶合成或减少的孢子形成。筛选方法可以进一步包括使用诱变(例如通过化学或辐射方式)以产生期望的微生物群体。然后，可以根据期望
特征筛选诱变的微生物，导致更高频率的期望分离株。在另一个实施方案中，用于发酵的一种或多种微生物可以是重组微生物。重组微生物包括与各自野生型微生物相比对其核酸的
一个或多个改变，这是自发(即，天然)突变没有产生的。在一个实施方案中，重组微生物
包括来自另一物类(例如另一种微生物)的外源性多核酸、合成多核酸、或从相同物类分离
或衍生的多核酸。

[0070] 在一个实施方案中，发酵过程可以包括用一种或多种酶同时水解和发酵生物质，所述酶例如木聚糖酶、内切1，4-β-木聚糖酶、木糖苷酶、β-D-木糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶、糖酶、葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、内切1，4-β-葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、淀粉酶、纤维二糖水解酶、外切纤维二糖水解酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、过氧化物酶、果胶酸裂合酶、半乳糖醛酸酶或漆酶。在一个实施方案中，用于处理生物质的一种或多种酶是热稳定的。在另一个实施方案中，生物质在发酵之前用一种或多种例如本文
提供的那些酶处理。在另一个实施方案中，生物质在发酵期间用一种或多种例如本文提供
的那些酶处理。在另一个实施方案中，生物质在发酵之前和发酵期间用一种或多种例如本
文提供的那些酶处理。在另一个实施方案中，用于预处理生物质的酶与发酵期间添加的那
些酶相同。在另一个实施方案中，用于预处理生物质的酶不同于在发酵期间添加的那些酶。

[0071] 在一些实施方案中，发酵可以在诸如生物反应器、发酵容器、搅拌罐反应器或流化床反应器的装置中进行。在一个实施方案中，处理的生物质可以补充适合的化学品以促进一种或多种发酵生物体的强力生长。在一个实施方案中，有用的补充包括但不限于氮和/
或氨基酸来源，例如酵母提取物、半胱氨酸、铵盐(例如，硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐等等)；简单碳水化合物的来源，例如玉米浸渍液体和麦芽糖浆；维生素来源，例如酵母提取物；缓冲剂，例如盐(包括但不限于柠檬酸盐、磷酸盐或碳酸盐)；或矿脂营养素，例如镁盐、钙盐或铁盐。在一些实施方案中，氧化还原调节剂被添加至发酵混合物，包括但不限于半胱氨酸或巯基乙醇。

[0072] 用于本发明方法的化学品容易获得并且可以购自商业供应商，例如TM
Sigma-Aldrich。此 外，商业 酶混 合物(例 如，accellerase 1000、CelluSeb-TL、
TM TM TM
CelluSeb-TS、Cellic CTec、STARGEN 、Maxaliq 、Spezyme Distillase G-Zyme
TM TM
Fermenzyme Fermgen 、GC 212或Optimash )或任何其他商业酶混合物可以购自供应
商，例如Specialty Enzymes & Biochemicals Co.、Genencor或Novozymes。可选地，酶混合物可以通过在适合培养基中培养一种或多种生物体例如真菌(例如，木霉菌、酵母菌、毕赤酵母、白腐菌等等)、细菌(例如梭状芽胞杆菌(例如植物发酵梭状芽胞杆菌)或大肠杆
菌、运动发酵单胞菌、Sacharophagus degradans等等)并收获从其产生的酶来制备。在一
些实施方案中，收获可以包括一个或多个酶纯化步骤。

[0073] 在一个实施方案中，通过微生物生产发酵终产物(例如植物发酵梭状芽胞杆菌)的滴度和/或生产率通过在包含一种或多种含有己糖和/或戊糖的化合物的培养基中培养
所述微生物来提高。在一个实施方案中，过程包括将起始材料(例如生物质)转化为生物
燃料，例如一种或多种醇。在一个实施方案中，本发明方法包括使包含己糖(例如葡萄糖、纤维素二糖)和戊糖(例如木糖、阿拉伯糖)的底物与植物发酵梭状芽胞杆菌接触以产生
乙醇。

[0074] 在本发明的一些实施方案中，使用本发明方法用微生物(例如植物发酵梭状芽胞杆菌)分批发酵己糖和戊糖的混合物提供了约0.1-8g/L/h或更高的己糖(例如葡萄糖、纤
维素、纤维素二糖等等)和约0.1-8g/L/h或更高的戊糖(木糖、木聚糖、半纤维素等等)的
摄取速率。在本发明的一些实施方案中，使用本发明方法用微生物(例如植物发酵梭状芽
胞杆菌)分批发酵己糖和戊糖的混合物提供了约0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1、2、3、
4、5或6g/L/h或更高的己糖(例如葡萄糖、纤维素、纤维素二糖等等)和约0.1、0.2、0.4、
0.5、0.6、0.7、0.8、1、2、3、4、5或6g/L/h或更高的戊糖(木糖、木聚糖、半纤维素等等)的摄取速率。

[0075] 在一个实施方案中，用于生产乙醇的方法在40小时或更短时间内产生约10g/l至120g/l。在另一个实施方案中，用于生产乙醇的方法在40小时内通过生物质发酵产生约
10g/l、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、25g/L、26g/L、27g/L、28g/L、29g/L、30g/L、31g/L、32g/L、33g/L、34g/L、
35g/L、36g/L、37g/L、38g/L、39g/L、40g/L、41g/L、42g/L、43g/L、44g/L、45g/L、46g/L、47g/L、48g/L、49g/L、50g/L、51g/L、52g/L、53g/L、54g/L、55g/L、56g/L、57g/L、58g/L、59g/L、
60g/L、61g/L、62g/L、63g/L、64g/L、65g/L、66g/L、67g/L、68g/L、69g/L、70g/L、71g/L、72g/L、73g/L、74g/L、75g/L、76g/L、77g/L、78g/L、79g/L、80g/L、81g/L、82g/L、83g/L、84g/L、
85g/L、86g/L、87g/L、88g/L、89g/L、90g/L、91g/L、92g/L、93g/L、94g/L、95g/L、96g/L、97g/L、98g/L、99g/L、100g/L、110g/l、120g/l或更多乙醇。在另一个实施方案中，通过包括同时发酵己糖和戊糖的方法生产乙醇。在另一个实施方案中，乙醇通过包括同时发酵己糖和戊
糖的微生物生产。

[0076] 在另一个实施方案中，产生发酵终产物的微生物在高醇(例如乙醇或丁醇)浓度存在下耐受。在一个实施方案中，植物发酵梭状芽胞杆菌在高醇(例如乙醇或丁醇)浓度
存在下耐受。在一个实施方案中，微生物可以在达15％v/v的醇(例如乙醇或丁醇)浓度
下生长并发挥功能。在另一个实施方案中，微生物可以在1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、
8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％v/v的醇(例如乙醇或丁醇)浓度下生长并发挥功能。在一个实施方案中，高醇浓度中的功能包括促进生产醇而无过度的醇和/或其他
存在组分的抑制或压抑的能力。在另一个实施方案中，高醇浓度中的功能包括将生物质原
料中的己糖和戊糖碳源有效转化成发酵终产物例如醇的能力。在一个实施方案中，植物发
酵梭状芽胞杆菌在高醇(例如乙醇或丁醇)浓度存在下耐受。

[0077] 已经发现，在包含植物发酵梭状芽胞杆菌的发酵培养基中乙醇浓度在分批发酵约36-48小时之后达到约15g/L的平稳状态，碳物质包括在培养基中。在另一个实施方案中，
将发酵pH降低至约6.5和/或添加不饱和脂肪酸至发酵培养基，导致生物体产生的乙醇
量显著增加，在48-96小时或更长发酵之后在培养基中发现约20g/L至约30、40、50、60或
70g/L或更多的乙醇。此外，已经发现，当乙醇滴度低时，生物体的生产率较高(至约10g/
L-d)，并且当乙醇浓度较高时，生物体的生产率较低(至约2g/L-d)。在减小的pH和/或添
加脂质(例如脂肪酸)时的发酵可以导致乙醇生产率与未调节发酵培养基相比约2至10
倍(例如2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x或10x增加)或更高的增加。在本发明一些实施方案中，己糖和戊糖的同时发酵还可实现乙醇生产率和/或产率的增加。在一些情况下，己糖和戊糖碳水化合物底物的同时发酵可与在减小的pH和/或添加脂质(例如脂肪酸)时的发
酵组合使用以进一步增加生产率和/或产率。在一个实施方案中，脂质是脂肪或油，包括但不限于脂肪酸的甘油酯以及伴随的磷脂、甾醇、醇、烃、酮和相关化合物。在另一个实施方案中，脂质是磷脂。在一个实施方案中，脂肪酸是脂肪族或芳香族单羧酸。在另一个实施方案中，脂肪酸是不饱和脂肪酸。在一个实施方案中，不饱和脂肪酸是具有1至3个双键的脂
肪酸，并且″高度不饱和脂肪酸″指具有4个或更多双键的脂肪酸。在另一个实施方案中，不饱和脂肪酸是ω-3高度不饱和脂肪酸，例如二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸、α亚麻酸、二十二碳六烯酸及其轭合物。在另一个实施方案中，脂肪酸是饱和脂肪酸。在另一个实施
方案中，脂肪酸是植物油，例如部分氢化的植物油，包括棕榈油、棉籽油、玉米油、花生油、棕榈仁油、巴巴苏油、葵花油、红花油或其混合物。在另一个实施方案中，包含脂肪酸的组合物还包括蜡，例如蜂蜡、石油蜡、米糠蜡、蓖麻油蜡、微晶蜡或其混合物。

[0078] 在另一个实施方案中，生物质在用微生物发酵之前用表面活性剂预处理。在另一个实施方案中，生物质在微生物发酵期间与表面活性剂接触。在一个实施方案中，所述表面活性剂是Tween系列表面活性剂(例如Tween 20或Tween 80)或Triton系列表面活性剂
(例如Triton X-100)。在另一个实施方案中，所述表面活性剂是聚山梨酯60、聚山梨酯80、丙二醇、二辛基磺基琥珀酸钠、月桂基硫酸钠、脂肪酸的乳酸酯、脂肪酸的聚甘油酯或其混合物。在另一个实施方案中，生物质在用微生物发酵之前用表面活性剂和脂质预处理。在
另一个实施方案中，生物质在用微生物发酵期间与表面活性剂和脂质接触。

[0079] 在另一个实施方案中，发酵培养基包括螯合剂(例如柠檬酸三钠的二水合物或EDTA)。在一个实施方案中，螯合剂是与某些金属离子形成可溶性络合分子的化学品，使所述离子失活以使它们不与其他元素或离子反应。在一个实施方案中，发酵培养基中螯合剂
的浓度大于约0.2g/L、大于约0.5g/L或大于约1g/L。在另一个实施方案中，发酵培养基中
螯合剂的浓度小于约10g/L、小于约5g/L或小于约2g/L。在一个实施方案中，生物可接受
螯合剂是5-磺基水杨酸二水合物、柠檬酸二胺、草酸铵一水合物、柠檬酸、乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠盐二水合物、L-(+)-酒石酸、草酸钾一水合物、酒石酸钾钠四水合物、柠檬酸三钠二水合物、L-酒石酸二钠二水合物、草酸钠、乙二醇-双(2-氨基乙醚)-N，N，N′，N′-四乙酸、柠檬酸三镁九水合物、乙二胺四乙酸二铵盐、乙二胺四乙酸二钾盐二水合物、四草酸钾二水合物、酒石酸二钠二水合物、乙二胺四乙酸三钾盐二水合物、乙二胺四乙酸三钠盐二水合物、酒石酸二铵、柠檬酸三锂四水合物、柠檬酸钾、酒石酸氢钠一水合物、柠檬酸钠、乙二胺四乙酸四钠盐水合物、N，N-二甲基癸胺N-氧化物、N，N-二甲基十二胺N-氧化
物、次氮基三乙酸、柠檬酸三钾、D-酒石酸钾、过氧化硫酸氢钾、酒石酸钾钠、苯均四酸水合物、酒石酸二钠溶液、柠檬酸浓缩溶液、乙二胺四乙酸二钠盐、依地酸二钠、柠檬酸钠、乙二胺四(亚甲基磷酸)、二羧基甲基谷氨酸、二乙胺二琥珀酸(EDDS)、甲胺、绿脓菌素、绿脓菌荧光素、肠菌素、蛋氨酸，例如植物螯合肽、苹果酸、次氮基三乙酸、草酸或去铁草酰胺B。在一个实施方案中，螯合剂根据靶向螯合的金属的特异性和/或通过螯合剂在预处理环境中
发挥作用的能力来选择。在一个实施方案中，当碱性pH通过向原料添加碱剂来维持时，选
择的螯合剂将能够在碱性pH下发挥作用。在另一个实施方案中，当酸性pH通过向原料添
加酸剂来维持时，选择的螯合剂将能够在酸性pH下发挥作用。在另一个实施方案中，当在
预处理过程中利用高温时，选择的螯合剂能够在高温发挥作用。在另一个实施方案中，发酵培养基包括超过一种螯合剂。在一个实施方案中，一种或多种螯合剂在微生物例如植物发
酵梭状芽胞杆菌发酵生物质期间被添加至发酵培养基。

[0080] 生物质

[0081] 在一些实施方案中，微生物(例如植物发酵梭状芽胞杆菌)与预处理或非预处理的原料接触，所述原料包含纤维素、半纤维素和/或木质纤维素材料。其他营养素可以存在或添加至生物质材料以被微生物加工，所述营养素包括含氮化合物，例如氨基酸、蛋白、水解蛋白、氨、尿素、硝酸盐、亚硝酸盐、大豆、大豆衍生物、酪蛋白、酪蛋白衍生物、乳粉、乳衍生物、乳清、酵母提取物、水解酵母、自溶酵母、玉米浸渍液体、玉米浸渍固体、谷氨酸单钠和/或其他发酵氮源。维生素和/或矿物补充物。在一些实施方案中，一种或多种其他低分
子量碳源可以被添加或存在，例如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、玉米糖浆、蒸馏干燥可溶物(DDS)、蒸馏干燥颗粒(DDG)、浓缩蒸馏可溶物(CDS)、蒸馏湿润颗粒(DWG)、蒸馏干燥颗粒及可溶物(DDGS)、乳酸等等。

[0082] 此类低分子量碳源可以发挥多种功能，包括在发酵期开始时提供初始碳源，帮助构建细胞技术，控制碳/氮比例，去除过量氮，或一些其他功能。在一些实施方案中，添加另一种培养基补充物，例如pH调节剂、脂质(例如脂肪酸)、表面活性剂或螯合剂)。

[0083] 在一些实施方案中，需氧/厌氧循环用于将纤维素或木质纤维素材料转化为燃料和化学品。在一些实施方案中，厌氧微生物可以直接发酵生物质而无需预处理。在一些实
施方案中，原料与能够将植物衍生的聚合物材料分解成低分子量产物的生物催化剂接触，
低分子量产物随后可以被生物催化剂转化为燃料和/或其他期望的化学品。

[0084] 在一些实施方案中，本发明提供了通过微生物同时糖化和发酵来自生物质的纤维素固体成为燃料或另一种发酵终产物的方法。在一个实施方案中，微生物是植物发酵梭状
芽胞杆菌。

[0085] 在一个实施方案中，通过微生物对预处理的原料的水解和对寡糖的水解在单个发酵反应容器中同时发生。在一个实施方案中，微生物是植物发酵梭状芽胞杆菌。在另一个
实施方案中，预处理的原料的水解、寡糖的水解和单糖转化为乙醇可以在单个反应容器中
同时发生。在一个实施方案中，单一微生物同时进行水解和转化。在一个实施方案中，微生物是植物发酵梭状芽胞杆菌。在另一个实施方案中，微生物的第一和第二个种进行水解和
转化步骤。

[0086] 在一个实施方案中，方法包括用可以糖化C5/C6糖的微生物在封闭容器中处理生物质。在另一个实施方案中，方法包括用植物发酵梭状芽胞杆菌细菌或另一梭状芽胞杆菌
种在封闭容器中在其中植物发酵梭状芽胞杆菌细菌或其他微生物产生足以充分转化生物
质成为单糖和二糖的糖解酶的条件下处理生物质。在另一个实施方案中，方法包括用可以
糖化C5/C6糖的微生物在容器中处理生物质并添加一种或多种酶以帮助碳水化合物或木
质纤维素材料的分解或脱毒。在另一个实施方案中，方法包括用植物发酵梭状芽胞杆菌或
另一种类似的C5/C6梭状芽胞杆菌种在容器中处理微生物并添加一种或多种酶以帮助碳
水化合物或木质纤维素材料的分解或脱毒。在一些实施方案中，培养物在用第一微生物
(例如植物发酵梭状芽胞杆菌)发酵之后可以与第二微生物接触，其中第二微生物能够充
分转化单糖和二糖成为期望的发酵产物，例如燃料(例如乙醇或丁醇)。在一个实施方案
中，第二微生物是真菌。在另一个实施方案中，第二微生物是酵母。在另一个实施方案中，第二微生物是贝酵母(Saccharomyces bayanus)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、
博 伊丁 酵 母(Saccharomyces bulderi)、Saccharomyces cariocanus、Saccharomyces
cariocus、酿 酒 酵 母、薛 瓦 酵 母 (Saccharomyces chevalieri)、Saccharomyces
dairenensis、葡萄酵母(Saccharomyces ellipsoideus)、Saccharomyces martiniae、摩纳酵母(Saccharomyces monacensis)、Saccharomyces norbensis、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)、巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)、Saccharomyces spencerorum、图列茨酵母(Saccharomyces turicensis)、单胞酵母(Saccharomyces unisporus)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、Saccharomyces zonatus。在另一个实施方案中，第二微生物是酵母菌或念珠菌。在另一个实施方案中，第二微生物是梭状芽胞杆菌种，例如热梭状芽胞杆菌、丙酮丁醇梭状芽胞杆菌和噬纤维梭状芽胞杆菌或运动发酵单胞菌。

[0087] 在一些实施方案中，提供了从含有木质素的生物质生产生物燃料或其他化学品的方法。该方法包括：1)使含木质素的生物质与浓度足以水解至少一部分含木质素的生物
质的碱水溶液接触；2)将处理的生物质中和至pH 5至9(例如5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5或
9)；3)在封闭容器中用植物发酵梭状芽胞杆菌或另一种类似的C5/C6梭状芽胞杆菌种在其
中植物发酵梭状芽胞杆菌(任选添加一种或多种酶至容器)充分转化被处理的生物质成为
单糖和二糖和/或生物燃料或其他发酵终产物的条件下处理生物质；和4)任选地，引入第
二微生物培养物，其中所述第二微生物能够充分转化单糖和二糖成为发酵终产物，例如生
物燃料。

[0088] 微生物的遗传修饰

[0089] 另一方面，提供了通过构建和使用遗传修饰微生物来生产发酵终产物例如一种或多种醇例如乙醇的组合物和方法。在一个实施方案中，遗传修饰微生物是植物发酵梭状芽
胞杆菌。在一个实施方案中，遗传修饰针对调节或编码与发酵生化途径、糖解酶表达或增加发酵期间环境条件耐受性相关的蛋白的核酸序列。在另一个实施方案中，遗传修饰针对微
生物中的核酸序列。在一个实施方案中，微生物用编码感兴趣的途径、酶或蛋白的一个或多个基因的多核苷酸转化。在另一个实施方案中，微生物被转化以产生感兴趣的途径、酶或蛋白的一个或多个基因的多个拷贝。在一些实施方案中，被转化入微生物的多核苷酸是异源
的。在其他实施方案中，所述多核苷酸衍生自微生物。在一个实施方案中，微生物用编码一个或多个基因的异源多核苷酸转化，所述一个或多个基因编码用于发酵己糖的酶，其中所
述基因以足以赋予所述微生物转化子与未转化的微生物相比增加的浓度、生产率水平或产
率生产乙醇的能力的水平表达。在另一个实施方案中，微生物用编码一个或多个基因的异
源多核苷酸转化，所述一个或多个基因编码用于发酵戊糖的酶，其中所述基因以足以赋予
所述微生物转化子与未转化的微生物相比增加的浓度、生产率水平或产率生产乙醇或其他
终产物的能力的水平表达。在其他实施方案中，微生物用发酵己糖和戊糖的酶的组合转化。
在一些实施方案中，可以实现提高的终产物生产率。在另一个实施方案中，微生物用编码
一个或多个基因的异源多核苷酸转化，所述一个或多个基因编码用于多糖糖化的糖解酶，
其中所述基因以足以赋予转化的微生物与未转化的微生物相比增加的浓度、糖化速率或单
糖、二糖或寡糖的产率糖化多糖为单糖、二糖或寡糖的能力的水平表达。

[0090] 在另一个实施方案中，遗传修饰针对植物发酵梭状芽胞杆菌中的核酸序列。在一个实施方案中，植物发酵梭状芽胞杆菌用编码感兴趣的途径、酶或蛋白的一个或多个基因
的多核苷酸转化。在另一个实施方案中，植物发酵梭状芽胞杆菌被转化以产生感兴趣的途
径、酶或蛋白的一个或多个基因的多个拷贝。在一些实施方案中，被转化入植物发酵梭状芽胞杆菌的多核苷酸是异源的。在其他实施方案中，多核苷酸衍生自植物发酵梭状芽胞杆菌。
在一个实施方案中，植物发酵梭状芽胞杆菌用编码一个或多个基因的异源多核苷酸转化，
所述一个或多个基因编码用于发酵己糖的酶，其中所述基因以足以赋予所述植物发酵梭状
芽胞杆菌转化子与未转化的植物发酵梭状芽胞杆菌相比增加的浓度、生产率水平或产率生
产乙醇的能力的水平表达。在另一个实施方案中，植物发酵梭状芽胞杆菌用编码一个或多
个基因的异源多核苷酸转化，所述一个或多个基因编码用于发酵戊糖的酶，其中所述基因
以足以赋予所述植物发酵梭状芽胞杆菌转化子与未转化的植物发酵梭状芽胞杆菌相比增
加的浓度、生产率水平或产率生产乙醇或其他终产物的能力的水平表达。在其他实施方案
中，植物发酵梭状芽胞杆菌被用于发酵己糖和戊糖的酶的组合转化。在一些实施方案中，可以实现提高的终产物生产率。

[0091] 在另一个实施方案中，植物发酵梭状芽胞杆菌用编码一个或多个基因的异源多核苷酸转化，所述一个或多个基因编码用于多糖糖化的糖解酶，其中所述基因以足以赋予所
述植物发酵梭状芽胞杆菌转化子与未转化的予植物发酵梭状芽胞杆菌相比增加的浓度、糖
化速率或单糖、二糖或寡糖的产率使多糖糖化为单糖、二糖或寡糖的能力的水平表达。宿主产生糖解酶以及该糖解酶随后释放入培养基，减少了降解生物质或多糖成为可发酵单糖和
寡糖所必需的商业酶的量。糖解DNA可以是宿主本身的，但更通常DNA是外来的，即外源
的。有利的糖解基因包括纤维素分解、木聚糖分解和淀粉降解酶，例如纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、葡糖苷酶和淀粉酶。糖解酶可以至少部分由宿主分泌，或者它可以大量地在细胞内累积以随后释放。有利地，热稳定的细胞内累积的酶可以在需要时通过热诱导的溶胞来
释放。酶的组合可以由异源DNA编码，一些异源DNA被分泌，而一些异源DNA被累积。

[0092] 在另一个实施方案中，可以做出其他修饰以增加重组微生物的终产物(例如乙醇)生成。在一个实施方案中，重组微生物可以进一步包含其他异源DNA区段，其表达产物
是参与单糖和/或寡糖转运进入重组宿主的蛋白。同样，来自糖解途径的其他基因可以被
加入宿主。以这种方式，可以实现增加的乙醇生成速率。

[0093] 为了提高发酵终产物(例如甲醇)的生成，可以在以下中进行修饰：转录调节子，用于形成有机酸的基因，碳水化合物转运基因，孢子形成基因，影响酶辅因子形成/再生的基因，影响乙醇耐受性的基因，影响盐耐受性的基因，影响生长速率的基因，影响氧耐受性的基因，影响代谢物阻遏的基因，影响氢生成的基因，影响对重金属耐受性的基因，影响对酸耐受性基因，或影响对醛耐受性的基因。

[0094] 本领域技术人员将理解可以对本文示例的方法进行许多修饰。例如，可以利用多种启动子来驱动异源基因在重组植物发酵梭状芽胞杆菌宿主中表达。受益于本公开内容的
技术人员能够容易选择和利用可用于此目的的各种启动子的任何一种。类似地，作为常规
偏好的问题，技术人员可以利用较高拷贝数的质粒。在另一个实施方案中，可以制备用于期望基因染色体整合的构建体。外来基因的染色体整合可以提供超过基于质粒的构建的几个
优点，基于质粒的构建对于商业化过程具有某些限制。产甲烷基因被染色体整合入大肠杆
菌B；参见Ohta等.(1991)Appl.Environ.Microbiol.57：893-900。一般而言，这通过DNA
片段的纯化来进行，所述DNA片段含有(1)来自抗生素抗性基因上游的期望基因和(2)来
自靶生物体的异源DNA的片段。该DNA可以被连接形成无复制子的环并用于转化。因此，
感兴趣的基因可以被引入异源宿主，例如大肠杆菌，并且短的随机片段可以被分离并连接
入植物发酵梭状芽胞杆菌以促进同源重组。

[0095] 在其他实施方案中，可以不使用重组DNA技术而获得可以表现出期望性质例如增加的生产率、增加的产率或增加的滴度的植物发酵梭状芽胞杆菌分离株。例如，可以通过化学方式或通过微生物辐射来进行诱变或随机诱变。然后，可以根据表现出一种或多种期望
性质的有益突变来筛选被诱变的微生物群体。筛选可以通过在含有将在发酵生产终产物的
过程中使用的碳源的底物上培养诱变微生物来进行。筛选还可以包括在生物体生长期间测
量终产物生成，或者测量碳源的消化或同化。如此获得的分离株可以进一步用重组多核苷
酸转化，或者与本文提供的任何方法和组合物组合使用，以进一步改善燃料生产。

[0096] 生物燃料厂和产生生物燃料的方法

[0097] 一方面，本文提供了包括用于水解包括高分子量碳水化合物的生物质材料的水解设备和用于容纳培养基和其中分散的微生物的发酵罐的燃料厂。在一个实施方案中，微生
物是植物发酵梭状芽胞杆菌。

[0098] 另一方面，本文提供了制备燃料或化学终产物的方法，包括在培养基中混合微生物(例如植物发酵梭状芽胞杆菌细胞或类似的C5/C6梭状芽胞杆菌种)和木质纤维素材料
(和/或其他生物质材料)，并在足以产生发酵终产物例如燃料(例如乙醇、丙醇、甲烷或
氢)的条件和时间下发酵木质纤维素材料。

[0099] 在一些实施方案中，提供了使用酸水解预处理从生物质产生发酵终产物(例如乙醇或氢)的方法。在一些实施方案中，提供了使用酶水解预处理从生物质产生发酵终产物
(例如乙醇或氢)的方法。在另一个实施方案中，提供了使用已经酶预处理的生物质从生物
质产生发酵终产物(例如乙醇或氢)的方法。在另一个实施方案中，提供了使用已经化学
或酶预处理但任选蒸汽处理的生物质从生物质产生发酵终产物(例如乙醇或氢)的方法。

[0100] 另一方面，本文提供了通过本文描述的任何方法制成的终产物。

[0101] 本领域技术人员将理解可以对本文示例的方法进行许多修饰。例如，可以利用多种启动子来驱动异源基因在重组微生物(例如植物发酵梭状芽胞杆菌)中表达。受益于本
公开内容的技术人员能够容易选择和利用可用于此目的的各种启动子的任何一种。类似
地，作为常规偏好的问题，技术人员可以利用较高拷贝数的质粒。在另一个实施方案中，可以制备用于期望基因染色体整合的构建体。外来基因的染色体整合可以提供超过基于质粒
的构建的几个优点，基于质粒的构建对于商业化过程具有某些限制。产甲烷基因被染色体
整合入大肠杆菌B；参见Ohta等.(1991)Appl.Environ.Microbiol.57：893-900。一般而
言，这通过DNA片段的纯化来进行，所述DNA片段含有(1)来自抗生素抗性基因上游的期望
基因和(2)来自靶生物体的异源DNA的片段。该DNA可以被连接形成无复制子的环并用于
转化。因此，感兴趣的基因可以被引入异源宿主，例如大肠杆菌，并且短的随机片段可以被分离并连接入植物发酵梭状芽胞杆菌以促进同源重组。

[0102] 从生物质大规模生产发酵终产物

[0103] 一方面，利用微生物例如植物发酵梭状芽胞杆菌从生物质大规模生产发酵终产物(例如乙醇)。在一个实施方案中，首先将包括高分子量碳水化合物的生物质材料水解为
低分子量碳水化合物，然后使用微生物细胞发酵低分子量碳水化合物以产生乙醇。在另一
个实施方案中，发酵生物质材料本身而无化学和/或酶预处理。在第一方法中，水解可以使用酸例如布朗斯台德酸(例如硫酸或盐酸)、碱例如氢氧化钠、热液处理、蒸汽爆发、氨纤维爆发处理(″AFEX″)、石灰处理、酶、或这些的组合来完成。如果需要，氢和其他发酵产物可以被捕获并纯化，或者例如通过燃烧而处理掉。例如，氢气可以被点燃，或者用作过程中的能源，例如以驱动蒸汽锅炉，例如通过燃烧。生物质的水解和/或蒸汽处理可以例如增加生物质的孔隙率和/或表面积，通常使纤维素材料更多暴露于微生物细胞，这可以增加发
酵速率和产率。木质素的去除可以例如提供用于驱动锅炉的燃料，并且还可以例如增加生
物质的孔隙率和/或表面积，经常增加发酵速率和产率。在一些实施方案中，培养基中碳水化合物的初始浓度大于20mM，例如大于30mM、50mM、75mM、100mM、150mM、200mM或甚至大于
500mM。

[0104] 生物质加工厂和从生物质产生产物的方法

[0105] 一方面，本发明特征为燃料厂，包括：用于水解包括高分子量碳水化合物的生物质材料的水解设备，用于容纳具有分散其中的C5/C6水解微生物(例如植物发酵梭状芽胞
杆菌)的培养基的发酵罐，和分离终产物与相关副产物和共产物的一个或多个产物回收系
统。

[0106] 另一方面，本发明特征为制备终产物的方法，包括混合C5/C6水解微生物(例如植物发酵梭状芽胞杆菌)和培养基中的生物质原料，并在足以产生生物燃料、化学产物或发
酵终产物(例如乙醇、丙醇、氢、木质素、萜类等)的条件和时间下发酵生物质材料。

[0107] 另一方面，本发明特征为通过本文描述的任何方法制成的发酵终产物。

[0108] 从生物质大规模生产发酵终产物

[0109] 一般而言，有两种基本方法利用C5/C6水解微生物(例如植物发酵梭状芽胞杆菌)从生物质大规模生产一种或多种发酵终产物。在所有方法中，根据生物质类型及其物理表
现，方法之一可以包括经由湿研磨或干研磨来磨碎含碳材料，以减少材料尺寸并增加表面
体积比(物理改性)。

[0110] 在一个实施方案中，包含高分子量碳水化合物的生物质材料被水解以使其脱木质素或者以分离碳水化合物和非碳水化合物。使用热、化学和/或酶处理的组合，水解的材料可以被分离以形成液体和脱水蒸汽，其可以被单独处理并保持分离或重新组合，然后使用
C5/C6水解微生物(例如植物发酵梭状芽胞杆菌)发酵低分子量碳水化合物以产生一种或
多种化学产物。在第二方法中，发酵生物质材料本身而无热、化学和/或酶预处理。在第一方法中，水解可以使用酸(例如硫酸或盐酸)、碱(例如氢氧化钠)、热液处理、氨纤维爆发
处理(″AFEX″)、石灰处理、酶、或这些的组合来完成。生物质的水解和/或蒸汽处理可
以例如增加生物质的孔隙率和/或表面积，常使纤维素材料更多暴露于C5/C6水解微生物
(例如植物发酵梭状芽胞杆菌)，这可以增加发酵速率和产率。生物质的水解和/或蒸汽处
理可以例如产生副产物或共产物，其可以被分离或处理以提高发酵速率和产率，或者用于
产能以驱动过程，或者经进一步加工或无需进一步加工而用作产品。木质素的去除可以例
如提供用于驱动锅炉的燃料。如果需要，发酵产物气体(例如甲烷、氢或CO2)、液体(例如
乙醇和有机酸)或固体(例如木质素)可以被捕获并纯化，或者例如通过燃烧处理掉。例
如，氢气可以被点燃，或例如通过燃烧用作过程中的能源以例如驱动蒸汽锅炉。从发酵罐排出的产物可以被进一步加工，例如乙醇可以被转移至蒸馏和精馏，产生浓缩的乙醇混合物，或者固体可被分离用于提供能源或作为化学产物。

[0111] 在一些实施方案中，预处理包括用酸预处理的步骤。在一些实施方案中，酸是稀酸。在一些实施方案中，酸处理在约85至140℃之间的升高温度下进行。在一些实施方案
中，方法还包括例如使用滤网回收酸处理的生物质固体。在一些实施方案中，滤网包括直径大约150-250微米的开口。在一些实施方案中，方法还包括用水或其他溶剂洗涤酸处理的
生物质。在一些实施方案中，方法还包括用碱中和酸。在一些实施方案中，方法还包括干燥酸处理的生物质。在一些实施方案中，干燥步骤在约15-45℃之间的升高温度下进行。在
一些实施方案中，分离的材料的液体部分被进一步处理以除去毒性材料。在一些实施方案
中，液体部分与固体分离，然后单独发酵。在一些实施方案中，从酸处理形成固体和液体的浆体，然后一起发酵。

[0112] 图11描绘通过用酸在升高的温度和压力下在水解设备中处理生物质而从生物质产生化学产物的方法的实例。生物质可以首先通过添加热水或蒸汽来加热。生物质可以通
过将气体二氧化硫鼓泡经过悬浮于水中的生物质或者通过添加强酸例如硫酸、盐酸或硝酸
来酸化，添加或不添加预热/预蒸汽/水。酸化过程中，pH保持在低水平，例如低于约5。
温度和压力可以在酸添加之后被升高。除了已经在酸化设备中的酸外，任选地，可以添加金属盐例如硫酸亚铁、硫酸铁、氯化铁、硫酸铝、氯化铝、硫酸镁或这些的混合物以辅助生物质的水解。含酸的生物质被添加入预处理设备的水解部分。蒸汽被注入预处理设备的水解部
分以直接接触并加热生物质至期望的温度。添加蒸汽之后的生物质温度在例如约130℃和
220℃。然后将水解产物排入预处理设备的闪蒸罐部分，并在罐内保持一段时间以进一步水解生物质成寡糖和单糖。也可以使用蒸汽爆发来进一步分解生物质。可选地，对于任何高
压预处理过程，生物质可以通过空气阀排放。然后水解产物从预处理反应器排放，添加或不添加水，例如固体浓度为约15％至60％。

[0113] 预处理之后，生物质可以被脱水和/或用一定量的水洗涤，例如通过挤压或通过离心，或者通过过滤，使用例如逆流提取器、压洗器、压滤器、压力过滤器、螺旋运输提取器或真空皮带提取器以除去酸化流体。经或不经进一步处理例如添加碱(例如石灰)和或氨
(例如磷酸铵)，酸化流体可以例如在预处理设备的酸化部分中被重复使用，或者被添加至
发酵，或者被收集用于其它用途/处理。产物可以衍生自酸化流体的处理，例如石膏或磷酸铵。酶或酶混合物可以在预处理期间添加以帮助高分子量组分的水解，例如对纤维素、半纤维素、果胶和淀粉组分活性的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶(CBH)、β-葡糖苷酶、糖苷水解酶、糖基转移酶、裂合酶和酯酶。

[0114] 发酵罐被添加水解的生物质、来自生物质预处理的任何液体级分、植物发酵梭状芽胞杆菌细胞的活性种子培养物、可能需要的辅助发酵微生物，例如酵母或大肠杆菌，和可能需要的促进植物发酵梭状芽胞杆菌或其他微生物生长的营养素。可选地，预处理的生物
质或液体级分可以被分入多个发酵罐，每个发酵罐含有不同菌株的植物发酵梭状芽胞杆菌
和/或其他微生物，并且每个发酵罐在特定物理条件下操作。允许发酵进行一段时间，例如约15至150小时，同时保持温度在例如约25℃至50℃。发酵期间产生的气体从发酵罐吹
扫并排放、收集或点燃，有或没有其他处理，例如氢气可以被收集并用作能源或纯化为共产物。

[0115] 发酵后，发酵罐内容物被转移至产物回收。产物被提取，例如乙醇通过蒸馏和精馏回收。

[0116] 无预处理从生物质化学生产

[0117] 图12描绘了通过将生物质装入发酵容器而从生物质产生化学品的方法。生物质可以被允许浸泡一段时间，添加或不添加热、水、酶或酸/碱。加工容器中的压力可以保持在大气压或之上。可以在预处理期末添加酸或碱以中和。在预处理期末，或者在预处理开
始的同时，添加C5/C6水解微生物(例如，植物发酵梭状芽胞杆菌)的活性种子培养物、可
能需要的辅助发酵微生物，例如酵母或大肠杆菌，和可能需要的促进C5/C6水解微生物(例
如，植物发酵梭状芽胞杆菌)生长的营养素。如上所述进行发酵。发酵后，发酵罐内容物被转移至如上所述的产物回收。

[0118] 可以使用化学生产方法和/或特征的任何组合以产生组合生产方法。在本文所述方法的任何一种中，产物可以在任何步骤被去除、添加或组合。C5/C6水解微生物(例如，植物发酵梭状芽胞杆菌)可以单独使用或者与一种或多种其他微生物(例如酵母、真菌或其
他细菌)组合协同使用。在一些实施方案中，不同方法可以用于单一工厂以产生不同终产
物。

[0119] 另一方面，本发明特征为包括用于水解包括高分子量碳水化合物的生物质材料的水解设备和用于容纳培养基和其中分散的C5/C6水解微生物(例如，植物发酵梭状芽胞杆
菌)的发酵罐的燃料厂。

[0120] 另一方面，本发明特征为制备燃料的方法，包括在培养基中混合C5/C6水解微生物(例如，植物发酵梭状芽胞杆菌)和木质纤维素材料(和/或其他生物质材料)，并在足以
产生燃料例如乙醇、丙醇和/或氢或另一种化合物的条件和时间下发酵木质纤维素材料。

[0121] 在一些实施方案中，本发明提供了使用酸水解预处理从生物质生产乙醇和氢的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用酶水解预处理从生物质生产乙醇和氢的方法。其他实施方案提供了使用未经酶预处理的生物质从生物质生产乙醇和氢的方法。其他实施方
案公开了使用已经化学或酶预处理但任选蒸汽处理的生物质从生物质产生乙醇和氢的方
法。

[0122] 图10公开了产生己糖或戊糖或寡聚体的预处理，其然后不经处理或进一步处理并单独或一起发酵。图10A描绘了产生固相和液相的方法(例如酸预处理)，其然后被单独
发酵。图10B描绘了产生固相和液相的类似预处理。液相与固相分离，并且对于发酵微生
物毒性的成分在发酵之前被去除。在发酵开始时，两相被重新组合并在一起共发酵。这是
比单独发酵每个相更有经济效益的方法。第三方法(图10C是成本最低的)。预处理产生
液体或固体的浆体，其然后被共发酵。存在很少的糖分损失和最小的设备需求。
实施例

[0123] 实施例1：生物质加工和预处理程序

[0124] 玉米秸秆在切碎机中切碎至0.25英寸大小，然后通过2mm滤网筛选。筛选的玉米秸秆与水混合以制备10％(w/v)浆体。玉米秸秆浆体的碱消化在高压釜中121℃和15PSI
下使用0.2g NaOH每克玉米秸秆进行2小时。

[0125] 消化的玉米秸秆用自来水(5-7体积)洗涤以中和pH。中和后，固体通过250微米滤网过滤回收并在35摄氏度干燥至湿量约5％。干燥的团簇在添加至发酵罐之前被研磨。

[0126] 培养基的脱气和灭菌程序：

[0127] 所有用于接种物繁殖的血清瓶在室温下真空(约400mbar绝对压力)脱气约5分钟，在氮气吹扫下真空破碎。进行最少三个脱气循环。血清瓶、培养基和发酵容器通过在
121℃温度和15PSI压力下高压灭菌来灭菌。发酵罐在接种之前用氮气吹扫1小时以降低
氧化还原电势至大约-300mV。

[0128] 接种物繁殖：

[0129] 植物发酵梭状芽胞杆菌的冷冻培养物将在含有0.3％纤维素二糖和在去离子水中的1.5g/L KH2PO4、2.9g/L K2HPO4、4.6g/L硫酸铵、2g/L半胱氨酸-HCl、1g/L MgCl2 6H2O、
0.15g/L CaCl2 2H2O、0.00125g/L FeSO4 7H2O的10mL管中35℃下繁殖48小时。用2N NaOH
调节培养基的pH至7.5。在测试管中繁殖后，接种物将在100mL血清瓶中35℃生长24小时，
使用2％(v/v)种子量。血清瓶具有在去离子水中的20g/L麦芽糖浆、1.5g/L KH2PO4、2.9g/L K2HPO4、4.6g/L硫酸铵、2g/L半胱氨酸-HCl、3g/L柠檬酸钠、1g/L MgCl2 6H2O、0.15g/L CaCl2 2H2O、0.00125g/L FeSO4 7H2O。

[0130] 生物质的同时水解和发酵：

[0131] 5L搅拌的罐反应器以补料分批模式以2L起始体积运行。培养基含有50g/L预处理的玉米秸秆以及溶解于去离子水的3g/L K2HPO4、1.6g/L KH2PO4、2g/L柠檬酸钠·2H2O、
1.2g/L柠檬酸H2O、0.5g/L(NH4)2SO4、1g/L NaCl、0.8g/L MgCl2·6H2O、0.1g/L CaCl2·2H2O、
0.00125g/L FeSO4·7H2O、1g/L半胱氨酸HCl、10g/L酵母提取物(Bacto)以及5g/L玉米浆
粉。

[0132] 在一些情况下，50mL CelluSeb-TL在接种之前通过0.2微米滤器添加至发酵罐以增强水解并增加产率。然后发酵罐用氮气吹扫1小时以降低氧化还原电势至大约-300mV，
随后接种20ml浓缩接种物。运行pH和温度分别是6.5和35℃，并且发酵罐以300rpm连续
搅拌。

[0133] 25-50g预处理的玉米秸秆的团块以规律的时间间隔提供。7.5和25mL酶的额外剂在接种后72小时和240小时提供。

[0134] 样品收集和分析：

[0135] 样品以时间间 隔收集并使用装 配有Aminex HPX-87H Exclusion柱(300mmx7.8mm)和RI检测器的HPLC分析糖、有机酸和乙醇。0.01N H2SO4用作流动相，0.6mL/分钟，并且柱保持在55℃。

[0136] 结果

[0137] 发酵开始于添加50g/L固体。额外批量补料25g/L预处理的玉米秸秆固体在第3天和第4天进行。发现初始乙醇生产率是约10g/L-d，这在不进一步添加玉米秸秆的情况
下在第4天至第8天下降至约2g/L-d。从第9天开始，固体批量补料量减至12.5g/L，并每
24小时提供，如图1所示。这帮助提高乙醇生产率至高于3g/L-d。

[0138] 乙醇是主要的发酵产物。预处理玉米秸秆的组成分析使用酸分析进行。组成分析结果显示葡聚糖、木聚糖、阿拉伯聚糖和不溶物的百分比分别是64％、26％、3％和6％(图
2)。基于该组成，在预处理玉米秸秆中可发酵的量是约93％。假设糖化效率是90％，观察
的乙醇产率被计算为每克加载的生物质0.39g。

[0139] 实施例2从己糖和戊糖生产乙醇

[0140] 通过使用植物发酵梭状芽胞杆菌在搅拌的罐反应器中同时发酵己糖(葡萄糖、纤维素二糖)和戊糖(木糖和阿拉伯糖)来进行分批发酵以生产乙醇。

[0141] 使用的化学品：

[0142] 该实验中使用的所有化学品是试剂级，来自Sigma-Aldrich。

[0143] 脱气和灭菌程序：

[0144] 所有用于接种物繁殖的反应器和血清瓶在室温下真空(约400mbar绝对压力)脱气约5分钟，在氮气吹扫下真空破碎。进行最少三个脱气循环。容器通过在121℃温度和
15PSI压力下高压灭菌来灭菌。

[0145] 接种物繁殖：

[0146] 植物发酵梭状芽胞杆菌的冷冻培养物将在含有0.3％纤维素二糖和在去离子水中的1.5g/L KH2PO4、2.9g/L K2HPO4、4.6g/L硫酸铵、2g/L半胱氨酸-HCl、1g/L MgCl2 6H2O、
0.15g/L CaCl2 2H2O、0.00125g/L FeSO4 7H2O的10mL管中35℃下繁殖48小时。用2N NaOH
调节培养基的pH至7.5。在高压灭菌后，接种物在100mL血清中35℃生长24小时，使用2％
(v/v)种子量。血清瓶含有在去离子水中的20g/L麦芽糖浆、1.5g/L KH2PO4、2.9g/L K2HPO4、
4.6g/L硫酸铵、2g/L半胱氨酸-HCl、3g/L柠檬酸钠、1g/L MgCl2 6H2O、0.15g/L CaCl2 2H2O、
0.00125g/L FeSO4 7H2O。扩增的接种物被检查纯度并在3000rpm离心15分钟以产生10mL
浓缩的生物质(2-4g/L总悬浮固体)以用作每个发酵罐的接种物。

[0147] 己糖和戊糖的同时发酵：

[0148] 400mL工作体积的两个搅拌罐反应器以分批模式运行。在生物反应器BR1中，30g/L纤维素二糖和30g/L木糖用作碳源，以及溶于去离子水的3g/L K2HPO4、1.6g/L KH2PO4、2g/L柠檬酸钠·2H2O、1.2g/L柠檬酸H2O、0.5g/L(NH4)2SO4、1g/L NaCl、0.8g/L MgCl2·6H2O、
0.1g/L CaCl2·2H2O、0.00125g/L FeSO4·7H2O、1g/L半胱氨酸HCl、10g/L酵母提取物
(Bacto)以及5g/L玉米浆粉。第二反应器BR2含有作为碳源的30g/L的葡萄糖和30g/L的
木糖，以及与BR1相同的营养素。每个发酵罐接种10ml接种物。发酵罐在35℃和pH 6.5
下运行，并300rpm连续搅拌。

[0149] 样品以不同的时间间隔收集并使用装配有Aminex HPX-87H Exclusion柱(300mmx7.8mm)和RI检测器的HPLC分析糖、有机酸和乙醇。0.005N H2SO4用作流动相，
0.6mL/分钟，并且柱保持在55℃。

[0150] 显示于表1和图3A和3B的结果描绘了在发酵过程中己糖和戊糖底物的充分利用和这些底物转化为乙醇。结果还表明，戊糖(例如木糖)至少与己糖(例如纤维素二糖或
葡萄糖)一样快速且完全地转化为乙醇。

[0151] 表1.糖和乙醇的浓度

[0152]

[0153] BR1和BR2发酵运行的标准化碳水化合物利用结果描绘于图7，这允许不同碳源之间更直接的比较。图7进一步表明戊糖碳水化合物(例如木糖)至少与己糖碳水化合物
(例如纤维素二糖或葡萄糖)一样被转化为乙醇。

[0154] 实施例3.从淀粉、纤维素二糖和木糖生产乙醇

[0155] 通过使用植物发酵梭状芽胞杆菌同时发酵己糖(葡萄糖、纤维素二糖)和戊糖(木糖和阿拉伯糖)来进行分批发酵以生产乙醇。

[0156] α-1，4-联葡聚糖(淀粉)、β-1，4-联葡聚糖(纤维素二糖)和木糖的10g/L混合物与植物发酵梭状芽胞杆菌衍生菌株在35℃孵育48小时。显示于图5和下表2的发酵
结果指示生物体能够同时利用和转化所有三种碳源成为乙醇。

[0157] 表2.糖和乙醇的浓度

[0158]

[0159] 实施例4.从己糖(葡萄糖)和戊糖(木糖、阿拉伯糖)生产乙醇

[0160] 通过使用植物发酵梭状芽胞杆菌发酵己糖(葡萄糖)或戊糖(木糖、阿拉伯糖)来进行分批发酵以生产乙醇。

[0161] 设定分批发酵反应以测试从不同碳水化合物底物生产乙醇。准备包含木糖、葡萄糖和阿拉伯糖的发酵培养基。然后得到的培养基与植物发酵梭状芽胞杆菌衍生菌株在35℃
孵育48小时。显示于图6的发酵结果指示生物体能够有效和快速利用所有三种碳源，并且
生物体能够在约48小时内产生至少约25-30g/L的乙醇。

[0162] 实施例5.从淀粉、微晶纤维素、木聚糖和纤维素二糖生产乙醇

[0163] 通过使用植物发酵梭状芽胞杆菌发酵己糖(淀粉、微晶纤维素、纤维素二糖)或戊糖(木聚糖)来进行分批发酵以生产乙醇。

[0164] 设定分批发酵反应以测试从不同碳水化合物底物生产乙醇。测试了四种不同的发酵培养基，包含：1)30g/L木聚糖，2)30g/L淀粉，3)30g/L Avicel微晶纤维素(AVC)，和20g/L纤维素二糖。然后得到的培养基与植物发酵梭状芽胞杆菌衍生菌株在35℃孵育48小时。
显示于图7和表3的发酵结果指示生物体能够有效和快速将所有四种碳源转化成乙醇，微
晶纤维素的转化表现出最慢的乙醇生产率，随后是木聚糖、纤维素二糖和淀粉。

[0165] 表3.48小时的底物消耗速率

[0166]底物 48小时 120小时 最大速率 产率
g/l初始 g/l乙醇 g/l乙醇 g/l/h g EtOH/g底物
木聚糖 30 5.5 7.61 0.15 0.25
淀粉 30 9.99 11.12 0.35 0.37
Avicel 30 1.29 4.49 0.03 0.15
纤维素二糖 20 8.68 8.96 0.33 0.45

[0167] 实施例6.植物发酵梭状芽胞杆菌遗传修饰以产生增加的生物燃料，包括乙醇

[0168] 适用于植物发酵梭状芽胞杆菌的质粒使用获自细菌培养收集物的部分质粒构建。质粒pIMP1是可以在大肠杆菌以及一系列革兰氏阳性细菌种中复制的非接合质粒，并且它
编码对红霉素的抗性。野生型植物发酵梭状芽胞杆菌对红霉素高度敏感。野生型植物发
酵梭状芽胞杆菌在每毫升微生物培养基0.5微克红霉素的浓度下不生长。光谱宿主范围
接合质粒RK2含有细菌接合系统所需基因的全部，细菌接合系统包括：对接合系统的DNA
聚合酶特异性的复制起点，接合的DNA复制基因，和编码实现潜在受体细菌细胞识别并用
作经过它单链质粒DNA通过细胞-细胞接触从供体转移至受体细胞的导线的菌毛合成的
基因。RK2接合系统的转移起点获自质粒pRK29O，其作为DSM 3928获自德国微生物和细
胞培养物保藏中心(DSMZ)，并且RK2的其他接合功能获自pRK2013，其作为DSM 5599获自
DSMZ。聚合酶链式反应用于扩增来自pRK29O的112个碱基对的转移区起点(oriT)，使用在
oriT区两翼添加Cla1限制位点的引物。该DNA片段被插入pIMP1的Cla1位点以产生质粒
pIMPT。聚合酶链式反应被用于扩增来自植物发酵梭状芽胞杆菌染色体的醇脱氢酶基因植
物发酵梭状芽胞杆菌1029的启动子，并且它用于替代pIMPT的红霉素基因的启动子以产生
pIMPT1029。当还存在提供接合功能的pRK2013时，pIMPT1029可以从大肠杆菌接合转移至
植物发酵梭状芽胞杆菌。质粒DNA成功转移入植物发酵梭状芽胞杆菌通过含有pIMPT1029
的植物发酵梭状芽胞杆菌衍生物在每毫升含有最多10毫克红霉素的培养基上生长的能力
来证明，并通过使用PCR引物特异性扩增来自植物发酵梭状芽胞杆菌衍生物而非不含质粒
的对照植物发酵梭状芽胞杆菌培养物的pIMPT1029特异性的两个基因区来证明。

[0169] 实现pIMPT1029从大肠杆菌接合转移至植物发酵梭状芽胞杆菌的方法包括首先构建含有pIMPT1029和pRK2013的大肠杆菌菌株(DH5α)。获得了该大肠杆菌培养物的新
细胞和植物发酵梭状芽胞杆菌受体培养物的新细胞。然后将两种细菌培养物离心产生细胞
10
沉淀，沉淀重悬于相同培养基中以获得浓缩约10倍并具有约10 细胞/ml细胞密度的细
胞悬液。然后这些浓缩细胞悬液被混合以实现5∶1的供体∶受体比。该细胞悬液被涂
到QM1琼脂板上并在30摄氏度厌氧孵育24小时。然后从QM1板取出细胞混合物并放入含
有针对表达红霉素抗性的植物发酵梭状芽胞杆菌受体细胞选择的抗生素的固体或液体QM1
培养基。这通过使用由20毫克/ml三甲氧苄二氨嘧啶、250毫克/ml环丝氨酸和10毫克/
ml红霉素组成的抗生素组合来实现。大肠杆菌供体在暴露于这些浓度的三甲氧苄二氨嘧啶
和环丝氨酸时不能存活，而野生型植物发酵梭状芽胞杆菌受体在暴露于该浓度的红霉素时
不能存活(但能够耐受这些浓度的三甲氧苄二氨嘧啶和环丝氨酸)。因此，这些含抗生素的
平板或液体培养基在厌氧条件下30摄氏度孵育5至7天后，获得了红霉素抗性的植物发酵
梭状芽胞杆菌衍生物，并且这些植物发酵梭状芽胞杆菌衍生物随后通过PCR分析证明显示
含有pIMPT1029。

[0170] 惊人的结果是，只有特别构建的含有来自醇脱氢酶基因的植物发酵梭状芽胞杆菌启动子的红霉素抗性基因的衍生物可以在植物发酵梭状芽胞杆菌中功能性表达。

[0171] 来自植物发酵梭状芽胞杆菌或来自异源的其他感兴趣基因将被引入pIMPT构建体并用于转化植物发酵梭状芽胞杆菌。用于转化植物发酵梭状芽胞杆菌的基因包括表达增
加植物发酵梭状芽胞杆菌对乙醇、酸性pH或生物燃料生产过程中遇到的其他毒性中间体
环境耐受的那些基因。

[0172] 质粒pIMPT1029的图谱在图11提供，该质粒的DNA序列提供为SEQ ID NO：1。

[0173] SEQ ID NO：1：

[0174] gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttac
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[0175] 虽然本发明优选实施方案已经在本文显示和描述，但对于本领域技术人员明显的是，这些实施方案仅作为实例被提供。现在，本领域技术人员会想到不背离本发明的许多改变、变化和替代。应该理解，对本文描述的本发明实施方案的各种替代可用于实施本发明。
预期以下权利要求限定了本发明的范围，并且这些权利要求范围内的方法和结构及其等同
物被涵盖在权利要求中。