[0001] 本发明涉及一种用于检测类/抗维甲酸化合物的双杂交酵母以及生物测试方法，具体的说是涉及一种利用酵母双杂交技术获得的包含重组维甲酸X受体基因的双杂交酵母，以及利用该酵母来检测类/抗维甲酸化合物，特别是环境中的类/抗维甲酸化合物的生物测试方法。

[0002] 环境中的内分泌干扰物，亦被称为环境激素，是指人类在生产、生活过程中释放到环境中的某些有毒化学物质，它们与人体和动物体内的激素具有类似的化学结构，并能够产生类似激素的作用。它们进入体内，扰乱了激素的正常分泌，使人和动物的生理过程发生紊乱，导致生殖、免疫等功能发生障碍。环境中的内分泌干扰物的干扰效应包括：雌激素干扰效应、雄激素干扰效应、维甲酸干扰效应等。维甲酸(retinoic acid，RA)也称为视黄酸，是指天然或人工合成的维生素A的衍生物，具有重要生理活性，特别是对生物体的胚胎发育、器官形成、生殖等具有重要作用。已经发现持久性有毒有机污染物(POPs)的暴露与生物体内维甲酸平衡的破坏相关，尽管这类具有维甲酸干扰活性的化合物在环境中浓度极小，但是其一旦进入人体和动物体内，可以与特定的维甲酸受体结合形成复合物，启动/抑制下游基因的表达，干扰内分泌系统的正常功能。90年代对维甲酸X受体作用机制的研究进一步发现了维甲酸X受体的共激活因子(coactor)，并建立了新的受体作用理论(参见，Hong，H.，Kohlit，K.，Trivedit，A.，Deborah，L.，Johnson，D.L.和Stallcup，M.R.，1996，Natl.Acad.Sci.USA.93：4948-4952)。该理论认为，维甲酸(或者环境中类/抗维甲酸物质)与相应维甲酸X受体的配体结合区(LBD) 结合后引起构象改变，进一步结合共激活因子，促进转录。

[0003] 对环境中维甲酸干扰效应的研究刚刚起步，目前报道应用较多的为化学分析和生物测试方法。化学分析需要高分辨色谱/高分辨质谱，除了分析费用高外，对仪器设备条件和人员素质有相当严格的要求。另外一种广泛采用的是利用重组维甲酸X受体酵母菌(Yeast Estrogen Screen，YES)进行测试，这种测试利用的是重组维甲酸X受体及受体共激活因子TIF2构建的双杂交酵母(参见，Nishikawa，J.I.，Mamiya，S.，2004，Environ.Sci.Technol.38：6271-6276)。目前，通常采用报道基因的方法指示外界干扰、如化合物暴露等对基因转录的影响。在双杂交酵母方法中，通常采用的LacZ基因是一种常用的编码β-半乳糖苷酶的报道基因，其产物β-半乳糖苷酶具有强的酶催化活性，能够与特定底物反应生成新的有色化合物，易于检测。因此，通过简单测定β-半乳糖苷酶的活性，就能够表征对基因转录的影响。Nishihara等报道的双杂交酵母方法采用的是Y190酵母菌株作为载体，随着技术的发展采用Y187(含有双拷贝数的编码β-半乳糖苷酶的LacZ基因)酿酒酵母菌株作为载体，由于其高的β-半乳糖苷酶表达量，则更能提高整个方法的灵敏度与准确性，减少假阳性或假阴性结果的产生。

[0004] 本发明的目的在于构建一种用于检测样品中类/抗维甲酸化合物的双杂交酵母，在此基础上建立一种检测类/抗维甲酸化合物的生物测试方法。该检测方法快速简便，成本低廉，省时省力，应用广泛，所需样品量少。

[0005] 本发明是通过下述方案实现的：

[0006] 本发明的一个方面提供了一种用于检测环境样品中的类/抗维甲酸化合物的双杂交酵母，其中，该酵母中含有pGBT9-RXR酵母表达质粒和pGAD424-GRIP1酵母表达质粒，并且所述pGBT9-RXR酵母表达质粒包含维甲酸X的受体基因，pGAD424-GRIP1酵母表达质粒包含具有如SEQ IDNo.2所示序列的维甲酸X受体共激活因子基因片段。

[0007] 优选地，所述维甲酸X受体基因为鼠维甲酸X受体基因或具有如SEQID No.1所示序列的鼠维甲酸X受体基因片段。

[0008] 所述的双杂交酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)RXR-GRIP1，其保藏编号为：CGMCC No.2305。该酵母已于2007年12月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编100101)进行了生物材料保藏。

[0009] 优选地，所述类维甲酸化合物选自天然维甲酸化合物、有机锡化合物、酚类化合物或其代谢后具有酚类结构的化合物、邻苯二甲酸酯类化合物、有机氯农药类化合物中的一种或几种，所述抗维甲酸化合物选自酚类化合物或其代谢后具有酚类结构的化合物、邻苯二甲酸酯类化合物、有机氯农药类化合物中的一种或几种。

[0010] 本发明的另一个方面还提供了一种制备双杂交酵母的方法，其中，该方法包括以下步骤：

[0011] (1)纯化包含维甲酸X受体基因的pGBT9-RXR酵母表达质粒；

[0012] (2)纯化包含维甲酸X受体共激活因子基因的pGAD424-GRIP1酵母表达质粒；

[0013] (3)构建双杂交酵母，用所述的pGBT9-RXR质粒和所述的pGAD424-GRIP1质粒转化进入酵母细胞中，形成双杂交酵母，此处的酵母细胞优选Y187酿酒酵母细胞。

[0014] 具体而言，pGBT9-RXR酵母表达质粒用pGBT9-RXR(日本大阪大学Nishikawa教授惠赠。参见Nishikawa，J.I.，Mamiya，S.，2004，Environ.Sci.Technol.38：6271-6276)转化感受态大肠杆菌，在含有氨苄青霉素的培养基中筛选阳性克隆，提取质粒并纯化。

[0015] pGAD424-GRIP1酵母表达质粒用pGAD424-GRIP1(美国加州大学Stallcup教授惠赠。参见Li，H.W.，Kim，J.H.，Koh，S.S.，Stallcup，M.R.2003.J.Biol.Chem.Biol.279(6)：4212-4220.)转化感受态大肠杆菌，在含有氨苄青霉素的培养基中筛选阳性克隆，提取质粒并纯化。

[0016] 优选地，所述的形成双杂交酵母之后还筛选所述的双杂交酵母。

[0017] 所述的筛选所述的双杂交酵母优选是采用营养缺陷型筛选和菌落转移滤膜分析相结合的方法筛选所述双杂交酵母。

[0018] 所述的菌落转移滤膜分析优选是采用添加维甲酸的X-gal缓冲液的菌落转移滤膜分析。具体而言，在上述方法中，构建双杂交酵母时，同时加入pGBT9-RXR质粒和pGAD424-GRIP1质粒混合均匀，并加入感受态Y187酿酒酵母细胞孵育，得到双杂交酵母。

[0019] 所 述 维 甲 酸 优 选 为 9-顺 维 甲 酸，所 述X-gal 缓 冲 液 优 选 为-120mg·mL 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的二甲基甲酰胺溶液。

[0020] 所述营养缺陷型筛选中采用的培养基优选为不添加亮氨酸和色氨酸的SD培养基，(即SD/-Trp/-Leu)其中包含20mg/L腺嘌呤半硫酸盐、20mg/L盐酸精氨酸、20mg/L一水合盐酸组氨酸、30mg/L异亮氨酸、30mg/L盐酸赖氨酸、20mg/L甲硫氨酸、50mg/L苯丙氨酸、200mg/L苏氨酸、30mg/L酪氨酸、20mg/L尿嘧啶、150mg/L缬氨酸和6.7g/L无氨基酸酵母氮源。

[0021] 具体而言，在上述方法中，筛选双杂交酵母时，采用营养缺陷型筛选和菌落转移滤膜分析相结合的方法筛选双杂交酵母，双杂交酵母通过营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu)粗筛出阳性菌落，进一步使用菌落转移滤膜分析方法，将菌落影印到无菌的1#干燥滤膜上，液氮反复冻融，破碎细胞；将1#滤膜置于含维甲酸的X-gal缓冲液的2#滤膜上，30℃孵育至出现明显蓝色菌落，将显色菌落继续培养备用。

[0022] 本发明的再一个方面还提供了一种利用所述的双杂交酵母检测环境中类维甲酸化合物的生物测试方法，该方法包括如下步骤：

[0023] (1)首先将所述双杂交酵母细胞分别接种于已知系列浓度维甲酸培养液，形成菌液，暴露培养2-4小时；

[0024] (2)暴露培养结束后，向菌液中加入邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液进行反应30-60分钟，检测上清液在420nm处的吸光度值，并以此作为表示β-半乳糖苷酶活性的参数；

[0025] (3)根据所述的系列浓度维甲酸相对于它所对应的β-半乳糖苷酶活性的参数绘制β-半乳糖苷酶活性的诱导剂量-效应关系标准曲线；

[0026] (4)将所述双杂交酵母细胞与待测样品共培养，加入邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液进行反应，终止反应后检测反应上清液在420nm处的吸光度值，对照所述的诱导剂量-效应关系标准曲线计算出待测样品中类维甲酸化合物的含量。

[0027] 优选地，所述的待测样品优选为环境样品中的有机溶剂提取液，其中的类维甲酸-9 -7化合物浓度为10 ～10 mol/L。

[0028] 优选地，绘制诱导标准曲线具体步骤为：将维甲酸溶解到二甲基亚砜(DMSO)中，此处的维甲酸优选9-顺维甲酸，制备一系列的9-顺维甲酸标准浓度反应液，浓度范围-7 -12×10 ～2×10 mol/L，按照0.5％的比例添加9-顺维甲酸标准浓度反应液到双杂交酵母细胞菌液中，制备暴露液；将暴露液接种至96孔板中(200μL/孔)；30℃培养2小时后检测600nm处的吸光度值；再将含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液加入到96孔板中；30℃下充分反应后，添加1mol/L的碳酸钠溶液终止反应；在420nm处用分光光度计检测终产物邻硝基酚钠的吸光度值，并以此作为表示β-半乳糖苷酶的参数，绘制9-顺维甲酸对双杂交酵母细胞的β-半乳糖苷酶活性诱导的剂量-效应关系标准曲线。

[0029] β-半乳糖苷酶活性u的计算公式如下：u＝(AS-AB)/t·V·D·ODS，式中，u为β-半乳糖苷酶活性；t为反应时间(min)；V为测试体积(mL)；D为稀释因子；ODS为测试样品在595nm处的吸光度值；AS为测试样品在420nm处的吸光度值OD420；AB为空白对照在420nm处的吸光度。

[0030] 所述检测样品的具体步骤为：按照0.5％的比例添加二甲基亚砜(DMSO)溶解的待测样品到含有双杂交酵母细胞的菌液中，制备暴露液；暴露液接种至96孔板中(200μL/孔)；30℃培养2小时后检测600nm处的吸光度值；再将含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半-1乳糖苷的反应液加入到96孔板中；30℃下充分反应后，添加1mol·L 的碳酸钠溶液终止反应；在420nm处用分光光度计检测终产物邻硝基酚钠的吸光度值，来检测待测化合物是否具有维甲酸X受体诱导活性，即将测得的结果与上述标准曲线比较，进而可以计算出环境样品中类维甲酸化合物的含量，从而评价环境中类维甲酸化合物的毒性效应。

[0031] 本发明的再一个方面还提供了一种利用所述的双杂交酵母检测抗维甲酸化合物的生物测试方法，该方法具体包括如下步骤：

[0032] (1)首先将双杂交酵母细胞分别与接种于已知系列浓度的抗维甲酸化合物培养液，形成菌液，并向所述的菌液中添加已知浓度维甲酸，共培养2-4小时；

[0033] (2)培养结束后，向菌液中加入邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷反应液进行反应，直到菌液出现黄色，检测上清液在420nm处的吸光度值，并以此作为表示β-半乳糖苷酶活性的参数；

[0034] (3)根据所述的系列浓度的抗维甲酸化合物相对它所对应的β-半乳糖苷酶活性的参数绘制β-半乳糖苷酶活性诱导的剂量-效应关系标准曲线；

[0035] (4)将所述的菌液与待测样品共培养，加入邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷反应液进行反应，终止反应后检测反应上清液在420nm处的吸光度值，对照步骤(3)制定的标准曲线计算出样品中抗维甲酸化合物的含量。

[0036] 优选地，在所述步骤(1)中，所述的维甲酸为9-顺维甲酸，浓度为5×10-7～-65×10 mol/L。

[0037] 优选地，待测样品为环境样品中的有机溶剂提取液，其中抗维甲酸化合物浓度为-8 -510 ～10 mol/L。

[0038] 优选地，在步骤(1)中，将所述的双杂交酵母细胞接种前，调节维甲酸培养液在600nm处的吸光度值为0.1～0.2，并且在步骤(2)培养结束后，调节菌液在600nm处的吸光度值为0.7～0.8。

[0039] 具体而言，在上述检测环境中抗维甲酸化合物的生物测试方法中，双杂交酵母细胞的培养方法为：将上述的双杂交酵母细胞接种到不添加亮氨酸和色氨酸的SD培养基，(即SD/-Trp/-Leu)中，检测菌液600nm处的吸光度值为0.1～0.2，30℃培养24小时后调整酵母菌液600nm处的吸光度值为0.7～0.8。

[0040] 绘制诱导标准曲线具体步骤为：将9-顺维甲酸溶解到二甲基亚砜(DMSO)中，制备-39-顺维甲酸标准浓度反应液(1×10 mol/L)；将维甲酸抑制剂五氯酚溶解到DMSO中，制备-7 -1
一系列的五氯酚标准浓度反应液(浓度范围2×10 ～2×10 mol/L)，按照0.5％的比例添加9-顺维甲酸和五氯酚标准浓度反应液到RXR-GRIP1酵母菌液中，制备暴露液；将暴露液接种至96孔板中(200μL/孔)；30℃培养2-4小时后检测600nm处的吸光度值；再将含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液加入到96孔板中；30℃下充分反应后，添加1mol/L的碳酸钠溶液终止反应；在420nm处用分光光度计检测终产物邻硝基酚钠的吸光度值，并以此作为表示β-半乳糖苷酶的参数，绘制五氯酚对双杂交酵母细胞RXR-GRIP1的β-半乳糖苷酶活性抑制的剂量-效应关系标准曲线。

[0041] 所述的检测样品的具体步骤为：按照0.5％的比例添加9-顺维甲酸和二甲基亚砜(DMSO)溶解的待测样品的双杂交酵母细胞RXR-GRIP1菌液中，制备暴露液；暴露液接种至96孔板中(200μL/孔)；30℃培养2小时后检测600nm处的吸光度值；再将含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液加入到96孔板中；30℃下充分反应后，添加1mol/L的碳酸钠溶液终止反应；在420nm处用分光光度计检测终产物邻硝基酚钠的吸光度值，来检测待测化合物是否具有维甲酸X受体抑制活性，即将测得的结果与上述标准曲线比较，进而可以计算出环境样品中抗维甲酸化合物的含量，从而评价环境中抗维甲酸化合物的毒性效应。

[0042] 本发明提供的用于检测环境样品中类/抗维甲酸化合物的双杂交酵母以及生物检测方法的优益之处在于：1)本发明的双杂交酵母细胞RXR-GRIP1能够同时表达维甲酸X受体蛋白、维甲酸X受体共激活因子蛋白，支持最新的受体作用理论，最能模拟哺乳动物细胞内维甲酸X受体的作用机制，采用Y187酿酒酵母细胞作为载体，表达基因产生的β-半乳糖苷酶的酶活性大大增强，易于检测，很适合作为化合物毒性筛选、环境样品类/抗维甲酸效应评价方面的试验研究；2)酵母细胞试验快速、简便可以对大量环境样品或化学物质的内分泌干扰物效应进行前期筛选，为活体试验提供基础数据支持，弥补了活体试验试验-6 -1周期长，费用高的不足；3)添加9-顺维甲酸(5×10 mol.L )的X-gal缓冲液在菌落转移滤膜分析中的应用，大大的缩短了操作时间，相当程度上减轻了假阳性结果干扰的可能性；
4)利用SD/-Trp/-Leu营养缺陷型培养基进行酵母培养，能够有效防止双杂交酵母细胞的回复突变，减轻传代过程中质粒丢失的情况，使得双杂交酵母细胞的蛋白表达稳定，试验测试结果之间的平行性较好；5)利用重组维甲酸X受体基因双杂交酵母进行类维甲酸污染物的筛选和毒性毒理研究时，致毒机理明确，操作简便，省时省力，所需样品量少，成本低廉；
6)本发明重组了几乎全长的维甲酸X受体共激活因子GRIP1基因(＞99％)，能够更好的与维甲酸X受体反应，增强β-半乳糖苷酶的酶活性，提高反应灵敏度。7)本发明同时检测了环境样品中的类维甲酸化合物和抗维甲酸化合物，与类维甲酸化合物的单因素检测相比能够更全面的反映环境样品对维甲酸X受体的干扰作用；8)与Nishikawa文献(参见，Nishikawa，J.I.，Mamiya，S.，2004，Environ.Sci.Technol.38：271-6276)报道克隆维甲酸X受体共激活因子TIF2基因片段，采用酵母细胞Y190作为载体细胞不同的是，本发明克隆维甲酸X受体共激活因子GRIP1基因或基因片段(＞99％)采用酿酒酵母细胞Y187构建双杂交酵母，因此在测定环境化合物的维甲酸干扰效应时具有更高的灵敏度和反应活性，RXR-GRIP1酵母诱导的最大酶活性值是RXRβ-TIF2酵母诱导的最大酶活性值的3.4倍。
附图说明

[0043] 图1表示9-顺维甲酸对酿酒酵母CGMCC No.2305以及RXR-TIF2酵母酶活性诱导的剂量-效应关系标准曲线的比较。其中横坐标是9-顺维甲酸浓度，纵坐标是9-顺维甲酸诱导的β-半乳糖苷酶活性；其中□表示9-顺维甲酸对RXR-TIF2酵母诱导效应；■表示9-顺维甲酸对酿酒酵母CGMCC No.2305诱导效应。

[0044] 图2表示五氯酚对9-顺维甲酸(5×10-6mol/L)诱导酿酒酵母CGMCCNo.2305活性抑制的剂量-效应关系标准曲线。其中横坐标是五氯酚浓度，纵坐标是五氯酚抑制的β-半乳糖苷酶活性；

[0045] 图3表示结合环境水样前处理方法，利用酿酒酵母CGMCC No.2305生物方法测试某污水处理厂不同处理出水样品类/抗维甲酸效应的结果；其中横坐标是某污水处理厂不同处理工艺，纵坐标是酿酒酵母CGMCCNo.2305的测试结果；其中■表示样品的类维甲酸诱导效应；□表示样品的抗维甲酸抑制效应。

[0046] 本发明提供的双杂交酵母RXR-GRIP1是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的RXR-GRIP1菌株，其保藏编号为：CGMCC No.2305。该酵母已于2007年12月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编100101)进行了生物材料保藏。

[0047] 以下，结合附图来详细说明本发明。

[0048] 实施例1：双杂交酵母RXR-GRIP1细胞的制备

[0049] 1.纯化包含维甲酸受体基因片段(即SEQ ID No.1所示序列)的pGBT9-RXR酵母表达质粒。

[0050] 用10μL诱饵质粒pGBT9-RXR(日本大阪大学Nishikawa教授惠赠)转化100μL感受态大肠杆菌DH5α，在含有氨苄青霉素的培养基中筛选阳性克隆，提取质粒并纯化。0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA大小，同时对质粒DNA进行序列测定，测序引物为pGBT9通用引物(测序工作由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成)。所述含有氨苄青霉素的培养基包含100mg/L氨苄青霉素、10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/LNaCl和15g/L琼脂糖。

[0051] 2.纯化包含维甲酸X受体共激活因子基因片段(即SEQ ID No.2所示序列)的pGAD424-GRIP1酵母表达质粒。

[0052] 用10μL靶质粒pGAD424-GRIP1(美国加州大学Stallcup教授惠赠)转化100μL感受态大肠杆菌DH5α，在含有氨苄青霉素的培养基中筛选阳性克隆，提取质粒并纯化。0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA大小，同时对质粒DNA进行序列测定，测序引物为pGAD424通用引物(测序工作由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成)。所述含有氨苄青霉素的培养基包含100mg/L氨苄青霉素、10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/LNaCl和
15g/L琼脂糖。

[0053] 3.构建双杂交酵母RXR-GRIP1。

[0054] 同时加入0.1μgpGBT9-RXR质粒和0.1μgpGAD424-GRIP1质粒混合均匀，并加入0.1mL新鲜制备的感受态Y187酿酒酵母细胞，200rpm，30℃孵育30min。加入70μL二甲基亚砜(DMSO)混合均匀后，42℃水浴放置15min；细胞迅速转移到冰浴，静置1-2min，构建双杂交酵母RXR-GRIP1。

[0055] 4.筛选双杂交酵母RXR-GRIP1。

[0056] 在上述方法中，筛选双杂交酵母RXR-GRIP1时，采用营养缺陷型筛选和菌落转移滤膜分析相结合的方法筛选双杂交酵母，双杂交酵母通过营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu)粗筛出阳性菌落，进一步使用菌落转移滤膜分析方法，将菌落影印到无菌的1#干燥滤膜上，液氮反复冻融3～5次，破碎细胞；将1#滤膜置于含9-顺维甲酸-6(5×10 mol/L)的X-gal缓冲液的2#滤膜上，30℃孵育直到克隆出现明显的蓝色。显色的菌落即为阳性菌落，阳性菌落继续培养24小时后备用。所述SD/-Trp/-Leu包含20mg/L腺嘌呤半硫酸盐、20mg/L盐酸精氨酸、20mg/L一水合盐酸组氨酸、30mg/L异亮氨酸、30mg/L盐酸赖氨酸、20mg/L甲硫氨酸、50mg/L苯丙氨酸、200mg/L苏氨酸、30mg/L酪氨酸、20mg/L尿嘧啶、150mg/L缬氨酸、6.7g/L无氨基酸酵母氮源；X-gal缓冲液为20mg/L5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的二甲基甲酰胺溶液。

[0057] 实施例2：

[0058] 利用双杂交酵母RXR-GRIP1(酿酒酵母CGMCC No.2305)测定9-顺维甲酸的诱导效应来绘制标准诱导曲线

[0059] 酵母细胞培养：将制备的双杂交酵母RXR-GRIP1细胞接种到SD/-Trp/-Leu液体培养基中，(培养基组成与实施例1中相同)检测菌液600nm处的吸光度值(以培养基为空白)，调节吸光度值为0.1～0.2，30℃空气浴摇床中培养24小时调整菌液600nm处的吸光度值为0.7～0.8。

[0060] 绘制标准曲线：取菌悬液0.995mL至对应的Eppendorf管中，加入5μLDMSO(空白)或5μL用DMSO溶解的9-顺维甲酸；将以上溶液各200μL依次转移到96孔板中。然后于130rpm，30℃于96孔板摇床振荡培养2小时；培养结束后，首先检测600nm处的吸光度值；去除150μL酵母菌液；加入120μL测试缓冲液(每100mL基础缓冲液中加入3.33mL浓度为0.1％的SDS溶液和270μLβ-巯基乙醇)和20μL氯仿，在30℃的恒温摇床上预培养10min；再加入40μL邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液(0.04g/L)，启动酶反应，随着进一步的培养，可以逐渐看到培养液呈现越来越强的黄色；30℃下充分反应后，添加100μL碳酸钠溶液(1mol/L)终止反应；取200μL上清液在420nm处用分光光度计检测终产物邻硝基酚钠的吸光度值，并以此作为表示β-半乳糖苷酶的参数，绘制9-顺维甲酸对双杂交酵母细胞RXR-GRIP1的β-半乳糖苷酶活性诱导的剂量-效应关系标准曲线(图1)。

[0061] β-半乳糖苷酶活性u的计算公式如下：u＝(AS-AB)/t·V·D·ODS，式中，u为β-半乳糖苷酶活性；t为反应时间(min)；V为测试体积(mL)；D为稀释因子；ODS为测试样品595nm处的吸光度值；AS为测试样品在420nm处的吸光度值OD420；AB为空白对照在420nm处的吸光度。

[0062] 上述含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液包含：21.51g/LNa2HPO4·12H2O、6.22g/LNaH2PO4·2H2O、0.75g/LKCl、0.25g/LMgSO4.7H2O、0.04g/L邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷。

[0063] 相同的方法检测9-顺维甲酸对双杂交酵母RXR-TIF2细胞(日本大阪大学Nishikawa教授惠赠)β-半乳糖苷酶活性诱导的剂量-效应关系标准曲线。

[0064] 由图1可知，9-顺维甲酸对双杂交酵母RXR-GRIP1细胞β-半乳糖苷酶活性诱导-7 -9 -6的剂量-效应关系标准曲线的EC50值为1.0×10 mol/L，在5×10 ～5×10 mol/L范围内存在线性关系；同时，RXR-GRIP1酵母诱导的酶活性值明显高于RXR-TIF2酵母，RXR-GRIP1酵母诱导的最大酶活性值约是RXR-TIF2酵母诱导的最大酶活性值的3.4倍；初步表明双杂交维甲酸X激素受体基因酵母RXR-GRIP1测评体系，具有更高的灵敏度，可以作为环境中类维甲酸化合物的毒性效应的定量分析标准。

[0065] 实施例3：利用双杂交酵母RXR-GRIP1(酿酒酵母CGMCC No.2305)测定五氯酚的抑制效应来绘制抑制曲线。

[0066] 酵母细胞培养：将制备的双杂交酵母RXR-GRIP1细胞接种到SD/-Trp/-Leu液体培养基(组成与实施例2中相同)中，检测菌液600nm处的吸光度值(以培养基为空白)，调节吸光度值为0.1～0.2，30℃空气浴摇床中培养24小时后调整菌液600nm处的吸光度值为0.7～0.8。

[0067] 绘制标准曲线：取菌悬液0.995mL至对应的Eppendorf管中，加入5μL9-顺维甲酸和5μL用DMSO溶解的五氯酚；将以上溶液各200μL依次转移到96孔板中。然后于130rpm，30℃于96孔板摇床振荡培养2小时；培养结束后，首先检测600nm处的吸光度值；
去除150μL酵母菌液；加入120μL测试缓冲液(每100mL基础缓冲液中加入3.33mL浓度为0.1％的SDS溶液和270μLβ-巯基乙醇)和20μL氯仿，在30℃的恒温摇床上预培养10min；再加入40μL邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液(0.04g/L)，启动酶反应，随着进一步的培养，可以逐渐看到培养液呈现越来越强的黄色；30℃下充分反应后，添加
100μL碳酸钠溶液(1mol/L)终止反应；取200μL上清液在420nm处用分光光度计检测终产物邻硝基酚钠的吸光度值，并以此作为表示β-半乳糖苷酶的参数，绘制五氯酚对9-顺维甲酸诱导杂交酵母细胞RXR-GRIP1的β-半乳糖苷酶活性抑制的剂量-效应关系曲线(图2)。

[0068] β-半乳糖苷酶活性u的计算公式如下：u＝(AS-AB)/t·V·D·ODS，式中，u为β-半乳糖苷酶活性；t为反应时间(min)；V为测试体积(mL)；D为稀释因子；ODS为测试样品595nm处的吸光度值；AS为测试样品在420nm处的吸光度值OD420；AB为空白对照在420nm处的吸光度。

[0069] 上述含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液包含：21.51g/LNa2HPO4·12H2O、6.22g/LNaH2PO4·2H2O、0.75g/LKCl、0.25g/LMgSO4·7H2O、0.04g/L邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷。

[0070] 由图2可知，五氯酚对双杂交酵母RXR-GRIP1细胞β-半乳糖苷酶活性抑制在-9 -51×10 ～1×10 mol/L测试浓度范围内存在显著的剂量-效应关系线性关系；IC20值(抑-7
制20％的效应所需化合物的浓度)为1.0×10 mol/L，初步表明双杂交维甲酸X受体基因酵母测评体系可以作为环境中抗维甲酸化合物的毒性效应的测评体系。

[0071] 实施例4：利用双杂交酵母RXR-GRIP1(酿酒酵母CGMCC No.2305)生物测试方法评价环境样品的类/抗维甲酸污染物毒性。

[0072] 分别采集某市污水处理厂进水、不同处理工艺出水作为样品。采用本发明所述的样品前处理方法提取样品中的类/抗维甲酸污染物，将提取到的有机溶剂在高纯氮气中吹干，加入DMSO溶解并制备成在标准曲线线性范围内任一浓度的测试用样品溶液。

[0073] 利用实施例2中所述的双杂交酵母RXR-GRIP1生物测试方法评价环境样品的类维甲酸污染物毒性，测定结果参照图1绘制的诱导标准曲线，表示成为9-顺维甲酸的当量浓度；同时利用实施例3中所述的双杂交酵母RXR-GRIP1生物测试方法评价环境样品的抗维甲酸污染物毒性，测定结果参照图2绘制的抑制曲线，表示成为五氯酚的当量浓度，见图3。

[0074] 从图3可以看出，该污水处理厂的不同处理工艺阶段出水中均不含有类甲维甲酸-5物质，抗维甲酸物质则有检测五氯酚的当量浓度范围为0～2×10 g/L，该处理工艺对抗维甲酸物质能够有很好的去除。图3的结果表示可以用本发明提出的方法，判断环境样品中类/抗维甲酸污染物的毒性当量或其潜在生态毒性的大小。

[0075] 序列表

[0076] <110>中国科学院生态环境研究中心

[0077] <120>检测类/抗维甲酸化合物的双杂交酵母以及生物测试方法

[0078] <130>DIC07110127

[0079] <160>2

[0080] <170>PatentIn version 3.3

[0081] <210>1

[0082] <211>1025

[0083] <212>DNA

[0084] <213>小鼠

[0085] <400>1

[0086] ggcagagttg actgtatcgc cggattcgat tcggtacagg aggagcgtca gcggggaaag 60[0087] gacaaggatg gggatgggga gggggctggg ggagcccccg aggagatgcc tgtggacagg 120[0088] atcctggagg cagagcttgc tgtggaacag aagagtgacc agggcgttga gggtcctggg 180[0089] ggaaccgggg gtagcggcag cagcccagat gaccctgtga ctaacatctg gcaggcactg 240[0090] acaaacagct attcacgctt gttgagtggg cgaaaaggat cccacacttt tcctccttgc 300[0091] ctctggatga tcaggtcata ttgctgcggg caggctggaa tgaactcctc attgcctcct 360[0092] tttcacaccg atccattgat gttcgagatg gcatcctcct tgccacaggt cttcacgtgc 420[0093] accgcaactc agcccattca gccgaggggg gagccatcgg gggatccgcc tgctgacaga 480[0094] gctagtgtcc aaaatgcgtg acatgaggat ggacaagaca gagcttggcc gcctgagggc 540[0095] aatcattctg tttaatccag atgccaaggg cctctccaac cctagtgagg tggaggtcct 600[0096] gcgggagaaa atgtatgcat cactggagac ctactgcaaa acagaaagta ccctgaacca 660[0097] gcagggacgg tttgccaagc tgctgctacg tcttcctgcc ctccggtcca ttggccttaa 720[0098] gtgtctagag catctgtttt tcatcaagct cattggtgaa cacccccatc gacaccttcc 780[0099] tcatggaatg cttgagctcc ccatcaactg acctaatcaa gcttatcgat accggcgacc 840[0100] tgcagccagc taattccggg cgaatttctt atgattatga tttttatatt aatacgttaa 900[0101] aaaaaaataa atgaatacaa tttaaaggac tcttaagttt aaaagaaatt cttaatctgg 960[0102] ataactcttc ctgaagtcag ttgcttctcg aaataaagag gagaacttat tgagaaactc 1020[0103] tcagg

[0104] 1025

[0105] <210>2

[0106] <211>4374

[0107] <212>DNA

[0108] <213>小鼠

[0109] <400>2

[0110] ggagaaaaca cctctgaccc gtccagggca gagaccagaa aacgcaagga atgtcccgac 60[0111] cagctcggac ccagccccaa aaggagcact gagaaacgga accgcgagca ggagaataag 120[0112] tacatagagg agctggccga tctgatcttc gcaaacttta atgatattga caacttcaac 180[0113] ttcaaacctg acaaatgtgc catcctaaaa gaaactgtga agcagatccg ccagatcaaa 240[0114] gagcaagaga aagcagcagc tgccaacata gatgaagtgc agaagtcaga tgtgtcgtcc 300[0115] acggggcagg gtgtcatcga caaggatgca ctggggccca tgatgcttga ggccctcgat 360[0116] gggttcttct tcgttgtgaa cctggaaggc agtgtggtgt tcgtgtcaga gaatgtgaca 420[0117] cagtatctac ggtataacca agaagagctg atgaacaaga gtgtctacag catcctgcat 480[0118] gtcggggacc acactgaatt tgtcaagaac ctgctgccaa agtccatggt gaatggagga 540[0119] tcctggtctg gagaacctcc caggcggacg agccatacct tcaactgtcg catgctggtg 600[0120] aagcctttgc cagattcaga agaggaaggc catgatagcc aggaagccca tcagaaatac 660[0121] gaggcgatgc agtgcttcgc tgtgtctcag cccaagtcca tcaaagagga aggcgaagat 720[0122] ttgcagtcct gcttgatttg tgtggcacga agagtcccca tgaaggaaag accaactctt 780[0123] 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