处理生物质以获得目标化学物质
阅读：862发布：2023-02-14
专利汇可以提供处理生物质以获得目标化学物质专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且使用 生物 催化剂生产目标化学物质，所述生物催化剂能够 发酵 来源于 生物质 的糖类。通过在高固形物和低 氨 浓度的条件下预处理生物质，继之以 糖化 而获得了糖类。，下面是处理生物质以获得目标化学物质专利的具体信息内容。
1.一种生产来源于生物质的目标化学物质的方法，包括：
a)使生物质与含氨的水溶液接触，其中氨的浓度至少足以维持生 物质-氨水混合物的碱性pH值，但是其中所述氨的存在量小于生物质干 重的约12wt％，并且进一步，其中生物质的干重处于占生物质-氨水混 合物重量的至少约15wt％的高固形物含量下；
b)在适于生产可发酵糖的条件下，使步骤(a)的产物与糖化酶聚 生体接触；以及
c)在合适的发酵的条件下，使步骤b)的产物与至少一种能发酵糖 类以生产目标化学物质的生物催化剂接触。
2.权利要求1所述的方法，其中同时进行步骤(b)和(c)。
3.权利要求1所述的目标化学物质，选自酸类、醇类、烷烃、烯烃、 芳香族化合物、醛类、酮类、生物聚合物、蛋白质、肽、氨基酸、维生 素、抗生素和药物。
4.权利要求1所述的方法，其中目标化学物质选自甲醇、乙醇、丙 醇、异丙醇、丁醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇、甘油、赤藓醇、木糖醇、 山梨糖醇、乙酸、乳酸、丙酸、3-羟基丙酸、丁酸、葡糖酸、衣康酸、 柠檬酸、琥珀酸、乙酰丙酸、谷氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、 甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甲烷、乙烯、丙酮和工 业酶。
5.权利要求4所述的方法，其中目标化学物质是乳酸、丙二醇或乙 醇。
6.权利要求1所述的方法，其中所述的至少一种生物催化剂选自细 菌、丝状真菌和酵母。
7.权利要求1所述的方法，其中至少一种生物催化剂选自野生型、 空变型或重组的埃希氏菌属、发酵单胞菌属、念珠菌属、酿酒酵母属、 毕赤氏酵母属、链霉菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属和梭状芽胞杆菌属。
8.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种生物催化剂选自重组 的大肠杆菌、运动发酵单胞菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、酿酒酵母、热纤梭 菌、解糖耐热厌氧杆菌和树干毕赤酵母。
9.权利要求1所述的方法，其中生物质-氨水混合物的pH值大于 8。
10.权利要求1所述的方法，其中在使生物质与含氨的水溶液接触之 前，向生物质施加真空。
11.权利要求1所述的方法，其中所述生物质干重处于至少约15％～ 约80％的高固形物含量下。
12.权利要求11所述的方法，其中所述生物质干重处于至少约 15％～约60％的高固形物含量下。
13.权利要求1所述的方法，其中所述的氨的存在量小于生物质干重 的约10wt％。
14.权利要求13所述的方法，其中所述的氨的存在量为生物质干重 的约6％或更小。
15.权利要求1所述的方法，其中生物质选自生物能农作物、农业残 留物、城市固体废物、工业固体废物、庭院废物、木材和森林废物。
16.权利要求1所述的方法，其中生物质选自柳枝稷、废纸、造纸淤 泥、玉米颗粒、玉米棒子、玉米皮、玉米秸杆、草、小麦、麦杆、干草、 大麦、大麦秆、稻草、甘蔗渣、高粱、大豆、从加工谷物得到的组分、 树木、树枝、根苗、叶、木材碎片、锯屑、灌木和灌木丛、蔬菜、水果、 花和牲畜粪。
17.权利要求16所述的方法，其中生物质选自玉米棒子、玉米秸杆、 玉米皮、甘蔗渣、锯屑、柳枝稷、麦杆、干草、大麦秆、稻草和草。
18.权利要求17所述的方法，其中生物质选自玉米棒子、玉米秸杆、 锯屑和甘蔗渣。
19.权利要求1所述的方法，其中氨选自氨气、氨水、尿素及其组合。
20.权利要求1所述的方法，其中(a)是在约4℃～200℃的温度 下进行的。
21.权利要求20所述的方法，其中(a)是在约75℃～150℃的温度 下进行的。
22.权利要求21所述的方法，其中(a)是在大于90℃～150℃的温 度下进行的。
23.权利要求1所述的方法，其中最多进行(a)约25小时。
24.权利要求23所述的方法，其中最多进行(a)约8小时。
25.权利要求1或2所述的方法，其中在(b)之前除去至少一部分(a) 中的氨。
26.权利要求25所述的方法，其中将来自(a)的氨循环。
27.权利要求1所述的方法，其中(b)的接触是在至少约15％的生 物质干重浓度下进行的。
28.权利要求1所述的方法，其中将(a)、(b)或(a)和(b)重 复至少一次。
29.权利要求1所述的方法，进一步包括在(a)中添加至少一种增 塑剂、软化剂或其组合。
30.权利要求29所述的方法，其中所述的至少一种增塑剂、软化剂 或其组合选自多元醇、多元醇酯、乙二醇醚、乙酰胺、乙醇和乙醇胺。
31.权利要求1所述的方法，进一步包括在(a)之前或期间、在(b) 之前或期间或其组合中施加能量。
32.权利要求31所述的方法，其中所述能量选自碾磨、压碎、磨碎、 撕碎、切碎、圆盘精炼、超声和微波。
33.权利要求1所述的方法，其中在糖化之前使用来自发酵的二氧化 碳来调节预处理混合物的pH值。
34.权利要求1所述的方法，其中所述糖化酶聚生体包括至少一种糖 苷酶。
35.权利要求1所述的方法，其中所述糖化酶聚生体包括至少一种 选自纤维素水解糖苷酶、半纤维素水解糖苷酶、淀粉水解糖苷酶、肽酶、 脂肪酶、木质酶和阿魏酰酯酶的酶。
36.权利要求1所述的方法，其中所述糖化酶聚生体包括至少一种选 自纤维素酶、葡聚糖内切酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡 糖苷酶、木聚糖酶、木聚糖内切酶、外切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿 拉伯木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果胶酶、葡糖苷酸酶、淀粉酶、 α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、异淀粉酶的酶。
37.权利要求1所述的方法，其中(b)是在约15℃～约100℃的温 度下和约2～约11的pH值下进行的。
发明领域
提供一种使用从处理生物质中所得到的可发酵糖类生产目标化学 物质的方法。具体地，将在高固形物和低氨浓度的条件下预处理生物质 然后糖化而得到的糖类用于生物催化剂发酵以生产目标化学物质。
发明背景
纤维素和木质纤维素原料和废物，例如农业残留物、木材、森林废 物、造纸淤泥、以及市政和工业固体废物提供了大量的生产化合物、塑 料、燃料和饲料的可再生原料。由包括纤维素、半纤维素、葡聚糖和木 质素的碳水化合物聚合物组成的纤维素和木质纤维素原料和废物，通常 经过各种化学试剂、机械的和酶学方法处理，主要释放可以被发酵为有 用产品的己糖和戊糖。
使用预处理方法使纤维素和木质纤维素原料的碳水化合物聚合物 更容易被糖化酶利用。标准的预处理方法曾经主要在高温下使用强酸； 然而，由于高能量成本、高设备投资、高预处理催化剂再生成本以及与 糖化酶的不相容性，正在发展替代方法，例如酶预处理，或在较温和温 度下使用酸或碱，其降低预处理期间发生的生物质碳水化合物聚合物的 水解，需要改进的酶系统来糖化纤维素和半纤维素。
一些预处理方法建议碱。Gould(Biotech，and Bioengr.(1984)26：46 -52)公开了使用过氧化氢(H2O2)预处理木质纤维素生物质的方法。 所用H2O2相对于底物的量至少为0.25wt/wt时，处理最有效。
Teixeira，L.，et al.(Appl.Biochem.and Biotech.(1999)77-79：19 -34)公开了一系列使用化学计量的氢氧化钠和氨水预处理生物质，其 中生物质浓度极低。溶液与生物质的比例是14∶1。
Elshafei，A.等人(Bioresource Tech.(1991)35：73-80)使用NaOH 预处理玉米秸杆。
Kim，T.和Y.Lee(Bioresource Technology(2005)96：2007-2013) 报告了使用大量氨水预处理玉米秸杆。
专利申请WO2004/081185探讨了水解木质纤维素的方法，包括使木 质纤维素与化学试剂接触；化学试剂可以是碱，例如碳酸钠或氢氧化 钾，在约9～约14的pH值下，在温和的温度、压力和pH值条件下。
美国专利号5,916,780和6,090,595描述了一种预处理方法，其中评价 阿糖基木聚糖与总非淀粉多糖(AX/NSP)的特定比例并用其选择原料。
为了成为经济上有竞争力的方法，从可再生资源生物质生产化合物 的商业化生产方法需要：使用少量化学试剂水解木质纤维素生物质的碳 水化合物，以提供高浓度高产量的糖类，以提供低毒的可发酵糖来源， 其被生产增值目标化学物质的生物催化剂利用。
发明既述
本发明提供使用生物质生产目标化学物质的方法。本发明的方法涉 及以较高生物质浓度，使用相对于生物质干重较低浓度的氨来预处理生 物质。在预处理之后，用糖化酶聚生体处理生物质以生产可发酵糖类。 然后让糖类与可以发酵糖类并产生目标化学物质的生物催化剂接触。在 本发明的一个实施例中，所述方法包括：
a)使生物质与含氨的水溶液接触，其中氨的浓度至少足以维持生 物质-氨水混合物的碱性pH值，但是其中所述氨的存在量小于生物质干 重的约12wt％，并且进一步，其中生物质干重处于占生物质-氨水混合 物重量的至少约15wt％的高固形物含量下；
b)在适于生产可发酵糖的条件下，使步骤(a)的产物与糖化酶聚 生体接触；以及
c)在合适的发酵的条件下，使步骤b)的产物与至少一种能发酵糖 类以生产目标化学物质的生物催化剂接触。
附图的简要描述
图1显示在存在或不存在乙酰胺和乙酸时，运动发酵单胞菌8b的生 长(描述于美国专利申请公开2003/0162271 A1的实施例IV、V1和XII 中)。
本发明的详细说明
申请人特别将此处公开的所有参考文献的全部内容结合在内。此 外，当以范围、优选的范围或一组较高的优选值和较低的优选值给出 量、浓度或其它数值或参数时，这些应被理解为具体地公开由任何一对 任何上限或优选值和任何下限或优选值形成的所有范围，不管是否该范 围被单独公开。除非另有说明，当此处列举数值范围时，范围意图包括 其端点以及所述范围内的全部整数和分数。本发明的范围不限于定义范 围时列举的具体数值。
本发明以下述方式提供使用生物质生产目标化学物质的方法：从生 物质得到糖类，其随后被用作微生物生长的碳源，所述微生物可以制备 作为其代谢产物的目标化学物质。通过以较高浓度，使用相对于生物质 干重较低浓度的氨预处理生物质来释放糖类。然后使用糖化酶聚生体消 化经过氨处理的生物质以生产可发酵糖类。糖类用作能产生目标化学物 质的微生物或生物催化剂生长的发酵基质。
定义：
本说明书中使用一些术语。提供了下列定义：
术语“可发酵糖”是指发酵过程中可以被微生物用作碳源的寡糖和 单糖。
术语“木质纤维素”是指包括木质素和纤维素的组合物。木质纤维 素物质还可以包括半纤维素。
术语“纤维素”是指包括纤维素的组合物。
生物质“干重”是除去全部或基本上全部水的生物质的重量。通常 根据美国测试和材料学会(American Society for Testing and Materials) (ASTM)标准E1756-01(测定生物质总固形物的标准试验方法)或纸 浆造纸工业股份有限公司技术协会(Technical Association of the Pulp and Paper Industry，Inc.)(TAPPI)标准T-412 om-02(纸浆，纸张和纸 板中水分)测量干重。
术语“目标化学物质”是指发酵产生的化合物。化合物为广义，并 且包括例如蛋白质的分子，包括例如肽、酶和抗体。
“可从生物质得到的”目标化学物质是通过一种方法生产的目标化 学物质，其中水解生物质以释放可发酵糖，并且使用至少一种生物催化 剂来发酵可发酵的糖以生产所需目标化学物质。
术语“增塑剂”和“软化剂”是指导致沿聚合体链或聚合体链之间 内聚的分子间作用力减少的物质。例如，上述原料可以降低结晶度，或 破坏木质素和非木质素碳水化合物纤维(例如纤维素或半纤维素)之间 的键。
术语“糖化”是指从多糖生产可发酵的糖。
“适于生产可发酵的糖的条件”是指糖化酶具有活性的条件，例如 pH值、培养基组成和温度。
“合适的发酵的条件”是指支持生物催化剂生长并产生目标化学物 质的条件。上述条件包括pH值、营养素及其他培养基组分、温度、大气 压及其他因素。
术语“经过预处理的生物质”意思是指在糖化之前已经进行预处理 的生物质。
“生物质”是指任何纤维素或木质纤维素原料并包括含有纤维素以 及任选地进一步含有半纤维素、木质素、淀粉、寡糖和/或单糖的原料。 生物质还可以包括其他组分，例如蛋白质和/或脂类。根据本方法，生物 质可以得自单一来源，或生物质可以包括得自一种以上来源的混合物； 例如生物质可以包括玉米棒子和玉米秸的混合物或草和叶的混合物。生 物质包括但不限于生物能农作物、农业残留物、城市固体废物、工业固 体废物、造纸淤泥、工场废物、木材和森林废物。生物质的实例包括但 不限于，玉米颗粒、玉米棒子、作物残渣例如玉米皮、玉米秸秆、草、 小麦、麦杆、大麦、大麦秆、干草、稻草、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高 粱、大豆、加工谷物得到的组分、树木、树枝、根苗、叶、木材碎片、 锯屑、灌木和灌木丛、蔬菜、水果、花和牲畜粪。在一个实施例中，用 于本方法的生物质包括具有相对较高碳水化合物值的生物质，它们相对 稠密和/或相对便于收集、运输、贮藏和/或处理。在本发明的一个实施 例中，有用的生物质包括玉米棒子、玉米秸杆和甘蔗渣。
对于本发明的目的，“含氨的水溶液”是指在水介质中使用氨气 (NH3)、含有铵离子(NH4+)的化合物例如氨水或硫酸铵、降解时释 放氨的化合物例如尿素及其组合物。
用于本方法的最小氨浓度足以维持生物质-氨水混合物的碱性pH 值，并且最大浓度小于生物质干重的约12wt％。这种低浓度的氨足以用 于预处理，并且低浓度还可以小于生物质干重的约10wt％。还可以使用 极低浓度的占生物质干重的6％或更少的氨进行预处理。碱性的意思是指 pH值大于7.0。特别合适的生物质-氨水混合物的pH值大于8。在一个实 施例中，存在的氨小于生物质干重的约10wt％。特别合适的氨小于生物 质干重的约6wt％。
用于本方法的氨与其它碱相比具有优势。氨分配到液相和气相中。 气态氨比液态碱更容易地扩散穿过生物质，在较低浓度下更有效地进行 预处理。本文实施例11还显示氨通过氨解作用，与生物质中的乙酰基酯 水解竞争以形成乙酰胺。乙酰胺对某些发酵生物体的毒性比醋酸盐更 低，例如运动发酵单胞菌(如本文实施例12所示)。因此，乙酰基酯转 化为乙酰胺而不是乙酸，减少了除去乙酸的需求。使用氨还减少了发酵 期间用氮源补充生长培养基的需求。此外，氨是一种廉价的原料并且因 此提供经济的方法。在预处理期间或预处理之后，氨还可以被循环至预 处理反应器，因此实现了更经济的方法。例如，当温度降低至适于糖化 时，在预处理之后释放氨气，并且任选地在真空的情况下可以循环氨 气。在连续方法中，可以连续循环氨。
根据本方法，含氨的水溶液任选地包括至少一种其他碱，例如氢氧 化钠、碳酸钠、氢氧化钾、碳酸钾、氢氧化钙和碳酸钙。所述至少一种 其他碱的添加量与铵合并的总碱量小于生物质干重的约20wt％。优选第 二碱和氨的总量小于约15wt％。例如，可以使用其他碱中和生物质中的 酸，来为糖化酶提供金属离子或为发酵生长培养基提供金属离子。
在本方法中，生物质干重的初始含量为生物质-氨水混合物重量的 至少约15％～约80％。更合适地，生物质干重的含量为生物质-氨水混 合物重量的约15％～约60％。生物质占生物质-氨水混合物的百分比维 持在较高水平，以使对糖类浓缩的需求最小化，所述糖类得自用于发酵 的经过预处理的生物质的糖化。高生物质含量还降低预处理原料的总体 积，使该方法更经济。
生物质可以以得到的形式直接使用，或可以向生物质施加能量以减 少尺寸、增加暴露的表面积和/或使生物质中存在的纤维素、半纤维素和 /或寡糖被氨和所述方法第二步所用糖化酶利用的程度。用于减少尺寸、 增加暴露的表面积和/或使生物质中存在的纤维素、半纤维素和/或寡糖 被氨和糖化酶利用的程度的能量方式包括但不限于，磨细、压碎、磨碎、 撕碎、切碎、圆盘精炼、超声和微波。可以在预处理之前或期间、糖化 之前或期间或其任意组合中施加能量。
在合适的容器中用氨溶液预处理生物质。通常，容器可以经受压 力，具有加热机构，并且具有混合内容物的机构。市场上可买到的容器 包括例如，Zipperclave反应器(Autoclave Engineers，Erie，PA)、Jaygo 反应器(Jaygo Manufacturing，Inc.，Mahwah，NJ)和蒸汽枪反应器(General Methods；Autoclave Engineers，Erie，PA描述)。可以使用许多具有相 同性能的较大规模的反应器。或者，可以在一种容器中混合生物质和氨 溶液，然后转入另一种反应器。还可以在一种容器中预处理生物质，然 后在另一种反应器，例如蒸汽枪反应器(General Methods；Autoclave Engineers，Erie，PA描述)中进一步加工。
在生物质与含氨的水溶液接触之前，向装有生物质的容器施加真 空。通过抽空生物质孔隙中的空气，可以使氨更好地渗透入生物质。施 加真空的时期和施加于生物质的负压值取决于生物质种类，并且可以凭 经验确定以便最理想地预处理生物质(如通过在糖化之后生产可发酵的 糖而测量的)。
在约4℃～约200℃温度下使生物质与含氨的水溶液接触。发现生物 质与氨在4℃首次接触，允许在该温度下渗透，增加了未经预处理的天 然生物质的糖化效率。在另一个实施例中，所述生物质的接触在约75 ℃～约150℃下进行。在另一个实施例中，所述生物质的接触在大于90 ℃至约150℃下进行。
使生物质与含氨的水溶液接触最多约25小时。预处理时间可以更 长，然而由于经济的原因实际上优选较短的处理时间。通常，与氨接触 处理的时间为约8小时或更少。较长时间的优点是降低对施加能量破碎 生物质的需求，因此优选最多约25小时的时间。
在一个实施例中，在较高温度进行预处理步骤持续较短时间，例如 在约100℃～约150℃进行约5分钟～约2小时。在另一个实施例中，在较 低温度进行预处理步骤持续较长时间，例如在约75℃～约100℃进行约2 小时～约8小时。在另一个实施例中，在室温下(约22～26℃)进行预 处理步骤持续甚至更长时间，约24小时。还可以使用在这些之间的温度 和时间的组合。
对于预处理方法，与温度、预处理时间、氨浓度、一种或多种其他 碱的浓度、生物质浓度、生物质类型和生物质粒径相关联；因此可以根 据需要调节这些变量，以获得最佳的产物与糖化酶聚生体的接触。
可以在预处理步骤(即步骤(a))中添加增塑剂、软化剂、或其 组合，例如多元醇(例如甘油、乙二醇)、多元醇的酯(例如单乙酸甘 油酯)、乙二醇醚(例如二甘醇)、乙酰胺、乙醇和乙醇胺。增塑剂可 以作为氨水溶液的组分、单独的溶液或干燥组分被添加。
可以在任何合适的容器中进行预处理反应，例如在间歇式反应器或 连续式反应器中进行。本领域技术人员应该认识到在较高温度(高于100 ℃)下需要耐压容器。合适的容器可以装备有用于搅拌生物质-氨水混 合物的叶轮等设备。Lin，K.-H.，和Van Ness，H.C.(in Perry，R.H.and Chilton，C.H.(eds)，Chemical Engineer′s Handbook，5th Edition(1973) Chapter 4，McGraw-Hill，NY)讨论了反应器设计。预处理反应可以 分批进行或连续进行。
本领域技术人员已知在发酵期间微生物生长需要氮源；因此在预处 理期间使用氨提供了氮源并降低或根除了发酵期间向生长培养基补充 氮源的需求。如果预处理产物的pH值超过糖化酶具有活性的pH值或超 过适于发酵中微生物生长的范围，可以使用酸类来降低pH值。达到所需 pH值所用的酸量可能导致形成盐，其浓度抑制糖化酶或微生物的生长。 为了降低达到所需pH值所需的酸量并降低目前预处理步骤中NH3的原 材料成本，可以从预处理反应器排出氨气并循环。通常，至少去除一 部分氨，其降低pH值却遗留某些氮气，其提供了用于随后的发酵的养 分。
为了从生物质获得足够的糖类，用氨水溶液预处理生物质一次或多 次。同样，可以进行一次或多次糖化反应。如果希望获得较高的糖产量， 可以重复预处理和糖化步骤。为了单独或共同评价预处理和糖化步骤， 测定得自起始生物质的糖类理论产量并与实测的产量相比。
糖化：
在预处理之后，产物包括氨、部分降解的生物质和可发酵糖的混合 物。在进一步处理之前，通过施加真空从经过预处理的生物质中除去 氨。去除氨降低了pH值，并且因此减少了为了获得糖化和发酵所需pH 值所用的中和酸。这导致预处理混合物中更低的盐负荷。通常残留某些 所需的氨而为发酵提供了氮源。
然后，糖化酶聚生体存在下预处理混合物进一步水解，释放水解产 物中的寡糖和/或单糖。Lynd，L.R.，et al.(Microbiol.MoI.Biol.Rev. (2002)66：506-577)回顾了糖化酶和处理生物质的方法。在一个优选 的实施例中，包括可溶性和不溶性部分的全部预处理混合物被用于糖化 反应中。
在另一个实施例中，在糖化之前，将包括氨和溶解的糖类的含水部 分与残留在混合物中的不溶性颗粒分离。用于从不溶部分中分离可溶部 分的方法包括但不限于倾析和过滤。不溶性颗粒可以被循环至预处理反 应器。在循环至预处理反应器之前，可以任选地用水性溶剂(例如水) 洗涤不溶性颗粒以去除吸附的糖类。然后，可以如上述预处理一样，用 氨水溶液对不溶部分进行额外的处理，接着用糖化酶聚生体进行糖化。 糖化之前，还可以利用合适的方法浓缩可溶部分，例如蒸发。
在糖化之前，可以处理预处理产物以改变pH值、组成或温度，以使 糖化酶聚生体的酶具有活性，由此形成适于产生可发酵糖的条件。可以 通过添加固体或液态酸类来改变pH值。或者，可以使用从发酵回收的二 氧化碳(CO2)来降低pH值。例如，通过可以从发酵罐收集CO2并且通 过鼓泡将其进料到预处理产物中，同时监控pH值，直至达到所需pH值。 可以将温度调节至与糖化酶活性相适合的温度，如下所述。可以添加糖 化酶活性所需的任何辅助因子。
糖化酶聚生体包括一种或多种酶，这些酶主要选自而非排他地选自 “糖苷酶”类，后者水解双糖、寡糖和多糖的醚键并且可以分别在一般 分类“水解酶”(EC 3.)的酶分类EC 3.2.1.x(Enzyme Nomenclature 1992， Academic Press，San Diego，CA with Supplement 1(1993)，Supplement 2(1994)，Supplement 3(1995)，Supplement 4(1997)and Supplement 5[分别在Eur.J.Biochem.(1 994)223：1-5，Eur.J.Biochem.(1995)232：1 -6，Eur.J.Biochem.(1996)237：1-5，Eur.J.Biochem.(1997)250：1 -6，and Eur.J.Biochem.(1999)264：610-650])中找到。对本方法有 用的糖苷酶可以通过其水解的生物质成分分类。对本方法有用的糖苷酶 包括纤维素水解糖苷酶(例如纤维素酶、葡聚糖内切酶、外切葡聚糖酶、 纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶)、半纤维素水解糖苷酶(例如木聚糖 酶、木聚糖内切酶、外切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、 甘露聚糖酶、半乳糖酶、果胶酶、葡糖苷酸酶)和淀粉水解糖苷酶(例 如淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、-葡糖苷酶、异 淀粉酶)。此外，向糖化酶聚生体中添加其它活性物质例如肽酶(EC 3.4.x.y)、脂肪酶(EC 3.1.1.x和3.1.4.x)、木质酶(EC 1.11.1.x)和阿 魏酰酯酶(EC 3.1.1.73)有助于从生物质的其它组分释放多糖。本领域 众所周知，产生多糖水解酶的微生物经常显示一种被具有不同底物特异 性的若干酶或一组酶催化的活性，例如纤维素降解。因此，得自微生物 的“纤维素酶”包括一组酶，这些酶均有助于纤维素降解活性。取决于 用于获得酶的纯化方案，商品或非商品酶制剂包括许多酶，例如纤维素 酶。因此，本方法的糖化酶聚生体具有酶活性，例如“纤维素酶”，然 而应认识到该活性可以被一种以上的酶催化。
可以购买糖化酶，例如SpezymeCP纤维素酶(Genencor International，Rochester，NY)和Multifect木聚糖酶(Genencor)。此 外，可以以生物学方式，包括利用重组微生物生产糖化酶。
本领域技术人员应该知晓如何确定聚生体中所用酶的有效量并调 节获得最佳酶活性的条件。本领域技术人员还应知晓如何优化聚生体内 所需酶活性的种类，以在选定条件下使给定的预处理产物获得最佳的糖 化。
优选糖化反应在对于糖化酶最佳的温度和pH值或其附近进行。在本 方法中糖化酶聚生体的最适温度为约15℃～约100℃。在另一个实施例 中，最适温度为约20℃～约80℃。最佳pH值为约2～约11。在另一个实 施例中，本方法中糖化酶聚生体的最佳pH值为约4～约10。
糖化可以进行约几分钟～约120小时，并且优选约几分钟～约48小 时。反应时间取决于酶浓度和比活度以及所用底物和环境条件，例如温 度和pH值。本领域技术人员可以容易地确定特定底物和糖化酶聚生体所 用的最佳温度、pH值和时间。
糖化可以分批进行或连续进行。糖化还可以一步完成或在若干步中 完成。例如，糖化所需的不同酶具有不同的最适pH值或最适温度。可以 在一个温度和pH值用酶进行初步处理，然后在不同温度和/或pH值用不 同的酶进行二次处理或三次(或更多)处理。此外，可以在相同的pH值 和/或温度或不同的pH值和温度，用不同的酶在顺序步骤中进行处理， 例如使用在较高的pH值和温度下稳定的并更具活性的半纤维素酶，继之 以在较低pH值和温度下具有活性的纤维素酶。
可以通过测量单糖和寡糖的释放来监控在糖化之后得自生物质的 糖类的溶解度。测量单糖和寡糖的方法为大家所熟知。例如，使用1，3 -二硝基水杨酸(DNS)分析(Miller，G.L.，Anal.Chem.(1959)31：426 -428)来测定还原糖的浓度。或者如本文一般方法部分所述，使用合 适的柱进行HPLC来测量糖类。
合适的微生物利用从生物质释放的可发酵糖来生产目标化学物 质。在糖化之后，在发酵之前，通过例如蒸发来浓缩糖化混合物，以增 加可发酵糖的浓度。任选地，以分批或连续方法将糖化产物中的液体与 固体分离。任选地，在发酵之前对液态或全部糖化产物灭菌。取决于发 酵所用微生物和糖化期间的pH值，可以调节pH值使其适于发酵。此外， 可以向糖化混合物中补加微生物生长所需的其他营养成份。例如，补充 物包括酵母提取物、特定氨基酸、磷酸盐、氮源、盐和微量元素。还包 括由特定生物催化剂生产的特定产物的生产所需的组分，例如维持质粒 的抗生素或在酶催化反应中所需的辅因子。还可以包括其他糖类以增加 总糖类浓度。糖化混合物可以被用作发酵肉汤的组分，例如组成最终培 养基的约100％～约10％。通过调节这些类型的用于生长和由生物催化剂 产生目标化学物质的因素来达到适于发酵的条件。
取决于对发酵微生物有用的条件，还可以调节温度和/或顶空气体。 发酵可以是需氧的或厌氧的。发酵可以在糖化之后进行，或通过同时的 糖化和发酵(SSF)而与糖化同时进行。SSF可以维持由糖化产生的糖 类水平较低，由此降低潜在的对糖化酶的产物的抑制，减少可被污染微 生物利用的糖，并改善经过预处理的生物质向单糖和/或寡糖的转化。
由发酵生产的目标化学物质包括例如酸类、醇类、烷烃、烯烃，芳 香族化合物、醛类、酮类、生物聚合物、蛋白质、肽、氨基酸、维生素、 抗生素和药物。醇类包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、 乙二醇、丙二醇、丁二醇、甘油、赤藓醇、木糖醇和山梨糖醇。酸类包 括乙酸、乳酸、丙酸、3-羟基丙酸、丁酸、葡糖酸、衣康酸、柠檬酸、 琥珀酸和乙酰丙酸。氨基酸包括谷氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、 甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。其他目标化学物质包括 甲烷、乙烯、丙酮和工业酶。
可以使用一种或多种合适的生物催化剂通过单级或多级发酵将糖 类发酵为目标化学物质。生物催化剂可以是选自细菌、丝状真菌和酵母 的微生物。生物催化剂可以是野生型微生物或重组的微生物，并且包括 埃希氏菌属、发酵单胞菌属、酿酒酵母属、念珠菌属、毕赤氏酵母属、 链霉菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属和梭状芽胞杆菌属。在另一个实施例 中，生物催化剂可以选自重组的大肠杆菌、运动发酵单胞菌、嗜热脂肪 芽孢杆菌、酿酒酵母、热纤梭菌、解糖热厌氧杆菌和树干毕赤酵母。
已经描述了许多用于发酵生产目标化学物质的生物催化剂，并且通 过突变方法生产的或通过重组方法工程化的其它生物催化剂。任何利用 在本方法中生产的可发酵糖的生物催化剂可以被用于通过在本方法通 过发酵制备目标化学物质。
已知生溶剂的梭状芽孢杆菌(Jones and Woods(1986)Microbiol.Rev. 50：484-524)发酵碳水化合物生成丙酮、丁醇和乙醇(ABE发酵)。在 US 5 1 92673中描述了使用丙酮丁醇棱菌空变型生产高浓度丁醇，还生产 丙酮和乙醇的发酵方法。在US 6358717中描述了使用拜季林斯基(氏) 梭菌空变型生产高浓度丁醇，还生产丙酮和乙醇。大肠杆菌的遗传修饰 菌株还被用作生产乙醇的生物催化剂(Underwood et al.，(2002)Appl. Environ.Microbiol.68：6263-6272)。在US 2003/0162271A1中描述了具 有改善的乙醇生产的运动发酵单胞菌的遗传修饰菌株。
通过大肠杆菌的重组菌株(Zhou et al.，(2003)Appl.Environ. Microbiol.69：399-407)，杆菌属的天然菌株(US20050250192)和米 根霉(Tay and Yang(2002)Biotechnol.Bioeng.80：1-12)在发酵中生 产乳酸。大肠杆菌的重组菌株已经被用作发酵的生物催化剂来生产1，3 丙二醇(US 6013494，US 6514733)和己二酸(Niu et al.，(2002)Biotechnol. Prog.18：201-211)。使用重组的梭状芽孢杆菌(Cheryan et al.，(1997) Adv.Appl.Microbiol.43：1-33)和新鉴定的酵母菌株(Freer(2002) World J.Microbiol.Biotechnol.18：271-275)通过发酵生产乙酸。US 6159738公开了重组的大肠杆菌和其他细菌以及(Lin et al.，(2005) Metab.Eng.7：116-127)公开了重组的大肠杆菌生产琥珀酸。通过光滑 球拟酵母空变型(Li et al.，(2001)Appl.Microbiol.Technol.55：680- 685)和大肠杆菌空变型(Yokota et al.，(1994)Biosci.Biotech.Biochem. 58：2164-2167)生产了丙酮酸。重组的大肠杆菌菌株被用作生物催化剂 生产对羟基肉桂酸(US20030170834)和奎尼酸(US20060003429)。
丙酸丙酸杆菌空变型被用于发酵生产丙酸(Suwannakham and Yang (2005)Biotechbol.Bioeng.91：325-337)，并且使用酪丁酸梭菌生产 丁酸(Wu and Yang(2003)Biotechnol.Bioeng.82：93-102)。通过梭 状芽孢杆菌17crl菌株发酵苏氨酸来生产丙酸盐和丙醇(Janssen(2004) Arch.Microbiol.182：482-486)。拟酵母出芽短梗霉被用于制备葡糖酸 (Anantassiadis et al.，(2005)Biotechnol.Bioeng.91：494-501)、黑 曲霉空变型(Singh et al.，(2001)Indian J.Exp.Biol.39：1136-43)。 氧化葡糖杆菌空变型制备5-氧代-D-葡糖酸(Elfari et al.，(2005) Appl Microbiol.Biotech.66：668～674)，土曲霉空变型生产衣康酸(Reddy and Singh(2002)Bioresour.Technol.85：69-71)，黑曲霉空变型生产 柠檬酸(Ikram-U1-Haq et al.，(2005)Bioresour.Technol.96：645- 648)，并且季也蒙氏假丝酵母FTI 20037生产木糖醇(Mussatto and Roberto(2003)J.Appl.Microbiol.95：331-337)。恶臭极毛杆菌和真 氧产碱杆菌重组体生产含4-羟基戊酸盐的生物聚酯，还含有大量3-羟 基丁酸3-羟基戊酸(Gorenflo et al.，(2001)Biomacromolecules 2：45 -57)。重组的大肠杆菌生产L-2，3-丁二醇(Ui et al.，(2004)Lett. Appl.Microbiol.39：533-537)。
使用棒状杆菌属、短杆菌属和沙雷氏菌属的营养缺陷菌株和氨基酸 类似物抗性株发酵生产氨基酸。例如，日本专利公开号8596/81描述了使 用组氨酸类似物抗性株以及EP136359描述了使用重组的菌株生产组氨 酸。日本专利公开号4505/72和1937/76描述了使用色氨酸类似物抗性株 生产色氨酸。日本专利公开号38995/72、6237/76、32070/79描述了使用 异亮氨酸类似物抗性株生产异亮氨酸。日本专利公开号10035/81描述了 使用苯丙氨酸类似物抗性株生产苯丙氨酸。描述了使用需要苯丙氨酸进 行生长的酪氨酸抗性株(Agr.Chem.Soc.Japan 50(1)R79-R87(1976)) 或重组菌株(EP263515，EP332234)生产酪氨酸，以及使用L-精氨酸 类似物抗性株(Agr.Biol.Chem.(1972)36：1675-1684，日本专利公开 号37235/79和150381/82)生产精氨酸。发酵大肠杆菌菌株ATCC 31882、 31883和31884生产苯丙氨酸。US 6962805描述了重组的棒杆菌生产谷氨 酸。Okamoto and lkeda(2000)J.Biosci Bioeng.89：87-79描述了大肠杆 菌空变型生产苏氨酸。百合棒杆菌空变型生产甲硫氨酸(Kumar et al， (2005)Bioresour.Technol.96：287-294)。
生物催化剂还生产有用的肽、酶及其他蛋白质(例如US6861237、 US6777207、US6228630)。
本文实施例9举例说明了预处理并糖化生物质变为可发酵糖，继之 以发酵糖类变为目标化学物质，用来从预处理的玉米棒子，使用运动发 酵单胞菌作为生物催化剂发酵糖类来生产乙醇。本方法还可以用于由生 物质生产1，3-丙二醇。根据本方法对生物质进行预处理和糖化；在糖化 之后(或期间)，如本文实施例10所述用大肠杆菌生产1，3-丙二醇。
使用本领域已知的各种方法回收生物催化剂发酵产生的目标化学 物质。通过离心、过滤、微孔过滤和纳滤分离产物和其它发酵组分。通 过离子交换、溶剂萃取或电渗析提取产物。用絮凝剂帮助产品分离。作 为一个具体实施例，使用本领域已知的用于ABE发酵的方法从发酵培 养基分离生物生产的1-丁醇(参见Durre，Appl.Microbiol.Biotechnol. 49：639-648(1998)，Groot et al.，Process.Biochem.27：61-75(1992) 及其参考文献)。例如，通过离心、过滤、倾析等从发酵培养基除去固 体。然后，使用蒸馏、共沸蒸馏、液-液萃取、吸附、气体剥离、薄膜 蒸发或渗透蒸发等方法从发酵培养基分离1-丁醇。通过例如用有机溶 剂抽提反应混合物、蒸馏和柱色谱法(U.S.5,356,812)从发酵培养基纯 化1，3-丙二醇。一种特别适于该方法的有机溶剂是环己烷(U.S. 5,008,473)。通过例如离子交换树脂吸附和/或结晶从发酵培养基收集氨 基酸。
实施例
一般方法和原料
使用下列缩写：
“HPLC”是高效液相色谱法，“C”是摄氏度，“kPa”是千帕斯 卡，“m”是米，“mm”是毫米，“kW”是千瓦，“μm”是微米，“μL” 是微升，“mL”是毫升，“L”是升，“min”是分钟，“mM”是毫摩 尔，“cm”是厘米，“g”是克，“kg”是千克，“wt”是重量，“hr” 是小时，“temp”或“T”是温度，“theoret”是理论的，“pretreat” 是预处理，“DWB”是生物质干重。
硫酸、氨水、乙酸、乙酰胺、酵母提取物、2-吗啉代乙磺酸(MES)、 磷酸钾、葡萄糖、木糖、胰蛋白胨、氯化钠和柠檬酸得自Sigma-Aldrich (St.Louis，MO)。
预处理反应器
Zipperclave反应器
4升的Zipperclave反应器(Autoclave Engineers，Erie，PA)是间歇 式耐压容器，装备有用于填充生物质的2.5升Hastelloy桶和用于混合生 物质的搅拌器。反应器容器被控制在所需的预处理温度下的电热器围 绕。还使用直接蒸汽注入迅速将生物质升至预处理温度。调节并控制蒸 汽压力以维持所需的预处理温度。加热Zipperclave反应器顶板、容器和 桶外的蒸汽冷凝水排至桶和反应器内壁之间形成的储液槽，以防止过度 稀释经过预处理的浆液。
Jaygo反应器
Jaygo反应器为130升(直径约51cm×长度91cm)、水平桨型反应器 (Jaygo Manufacturing，Inc.，Mahwah，NJ)，由HastelloyC-22合金 制造。反应器装有能够加热至约177℃(862kPa)的蒸汽套管。还使用 直接蒸汽注入迅速将生物质升至预处理温度。调节并控制蒸汽压力以维 持所需的预处理温度。许多孔口可以注入其它溶剂和热液体。
蒸汽枪反应器间歇式消化系统
4升蒸汽枪反应器(Autoclave Engineers，Erie，PA)是蒸汽夹套反 应器，包括由两个球阀紧固的一节102mm规程80 Hastelloy管。其他电 热器置于全部暴露的、反应器的非夹套表面并控制在设定的预处理温 度。还使用直接蒸汽注入迅速将生物质升至预处理温度。调节并控制蒸 汽压力以维持所需的预处理温度。反应器底部颈缩至51mm。所有经过 预处理的原料通过反应器底部处的可替换的冲模排出，并在厚壁的、带 夹套的并且冷却的闪蒸箱内支撑的0.21m3的尼龙(Hotfill)袋中收集。
圆盘磨
圆盘磨是Sprout Waldron型30.5cm精炼机(Andritz，Inc.，Muncy， PA)，装备有11kW电动机。在固定平板和旋转平板之间的间隙是可变 的。进料螺旋速度也是可变的，在0～88rpm范围。精炼机的入口有六个 进样口，以在旋转精炼机平板前引入蒸汽、热水或其它扫掠气和液体。 精炼机具有含镍铸铁D2A506型或含镍铸铁18034-A型的平板 (Durametal，Corp.，Tulatin，OR)。
预处理和酶水解反应器(PEHR)
9L PEHR(NREL，Golden，CO制造；参见共同未决美国专利申请 CL3447)具有约15cm×51cm不锈钢反应器，带有用于引入处理反应物 的注入喷管。采用旋转接头将注入喷管连接至容器一端盖上的孔口，所 述容器具有进入容器的其他孔口。四个挡板的长度直达容器壁并垂直连 接至器壁。当容器旋转时，挡板和22个在容器中自由浮动的3.2cm×3.2 cm的陶瓷研磨介质圆筒(E.R.Advanced Ceramics，East Palestine，OH) 对生物质和反应物进行机械搅拌，促进生物质吸收反应物。PEHR被置 于提供旋转机制的Bellco细胞生产滚筒装置(Bellco Cell-Production Roller Apparatus)(Bellco Technology，Vineland，NJ)，并且具有滚筒 装置的反应器被置于提供热量的温度控制室。通过将外源连接到在盖中 与喷管连接的孔口，来向反应器施加真空和压力。
分析方法
定量纤维素
用本领域熟知的方法，例如ASTM E1758-01“通过HPLC测定碳水 化合物的标准方法(Standard method for the determination of carbohydrates by HPLC)”来测定每份生物质样品中的纤维素的量。 测量糖、乙酰胺、乳酸和乙酸的含量
使用具有合适保护柱的Bio-Rad HPX-87P和Bio-Rad HPX-87H 柱(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，通过HPLC(Agilent Model 1100，Agilent Technologies，Palo Alto，CA)测量糖化液中可溶性糖(葡 萄糖、纤维二糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖)、乙酰胺、乳酸 和乙酸。测量样品的pH值并且在必要时用硫酸将其调节至5～6。然后使 样品经由0.2μm针筒式滤器直接进入HPLC小瓶。HPLC条件如下：
Biorad Aminex HPX-87P(用于碳水化合物)：
注入体积：10～50μL，取决于浓度和检测器极限
流动相：HPLC级水，0.2μm过滤并脱气的
流速：0.6mL/分钟
柱温：80～85℃，保护柱温度＜60℃
检测器温度：尽量接近主柱温度
监测器：折射率
运行时间：35分钟的数据收集加运行后的15分钟(适当调整以利于 随后洗脱化合物)
Biorad Aminex HPX-87H(用于碳水化合物、乙酰胺、乳酸、乙酸 和乙醇)
注入体积：5～10μL，取决于浓度和检测器极限
流动相：0.01N硫酸，0.2μm过滤并脱气的
流速：0.6mL/分钟
柱温：55℃
检测器温度：尽可能接近柱温
检测器：折射率
运行时间：25～75分钟的数据收集
运行之后，根据每种化合物的标准曲线确定样品浓度。
实施例1
在高生物质浓度、高温下秸杆的预处理以及氨浓度的对比
在装入生物质之前，通过向反应器循环蒸汽并通风若干次，来将 Zipperclave反应器容器和顶板预热至目标预处理温度。在预处理之前通 过真空抽吸除去预热期间形成的冷凝物。Hastelloy桶装有0.635-cm (1/4英寸)磨碎的秸杆(干重100g)并插入预热的反应器。将反应器 搅拌器设置在20rpm，同时向容器内部和生物质负荷施加真空(约85 kPa)。在容器底部附近用喷雾型喷嘴注入所需浓度的氨水溶液，以使 生物质含量的干重达到生物质-氨水混合物重量的30wt％以及表1所列 所需的氨浓度。试样的最终氨浓度为生物质干重的12％，而对照品的最 终氨浓度为生物质干重的35％。当生物质负荷的温度达到50℃时，在反 应器底部附近引入蒸汽以液化并将生物质负荷的温度升至140℃或170 ℃。在预处理结束时，通过排气冷凝器降低反应器压力，并且打开反应 器并在回收经过预处理的生物质之前施加真空(约85kPa)3分钟以降温 并从经过预处理的浆液除去多余的氨。
将含有0.5g纤维素(基于最初的原料组成)的完整的、未洗涤的预 处理浆液添加入最终容积为50mL～125mL的摇瓶。由于酶对高pH值环 境敏感，在添加酶之前加入乙酸(10-100μL)而将经过氨预处理的生 物质的pH值滴定至5.0。糖化期间通过添加50mM柠檬酸缓冲液将pH值 控制在5.0，并且将温度维持在50℃。按表1对每份样品列出的浓度添加 SpezymeCP纤维素酶(Genencor International，Rochester，NY)。糖化 96小时后，根据一般方法中描述的糖类测量方案测定所得糖化液的糖含 量。表2显示96小时之后释放的糖类。本实验的对照是1)未经处理的玉 米秸杆，其葡萄糖的理论产量为23％(使用56mg纤维素酶/g纤维素)和 2)蒸汽(140℃)预处理的玉米秸杆，其葡萄糖的理论产量为40％(使 用56mg纤维素酶/g纤维素)；对照不测量木糖。
表1：糖化96小时后经过预处理的玉米秸杆释放的糖类
DWB：生物质干重
氨 (g/100g DWB) 预处理 温度 (℃) 预处理 时间 纤维素酶 (mg/g纤维素) 释放的 葡萄糖 (理论值％) 释放的 木糖 (理论值％) 35 170 5min 56 68.0 60.0 12 170 5min 56 58.5 45.3 12 170 5min 11 40.8 27.1 35 140 5min 56 54.5 41.5 12 140 5min 56 53.0 31.4 12 140 5min 11 38.9 17.1 12 140 15min 56 62.4 49.6 12 140 15min 11 41.7 33.6
这些结果显示使用12％的氨在140℃预处理15分钟，然后糖化，比使 用35％的氨在140℃预处理5分钟释放更多的葡萄糖和木糖。因此，少量 增加预处理时间可以体现使用较低浓度氨的优势。
实施例2
在高生物质浓度、低温和极低浓度氨情况下秸杆的预处理
Jaygo反应器装有0.635-cm磨碎的秸杆(干重13kg)。向容器施加 真空(67.7kPa)，并注入稀释的氨水溶液以使氨浓度为6.2g氨/100g生 物质干重并且生物质含量的干重为生物质-氨水混合物总重量的 30wt％。解除真空，向夹套施加蒸汽以加热秸杆至100℃。将浸透的秸杆 在该温度保持8小时，在32rpm下恒速搅拌，然后持续混合所得浆液以冷 却过夜。
将含有0.5g纤维素(基于最初的原料组成)的完整的、未洗涤的预 处理浆液添加到最终容积50mL～125mL的摇瓶中。由于酶对高pH值环 境敏感，必要时在添加酶之前加入乙酸(10-100uL)将经过氨预处理 的生物质的pH值滴定至5.0。在糖化期间通过添加50mM柠檬酸缓冲液将 pH值控制在5.0，并将温度维持在50℃。添加SpezymeCP纤维素酶 (Genencor International，Rochester，NY)使其达到56mg/g纤维素。在 糖化96小时后，根据一般方法中描述的糖类测量方案测定所得糖化液的 含糖量，并如表2中所示。
表2：在96小时时经过预处理的玉米秸杆释放的糖类
氨 (g/100g DWB) 预处理 温度 (℃) 预处理 时间 纤维素酶 (mg/g纤维素) 释放的 葡萄糖 (理论值的％) 释放的 木糖 (理论值的％) 6.2 100 8hr 56 63.9 44.8
结果显示这种极低的氨浓度和低温预处理条件(进行8小时)与使 用12％的氨在140℃处理15分钟同样有效。
实施例3
在高生物质浓度、低温和极低氨浓度条件下预处理玉米棒子， 然后进行高生物质浓度糖化
将完整的或折断的玉米棒子(干重约13kg)装入Jaygo反应器。通 过让玉米棒子通过装备有平板C-2975的圆盘精研机(一般方法)而将 其折断。所得折断的玉米棒子经过1.27cm筛选。让任何残留碎片再次经 过间隙小0.5cm的圆盘精研机。向反应器施加真空，并且注入稀释的氨 水溶液以产生表3所示最终所需的氨浓度(2％或6％)和干燥生物质浓度 (30％或40％)。解除真空并向夹套施加蒸汽以加热并浸透，使完整的 玉米棒子样品达到93℃并且折断的玉米棒子样品达到85℃。短期增加搅 拌器速度(直至96rpm)以增加加热速率。让浸透的玉米棒子在该温度 保持4或8小时，以32rpm恒速搅拌，然后持续混合冷却过夜。
在从反应器除去经过预处理的生物质之前，将反应器置于在90℃的 真空下，以从经过预处理的生物质中除去氨。在糖化之前，用固体柠檬 酸将经过预处理的玉米棒子的pH值调节至5.5。让约10kg经过预处理的 完整的玉米棒子在Jaygo反应器中于50℃进行糖化。将约1400g经过预处 理的折断的玉米棒子和22个陶瓷磨碎圆筒(直径3.2cm×长3.2cm；E.R. Advanced Ceramics，East Palestine，OH)装入PEHR进行糖化。每次糖 化反应使用28mg Spezyme CP/g纤维素加28mg/g纤维素Multifect Xylanase未经处理的秸杆中的酶混合物。每次糖化开始时生物质含量的 最终干重为经过预处理的生物质-糖化酶聚生体混合物总重量的30％。 PEHR以19rpm轴向转动同时维持温度为50℃。根据一般方法中的糖类测 量方案测定所得糖化液的糖含量。在表3中显示在96小时之后糖的释 放。
表3：在糖化期间使用高浓度的生物质(干重)，从经过预处理的玉米 棒子释放的糖类。
DWB：生物质干重(以相对于混合物的总重量计算百分比)
原料 预处理 时间 (hr) 预处理 温度 (℃) 氨 (g/100g DWB) DWB (预处理) DWB (糖化) 释放的 葡萄糖 (理论值 的％) 释放的 木糖 (理论值 的％) 完整的 玉米棒子 8hr 93 6 40％ 30％ 54.4 46.1 折断的 玉米棒子 4hr 85 2 30％ 30％ 42.1 19.1
实施例4
在高生物质浓度、高温和极低氨浓度条件下预处理玉米棒子， 然后进行高生物质浓度糖化
将折断的玉米棒子(干重13kg)装入Jaygo反应器。对反应器施加 真空之后，向反应器注入适当浓度的氨水溶液以产生2％氨和30％生物质 浓度的干重，在室温下以32rpm搅拌。然后使用低压夹套蒸汽加热反应 器内容物至95℃。一旦反应器达到95℃，使用直接蒸汽注入加热反应器 内容物至145℃。当反应器达到145℃，使用夹套蒸汽和一定的直接蒸汽 注入将反应器内容物在该温度维持20分钟。在20分钟之后，从通风孔向 反应器施加真空并开启切碎机马达5分钟。1小时之后，开启通向夹套的 冷却水。将Jaygo反应器的内容物冷却至33℃～37℃；然后使用CO2将反 应器增压至138kPa。增压CO2气压维持30min。反应器内容物的最终温 度为27℃～31℃。浸透的/经过预处理的生物质的pH值为约7.5。
从Jaygo反应器除去经过预处理的生物质并转入PEHR糖化，糖化开 始时，生物质浓度的最终干重为经过预处理的生物质-糖化酶聚生体混 合物总重量的30％。然后用固体柠檬酸调节pH值至5.5，并如实施例3所 述用在未经处理的玉米棒子中的28mg Spezyme CP/g纤维素和28mg Multifect Xylanase/g纤维素消化原料。根据一般方法中的糖类测量方案 测定所得糖化液的糖含量。表4显示在消化96小时之后释放的糖类。
表4：在糖化期间使用高浓度生物质(干重)，从经过预处理的玉米棒 子释放的糖类。
原料 预处理 时间 (hr) 预处理 温度 (℃) 氨 (g/100g DWB) DWB (预处理) DWB (糖化) 释放的 葡萄糖 (理论值 的％) 释放的 木糖 (理论值 的％) 折断的 玉米棒子 20min 145 2 30％ 30％ 35.9 45 4
实施例5
添加增塑剂进行预处理
如实施例3所述预处理完整的玉米棒子，生物质浓度的干重为生物 质-氨水混合物总重量的约30％，氨为生物质干重的2wt％，在100℃下 在Jaygo反应器进行8小时，添加占生物质干重3wt％的甘油作为增塑 剂。在预处理之后，用固体柠檬酸将所得物质的pH值调节至5。然后 如实施例3中所述消化经过预处理的玉米棒子。使用28mg Spezyme CP/g纤维素在未经处理的秸杆中加28mg/g纤维素Multifect Xylanase 在未经处理的玉米棒子中的酶混合物。在消化96小时之后，葡萄糖浓 度为92.3g/L并且木糖浓度为54.4g/L。
实施例6
对经过预处理的生物质进行圆盘精炼
如实施例1所述对秸杆进行预处理，不同样品使用低氨浓度(12％) 或对照氨浓度(35％)，并且温度、时间和酶条件如表5中所列。如实施 例3所述对完整的玉米棒子进行预处理，不同样品使用极低氨浓度(3％ 或6％)，并且其它条件如表5中所列。在预处理之后，让样品经过Sprout Waldron圆盘磨。将固定平板和旋转平板之间的间隙设为0.254mm(0.010 英寸)并且输送螺旋速度为7rpm。如实施例2中所述糖化经过精炼的原 料，并且根据一般方法中的糖类测量方案测定所得糖化液的糖含量。表 5中显示糖化96小时的结果。结果显示在糖化之前进行圆盘精炼，可以 更好地消化，或使用较低浓度的酶是有效的。
表5：在糖化之前进行圆盘精炼的经过预处理的原料的可消化性
原料 预处理 时间 预处理 温度 (℃) 氨 (g/100g DWB) 纤维 素酶 (mg/g 纤维素) 添加的 木聚糖酶 (mg/g 纤维素) 释放的 葡萄糖 (理论值 的％) 释放的 木糖 (理论值 的％) 秸杆 5min 170 35 56 0 87.3 72.5 秸杆 5min 140 35 56 0 76 9 59.4 秸杆 5min 170 12 56 0 58.8 39.9 秸杆 5min 170 12 28 28 68 4 62.3 秸杆 5min 140 12 56 0 69.1 48.6 秸杆 5min 140 12 11 0 52.6 31.5 秸杆 15min 140 12 56 0 61.8 40.1 秸杆 15min 140 12 28 28 66.7 54.1 秸杆 8hr 100 6 56 0 79.9 59.6 玉米 棒子 8hr 93 6 56 0 82.4 51.7 玉米 棒子 8hr 93 6 28 28 83.1 58.6 玉米 棒子 8hr 100 2 56 0 68.0 38.5 玉米 棒子 8hr 100 2 28 28 81.0 57.3
实施例7
经过预处理的生物质的蒸汽枪处理
如实施例1中所述预处理秸杆，所用条件为生物质干重占生物质- 氨水混合物总重量的30％、占DWB 6wt％的氨、100℃、8小时、Jaygo反 应器。如实施例3中所述预处理玉米棒子，所用条件为生物质干重是生 物质-氨水混合物总重量的40％、占DWB 6wt％的氨、93℃、8小时、Jaygo 反应器。将每份经过预处理的生物质样品单独装入4升的蒸汽枪反应 器。在经过冲模释放之前，使经过预处理的原料经受170℃5分钟或140 ℃20分钟。如实施例2中所述糖化所得原料。结果显示于下面的表6中。 结果显示在糖化之前进行蒸汽枪处理改善了葡萄糖的释放。
表6：在蒸汽枪处理之后经过预处理的原料的可消化性
原料 蒸汽枪 温度(℃) 蒸汽枪 时间 (min) 纤维素酶 (mg/g 纤维素) 添加的 木聚糖酶 (mg/g 纤维素) 释放的 葡萄糖 (理论值 的％) 释放的 木糖 (理论值 的％) 秸杆 170 5 56 0 77.5 37.5 秸杆 170 5 28 28 82.5 64.4 秸杆 140 20 56 0 73.4 43.4 秸杆 140 20 28 28 82.2 66.9 玉米 棒子 170 5 28 28 70.7 47.4 玉米 棒子 170 5 11 11 49.1 38.9 玉米 棒子 140 20 28 28 55.7 39.0 玉米 棒子 140 20 11 11 32.9 24.0
实施例8
使用氨循环的预处理模型
对于下列两种预处理方案，使用Aspen模型(Aspen Technologies， Cambridge，MA，version 12.1)检查氨循环的优点：低温(85℃)长保 留时间(4小时)和高温(130℃)短保留时间(20分钟)。在每种模型 中存在一系列三个闪蒸箱，在预处理反应器之后，以连续较低的压力操 作以提供氨循环手段。当原料流进入每个闪蒸箱时，其由于压力减少而 分为蒸气和液体部分。蒸气部分循环至预处理，而液体部分继续行进到 下一步。假设预处理中氨占DWB的2wt％并且生物质干重为生物质-氨 水混合物总重量的约27％，表7中显示每一步新鲜供应的氨和循环液流供 应的氨。在两种模型中，闪蒸箱以相似的方式运转以便氨循环相似。对 于两种方案，所需氨的一半以上由循环供应，降低了对新鲜氨的需求和 成本。
表7：在预处理中的氨循环-Aspen模型试验结果。
高温/短保留时间 低温/长保留时间 进入预处理的 氨流速 (kg/hr) 在预处理中 占总氨的分数 进入预处理的 氨流速 (kg/hr) 在预处理中 占总氨的分数 闪蒸箱NH3 518.6 43.5％ 520.2 43.7％ 得自第一个闪蒸箱 371.2 31.2％ 374.4 31.4％ 得自第二个闪蒸箱 137.2 11.5％ 135.4 11.4％ 得自第三个闪蒸箱 164.1 13.8％ 161.2 13.5％ 总计 1191.2 100％ 1191.2 100％
实施例9
从低浓度氨预处理和糖化的玉米棒子生物质生产乙醇 以及与高浓度氨预处理和糖化的秸杆对比
如实施例3中所述，通过在Jaygo反应器中于93℃预处理完整的玉米 棒子8小时生产玉米棒子水解产物，所用氨浓度占生物质干重的6wt％， 生物质浓度的干重占生物质-氨水混合物总重量的40wt％。在预处理之 后，在真空下加热反应器至90℃以除去氨。然后用硫酸调节经过预处理 的生物质的pH值至5。在Jaygo反应器中糖化经过预处理的生物质，生物 质干重占经过预处理的生物质-糖化酶聚生体混合物总重量的30％，使 用28mg/g纤维素Spezyme纤维素酶和28mg/g纤维素Multifect木聚糖 酶，于50℃和pH5下糖化168小时。所得水解产物用于在Sixfors发酵罐 (INFORS AG，Switzerland)中运动发酵单胞菌8b的发酵。运动发酵单 胞菌8b是一株已经进行遗传工程化的运动发酵单胞菌，其具有比野生型 改善的乙醇生产并被描述在美国专利申请公开号2003/0162271 A1(实施 例IV、Vl和XII)中。玉米棒子水解产物含有78g/L葡萄糖、51g/L木糖、 6g/L乙酰胺和7g/L乙酸。使用40％和80％浓度的玉米棒子水解产物，与 其平衡的培养基是浓缩的液体培养基，液体培养基由酵母提取物和 KH2PO4，其含量使其在最终浆液中的浓度分别为约5g/L和2g/L。此外， 在40％水解产物浆液中，添加葡萄糖和木糖使其浓度足以与80％水解产 物浆液中的浓度相同。发酵在37℃下进行。发酵罐中的搅拌为100rpm， 并且通过添加2N KOH维持pH值5.5。在表8中显示了结果。如一般方法 中所述分析糖类和乙醇。
为了进行比较，如实施例1中所述，在Zipperclave反应器中，于170 ℃预处理秸杆5分钟产生秸杆水解产物，所用氨的浓度为生物质干重的 35wt％，生物质浓度的干重为生物质-氨水混合物总重量的约30wt％。 对经过预处理的生物质进行酶消化，生物质干重为经过预处理的生物质 -糖化酶聚生体混合物总重量的30％，使用224mg/g纤维素Spezyme CP 纤维素酶于50℃和pH5下进行，以产生用于发酵试验的高糖含量的水解 产物。所得水解产物包括88g/L葡萄糖、52g/L木糖、9g/L乙酸和15g/L 乳酸。为了生产乙醇，对40％或80％(v/v)水解产物浆液进行运动发 酵单胞菌8b的发酵。剩余体积由浓缩液体培养基组成，该培养基由酵母 提取物、KH2PO4和MES缓冲液组成，其含量使其在最终浆液中的浓度分 别为约10g/L、2g/L和0.1M。此外，在40％水解产物浆液中，添加定量 的葡萄糖和木糖，使其浓度足以与在80％水解产物浆液中的浓度相同。 于30℃和pH6下在具有20ml工作容积的25ml摇瓶中进行发酵。在150 rpm下维持搅拌。分析玉米棒子水解产物发酵样品并且结果列于表8中。
表8：在针对玉米棒子和秸杆水解产物的发酵中糖的利用和乙醇产量
秸杆(120小时终点) 玉米棒子(72小时终点) 40％水解产物 80％水解产物 40％水解产物 80％水解产物 利用的葡萄糖 100％ 97％ 99％ 97％ 利用的木糖 90％ 16％ 96％ 57％ 乙醇产量 77％ 53％ 98％ 87％
这些结果显示，用从经过低浓度氨预处理的玉米棒子水解产物的发 酵生产乙醇比用经过高浓度氨预处理的秸杆的效率更高。
实施例10
从经过极低浓度氨预处理和糖化的玉米棒子生物质生产1，3丙二醇
将经过预处理和糖化的玉米棒子产生的水解产物发酵以生产1，3- 丙二醇。在蒸汽枪反应器中预处理玉米棒子碎片以产生水解产物。首先 将玉米棒子生物质装入PEHR(一般方法描述)，施加真空，并注入稀 释的氨水溶液以使氨浓度为4g氨/100g生物质干重，生物质浓度的干重 为30g生物质干重/100g总生物质-氨水混合物。将装有氨和玉米棒子的 反应器容器于4℃旋转30分钟。将内容物转入蒸汽枪反应器(一般方法 所述)，温度升高至145℃，并且将混合物维持在该温度20分钟。蒸汽 枪中的物质进入闪蒸箱，维持闪蒸箱真空以帮助除去氨。在调节pH值之 后，将经过预处理的生物质以30g生物质干重/100g经过预处理的生物 质-糖化酶聚生体混合物糖化，使用28.4mg/g纤维素Spezyme CP纤维 素酶和10.1mg活性蛋白质/g纤维素酶聚生体(包括β-葡糖苷酶、木聚 糖酶、β-木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖酶)，于50℃和pH5.5下糖化72小时。 所得水解产物被用作可发酵糖的来源，用于通过重组的大肠杆菌菌株 RJ8n pBE93-k1转化为1，3-丙二醇。在PCT申请WO/2004/018645(实施 例7)中详细描述了构建RJ8n pBE93-k1菌株，并且其是US 6358716描 述的RJ8n菌株的衍生物。所用水解产物浓度为10％，与其平衡的液体培 养基由7.5g/L KH2PO4、2.0g/L柠檬酸*H2O、4.0ml/L 28％NH4OH、3.0 g/L(NH4)2SO4、2.0g/L MgSO4*7H2O、0.2g/L CaCl2*2H2O、0.33g/L柠 檬酸铁铵、0.5g/L酵母提取物、0.1mg/L维生素B12、1.0mg/L FeSO4*7H2O、1mg/L ZnSO4*7H2O、0.1g/L CuSO4*5H2O、1mg/L CoCl2*6H2O、0.3mg/L MnSO4*7H2O、0.1g/L H3BO4、0.10g/L NaMoO4*2H2O、10mg/L NaCl组成，将最终pH值调节至6.8。培养物起 始于250mL挡板烧瓶中50mL培养基中的冷冻原料(15％甘油作为防冻 剂)。将培养物于34℃和300rpm振摇培养24小时。根据下列条件使用 HPLC测量产生的1，3-丙二醇的量。
柱：Showdex SH1011
样品体积：20μL
流动相：0.01N H2SO4
流速：0.5ml/min
柱温：50℃
监测器：Waters 996光电二极管阵列
检测器温度：40℃
运行时间：40分钟
在下表9中显示了结果。大肠杆菌RJ8n pBE93-k1菌株发酵葡萄糖 的产物包括甘油(中间代谢物)和1，3-丙二醇。实验在烧瓶中平行进行 两次并在24小时时分析。在该体系中，水解产物中的葡萄糖转化为甘油 和1，3-丙二醇。
表9：通过采用大肠杆菌发酵的底物利用和产物形成
时间为零时的 液体培养基 烧瓶1，24小时 烧瓶2，24小时 葡萄糖(g/L) 7.39 2.12 2.10 甘油(g/L) 0 3.14 3.14 1，3-丙二醇(g/L) 0 1.03 1.07 葡萄糖的利用率 0 71％ 72％
实施例11
在预处理期间乙酰胺的形成
分析经过实施例3和实施例4所述方法预处理的玉米棒子样品，以确 定生物质中乙酰基的走向。如下分析预处理液(除去不溶性固形物的预 处理混合物)的乙酸和乙酰胺含量。用H2SO4(72％)调节每份样品的 pH值至约3。对于乙酰胺的测量，让样品通过0.2μm过滤器并根据下列条 件通过HPLC进行分析。对于总乙酸盐(包括以乙酸和乙酰胺形式存在 的乙酸盐)的测量，将酸化样品于121℃高压灭菌1小时；在该步骤期间 乙酰胺定量转化为乙酸。在高压灭菌之后，冷却样品。然后使样品通过 0.2μm过滤器进入样品小瓶并根据下列条件进行分析。根据各自产生的 标准曲线测定乙酸和乙酰胺的浓度。
流动相：0.01N H2SO4，0.2μm过滤并脱气的
流速：0.6mL/min
柱温：55～65℃
检测器温度：尽可能接近柱温
检测器：折射率
运行时间：60分钟
柱：具有相应保护柱的Biorad Aminex HPX-87H柱
表10显示了3种不同预处理条件的结果。在所有情况下，所有乙酰 基都被溶解为乙酸或乙酰胺。
表10：在预处理期间生物质中的乙酰胺向乙酰基的转化。
DWB，生物质的干重(相对于生物质-氨水混合物的总重量计算百 分比)
原料 预处理 时间 (hr) 预处理 温度 (℃) 氨 (g/100g DWB) DWB (预处理) 在液体 中回收 的初始 乙酰基 的分数 以乙酰 胺形式 回收的 乙酰基 的分数 以乙酸 形式回 收的乙 酰基的 分数 完整的 玉米棒子 8hr 93 6 40％ 100％ 44％ 56％ 折断的 玉米棒子 4hr 85 2 30％ 90％ 10％ 90％ 折断的 玉米棒子 20min 145 2 30％ 99％ 9％ 91％
使用6％浓度的氨，几乎一半乙酰基转化为乙酰胺，其如实施例12 所示对生物催化剂生长无抑制性。
实施例12
乙酰胺和乙酸对单胞发酵菌生长的影响
为了测试乙酰胺和乙酸的毒性，于pH值6.0，在有和没有乙酰胺或 乙酸条件下，在发酵培养基中培养运动发酵单胞菌菌株8b(实施例9描 述)。发酵培养基由10g/L酵母提取物、2g/L KH2PO4、70g/L葡萄糖、 40g/L木糖和0.1M MES缓冲液组成。将运动发酵单胞菌8b在25-mL挡 板Erlenmeyer摇瓶中，以150rpm于30℃旋转，在未补充培养基(对照)、 补充有的6g/L乙酰胺的培养基或补充有7.2g/L乙酸的培养基中生长。如 表1所示，乙酰胺的存在对运动发酵单胞菌的生长率或最终密度没有影 响，而乙酸的存在导致生长率降低和较低的细胞产量(通过干细胞质量 测定的)。
实施例13
在高生物质浓度、高温和极低氨浓度条件下预处理甘蔗渣， 并且以低和高浓度进行糖化
给不具有研磨介质的PEHR(常规方法中描述)中装入1.27cm磨碎 的甘蔗渣(干重370g)。这些甘蔗渣是NIST参照物质RM8491，来自甘 蔗纯系H65-7052，最初得自Hawaii Sugar Planters Association，Kunia substation，Oahu，HI。在Wiley磨中将其磨碎以通过2mm筛选，除去细 粒(+74网孔)。通过旋转使PEHR容器的外表面与冰接触而将其冷却至 4℃。向反应器容器施加真空，并注入稀释的氨水溶液以使氨浓度为4 g/100g生物质干重，生物质浓度的干重为45g/100g总生物质-氨水混合 物，其中氨水溶液在冷藏室中于4℃被预冷并通过浸于冰水浴中的桶。 通过向旋转反应器容器表面施加冰并在4℃旋转30分钟，将装有氨和甘 蔗渣的反应器容器冷却至4℃。这时内容物被转入常规方法中描述的蒸 汽枪反应器。一旦蒸汽枪反应器装入了氨-甘蔗渣混合物，温度升至145 ℃并且将混合物在该温度维持20分钟。在预处理结束时，通过1英寸圆 型冲模从蒸汽枪反应器排出甘蔗渣进入闪蒸箱。随后将一种经过预处理 的甘蔗渣样品在摇瓶中糖化，并且将另一种样品(干重约163g)在PEHR 中糖化。以占经过预处理的生物质-糖化酶聚生体混合物总重量的5％ 的生物质干重进行摇瓶的糖化，而以占经过预处理的生物质-糖化酶聚 生体混合物总重量的30％的生物质干重进行PEHR的糖化。将温度维持在 50℃。
对于PEHR的糖化，将约476g(约163g的干重)经过预处理的生物 质和22个陶瓷磨碎圆筒装入反应器容器。用固体柠檬酸调节pH值至 5.0～5.5。将反应器容器置于控制在50℃并以19rpm轴向旋转的保温箱内 部。将未经预处理的甘蔗渣也以占经过预处理的生物质-糖化酶聚生体 混合物总重量5％的生物质干重在摇瓶中糖化。所有糖化均使用28.4mg/g 纤维素Spezyme CP纤维素酶和28.4mg/g纤维素Multifect木聚糖酶于50 ℃和pH值5.5进行96小时。下表11中给出的产量是作为理论产量百分比 的释放量。
表11：在甘蔗渣预处理和糖化之后的产量
未预处理 5％ 糖化 预处理 5％DWB 糖化 预处理 30％DWB 糖化 单体葡萄糖 0.5％ 16.6％ 23.3％ 总葡萄糖 ND ND 36.4％ 单体木糖 1.3％ 15.6％ 17.2％ 总木糖 ND ND 37.4％
ND：未确定
结果显示，与未经过预处理的对照相比，使用极低氨浓度预处理甘 蔗渣允许相当多的糖释放，而在PEHR中以高干生物质浓度糖化在释放 糖类方面非常有效。
实施例14
在高生物质浓度、高温和极低氨浓度条件下预处理美国鹅掌楸锯屑， 并且以低和高浓度进行糖化
在不具有研磨介质的PEHR中装入美国鹅掌楸锯屑(干重596g；购 自Sawmiller Inc.，Haydenville，OH)。向反应器容器施加真空，并注入 稀释的氨水溶液以使氨浓度为6g/100g生物质干重，并且生物质浓度的 干重为44g/100g总生物质-氨水混合物。如实施例13中所述，将装有氨 和美国鹅掌楸锯屑的反应器容器置于4℃，并于4℃旋转30分钟。这时， 将内容物转入蒸汽枪反应器。一旦蒸汽枪反应器装入了氨-美国鹅掌楸 混合物，温度升至145℃并且在该温度维持混合物20分钟。在预处理结 束时，通过1英寸圆型冲模从蒸汽枪反应器排出美国鹅掌楸锯屑，进入 闪蒸箱。随后，将经过预处理的美国鹅掌楸锯屑样品如实施例13中所述 在摇瓶中糖化，并且将另一个样品在PEHR中糖化。以占经过预处理的 生物质-糖化酶聚生体混合物总重量5％的生物质干重进行摇瓶糖化，而 以占经过预处理的生物质-糖化酶聚生体混合物总重量30％的生物质干 重进行PEHR糖化(使用干重约279g的经过预处理的锯屑)。将未经预 处理的美国鹅掌楸锯屑也以占经过预处理的生物质-糖化酶聚生体混 合物总重量5％的生物质干重在摇瓶中糖化。所有糖化均使用28.4mg/g 纤维素Spezyme CP纤维素酶和28.4mg/g纤维素Multifect木聚糖酶于50 ℃和pH值5.5进行96小时。下表12中给出的产量是作为理论产量百分比 的每种糖类的释放量。
表12：在美国鹅掌楸锯屑的预处理和糖化之后的产量
成分 未预处理 5％DWB 糖化 预处理 5％DWB 糖化 预处理 30％DWB 糖化 葡萄糖单糖 2.7％ 11.1％ 20.6％ 总葡萄糖 ND ND 30.0％ 木糖单糖 0％ 17.9％ 18.9％ 总木糖 ND ND 40.2％
ND：未确定
结果显示，与未经预处理的对照相比，用极低氨浓度预处理的美国 鹅掌楸锯屑允许相当量的糖类释放，而在PEHR中以高生物质干重进行 糖化对释放糖类比摇瓶更有效。
实施例15
通过对得自极低氨浓度预处理和糖化的 玉米棒子生物质的水解产物进行酵母发酵来生产乙醇
与实施例10相同的用于生产1，3-丙二醇的水解产物也用于通过酵 母发酵生产乙醇。这些水解产物被用作在摇瓶中通过野生型酿酒酵母发 酵糖来源转化为乙醇。以10％(v/v)浓度使用该水解产物，与其平衡的 液体培养基包括10g/L酵母提取物和20g/L蛋白胨。在装有50mL培养基 的250mL挡板烧瓶中培养酵母。将培养物于30℃以250rpm振摇培养24 小时。如实施例9中所述通过HPLC测量产生的乙醇量，下表13中列出了 两份烧瓶的结果。
表13：通过用酵母发酵的底物利用和产物形成。
时间为零时的 液体培养基 烧瓶1，24小时 烧瓶2，24小时 葡萄糖(g/L) 13.9 1.3 0.9 乙醇(g/L) 0 4.1 4.3 葡萄糖的利用率 0 91％ 94％
实施例16
通过从得自极低氨浓度预处理和糖化的 玉米棒子生物质的水解产物进行乳酸杆菌发酵来生产乳酸
与实施例10相同的用于生产1，3-丙二醇的水解产物也用于在摇瓶 中发酵短乳杆菌来生产乳酸。以10％(v/v)的浓度使用水解产物，与其 平衡的液体培养基包括5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、2g/L柠檬酸铵、 5g/L乙酸钠、0.1g/L MgSO4、0.05g/L MnSO4和2g/L K2HPO4以及1g/L 吐温。在装有50mL肉汤的250mL挡板烧瓶中培养乳酸杆菌。于34℃以 150rpm振荡培养24小时，重复培养。如实施例10中所述通过HPLC测量 产生的乳酸量并列于表14中。两个烧瓶的2份样品是同样培养的重复试 验。
表14：通过用短乳杆菌发酵的底物利用和产物形成
时间为零时的 液体培养基 烧瓶1， 24小时 烧瓶2， 24小时 烧瓶2， 24小时 葡萄糖(g/L) 25.1 4.6 3.9 3.3 乳酸(g/L) 0 8.8 6.2 6.4 葡萄糖的利用率 0 82％ 84％ 87％
实施例17
以较高的干生物质浓度，用极低氧浓度预处理玉米棒子
用颚间距约0.95cm的颚式破碎机(2.2kW马达)处理完整的玉米棒 子，继之以破块机(1.5kW马达，Franklin MillerInc.，Livingston，NJ)， 然后用装备有1.9cm美国标准筛的Sweco筛筛选。将约805g折断的玉米 棒子装入PEHR。玉米棒子的水分含量为约7％。在装料之前用氮气冲洗 反应器容器中的空气5次。在实验开始前，将不具有研磨介质的反应器 预热至75℃，不旋转。当反应器容器内温度稳定在75℃时，开启保温箱 内的旋转机构并调节转速到19rpm。然后向反应器注入合适量的稀释的 氨水溶液以使氨浓度为6g氨/100g生物质干重，并且固形物浓度为50g 生物质干重/100g生物质-氨混合物总重量。还向溶液添加1g/100g生物 质干重的乙醇。将氨溶液泵过加热至75℃的水浴中的使用2加仑的Parr 反应器制造的加热环。通过注入喷管向反应器容器中注入加热的稀释的 氨水溶液，并在反应器中喷涂旋转并滚动的折断的玉米棒子。将反应器 维持在75℃持续2小时，同时以19rpm旋转。结束时，向反应器容器施加 真空(约85kPa)30分钟以除去氨，并将反应器内容物的温度降至约50 ℃。然后将二氧化碳注入反应器以解除真空，并用CO2将反应器加压至 103kPa表压并于该压力在50℃维持30分钟。
之后，将反应器卸压，打开并添加研磨介质。使用注入喷管注入pH 值为4.8的1M柠檬酸缓冲液并添加柠檬酸一水化物，以增加柠檬酸缓冲 液浓度至～75mM，将内容物的pH值调节至约5.5。并非所有氨均在真空 步骤中被除去，也没有被CO2中和。在加热至50℃之后，将柠檬酸缓冲 液注入反应器，然后将反应器于50℃和19rpm保温1小时以使内容物平 衡。在使用注入喷管注入柠檬酸缓冲液的同时，旋转反应器使得缓冲液 更均匀地喷洒并分布在经过预处理的玉米棒子颗粒上。从保温箱取出反 应器，打开，测定样品的pH值。如果pH值大于5.5，那么额外添加固体 柠檬酸一水化物，并将反应器于搅拌下在50℃再保温一小时。重复这些 步骤直至pH值为约5.5。一旦达到所需的pH值，将12.9mg/g纤维素 Spezyme CP(Genencor)和5mg活性蛋白质/g纤维素酶聚生体(包括β -葡糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖酶)装入反应器。 将反应器置于保温箱，在50℃19rpm下持续72小时。在这些预处理和糖 化之后，单体葡萄糖的产量是62.0％并且单体木糖的产量是31.0％。总葡 萄糖产量是75.2％并且总木糖产量是80.3％。
实施例18
以较高的固形物浓度，用极低浓度的氨和替换条件预处理玉米棒子
用锤磨机(10英寸锤磨机，Glen Mills Inc.，Clifton，NH)处理完 整的玉米棒子，使其通过1.27cm筛。将约805g折断的玉米棒子装入 PEHR。玉米棒子的水分含量为约7％。向反应器中添加22个陶瓷磨碎圆 筒(直径3.2 cm×长3.2厘米；E.R.Advanced Ceramics，East Palestine， OH)。在实验开始前，将反应器预热至95℃，不旋转。在开始之前， 向反应器容器施加真空(约85kPa)并密封容器。当反应器容器内温度 稳定在95℃时，开启保温箱内的旋转机构并调节转速到19rpm。然后向 反应器内注入合适量的稀释的氨水溶液以使氨浓度为6g氨/100g生物质 干重，并且固形物含量为50g生物质干重/100g生物质-氨混合物总重 量。将氨溶液泵过在沸水浴中的使用2加仑Parr反应器制成的加热环。通 过注入喷管向反应器容器注入加热的稀释的氨水溶液，并在反应器中喷 涂旋转并滚动的折断的玉米棒子。将反应器维持在95℃持续2小时，同 时以19rpm转动。在结束时，向反应器容器施加真空(约85kPa)30分 钟以除去氨，并将反应器内容物的温度降至约50℃。然后将二氧化碳注 入反应器以解除真空，并且将反应器加压至103kPa表压并于该压力在50 ℃维持30分钟。
之后，降低反应器压力，打开，并注入pH值为4.8的添加并溶有 柠檬酸一水化物的1M柠檬酸缓冲液，将内容物的pH值调节至约5.5。 在加热至50℃之后，将柠檬酸缓冲液注入反应器，然后将反应器于50 ℃和19rpm保温1小时以使内容物平衡。在使用注入喷管注入柠檬酸缓 冲液的同时，旋转反应器，使得缓冲液更均匀地喷洒并分布在经过预处 理的玉米棒子颗粒上。从保温箱取出反应器，打开，测定样品的pH值。 如果pH值大于5.5，那么额外添加固体柠檬酸一水化物，并将反应器于 搅拌下在50℃再保温一小时。重复这些步骤直至pH值为约5.5。一旦 达到所需pH值，将12.9mg/g纤维素Spezyme CP(Genencor)和5mg 活性蛋白质/g纤维素酶聚生体(包括β-葡糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖 苷酶和阿拉伯呋喃糖酶)装入反应器。将反应器置于保温箱，在50℃和 19rpm下持续72小时。在这些预处理和糖化之后，单体葡萄糖产量是 50.7％并且单体木糖产量是35.7％。总葡萄糖产量和总木糖产量分别是 71.7％和89.8％。
实施例19
用极低浓度的氨和额外的碱预处理玉米棒子
用颚间距为约0.95cm的颚式破碎机(2.2kW马达)处理完整的玉米棒 子，继之以破块机(1.5kW马达，Franklin Miller Inc.)处理，然后用装备 有1.9cm美国标准筛的Sweco筛筛选。将约460g折断的玉米棒子装入 PEHR。玉米棒子的水分含量为约7％。在实验开始前，将反应器预热至 95℃，不旋转。在开始之前，向反应器容器施加真空(约85kPa)并密 封容器。当反应器容器内温度再次稳定在95℃时，开启保温箱内的旋转 机构并调节转速到19rpm。然后向反应器注入合适量的氨水溶液以使氨 浓度为3.2g氨/100g生物质干重，注入NaOH使得达到1.9g NaOH/100g 生物质干重，同时维持固形物含量为30g生物质干重/100g生物质-氨混 合物总重量。将氨和额外的碱性溶液泵过在沸水浴中，的使用2加仑Parr 反应器制造的加热环。通过注入喷管将加热的稀释的氨水溶液注入反应 器容器，并在反应器中喷涂旋转并滚动的折断的玉米棒子。在注入之 后，解除容器真空至大气压。将反应器维持在95℃持续30分钟，然后将 温度降低至85℃并维持4小时。在结束时，向反应器容器施加真空(约 85kPa)30分钟以除去氨，并将反应器内容物的温度降至约50℃。然后 将二氧化碳注入反应器以解除真空，并且将反应器加压至103kPa表压并 在该压力于50℃下维持30分钟。
之后，降低反应器压力，打开，并注入约75ml pH值为4.8的添加 并溶有柠檬酸一水化物的1 M柠檬酸缓冲液，将内容物的pH值调节至 约5.5。在加热至50℃之后，将柠檬酸缓冲液注入反应器，然后将反应 器于50℃和19rpm下保温1小时以使内容物平衡。在使用注入喷管注 入柠檬酸缓冲液的同时旋转反应器，使得缓冲液更均匀地喷洒并分布在 经过预处理的玉米棒子颗粒上。从保温箱取出反应器，打开，测定样品 的pH值。如果pH值大于5.5，那么额外添加固体柠檬酸一水化物，并 将反应器于搅拌下在50℃再保温一小时。重复这些步骤直至pH值为约 5.5。一旦达到所需的pH值，将28.4mg/g纤维素Spezyme CP(Genencor) 和28.4mg/g纤维素Multifect装入反应器。将反应器置于保温箱，在50 ℃和19rpm下持续72小时。在这些预处理和糖化之后，单体葡萄糖产 量是56.1％并且单体木糖产量是39.5％。总葡萄糖产量和总木糖产量分 别是82.8％和84.2％。这些数值是2次实验的平均值。
实施例20
室温和极低浓度氨预处理
用颚间距约3/8英寸的颚式破碎机(2.2kW马达)处理完整的玉米 棒子，继之以破块机(1.5kW马达，Franklin Miller Inc.)处理，然后用 装备有1.9cm美国标准筛的Sweco筛筛选。将约460g折断的玉米棒子 装入PEHR。玉米棒子的水分含量为约7％。还向反应器中添加22个陶 瓷磨碎圆筒(直径3.2cm×长3.2厘米；E.R.Advanced Ceramics，East Palestine，OH)。在开始之前，向反应器容器施加真空(约85kPa)并 密封反应器。当反应器内温度再次稳定在室温时(22-26℃)，开启保 温箱内的旋转机构并调节转速到19rpm。然后向反应器中注入合适量的 稀释的氨水溶液，以使氨浓度为4g氨/100g生物质干重，同时维持固 形物浓度为30g生物质干重/生物质-氨混合物总重量。通过注入喷管 将稀释的氨水溶液注入反应器容器，并在反应器中喷涂旋转并滚动的折 断的玉米棒子。在注入之后，解除每个容器的真空至大气压。将反应器 在室温(22～26℃)下维持24小时。在结束时，向反应器容器施加真 空(约81kPa)30分钟以除去氨。然后将二氧化碳注入反应器以解除真 空，并用CO2将反应器加压至103kPa表压并于该压力在室温下维持30 分钟。
之后，降低反应器压力，打开，加热至50℃之后，添加柠檬酸一水 化物将内容物的pH值调节至约5.5，然后将反应器在50℃和19rpm保 温以平衡。从保温箱取出反应器，打开，测定样品的pH值。如果pH 值大于5.5，那么额外添加固体柠檬酸一水化物，并将反应器于搅拌下 在50℃下保温。重复这些步骤直至pH值为约5.5。一旦达到所需pH值， 将12.9mg/g纤维素Spezyme CP(Genencor)和5mg活性蛋白质/g纤维 素酶聚生体(包括β-葡糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶和阿拉伯呋喃 糖酶)装入反应器。将反应器置于保温箱，在50℃和19rpm下持续72 小时。在这些预处理和糖化之后，单体葡萄糖产量是4 1.7％并且单体木 糖产量是25.4％。葡萄糖总产量和木糖总产量分别是50.1％和53.2％。 这些数值是2次实验的平均值。
本申请要求享受2005年4月12日的美国临时申请号60/670437的权 益。
政府权力声明
本发明是在美国政府支持下，根据能源部授予的契约号04-03-CA -70224而完成的。政府对本发明具有一定的权力。
使用预处理方法使纤维素和木质纤维素原料的碳水化合物聚合物 更容易被糖化酶利用。标准的预处理方法曾经主要在高温下使用强酸； 然而，由于高能量成本、高设备投资、高预处理催化剂再生成本以及与 糖化酶的不相容性，正在发展替代方法，例如酶预处理，或在较温和温 度下使用酸或碱，其降低预处理期间发生的生物质碳水化合物聚合物的 水解，需要改进的酶系统来糖化纤维素和半纤维素。
一些预处理方法建议碱。Gould(Biotech，and Bioengr.(1984)26：46 -52)公开了使用过氧化氢(H2O2)预处理木质纤维素生物质的方法。 所用H2O2相对于底物的量至少为0.25wt/wt时，处理最有效。
Teixeira，L.，et al.(Appl.Biochem.and Biotech.(1999)77-79：19 -34)公开了一系列使用化学计量的氢氧化钠和氨水预处理生物质，其 中生物质浓度极低。溶液与生物质的比例是14∶1。
Elshafei，A.等人(Bioresource Tech.(1991)35：73-80)使用NaOH 预处理玉米秸杆。
Kim，T.和Y.Lee(Bioresource Technology(2005)96：2007-2013) 报告了使用大量氨水预处理玉米秸杆。
专利申请WO2004/081185探讨了水解木质纤维素的方法，包括使木 质纤维素与化学试剂接触；化学试剂可以是碱，例如碳酸钠或氢氧化 钾，在约9～约14的pH值下，在温和的温度、压力和pH值条件下。
美国专利号5,916,780和6,090,595描述了一种预处理方法，其中评价 阿糖基木聚糖与总非淀粉多糖(AX/NSP)的特定比例并用其选择原料。
为了成为经济上有竞争力的方法，从可再生资源生物质生产化合物 的商业化生产方法需要：使用少量化学试剂水解木质纤维素生物质的碳 水化合物，以提供高浓度高产量的糖类，以提供低毒的可发酵糖来源， 其被生产增值目标化学物质的生物催化剂利用。
发明既述
本发明提供使用生物质生产目标化学物质的方法。本发明的方法涉 及以较高生物质浓度，使用相对于生物质干重较低浓度的氨来预处理生 物质。在预处理之后，用糖化酶聚生体处理生物质以生产可发酵糖类。 然后让糖类与可以发酵糖类并产生目标化学物质的生物催化剂接触。在 本发明的一个实施例中，所述方法包括：
a)使生物质与含氨的水溶液接触，其中氨的浓度至少足以维持生 物质-氨水混合物的碱性pH值，但是其中所述氨的存在量小于生物质干 重的约12wt％，并且进一步，其中生物质干重处于占生物质-氨水混合 物重量的至少约15wt％的高固形物含量下；
b)在适于生产可发酵糖的条件下，使步骤(a)的产物与糖化酶聚 生体接触；以及
c)在合适的发酵的条件下，使步骤b)的产物与至少一种能发酵糖 类以生产目标化学物质的生物催化剂接触。
附图的简要描述
图1显示在存在或不存在乙酰胺和乙酸时，运动发酵单胞菌8b的生 长(描述于美国专利申请公开2003/0162271 A1的实施例IV、V1和XII 中)。
本发明的详细说明
申请人特别将此处公开的所有参考文献的全部内容结合在内。此 外，当以范围、优选的范围或一组较高的优选值和较低的优选值给出 量、浓度或其它数值或参数时，这些应被理解为具体地公开由任何一对 任何上限或优选值和任何下限或优选值形成的所有范围，不管是否该范 围被单独公开。除非另有说明，当此处列举数值范围时，范围意图包括 其端点以及所述范围内的全部整数和分数。本发明的范围不限于定义范 围时列举的具体数值。
本发明以下述方式提供使用生物质生产目标化学物质的方法：从生 物质得到糖类，其随后被用作微生物生长的碳源，所述微生物可以制备 作为其代谢产物的目标化学物质。通过以较高浓度，使用相对于生物质 干重较低浓度的氨预处理生物质来释放糖类。然后使用糖化酶聚生体消 化经过氨处理的生物质以生产可发酵糖类。糖类用作能产生目标化学物 质的微生物或生物催化剂生长的发酵基质。
定义：
本说明书中使用一些术语。提供了下列定义：
术语“可发酵糖”是指发酵过程中可以被微生物用作碳源的寡糖和 单糖。
术语“木质纤维素”是指包括木质素和纤维素的组合物。木质纤维 素物质还可以包括半纤维素。
术语“纤维素”是指包括纤维素的组合物。
生物质“干重”是除去全部或基本上全部水的生物质的重量。通常 根据美国测试和材料学会(American Society for Testing and Materials) (ASTM)标准E1756-01(测定生物质总固形物的标准试验方法)或纸 浆造纸工业股份有限公司技术协会(Technical Association of the Pulp and Paper Industry，Inc.)(TAPPI)标准T-412 om-02(纸浆，纸张和纸 板中水分)测量干重。
术语“目标化学物质”是指发酵产生的化合物。化合物为广义，并 且包括例如蛋白质的分子，包括例如肽、酶和抗体。
“可从生物质得到的”目标化学物质是通过一种方法生产的目标化 学物质，其中水解生物质以释放可发酵糖，并且使用至少一种生物催化 剂来发酵可发酵的糖以生产所需目标化学物质。
术语“增塑剂”和“软化剂”是指导致沿聚合体链或聚合体链之间 内聚的分子间作用力减少的物质。例如，上述原料可以降低结晶度，或 破坏木质素和非木质素碳水化合物纤维(例如纤维素或半纤维素)之间 的键。
术语“糖化”是指从多糖生产可发酵的糖。
“适于生产可发酵的糖的条件”是指糖化酶具有活性的条件，例如 pH值、培养基组成和温度。
“合适的发酵的条件”是指支持生物催化剂生长并产生目标化学物 质的条件。上述条件包括pH值、营养素及其他培养基组分、温度、大气 压及其他因素。
术语“经过预处理的生物质”意思是指在糖化之前已经进行预处理 的生物质。
“生物质”是指任何纤维素或木质纤维素原料并包括含有纤维素以 及任选地进一步含有半纤维素、木质素、淀粉、寡糖和/或单糖的原料。 生物质还可以包括其他组分，例如蛋白质和/或脂类。根据本方法，生物 质可以得自单一来源，或生物质可以包括得自一种以上来源的混合物； 例如生物质可以包括玉米棒子和玉米秸的混合物或草和叶的混合物。生 物质包括但不限于生物能农作物、农业残留物、城市固体废物、工业固 体废物、造纸淤泥、工场废物、木材和森林废物。生物质的实例包括但 不限于，玉米颗粒、玉米棒子、作物残渣例如玉米皮、玉米秸秆、草、 小麦、麦杆、大麦、大麦秆、干草、稻草、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高 粱、大豆、加工谷物得到的组分、树木、树枝、根苗、叶、木材碎片、 锯屑、灌木和灌木丛、蔬菜、水果、花和牲畜粪。在一个实施例中，用 于本方法的生物质包括具有相对较高碳水化合物值的生物质，它们相对 稠密和/或相对便于收集、运输、贮藏和/或处理。在本发明的一个实施 例中，有用的生物质包括玉米棒子、玉米秸杆和甘蔗渣。
对于本发明的目的，“含氨的水溶液”是指在水介质中使用氨气 (NH3)、含有铵离子(NH4+)的化合物例如氨水或硫酸铵、降解时释 放氨的化合物例如尿素及其组合物。
用于本方法的最小氨浓度足以维持生物质-氨水混合物的碱性pH 值，并且最大浓度小于生物质干重的约12wt％。这种低浓度的氨足以用 于预处理，并且低浓度还可以小于生物质干重的约10wt％。还可以使用 极低浓度的占生物质干重的6％或更少的氨进行预处理。碱性的意思是指 pH值大于7.0。特别合适的生物质-氨水混合物的pH值大于8。在一个实 施例中，存在的氨小于生物质干重的约10wt％。特别合适的氨小于生物 质干重的约6wt％。
用于本方法的氨与其它碱相比具有优势。氨分配到液相和气相中。 气态氨比液态碱更容易地扩散穿过生物质，在较低浓度下更有效地进行 预处理。本文实施例11还显示氨通过氨解作用，与生物质中的乙酰基酯 水解竞争以形成乙酰胺。乙酰胺对某些发酵生物体的毒性比醋酸盐更 低，例如运动发酵单胞菌(如本文实施例12所示)。因此，乙酰基酯转 化为乙酰胺而不是乙酸，减少了除去乙酸的需求。使用氨还减少了发酵 期间用氮源补充生长培养基的需求。此外，氨是一种廉价的原料并且因 此提供经济的方法。在预处理期间或预处理之后，氨还可以被循环至预 处理反应器，因此实现了更经济的方法。例如，当温度降低至适于糖化 时，在预处理之后释放氨气，并且任选地在真空的情况下可以循环氨 气。在连续方法中，可以连续循环氨。
根据本方法，含氨的水溶液任选地包括至少一种其他碱，例如氢氧 化钠、碳酸钠、氢氧化钾、碳酸钾、氢氧化钙和碳酸钙。所述至少一种 其他碱的添加量与铵合并的总碱量小于生物质干重的约20wt％。优选第 二碱和氨的总量小于约15wt％。例如，可以使用其他碱中和生物质中的 酸，来为糖化酶提供金属离子或为发酵生长培养基提供金属离子。
在本方法中，生物质干重的初始含量为生物质-氨水混合物重量的 至少约15％～约80％。更合适地，生物质干重的含量为生物质-氨水混 合物重量的约15％～约60％。生物质占生物质-氨水混合物的百分比维 持在较高水平，以使对糖类浓缩的需求最小化，所述糖类得自用于发酵 的经过预处理的生物质的糖化。高生物质含量还降低预处理原料的总体 积，使该方法更经济。
生物质可以以得到的形式直接使用，或可以向生物质施加能量以减 少尺寸、增加暴露的表面积和/或使生物质中存在的纤维素、半纤维素和 /或寡糖被氨和所述方法第二步所用糖化酶利用的程度。用于减少尺寸、 增加暴露的表面积和/或使生物质中存在的纤维素、半纤维素和/或寡糖 被氨和糖化酶利用的程度的能量方式包括但不限于，磨细、压碎、磨碎、 撕碎、切碎、圆盘精炼、超声和微波。可以在预处理之前或期间、糖化 之前或期间或其任意组合中施加能量。
在合适的容器中用氨溶液预处理生物质。通常，容器可以经受压 力，具有加热机构，并且具有混合内容物的机构。市场上可买到的容器 包括例如，Zipperclave反应器(Autoclave Engineers，Erie，PA)、Jaygo 反应器(Jaygo Manufacturing，Inc.，Mahwah，NJ)和蒸汽枪反应器(General Methods；Autoclave Engineers，Erie，PA描述)。可以使用许多具有相 同性能的较大规模的反应器。或者，可以在一种容器中混合生物质和氨 溶液，然后转入另一种反应器。还可以在一种容器中预处理生物质，然 后在另一种反应器，例如蒸汽枪反应器(General Methods；Autoclave Engineers，Erie，PA描述)中进一步加工。
在生物质与含氨的水溶液接触之前，向装有生物质的容器施加真 空。通过抽空生物质孔隙中的空气，可以使氨更好地渗透入生物质。施 加真空的时期和施加于生物质的负压值取决于生物质种类，并且可以凭 经验确定以便最理想地预处理生物质(如通过在糖化之后生产可发酵的 糖而测量的)。
在约4℃～约200℃温度下使生物质与含氨的水溶液接触。发现生物 质与氨在4℃首次接触，允许在该温度下渗透，增加了未经预处理的天 然生物质的糖化效率。在另一个实施例中，所述生物质的接触在约75 ℃～约150℃下进行。在另一个实施例中，所述生物质的接触在大于90 ℃至约150℃下进行。
使生物质与含氨的水溶液接触最多约25小时。预处理时间可以更 长，然而由于经济的原因实际上优选较短的处理时间。通常，与氨接触 处理的时间为约8小时或更少。较长时间的优点是降低对施加能量破碎 生物质的需求，因此优选最多约25小时的时间。
在一个实施例中，在较高温度进行预处理步骤持续较短时间，例如 在约100℃～约150℃进行约5分钟～约2小时。在另一个实施例中，在较 低温度进行预处理步骤持续较长时间，例如在约75℃～约100℃进行约2 小时～约8小时。在另一个实施例中，在室温下(约22～26℃)进行预 处理步骤持续甚至更长时间，约24小时。还可以使用在这些之间的温度 和时间的组合。
对于预处理方法，与温度、预处理时间、氨浓度、一种或多种其他 碱的浓度、生物质浓度、生物质类型和生物质粒径相关联；因此可以根 据需要调节这些变量，以获得最佳的产物与糖化酶聚生体的接触。
可以在预处理步骤(即步骤(a))中添加增塑剂、软化剂、或其 组合，例如多元醇(例如甘油、乙二醇)、多元醇的酯(例如单乙酸甘 油酯)、乙二醇醚(例如二甘醇)、乙酰胺、乙醇和乙醇胺。增塑剂可 以作为氨水溶液的组分、单独的溶液或干燥组分被添加。
可以在任何合适的容器中进行预处理反应，例如在间歇式反应器或 连续式反应器中进行。本领域技术人员应该认识到在较高温度(高于100 ℃)下需要耐压容器。合适的容器可以装备有用于搅拌生物质-氨水混 合物的叶轮等设备。Lin，K.-H.，和Van Ness，H.C.(in Perry，R.H.and Chilton，C.H.(eds)，Chemical Engineer′s Handbook，5th Edition(1973) Chapter 4，McGraw-Hill，NY)讨论了反应器设计。预处理反应可以 分批进行或连续进行。
本领域技术人员已知在发酵期间微生物生长需要氮源；因此在预处 理期间使用氨提供了氮源并降低或根除了发酵期间向生长培养基补充 氮源的需求。如果预处理产物的pH值超过糖化酶具有活性的pH值或超 过适于发酵中微生物生长的范围，可以使用酸类来降低pH值。达到所需 pH值所用的酸量可能导致形成盐，其浓度抑制糖化酶或微生物的生长。 为了降低达到所需pH值所需的酸量并降低目前预处理步骤中NH3的原 材料成本，可以从预处理反应器排出氨气并循环。通常，至少去除一 部分氨，其降低pH值却遗留某些氮气，其提供了用于随后的发酵的养 分。
为了从生物质获得足够的糖类，用氨水溶液预处理生物质一次或多 次。同样，可以进行一次或多次糖化反应。如果希望获得较高的糖产量， 可以重复预处理和糖化步骤。为了单独或共同评价预处理和糖化步骤， 测定得自起始生物质的糖类理论产量并与实测的产量相比。
糖化：
在预处理之后，产物包括氨、部分降解的生物质和可发酵糖的混合 物。在进一步处理之前，通过施加真空从经过预处理的生物质中除去 氨。去除氨降低了pH值，并且因此减少了为了获得糖化和发酵所需pH 值所用的中和酸。这导致预处理混合物中更低的盐负荷。通常残留某些 所需的氨而为发酵提供了氮源。
然后，糖化酶聚生体存在下预处理混合物进一步水解，释放水解产 物中的寡糖和/或单糖。Lynd，L.R.，et al.(Microbiol.MoI.Biol.Rev. (2002)66：506-577)回顾了糖化酶和处理生物质的方法。在一个优选 的实施例中，包括可溶性和不溶性部分的全部预处理混合物被用于糖化 反应中。
在另一个实施例中，在糖化之前，将包括氨和溶解的糖类的含水部 分与残留在混合物中的不溶性颗粒分离。用于从不溶部分中分离可溶部 分的方法包括但不限于倾析和过滤。不溶性颗粒可以被循环至预处理反 应器。在循环至预处理反应器之前，可以任选地用水性溶剂(例如水) 洗涤不溶性颗粒以去除吸附的糖类。然后，可以如上述预处理一样，用 氨水溶液对不溶部分进行额外的处理，接着用糖化酶聚生体进行糖化。 糖化之前，还可以利用合适的方法浓缩可溶部分，例如蒸发。
在糖化之前，可以处理预处理产物以改变pH值、组成或温度，以使 糖化酶聚生体的酶具有活性，由此形成适于产生可发酵糖的条件。可以 通过添加固体或液态酸类来改变pH值。或者，可以使用从发酵回收的二 氧化碳(CO2)来降低pH值。例如，通过可以从发酵罐收集CO2并且通 过鼓泡将其进料到预处理产物中，同时监控pH值，直至达到所需pH值。 可以将温度调节至与糖化酶活性相适合的温度，如下所述。可以添加糖 化酶活性所需的任何辅助因子。
糖化酶聚生体包括一种或多种酶，这些酶主要选自而非排他地选自 “糖苷酶”类，后者水解双糖、寡糖和多糖的醚键并且可以分别在一般 分类“水解酶”(EC 3.)的酶分类EC 3.2.1.x(Enzyme Nomenclature 1992， Academic Press，San Diego，CA with Supplement 1(1993)，Supplement 2(1994)，Supplement 3(1995)，Supplement 4(1997)and Supplement 5[分别在Eur.J.Biochem.(1 994)223：1-5，Eur.J.Biochem.(1995)232：1 -6，Eur.J.Biochem.(1996)237：1-5，Eur.J.Biochem.(1997)250：1 -6，and Eur.J.Biochem.(1999)264：610-650])中找到。对本方法有 用的糖苷酶可以通过其水解的生物质成分分类。对本方法有用的糖苷酶 包括纤维素水解糖苷酶(例如纤维素酶、葡聚糖内切酶、外切葡聚糖酶、 纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶)、半纤维素水解糖苷酶(例如木聚糖 酶、木聚糖内切酶、外切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、 甘露聚糖酶、半乳糖酶、果胶酶、葡糖苷酸酶)和淀粉水解糖苷酶(例 如淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、-葡糖苷酶、异 淀粉酶)。此外，向糖化酶聚生体中添加其它活性物质例如肽酶(EC 3.4.x.y)、脂肪酶(EC 3.1.1.x和3.1.4.x)、木质酶(EC 1.11.1.x)和阿 魏酰酯酶(EC 3.1.1.73)有助于从生物质的其它组分释放多糖。本领域 众所周知，产生多糖水解酶的微生物经常显示一种被具有不同底物特异 性的若干酶或一组酶催化的活性，例如纤维素降解。因此，得自微生物 的“纤维素酶”包括一组酶，这些酶均有助于纤维素降解活性。取决于 用于获得酶的纯化方案，商品或非商品酶制剂包括许多酶，例如纤维素 酶。因此，本方法的糖化酶聚生体具有酶活性，例如“纤维素酶”，然 而应认识到该活性可以被一种以上的酶催化。
可以购买糖化酶，例如SpezymeCP纤维素酶(Genencor International，Rochester，NY)和Multifect木聚糖酶(Genencor)。此 外，可以以生物学方式，包括利用重组微生物生产糖化酶。
本领域技术人员应该知晓如何确定聚生体中所用酶的有效量并调 节获得最佳酶活性的条件。本领域技术人员还应知晓如何优化聚生体内 所需酶活性的种类，以在选定条件下使给定的预处理产物获得最佳的糖 化。
优选糖化反应在对于糖化酶最佳的温度和pH值或其附近进行。在本 方法中糖化酶聚生体的最适温度为约15℃～约100℃。在另一个实施例 中，最适温度为约20℃～约80℃。最佳pH值为约2～约11。在另一个实 施例中，本方法中糖化酶聚生体的最佳pH值为约4～约10。
糖化可以进行约几分钟～约120小时，并且优选约几分钟～约48小 时。反应时间取决于酶浓度和比活度以及所用底物和环境条件，例如温 度和pH值。本领域技术人员可以容易地确定特定底物和糖化酶聚生体所 用的最佳温度、pH值和时间。
糖化可以分批进行或连续进行。糖化还可以一步完成或在若干步中 完成。例如，糖化所需的不同酶具有不同的最适pH值或最适温度。可以 在一个温度和pH值用酶进行初步处理，然后在不同温度和/或pH值用不 同的酶进行二次处理或三次(或更多)处理。此外，可以在相同的pH值 和/或温度或不同的pH值和温度，用不同的酶在顺序步骤中进行处理， 例如使用在较高的pH值和温度下稳定的并更具活性的半纤维素酶，继之 以在较低pH值和温度下具有活性的纤维素酶。
可以通过测量单糖和寡糖的释放来监控在糖化之后得自生物质的 糖类的溶解度。测量单糖和寡糖的方法为大家所熟知。例如，使用1，3 -二硝基水杨酸(DNS)分析(Miller，G.L.，Anal.Chem.(1959)31：426 -428)来测定还原糖的浓度。或者如本文一般方法部分所述，使用合 适的柱进行HPLC来测量糖类。
合适的微生物利用从生物质释放的可发酵糖来生产目标化学物 质。在糖化之后，在发酵之前，通过例如蒸发来浓缩糖化混合物，以增 加可发酵糖的浓度。任选地，以分批或连续方法将糖化产物中的液体与 固体分离。任选地，在发酵之前对液态或全部糖化产物灭菌。取决于发 酵所用微生物和糖化期间的pH值，可以调节pH值使其适于发酵。此外， 可以向糖化混合物中补加微生物生长所需的其他营养成份。例如，补充 物包括酵母提取物、特定氨基酸、磷酸盐、氮源、盐和微量元素。还包 括由特定生物催化剂生产的特定产物的生产所需的组分，例如维持质粒 的抗生素或在酶催化反应中所需的辅因子。还可以包括其他糖类以增加 总糖类浓度。糖化混合物可以被用作发酵肉汤的组分，例如组成最终培 养基的约100％～约10％。通过调节这些类型的用于生长和由生物催化剂 产生目标化学物质的因素来达到适于发酵的条件。
取决于对发酵微生物有用的条件，还可以调节温度和/或顶空气体。 发酵可以是需氧的或厌氧的。发酵可以在糖化之后进行，或通过同时的 糖化和发酵(SSF)而与糖化同时进行。SSF可以维持由糖化产生的糖 类水平较低，由此降低潜在的对糖化酶的产物的抑制，减少可被污染微 生物利用的糖，并改善经过预处理的生物质向单糖和/或寡糖的转化。
由发酵生产的目标化学物质包括例如酸类、醇类、烷烃、烯烃，芳 香族化合物、醛类、酮类、生物聚合物、蛋白质、肽、氨基酸、维生素、 抗生素和药物。醇类包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、 乙二醇、丙二醇、丁二醇、甘油、赤藓醇、木糖醇和山梨糖醇。酸类包 括乙酸、乳酸、丙酸、3-羟基丙酸、丁酸、葡糖酸、衣康酸、柠檬酸、 琥珀酸和乙酰丙酸。氨基酸包括谷氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、 甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。其他目标化学物质包括 甲烷、乙烯、丙酮和工业酶。
可以使用一种或多种合适的生物催化剂通过单级或多级发酵将糖 类发酵为目标化学物质。生物催化剂可以是选自细菌、丝状真菌和酵母 的微生物。生物催化剂可以是野生型微生物或重组的微生物，并且包括 埃希氏菌属、发酵单胞菌属、酿酒酵母属、念珠菌属、毕赤氏酵母属、 链霉菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属和梭状芽胞杆菌属。在另一个实施例 中，生物催化剂可以选自重组的大肠杆菌、运动发酵单胞菌、嗜热脂肪 芽孢杆菌、酿酒酵母、热纤梭菌、解糖热厌氧杆菌和树干毕赤酵母。
已经描述了许多用于发酵生产目标化学物质的生物催化剂，并且通 过突变方法生产的或通过重组方法工程化的其它生物催化剂。任何利用 在本方法中生产的可发酵糖的生物催化剂可以被用于通过在本方法通 过发酵制备目标化学物质。
已知生溶剂的梭状芽孢杆菌(Jones and Woods(1986)Microbiol.Rev. 50：484-524)发酵碳水化合物生成丙酮、丁醇和乙醇(ABE发酵)。在 US 5 1 92673中描述了使用丙酮丁醇棱菌空变型生产高浓度丁醇，还生产 丙酮和乙醇的发酵方法。在US 6358717中描述了使用拜季林斯基(氏) 梭菌空变型生产高浓度丁醇，还生产丙酮和乙醇。大肠杆菌的遗传修饰 菌株还被用作生产乙醇的生物催化剂(Underwood et al.，(2002)Appl. Environ.Microbiol.68：6263-6272)。在US 2003/0162271A1中描述了具 有改善的乙醇生产的运动发酵单胞菌的遗传修饰菌株。
通过大肠杆菌的重组菌株(Zhou et al.，(2003)Appl.Environ. Microbiol.69：399-407)，杆菌属的天然菌株(US20050250192)和米 根霉(Tay and Yang(2002)Biotechnol.Bioeng.80：1-12)在发酵中生 产乳酸。大肠杆菌的重组菌株已经被用作发酵的生物催化剂来生产1，3 丙二醇(US 6013494，US 6514733)和己二酸(Niu et al.，(2002)Biotechnol. Prog.18：201-211)。使用重组的梭状芽孢杆菌(Cheryan et al.，(1997) Adv.Appl.Microbiol.43：1-33)和新鉴定的酵母菌株(Freer(2002) World J.Microbiol.Biotechnol.18：271-275)通过发酵生产乙酸。US 6159738公开了重组的大肠杆菌和其他细菌以及(Lin et al.，(2005) Metab.Eng.7：116-127)公开了重组的大肠杆菌生产琥珀酸。通过光滑 球拟酵母空变型(Li et al.，(2001)Appl.Microbiol.Technol.55：680- 685)和大肠杆菌空变型(Yokota et al.，(1994)Biosci.Biotech.Biochem. 58：2164-2167)生产了丙酮酸。重组的大肠杆菌菌株被用作生物催化剂 生产对羟基肉桂酸(US20030170834)和奎尼酸(US20060003429)。
丙酸丙酸杆菌空变型被用于发酵生产丙酸(Suwannakham and Yang (2005)Biotechbol.Bioeng.91：325-337)，并且使用酪丁酸梭菌生产 丁酸(Wu and Yang(2003)Biotechnol.Bioeng.82：93-102)。通过梭 状芽孢杆菌17crl菌株发酵苏氨酸来生产丙酸盐和丙醇(Janssen(2004) Arch.Microbiol.182：482-486)。拟酵母出芽短梗霉被用于制备葡糖酸 (Anantassiadis et al.，(2005)Biotechnol.Bioeng.91：494-501)、黑 曲霉空变型(Singh et al.，(2001)Indian J.Exp.Biol.39：1136-43)。 氧化葡糖杆菌空变型制备5-氧代-D-葡糖酸(Elfari et al.，(2005) Appl Microbiol.Biotech.66：668～674)，土曲霉空变型生产衣康酸(Reddy and Singh(2002)Bioresour.Technol.85：69-71)，黑曲霉空变型生产 柠檬酸(Ikram-U1-Haq et al.，(2005)Bioresour.Technol.96：645- 648)，并且季也蒙氏假丝酵母FTI 20037生产木糖醇(Mussatto and Roberto(2003)J.Appl.Microbiol.95：331-337)。恶臭极毛杆菌和真 氧产碱杆菌重组体生产含4-羟基戊酸盐的生物聚酯，还含有大量3-羟 基丁酸3-羟基戊酸(Gorenflo et al.，(2001)Biomacromolecules 2：45 -57)。重组的大肠杆菌生产L-2，3-丁二醇(Ui et al.，(2004)Lett. Appl.Microbiol.39：533-537)。
使用棒状杆菌属、短杆菌属和沙雷氏菌属的营养缺陷菌株和氨基酸 类似物抗性株发酵生产氨基酸。例如，日本专利公开号8596/81描述了使 用组氨酸类似物抗性株以及EP136359描述了使用重组的菌株生产组氨 酸。日本专利公开号4505/72和1937/76描述了使用色氨酸类似物抗性株 生产色氨酸。日本专利公开号38995/72、6237/76、32070/79描述了使用 异亮氨酸类似物抗性株生产异亮氨酸。日本专利公开号10035/81描述了 使用苯丙氨酸类似物抗性株生产苯丙氨酸。描述了使用需要苯丙氨酸进 行生长的酪氨酸抗性株(Agr.Chem.Soc.Japan 50(1)R79-R87(1976)) 或重组菌株(EP263515，EP332234)生产酪氨酸，以及使用L-精氨酸 类似物抗性株(Agr.Biol.Chem.(1972)36：1675-1684，日本专利公开 号37235/79和150381/82)生产精氨酸。发酵大肠杆菌菌株ATCC 31882、 31883和31884生产苯丙氨酸。US 6962805描述了重组的棒杆菌生产谷氨 酸。Okamoto and lkeda(2000)J.Biosci Bioeng.89：87-79描述了大肠杆 菌空变型生产苏氨酸。百合棒杆菌空变型生产甲硫氨酸(Kumar et al， (2005)Bioresour.Technol.96：287-294)。
生物催化剂还生产有用的肽、酶及其他蛋白质(例如US6861237、 US6777207、US6228630)。
本文实施例9举例说明了预处理并糖化生物质变为可发酵糖，继之 以发酵糖类变为目标化学物质，用来从预处理的玉米棒子，使用运动发 酵单胞菌作为生物催化剂发酵糖类来生产乙醇。本方法还可以用于由生 物质生产1，3-丙二醇。根据本方法对生物质进行预处理和糖化；在糖化 之后(或期间)，如本文实施例10所述用大肠杆菌生产1，3-丙二醇。
使用本领域已知的各种方法回收生物催化剂发酵产生的目标化学 物质。通过离心、过滤、微孔过滤和纳滤分离产物和其它发酵组分。通 过离子交换、溶剂萃取或电渗析提取产物。用絮凝剂帮助产品分离。作 为一个具体实施例，使用本领域已知的用于ABE发酵的方法从发酵培 养基分离生物生产的1-丁醇(参见Durre，Appl.Microbiol.Biotechnol. 49：639-648(1998)，Groot et al.，Process.Biochem.27：61-75(1992) 及其参考文献)。例如，通过离心、过滤、倾析等从发酵培养基除去固 体。然后，使用蒸馏、共沸蒸馏、液-液萃取、吸附、气体剥离、薄膜 蒸发或渗透蒸发等方法从发酵培养基分离1-丁醇。通过例如用有机溶 剂抽提反应混合物、蒸馏和柱色谱法(U.S.5,356,812)从发酵培养基纯 化1，3-丙二醇。一种特别适于该方法的有机溶剂是环己烷(U.S. 5,008,473)。通过例如离子交换树脂吸附和/或结晶从发酵培养基收集氨 基酸。
实施例
一般方法和原料
使用下列缩写：
“HPLC”是高效液相色谱法，“C”是摄氏度，“kPa”是千帕斯 卡，“m”是米，“mm”是毫米，“kW”是千瓦，“μm”是微米，“μL” 是微升，“mL”是毫升，“L”是升，“min”是分钟，“mM”是毫摩 尔，“cm”是厘米，“g”是克，“kg”是千克，“wt”是重量，“hr” 是小时，“temp”或“T”是温度，“theoret”是理论的，“pretreat” 是预处理，“DWB”是生物质干重。
硫酸、氨水、乙酸、乙酰胺、酵母提取物、2-吗啉代乙磺酸(MES)、 磷酸钾、葡萄糖、木糖、胰蛋白胨、氯化钠和柠檬酸得自Sigma-Aldrich (St.Louis，MO)。
预处理反应器
Zipperclave反应器
4升的Zipperclave反应器(Autoclave Engineers，Erie，PA)是间歇 式耐压容器，装备有用于填充生物质的2.5升Hastelloy桶和用于混合生 物质的搅拌器。反应器容器被控制在所需的预处理温度下的电热器围 绕。还使用直接蒸汽注入迅速将生物质升至预处理温度。调节并控制蒸 汽压力以维持所需的预处理温度。加热Zipperclave反应器顶板、容器和 桶外的蒸汽冷凝水排至桶和反应器内壁之间形成的储液槽，以防止过度 稀释经过预处理的浆液。
Jaygo反应器
Jaygo反应器为130升(直径约51cm×长度91cm)、水平桨型反应器 (Jaygo Manufacturing，Inc.，Mahwah，NJ)，由HastelloyC-22合金 制造。反应器装有能够加热至约177℃(862kPa)的蒸汽套管。还使用 直接蒸汽注入迅速将生物质升至预处理温度。调节并控制蒸汽压力以维 持所需的预处理温度。许多孔口可以注入其它溶剂和热液体。
蒸汽枪反应器间歇式消化系统
4升蒸汽枪反应器(Autoclave Engineers，Erie，PA)是蒸汽夹套反 应器，包括由两个球阀紧固的一节102mm规程80 Hastelloy管。其他电 热器置于全部暴露的、反应器的非夹套表面并控制在设定的预处理温 度。还使用直接蒸汽注入迅速将生物质升至预处理温度。调节并控制蒸 汽压力以维持所需的预处理温度。反应器底部颈缩至51mm。所有经过 预处理的原料通过反应器底部处的可替换的冲模排出，并在厚壁的、带 夹套的并且冷却的闪蒸箱内支撑的0.21m3的尼龙(Hotfill)袋中收集。
圆盘磨
圆盘磨是Sprout Waldron型30.5cm精炼机(Andritz，Inc.，Muncy， PA)，装备有11kW电动机。在固定平板和旋转平板之间的间隙是可变 的。进料螺旋速度也是可变的，在0～88rpm范围。精炼机的入口有六个 进样口，以在旋转精炼机平板前引入蒸汽、热水或其它扫掠气和液体。 精炼机具有含镍铸铁D2A506型或含镍铸铁18034-A型的平板 (Durametal，Corp.，Tulatin，OR)。
预处理和酶水解反应器(PEHR)
9L PEHR(NREL，Golden，CO制造；参见共同未决美国专利申请 CL3447)具有约15cm×51cm不锈钢反应器，带有用于引入处理反应物 的注入喷管。采用旋转接头将注入喷管连接至容器一端盖上的孔口，所 述容器具有进入容器的其他孔口。四个挡板的长度直达容器壁并垂直连 接至器壁。当容器旋转时，挡板和22个在容器中自由浮动的3.2cm×3.2 cm的陶瓷研磨介质圆筒(E.R.Advanced Ceramics，East Palestine，OH) 对生物质和反应物进行机械搅拌，促进生物质吸收反应物。PEHR被置 于提供旋转机制的Bellco细胞生产滚筒装置(Bellco Cell-Production Roller Apparatus)(Bellco Technology，Vineland，NJ)，并且具有滚筒 装置的反应器被置于提供热量的温度控制室。通过将外源连接到在盖中 与喷管连接的孔口，来向反应器施加真空和压力。
分析方法
定量纤维素
用本领域熟知的方法，例如ASTM E1758-01“通过HPLC测定碳水 化合物的标准方法(Standard method for the determination of carbohydrates by HPLC)”来测定每份生物质样品中的纤维素的量。 测量糖、乙酰胺、乳酸和乙酸的含量
使用具有合适保护柱的Bio-Rad HPX-87P和Bio-Rad HPX-87H 柱(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，通过HPLC(Agilent Model 1100，Agilent Technologies，Palo Alto，CA)测量糖化液中可溶性糖(葡 萄糖、纤维二糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖)、乙酰胺、乳酸 和乙酸。测量样品的pH值并且在必要时用硫酸将其调节至5～6。然后使 样品经由0.2μm针筒式滤器直接进入HPLC小瓶。HPLC条件如下：
Biorad Aminex HPX-87P(用于碳水化合物)：
注入体积：10～50μL，取决于浓度和检测器极限
流动相：HPLC级水，0.2μm过滤并脱气的
流速：0.6mL/分钟
柱温：80～85℃，保护柱温度＜60℃
检测器温度：尽量接近主柱温度
监测器：折射率
运行时间：35分钟的数据收集加运行后的15分钟(适当调整以利于 随后洗脱化合物)
Biorad Aminex HPX-87H(用于碳水化合物、乙酰胺、乳酸、乙酸 和乙醇)
注入体积：5～10μL，取决于浓度和检测器极限
流动相：0.01N硫酸，0.2μm过滤并脱气的
流速：0.6mL/分钟
柱温：55℃
检测器温度：尽可能接近柱温
检测器：折射率
运行时间：25～75分钟的数据收集
运行之后，根据每种化合物的标准曲线确定样品浓度。
实施例1
在高生物质浓度、高温下秸杆的预处理以及氨浓度的对比
在装入生物质之前，通过向反应器循环蒸汽并通风若干次，来将 Zipperclave反应器容器和顶板预热至目标预处理温度。在预处理之前通 过真空抽吸除去预热期间形成的冷凝物。Hastelloy桶装有0.635-cm (1/4英寸)磨碎的秸杆(干重100g)并插入预热的反应器。将反应器 搅拌器设置在20rpm，同时向容器内部和生物质负荷施加真空(约85 kPa)。在容器底部附近用喷雾型喷嘴注入所需浓度的氨水溶液，以使 生物质含量的干重达到生物质-氨水混合物重量的30wt％以及表1所列 所需的氨浓度。试样的最终氨浓度为生物质干重的12％，而对照品的最 终氨浓度为生物质干重的35％。当生物质负荷的温度达到50℃时，在反 应器底部附近引入蒸汽以液化并将生物质负荷的温度升至140℃或170 ℃。在预处理结束时，通过排气冷凝器降低反应器压力，并且打开反应 器并在回收经过预处理的生物质之前施加真空(约85kPa)3分钟以降温 并从经过预处理的浆液除去多余的氨。
将含有0.5g纤维素(基于最初的原料组成)的完整的、未洗涤的预 处理浆液添加入最终容积为50mL～125mL的摇瓶。由于酶对高pH值环 境敏感，在添加酶之前加入乙酸(10-100μL)而将经过氨预处理的生 物质的pH值滴定至5.0。糖化期间通过添加50mM柠檬酸缓冲液将pH值 控制在5.0，并且将温度维持在50℃。按表1对每份样品列出的浓度添加 SpezymeCP纤维素酶(Genencor International，Rochester，NY)。糖化 96小时后，根据一般方法中描述的糖类测量方案测定所得糖化液的糖含 量。表2显示96小时之后释放的糖类。本实验的对照是1)未经处理的玉 米秸杆，其葡萄糖的理论产量为23％(使用56mg纤维素酶/g纤维素)和 2)蒸汽(140℃)预处理的玉米秸杆，其葡萄糖的理论产量为40％(使 用56mg纤维素酶/g纤维素)；对照不测量木糖。
表1：糖化96小时后经过预处理的玉米秸杆释放的糖类
DWB：生物质干重
氨 (g/100g DWB) 预处理 温度 (℃) 预处理 时间 纤维素酶 (mg/g纤维素) 释放的 葡萄糖 (理论值％) 释放的 木糖 (理论值％) 35 170 5min 56 68.0 60.0 12 170 5min 56 58.5 45.3 12 170 5min 11 40.8 27.1 35 140 5min 56 54.5 41.5 12 140 5min 56 53.0 31.4 12 140 5min 11 38.9 17.1 12 140 15min 56 62.4 49.6 12 140 15min 11 41.7 33.6
这些结果显示使用12％的氨在140℃预处理15分钟，然后糖化，比使 用35％的氨在140℃预处理5分钟释放更多的葡萄糖和木糖。因此，少量 增加预处理时间可以体现使用较低浓度氨的优势。
实施例2
在高生物质浓度、低温和极低浓度氨情况下秸杆的预处理
Jaygo反应器装有0.635-cm磨碎的秸杆(干重13kg)。向容器施加 真空(67.7kPa)，并注入稀释的氨水溶液以使氨浓度为6.2g氨/100g生 物质干重并且生物质含量的干重为生物质-氨水混合物总重量的 30wt％。解除真空，向夹套施加蒸汽以加热秸杆至100℃。将浸透的秸杆 在该温度保持8小时，在32rpm下恒速搅拌，然后持续混合所得浆液以冷 却过夜。
将含有0.5g纤维素(基于最初的原料组成)的完整的、未洗涤的预 处理浆液添加到最终容积50mL～125mL的摇瓶中。由于酶对高pH值环 境敏感，必要时在添加酶之前加入乙酸(10-100uL)将经过氨预处理 的生物质的pH值滴定至5.0。在糖化期间通过添加50mM柠檬酸缓冲液将 pH值控制在5.0，并将温度维持在50℃。添加SpezymeCP纤维素酶 (Genencor International，Rochester，NY)使其达到56mg/g纤维素。在 糖化96小时后，根据一般方法中描述的糖类测量方案测定所得糖化液的 含糖量，并如表2中所示。
表2：在96小时时经过预处理的玉米秸杆释放的糖类
氨 (g/100g DWB) 预处理 温度 (℃) 预处理 时间 纤维素酶 (mg/g纤维素) 释放的 葡萄糖 (理论值的％) 释放的 木糖 (理论值的％) 6.2 100 8hr 56 63.9 44.8
结果显示这种极低的氨浓度和低温预处理条件(进行8小时)与使 用12％的氨在140℃处理15分钟同样有效。
实施例3
在高生物质浓度、低温和极低氨浓度条件下预处理玉米棒子， 然后进行高生物质浓度糖化
将完整的或折断的玉米棒子(干重约13kg)装入Jaygo反应器。通 过让玉米棒子通过装备有平板C-2975的圆盘精研机(一般方法)而将 其折断。所得折断的玉米棒子经过1.27cm筛选。让任何残留碎片再次经 过间隙小0.5cm的圆盘精研机。向反应器施加真空，并且注入稀释的氨 水溶液以产生表3所示最终所需的氨浓度(2％或6％)和干燥生物质浓度 (30％或40％)。解除真空并向夹套施加蒸汽以加热并浸透，使完整的 玉米棒子样品达到93℃并且折断的玉米棒子样品达到85℃。短期增加搅 拌器速度(直至96rpm)以增加加热速率。让浸透的玉米棒子在该温度 保持4或8小时，以32rpm恒速搅拌，然后持续混合冷却过夜。
在从反应器除去经过预处理的生物质之前，将反应器置于在90℃的 真空下，以从经过预处理的生物质中除去氨。在糖化之前，用固体柠檬 酸将经过预处理的玉米棒子的pH值调节至5.5。让约10kg经过预处理的 完整的玉米棒子在Jaygo反应器中于50℃进行糖化。将约1400g经过预处 理的折断的玉米棒子和22个陶瓷磨碎圆筒(直径3.2cm×长3.2cm；E.R. Advanced Ceramics，East Palestine，OH)装入PEHR进行糖化。每次糖 化反应使用28mg Spezyme CP/g纤维素加28mg/g纤维素Multifect Xylanase未经处理的秸杆中的酶混合物。每次糖化开始时生物质含量的 最终干重为经过预处理的生物质-糖化酶聚生体混合物总重量的30％。 PEHR以19rpm轴向转动同时维持温度为50℃。根据一般方法中的糖类测 量方案测定所得糖化液的糖含量。在表3中显示在96小时之后糖的释 放。
表3：在糖化期间使用高浓度的生物质(干重)，从经过预处理的玉米 棒子释放的糖类。
DWB：生物质干重(以相对于混合物的总重量计算百分比)
原料 预处理 时间 (hr) 预处理 温度 (℃) 氨 (g/100g DWB) DWB (预处理) DWB (糖化) 释放的 葡萄糖 (理论值 的％) 释放的 木糖 (理论值 的％) 完整的 玉米棒子 8hr 93 6 40％ 30％ 54.4 46.1 折断的 玉米棒子 4hr 85 2 30％ 30％ 42.1 19.1
实施例4
在高生物质浓度、高温和极低氨浓度条件下预处理玉米棒子， 然后进行高生物质浓度糖化
将折断的玉米棒子(干重13kg)装入Jaygo反应器。对反应器施加 真空之后，向反应器注入适当浓度的氨水溶液以产生2％氨和30％生物质 浓度的干重，在室温下以32rpm搅拌。然后使用低压夹套蒸汽加热反应 器内容物至95℃。一旦反应器达到95℃，使用直接蒸汽注入加热反应器 内容物至145℃。当反应器达到145℃，使用夹套蒸汽和一定的直接蒸汽 注入将反应器内容物在该温度维持20分钟。在20分钟之后，从通风孔向 反应器施加真空并开启切碎机马达5分钟。1小时之后，开启通向夹套的 冷却水。将Jaygo反应器的内容物冷却至33℃～37℃；然后使用CO2将反 应器增压至138kPa。增压CO2气压维持30min。反应器内容物的最终温 度为27℃～31℃。浸透的/经过预处理的生物质的pH值为约7.5。
从Jaygo反应器除去经过预处理的生物质并转入PEHR糖化，糖化开 始时，生物质浓度的最终干重为经过预处理的生物质-糖化酶聚生体混 合物总重量的30％。然后用固体柠檬酸调节pH值至5.5，并如实施例3所 述用在未经处理的玉米棒子中的28mg Spezyme CP/g纤维素和28mg Multifect Xylanase/g纤维素消化原料。根据一般方法中的糖类测量方案 测定所得糖化液的糖含量。表4显示在消化96小时之后释放的糖类。
表4：在糖化期间使用高浓度生物质(干重)，从经过预处理的玉米棒 子释放的糖类。
原料 预处理 时间 (hr) 预处理 温度 (℃) 氨 (g/100g DWB) DWB (预处理) DWB (糖化) 释放的 葡萄糖 (理论值 的％) 释放的 木糖 (理论值 的％) 折断的 玉米棒子 20min 145 2 30％ 30％ 35.9 45 4
实施例5
添加增塑剂进行预处理
如实施例3所述预处理完整的玉米棒子，生物质浓度的干重为生物 质-氨水混合物总重量的约30％，氨为生物质干重的2wt％，在100℃下 在Jaygo反应器进行8小时，添加占生物质干重3wt％的甘油作为增塑 剂。在预处理之后，用固体柠檬酸将所得物质的pH值调节至5。然后 如实施例3中所述消化经过预处理的玉米棒子。使用28mg Spezyme CP/g纤维素在未经处理的秸杆中加28mg/g纤维素Multifect Xylanase 在未经处理的玉米棒子中的酶混合物。在消化96小时之后，葡萄糖浓 度为92.3g/L并且木糖浓度为54.4g/L。
实施例6
对经过预处理的生物质进行圆盘精炼
如实施例1所述对秸杆进行预处理，不同样品使用低氨浓度(12％) 或对照氨浓度(35％)，并且温度、时间和酶条件如表5中所列。如实施 例3所述对完整的玉米棒子进行预处理，不同样品使用极低氨浓度(3％ 或6％)，并且其它条件如表5中所列。在预处理之后，让样品经过Sprout Waldron圆盘磨。将固定平板和旋转平板之间的间隙设为0.254mm(0.010 英寸)并且输送螺旋速度为7rpm。如实施例2中所述糖化经过精炼的原 料，并且根据一般方法中的糖类测量方案测定所得糖化液的糖含量。表 5中显示糖化96小时的结果。结果显示在糖化之前进行圆盘精炼，可以 更好地消化，或使用较低浓度的酶是有效的。
表5：在糖化之前进行圆盘精炼的经过预处理的原料的可消化性
原料 预处理 时间 预处理 温度 (℃) 氨 (g/100g DWB) 纤维 素酶 (mg/g 纤维素) 添加的 木聚糖酶 (mg/g 纤维素) 释放的 葡萄糖 (理论值 的％) 释放的 木糖 (理论值 的％) 秸杆 5min 170 35 56 0 87.3 72.5 秸杆 5min 140 35 56 0 76 9 59.4 秸杆 5min 170 12 56 0 58.8 39.9 秸杆 5min 170 12 28 28 68 4 62.3 秸杆 5min 140 12 56 0 69.1 48.6 秸杆 5min 140 12 11 0 52.6 31.5 秸杆 15min 140 12 56 0 61.8 40.1 秸杆 15min 140 12 28 28 66.7 54.1 秸杆 8hr 100 6 56 0 79.9 59.6 玉米 棒子 8hr 93 6 56 0 82.4 51.7 玉米 棒子 8hr 93 6 28 28 83.1 58.6 玉米 棒子 8hr 100 2 56 0 68.0 38.5 玉米 棒子 8hr 100 2 28 28 81.0 57.3
实施例7
经过预处理的生物质的蒸汽枪处理
如实施例1中所述预处理秸杆，所用条件为生物质干重占生物质- 氨水混合物总重量的30％、占DWB 6wt％的氨、100℃、8小时、Jaygo反 应器。如实施例3中所述预处理玉米棒子，所用条件为生物质干重是生 物质-氨水混合物总重量的40％、占DWB 6wt％的氨、93℃、8小时、Jaygo 反应器。将每份经过预处理的生物质样品单独装入4升的蒸汽枪反应 器。在经过冲模释放之前，使经过预处理的原料经受170℃5分钟或140 ℃20分钟。如实施例2中所述糖化所得原料。结果显示于下面的表6中。 结果显示在糖化之前进行蒸汽枪处理改善了葡萄糖的释放。
表6：在蒸汽枪处理之后经过预处理的原料的可消化性
原料 蒸汽枪 温度(℃) 蒸汽枪 时间 (min) 纤维素酶 (mg/g 纤维素) 添加的 木聚糖酶 (mg/g 纤维素) 释放的 葡萄糖 (理论值 的％) 释放的 木糖 (理论值 的％) 秸杆 170 5 56 0 77.5 37.5 秸杆 170 5 28 28 82.5 64.4 秸杆 140 20 56 0 73.4 43.4 秸杆 140 20 28 28 82.2 66.9 玉米 棒子 170 5 28 28 70.7 47.4 玉米 棒子 170 5 11 11 49.1 38.9 玉米 棒子 140 20 28 28 55.7 39.0 玉米 棒子 140 20 11 11 32.9 24.0
实施例8
使用氨循环的预处理模型
对于下列两种预处理方案，使用Aspen模型(Aspen Technologies， Cambridge，MA，version 12.1)检查氨循环的优点：低温(85℃)长保 留时间(4小时)和高温(130℃)短保留时间(20分钟)。在每种模型 中存在一系列三个闪蒸箱，在预处理反应器之后，以连续较低的压力操 作以提供氨循环手段。当原料流进入每个闪蒸箱时，其由于压力减少而 分为蒸气和液体部分。蒸气部分循环至预处理，而液体部分继续行进到 下一步。假设预处理中氨占DWB的2wt％并且生物质干重为生物质-氨 水混合物总重量的约27％，表7中显示每一步新鲜供应的氨和循环液流供 应的氨。在两种模型中，闪蒸箱以相似的方式运转以便氨循环相似。对 于两种方案，所需氨的一半以上由循环供应，降低了对新鲜氨的需求和 成本。
表7：在预处理中的氨循环-Aspen模型试验结果。
高温/短保留时间 低温/长保留时间 进入预处理的 氨流速 (kg/hr) 在预处理中 占总氨的分数 进入预处理的 氨流速 (kg/hr) 在预处理中 占总氨的分数 闪蒸箱NH3 518.6 43.5％ 520.2 43.7％ 得自第一个闪蒸箱 371.2 31.2％ 374.4 31.4％ 得自第二个闪蒸箱 137.2 11.5％ 135.4 11.4％ 得自第三个闪蒸箱 164.1 13.8％ 161.2 13.5％ 总计 1191.2 100％ 1191.2 100％
实施例9
从低浓度氨预处理和糖化的玉米棒子生物质生产乙醇 以及与高浓度氨预处理和糖化的秸杆对比
如实施例3中所述，通过在Jaygo反应器中于93℃预处理完整的玉米 棒子8小时生产玉米棒子水解产物，所用氨浓度占生物质干重的6wt％， 生物质浓度的干重占生物质-氨水混合物总重量的40wt％。在预处理之 后，在真空下加热反应器至90℃以除去氨。然后用硫酸调节经过预处理 的生物质的pH值至5。在Jaygo反应器中糖化经过预处理的生物质，生物 质干重占经过预处理的生物质-糖化酶聚生体混合物总重量的30％，使 用28mg/g纤维素Spezyme纤维素酶和28mg/g纤维素Multifect木聚糖 酶，于50℃和pH5下糖化168小时。所得水解产物用于在Sixfors发酵罐 (INFORS AG，Switzerland)中运动发酵单胞菌8b的发酵。运动发酵单 胞菌8b是一株已经进行遗传工程化的运动发酵单胞菌，其具有比野生型 改善的乙醇生产并被描述在美国专利申请公开号2003/0162271 A1(实施 例IV、Vl和XII)中。玉米棒子水解产物含有78g/L葡萄糖、51g/L木糖、 6g/L乙酰胺和7g/L乙酸。使用40％和80％浓度的玉米棒子水解产物，与 其平衡的培养基是浓缩的液体培养基，液体培养基由酵母提取物和 KH2PO4，其含量使其在最终浆液中的浓度分别为约5g/L和2g/L。此外， 在40％水解产物浆液中，添加葡萄糖和木糖使其浓度足以与80％水解产 物浆液中的浓度相同。发酵在37℃下进行。发酵罐中的搅拌为100rpm， 并且通过添加2N KOH维持pH值5.5。在表8中显示了结果。如一般方法 中所述分析糖类和乙醇。
为了进行比较，如实施例1中所述，在Zipperclave反应器中，于170 ℃预处理秸杆5分钟产生秸杆水解产物，所用氨的浓度为生物质干重的 35wt％，生物质浓度的干重为生物质-氨水混合物总重量的约30wt％。 对经过预处理的生物质进行酶消化，生物质干重为经过预处理的生物质 -糖化酶聚生体混合物总重量的30％，使用224mg/g纤维素Spezyme CP 纤维素酶于50℃和pH5下进行，以产生用于发酵试验的高糖含量的水解 产物。所得水解产物包括88g/L葡萄糖、52g/L木糖、9g/L乙酸和15g/L 乳酸。为了生产乙醇，对40％或80％(v/v)水解产物浆液进行运动发 酵单胞菌8b的发酵。剩余体积由浓缩液体培养基组成，该培养基由酵母 提取物、KH2PO4和MES缓冲液组成，其含量使其在最终浆液中的浓度分 别为约10g/L、2g/L和0.1M。此外，在40％水解产物浆液中，添加定量 的葡萄糖和木糖，使其浓度足以与在80％水解产物浆液中的浓度相同。 于30℃和pH6下在具有20ml工作容积的25ml摇瓶中进行发酵。在150 rpm下维持搅拌。分析玉米棒子水解产物发酵样品并且结果列于表8中。
表8：在针对玉米棒子和秸杆水解产物的发酵中糖的利用和乙醇产量
秸杆(120小时终点) 玉米棒子(72小时终点) 40％水解产物 80％水解产物 40％水解产物 80％水解产物 利用的葡萄糖 100％ 97％ 99％ 97％ 利用的木糖 90％ 16％ 96％ 57％ 乙醇产量 77％ 53％ 98％ 87％
这些结果显示，用从经过低浓度氨预处理的玉米棒子水解产物的发 酵生产乙醇比用经过高浓度氨预处理的秸杆的效率更高。
实施例10
从经过极低浓度氨预处理和糖化的玉米棒子生物质生产1，3丙二醇
将经过预处理和糖化的玉米棒子产生的水解产物发酵以生产1，3- 丙二醇。在蒸汽枪反应器中预处理玉米棒子碎片以产生水解产物。首先 将玉米棒子生物质装入PEHR(一般方法描述)，施加真空，并注入稀 释的氨水溶液以使氨浓度为4g氨/100g生物质干重，生物质浓度的干重 为30g生物质干重/100g总生物质-氨水混合物。将装有氨和玉米棒子的 反应器容器于4℃旋转30分钟。将内容物转入蒸汽枪反应器(一般方法 所述)，温度升高至145℃，并且将混合物维持在该温度20分钟。蒸汽 枪中的物质进入闪蒸箱，维持闪蒸箱真空以帮助除去氨。在调节pH值之 后，将经过预处理的生物质以30g生物质干重/100g经过预处理的生物 质-糖化酶聚生体混合物糖化，使用28.4mg/g纤维素Spezyme CP纤维 素酶和10.1mg活性蛋白质/g纤维素酶聚生体(包括β-葡糖苷酶、木聚 糖酶、β-木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖酶)，于50℃和pH5.5下糖化72小时。 所得水解产物被用作可发酵糖的来源，用于通过重组的大肠杆菌菌株 RJ8n pBE93-k1转化为1，3-丙二醇。在PCT申请WO/2004/018645(实施 例7)中详细描述了构建RJ8n pBE93-k1菌株，并且其是US 6358716描 述的RJ8n菌株的衍生物。所用水解产物浓度为10％，与其平衡的液体培 养基由7.5g/L KH2PO4、2.0g/L柠檬酸*H2O、4.0ml/L 28％NH4OH、3.0 g/L(NH4)2SO4、2.0g/L MgSO4*7H2O、0.2g/L CaCl2*2H2O、0.33g/L柠 檬酸铁铵、0.5g/L酵母提取物、0.1mg/L维生素B12、1.0mg/L FeSO4*7H2O、1mg/L ZnSO4*7H2O、0.1g/L CuSO4*5H2O、1mg/L CoCl2*6H2O、0.3mg/L MnSO4*7H2O、0.1g/L H3BO4、0.10g/L NaMoO4*2H2O、10mg/L NaCl组成，将最终pH值调节至6.8。培养物起 始于250mL挡板烧瓶中50mL培养基中的冷冻原料(15％甘油作为防冻 剂)。将培养物于34℃和300rpm振摇培养24小时。根据下列条件使用 HPLC测量产生的1，3-丙二醇的量。
柱：Showdex SH1011
样品体积：20μL
流动相：0.01N H2SO4
流速：0.5ml/min
柱温：50℃
监测器：Waters 996光电二极管阵列
检测器温度：40℃
运行时间：40分钟
在下表9中显示了结果。大肠杆菌RJ8n pBE93-k1菌株发酵葡萄糖 的产物包括甘油(中间代谢物)和1，3-丙二醇。实验在烧瓶中平行进行 两次并在24小时时分析。在该体系中，水解产物中的葡萄糖转化为甘油 和1，3-丙二醇。
表9：通过采用大肠杆菌发酵的底物利用和产物形成
时间为零时的 液体培养基 烧瓶1，24小时 烧瓶2，24小时 葡萄糖(g/L) 7.39 2.12 2.10 甘油(g/L) 0 3.14 3.14 1，3-丙二醇(g/L) 0 1.03 1.07 葡萄糖的利用率 0 71％ 72％
实施例11
在预处理期间乙酰胺的形成
分析经过实施例3和实施例4所述方法预处理的玉米棒子样品，以确 定生物质中乙酰基的走向。如下分析预处理液(除去不溶性固形物的预 处理混合物)的乙酸和乙酰胺含量。用H2SO4(72％)调节每份样品的 pH值至约3。对于乙酰胺的测量，让样品通过0.2μm过滤器并根据下列条 件通过HPLC进行分析。对于总乙酸盐(包括以乙酸和乙酰胺形式存在 的乙酸盐)的测量，将酸化样品于121℃高压灭菌1小时；在该步骤期间 乙酰胺定量转化为乙酸。在高压灭菌之后，冷却样品。然后使样品通过 0.2μm过滤器进入样品小瓶并根据下列条件进行分析。根据各自产生的 标准曲线测定乙酸和乙酰胺的浓度。
流动相：0.01N H2SO4，0.2μm过滤并脱气的
流速：0.6mL/min
柱温：55～65℃
检测器温度：尽可能接近柱温
检测器：折射率
运行时间：60分钟
柱：具有相应保护柱的Biorad Aminex HPX-87H柱
表10显示了3种不同预处理条件的结果。在所有情况下，所有乙酰 基都被溶解为乙酸或乙酰胺。
表10：在预处理期间生物质中的乙酰胺向乙酰基的转化。
DWB，生物质的干重(相对于生物质-氨水混合物的总重量计算百 分比)
原料 预处理 时间 (hr) 预处理 温度 (℃) 氨 (g/100g DWB) DWB (预处理) 在液体 中回收 的初始 乙酰基 的分数 以乙酰 胺形式 回收的 乙酰基 的分数 以乙酸 形式回 收的乙 酰基的 分数 完整的 玉米棒子 8hr 93 6 40％ 100％ 44％ 56％ 折断的 玉米棒子 4hr 85 2 30％ 90％ 10％ 90％ 折断的 玉米棒子 20min 145 2 30％ 99％ 9％ 91％
使用6％浓度的氨，几乎一半乙酰基转化为乙酰胺，其如实施例12 所示对生物催化剂生长无抑制性。
实施例12
乙酰胺和乙酸对单胞发酵菌生长的影响
为了测试乙酰胺和乙酸的毒性，于pH值6.0，在有和没有乙酰胺或 乙酸条件下，在发酵培养基中培养运动发酵单胞菌菌株8b(实施例9描 述)。发酵培养基由10g/L酵母提取物、2g/L KH2PO4、70g/L葡萄糖、 40g/L木糖和0.1M MES缓冲液组成。将运动发酵单胞菌8b在25-mL挡 板Erlenmeyer摇瓶中，以150rpm于30℃旋转，在未补充培养基(对照)、 补充有的6g/L乙酰胺的培养基或补充有7.2g/L乙酸的培养基中生长。如 表1所示，乙酰胺的存在对运动发酵单胞菌的生长率或最终密度没有影 响，而乙酸的存在导致生长率降低和较低的细胞产量(通过干细胞质量 测定的)。
实施例13
在高生物质浓度、高温和极低氨浓度条件下预处理甘蔗渣， 并且以低和高浓度进行糖化
给不具有研磨介质的PEHR(常规方法中描述)中装入1.27cm磨碎 的甘蔗渣(干重370g)。这些甘蔗渣是NIST参照物质RM8491，来自甘 蔗纯系H65-7052，最初得自Hawaii Sugar Planters Association，Kunia substation，Oahu，HI。在Wiley磨中将其磨碎以通过2mm筛选，除去细 粒(+74网孔)。通过旋转使PEHR容器的外表面与冰接触而将其冷却至 4℃。向反应器容器施加真空，并注入稀释的氨水溶液以使氨浓度为4 g/100g生物质干重，生物质浓度的干重为45g/100g总生物质-氨水混合 物，其中氨水溶液在冷藏室中于4℃被预冷并通过浸于冰水浴中的桶。 通过向旋转反应器容器表面施加冰并在4℃旋转30分钟，将装有氨和甘 蔗渣的反应器容器冷却至4℃。这时内容物被转入常规方法中描述的蒸 汽枪反应器。一旦蒸汽枪反应器装入了氨-甘蔗渣混合物，温度升至145 ℃并且将混合物在该温度维持20分钟。在预处理结束时，通过1英寸圆 型冲模从蒸汽枪反应器排出甘蔗渣进入闪蒸箱。随后将一种经过预处理 的甘蔗渣样品在摇瓶中糖化，并且将另一种样品(干重约163g)在PEHR 中糖化。以占经过预处理的生物质-糖化酶聚生体混合物总重量的5％ 的生物质干重进行摇瓶的糖化，而以占经过预处理的生物质-糖化酶聚 生体混合物总重量的30％的生物质干重进行PEHR的糖化。将温度维持在 50℃。
对于PEHR的糖化，将约476g(约163g的干重)经过预处理的生物 质和22个陶瓷磨碎圆筒装入反应器容器。用固体柠檬酸调节pH值至 5.0～5.5。将反应器容器置于控制在50℃并以19rpm轴向旋转的保温箱内 部。将未经预处理的甘蔗渣也以占经过预处理的生物质-糖化酶聚生体 混合物总重量5％的生物质干重在摇瓶中糖化。所有糖化均使用28.4mg/g 纤维素Spezyme CP纤维素酶和28.4mg/g纤维素Multifect木聚糖酶于50 ℃和pH值5.5进行96小时。下表11中给出的产量是作为理论产量百分比 的释放量。
表11：在甘蔗渣预处理和糖化之后的产量
未预处理 5％ 糖化 预处理 5％DWB 糖化 预处理 30％DWB 糖化 单体葡萄糖 0.5％ 16.6％ 23.3％ 总葡萄糖 ND ND 36.4％ 单体木糖 1.3％ 15.6％ 17.2％ 总木糖 ND ND 37.4％
ND：未确定
结果显示，与未经过预处理的对照相比，使用极低氨浓度预处理甘 蔗渣允许相当多的糖释放，而在PEHR中以高干生物质浓度糖化在释放 糖类方面非常有效。
实施例14
在高生物质浓度、高温和极低氨浓度条件下预处理美国鹅掌楸锯屑， 并且以低和高浓度进行糖化
在不具有研磨介质的PEHR中装入美国鹅掌楸锯屑(干重596g；购 自Sawmiller Inc.，Haydenville，OH)。向反应器容器施加真空，并注入 稀释的氨水溶液以使氨浓度为6g/100g生物质干重，并且生物质浓度的 干重为44g/100g总生物质-氨水混合物。如实施例13中所述，将装有氨 和美国鹅掌楸锯屑的反应器容器置于4℃，并于4℃旋转30分钟。这时， 将内容物转入蒸汽枪反应器。一旦蒸汽枪反应器装入了氨-美国鹅掌楸 混合物，温度升至145℃并且在该温度维持混合物20分钟。在预处理结 束时，通过1英寸圆型冲模从蒸汽枪反应器排出美国鹅掌楸锯屑，进入 闪蒸箱。随后，将经过预处理的美国鹅掌楸锯屑样品如实施例13中所述 在摇瓶中糖化，并且将另一个样品在PEHR中糖化。以占经过预处理的 生物质-糖化酶聚生体混合物总重量5％的生物质干重进行摇瓶糖化，而 以占经过预处理的生物质-糖化酶聚生体混合物总重量30％的生物质干 重进行PEHR糖化(使用干重约279g的经过预处理的锯屑)。将未经预 处理的美国鹅掌楸锯屑也以占经过预处理的生物质-糖化酶聚生体混 合物总重量5％的生物质干重在摇瓶中糖化。所有糖化均使用28.4mg/g 纤维素Spezyme CP纤维素酶和28.4mg/g纤维素Multifect木聚糖酶于50 ℃和pH值5.5进行96小时。下表12中给出的产量是作为理论产量百分比 的每种糖类的释放量。
表12：在美国鹅掌楸锯屑的预处理和糖化之后的产量
成分 未预处理 5％DWB 糖化 预处理 5％DWB 糖化 预处理 30％DWB 糖化 葡萄糖单糖 2.7％ 11.1％ 20.6％ 总葡萄糖 ND ND 30.0％ 木糖单糖 0％ 17.9％ 18.9％ 总木糖 ND ND 40.2％
ND：未确定
结果显示，与未经预处理的对照相比，用极低氨浓度预处理的美国 鹅掌楸锯屑允许相当量的糖类释放，而在PEHR中以高生物质干重进行 糖化对释放糖类比摇瓶更有效。
实施例15
通过对得自极低氨浓度预处理和糖化的 玉米棒子生物质的水解产物进行酵母发酵来生产乙醇
与实施例10相同的用于生产1，3-丙二醇的水解产物也用于通过酵 母发酵生产乙醇。这些水解产物被用作在摇瓶中通过野生型酿酒酵母发 酵糖来源转化为乙醇。以10％(v/v)浓度使用该水解产物，与其平衡的 液体培养基包括10g/L酵母提取物和20g/L蛋白胨。在装有50mL培养基 的250mL挡板烧瓶中培养酵母。将培养物于30℃以250rpm振摇培养24 小时。如实施例9中所述通过HPLC测量产生的乙醇量，下表13中列出了 两份烧瓶的结果。
表13：通过用酵母发酵的底物利用和产物形成。
时间为零时的 液体培养基 烧瓶1，24小时 烧瓶2，24小时 葡萄糖(g/L) 13.9 1.3 0.9 乙醇(g/L) 0 4.1 4.3 葡萄糖的利用率 0 91％ 94％
实施例16
通过从得自极低氨浓度预处理和糖化的 玉米棒子生物质的水解产物进行乳酸杆菌发酵来生产乳酸
与实施例10相同的用于生产1，3-丙二醇的水解产物也用于在摇瓶 中发酵短乳杆菌来生产乳酸。以10％(v/v)的浓度使用水解产物，与其 平衡的液体培养基包括5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、2g/L柠檬酸铵、 5g/L乙酸钠、0.1g/L MgSO4、0.05g/L MnSO4和2g/L K2HPO4以及1g/L 吐温。在装有50mL肉汤的250mL挡板烧瓶中培养乳酸杆菌。于34℃以 150rpm振荡培养24小时，重复培养。如实施例10中所述通过HPLC测量 产生的乳酸量并列于表14中。两个烧瓶的2份样品是同样培养的重复试 验。
表14：通过用短乳杆菌发酵的底物利用和产物形成
时间为零时的 液体培养基 烧瓶1， 24小时 烧瓶2， 24小时 烧瓶2， 24小时 葡萄糖(g/L) 25.1 4.6 3.9 3.3 乳酸(g/L) 0 8.8 6.2 6.4 葡萄糖的利用率 0 82％ 84％ 87％
实施例17
以较高的干生物质浓度，用极低氧浓度预处理玉米棒子
用颚间距约0.95cm的颚式破碎机(2.2kW马达)处理完整的玉米棒 子，继之以破块机(1.5kW马达，Franklin MillerInc.，Livingston，NJ)， 然后用装备有1.9cm美国标准筛的Sweco筛筛选。将约805g折断的玉米 棒子装入PEHR。玉米棒子的水分含量为约7％。在装料之前用氮气冲洗 反应器容器中的空气5次。在实验开始前，将不具有研磨介质的反应器 预热至75℃，不旋转。当反应器容器内温度稳定在75℃时，开启保温箱 内的旋转机构并调节转速到19rpm。然后向反应器注入合适量的稀释的 氨水溶液以使氨浓度为6g氨/100g生物质干重，并且固形物浓度为50g 生物质干重/100g生物质-氨混合物总重量。还向溶液添加1g/100g生物 质干重的乙醇。将氨溶液泵过加热至75℃的水浴中的使用2加仑的Parr 反应器制造的加热环。通过注入喷管向反应器容器中注入加热的稀释的 氨水溶液，并在反应器中喷涂旋转并滚动的折断的玉米棒子。将反应器 维持在75℃持续2小时，同时以19rpm旋转。结束时，向反应器容器施加 真空(约85kPa)30分钟以除去氨，并将反应器内容物的温度降至约50 ℃。然后将二氧化碳注入反应器以解除真空，并用CO2将反应器加压至 103kPa表压并于该压力在50℃维持30分钟。
之后，将反应器卸压，打开并添加研磨介质。使用注入喷管注入pH 值为4.8的1M柠檬酸缓冲液并添加柠檬酸一水化物，以增加柠檬酸缓冲 液浓度至～75mM，将内容物的pH值调节至约5.5。并非所有氨均在真空 步骤中被除去，也没有被CO2中和。在加热至50℃之后，将柠檬酸缓冲 液注入反应器，然后将反应器于50℃和19rpm保温1小时以使内容物平 衡。在使用注入喷管注入柠檬酸缓冲液的同时，旋转反应器使得缓冲液 更均匀地喷洒并分布在经过预处理的玉米棒子颗粒上。从保温箱取出反 应器，打开，测定样品的pH值。如果pH值大于5.5，那么额外添加固体 柠檬酸一水化物，并将反应器于搅拌下在50℃再保温一小时。重复这些 步骤直至pH值为约5.5。一旦达到所需的pH值，将12.9mg/g纤维素 Spezyme CP(Genencor)和5mg活性蛋白质/g纤维素酶聚生体(包括β -葡糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖酶)装入反应器。 将反应器置于保温箱，在50℃19rpm下持续72小时。在这些预处理和糖 化之后，单体葡萄糖的产量是62.0％并且单体木糖的产量是31.0％。总葡 萄糖产量是75.2％并且总木糖产量是80.3％。
实施例18
以较高的固形物浓度，用极低浓度的氨和替换条件预处理玉米棒子
用锤磨机(10英寸锤磨机，Glen Mills Inc.，Clifton，NH)处理完 整的玉米棒子，使其通过1.27cm筛。将约805g折断的玉米棒子装入 PEHR。玉米棒子的水分含量为约7％。向反应器中添加22个陶瓷磨碎圆 筒(直径3.2 cm×长3.2厘米；E.R.Advanced Ceramics，East Palestine， OH)。在实验开始前，将反应器预热至95℃，不旋转。在开始之前， 向反应器容器施加真空(约85kPa)并密封容器。当反应器容器内温度 稳定在95℃时，开启保温箱内的旋转机构并调节转速到19rpm。然后向 反应器内注入合适量的稀释的氨水溶液以使氨浓度为6g氨/100g生物质 干重，并且固形物含量为50g生物质干重/100g生物质-氨混合物总重 量。将氨溶液泵过在沸水浴中的使用2加仑Parr反应器制成的加热环。通 过注入喷管向反应器容器注入加热的稀释的氨水溶液，并在反应器中喷 涂旋转并滚动的折断的玉米棒子。将反应器维持在95℃持续2小时，同 时以19rpm转动。在结束时，向反应器容器施加真空(约85kPa)30分 钟以除去氨，并将反应器内容物的温度降至约50℃。然后将二氧化碳注 入反应器以解除真空，并且将反应器加压至103kPa表压并于该压力在50 ℃维持30分钟。
之后，降低反应器压力，打开，并注入pH值为4.8的添加并溶有 柠檬酸一水化物的1M柠檬酸缓冲液，将内容物的pH值调节至约5.5。 在加热至50℃之后，将柠檬酸缓冲液注入反应器，然后将反应器于50 ℃和19rpm保温1小时以使内容物平衡。在使用注入喷管注入柠檬酸缓 冲液的同时，旋转反应器，使得缓冲液更均匀地喷洒并分布在经过预处 理的玉米棒子颗粒上。从保温箱取出反应器，打开，测定样品的pH值。 如果pH值大于5.5，那么额外添加固体柠檬酸一水化物，并将反应器于 搅拌下在50℃再保温一小时。重复这些步骤直至pH值为约5.5。一旦 达到所需pH值，将12.9mg/g纤维素Spezyme CP(Genencor)和5mg 活性蛋白质/g纤维素酶聚生体(包括β-葡糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖 苷酶和阿拉伯呋喃糖酶)装入反应器。将反应器置于保温箱，在50℃和 19rpm下持续72小时。在这些预处理和糖化之后，单体葡萄糖产量是 50.7％并且单体木糖产量是35.7％。总葡萄糖产量和总木糖产量分别是 71.7％和89.8％。
实施例19
用极低浓度的氨和额外的碱预处理玉米棒子
用颚间距为约0.95cm的颚式破碎机(2.2kW马达)处理完整的玉米棒 子，继之以破块机(1.5kW马达，Franklin Miller Inc.)处理，然后用装备 有1.9cm美国标准筛的Sweco筛筛选。将约460g折断的玉米棒子装入 PEHR。玉米棒子的水分含量为约7％。在实验开始前，将反应器预热至 95℃，不旋转。在开始之前，向反应器容器施加真空(约85kPa)并密 封容器。当反应器容器内温度再次稳定在95℃时，开启保温箱内的旋转 机构并调节转速到19rpm。然后向反应器注入合适量的氨水溶液以使氨 浓度为3.2g氨/100g生物质干重，注入NaOH使得达到1.9g NaOH/100g 生物质干重，同时维持固形物含量为30g生物质干重/100g生物质-氨混 合物总重量。将氨和额外的碱性溶液泵过在沸水浴中，的使用2加仑Parr 反应器制造的加热环。通过注入喷管将加热的稀释的氨水溶液注入反应 器容器，并在反应器中喷涂旋转并滚动的折断的玉米棒子。在注入之 后，解除容器真空至大气压。将反应器维持在95℃持续30分钟，然后将 温度降低至85℃并维持4小时。在结束时，向反应器容器施加真空(约 85kPa)30分钟以除去氨，并将反应器内容物的温度降至约50℃。然后 将二氧化碳注入反应器以解除真空，并且将反应器加压至103kPa表压并 在该压力于50℃下维持30分钟。
之后，降低反应器压力，打开，并注入约75ml pH值为4.8的添加 并溶有柠檬酸一水化物的1 M柠檬酸缓冲液，将内容物的pH值调节至 约5.5。在加热至50℃之后，将柠檬酸缓冲液注入反应器，然后将反应 器于50℃和19rpm下保温1小时以使内容物平衡。在使用注入喷管注 入柠檬酸缓冲液的同时旋转反应器，使得缓冲液更均匀地喷洒并分布在 经过预处理的玉米棒子颗粒上。从保温箱取出反应器，打开，测定样品 的pH值。如果pH值大于5.5，那么额外添加固体柠檬酸一水化物，并 将反应器于搅拌下在50℃再保温一小时。重复这些步骤直至pH值为约 5.5。一旦达到所需的pH值，将28.4mg/g纤维素Spezyme CP(Genencor) 和28.4mg/g纤维素Multifect装入反应器。将反应器置于保温箱，在50 ℃和19rpm下持续72小时。在这些预处理和糖化之后，单体葡萄糖产 量是56.1％并且单体木糖产量是39.5％。总葡萄糖产量和总木糖产量分 别是82.8％和84.2％。这些数值是2次实验的平均值。
实施例20
室温和极低浓度氨预处理
用颚间距约3/8英寸的颚式破碎机(2.2kW马达)处理完整的玉米 棒子，继之以破块机(1.5kW马达，Franklin Miller Inc.)处理，然后用 装备有1.9cm美国标准筛的Sweco筛筛选。将约460g折断的玉米棒子 装入PEHR。玉米棒子的水分含量为约7％。还向反应器中添加22个陶 瓷磨碎圆筒(直径3.2cm×长3.2厘米；E.R.Advanced Ceramics，East Palestine，OH)。在开始之前，向反应器容器施加真空(约85kPa)并 密封反应器。当反应器内温度再次稳定在室温时(22-26℃)，开启保 温箱内的旋转机构并调节转速到19rpm。然后向反应器中注入合适量的 稀释的氨水溶液，以使氨浓度为4g氨/100g生物质干重，同时维持固 形物浓度为30g生物质干重/生物质-氨混合物总重量。通过注入喷管 将稀释的氨水溶液注入反应器容器，并在反应器中喷涂旋转并滚动的折 断的玉米棒子。在注入之后，解除每个容器的真空至大气压。将反应器 在室温(22～26℃)下维持24小时。在结束时，向反应器容器施加真 空(约81kPa)30分钟以除去氨。然后将二氧化碳注入反应器以解除真 空，并用CO2将反应器加压至103kPa表压并于该压力在室温下维持30 分钟。
之后，降低反应器压力，打开，加热至50℃之后，添加柠檬酸一水 化物将内容物的pH值调节至约5.5，然后将反应器在50℃和19rpm保 温以平衡。从保温箱取出反应器，打开，测定样品的pH值。如果pH 值大于5.5，那么额外添加固体柠檬酸一水化物，并将反应器于搅拌下 在50℃下保温。重复这些步骤直至pH值为约5.5。一旦达到所需pH值， 将12.9mg/g纤维素Spezyme CP(Genencor)和5mg活性蛋白质/g纤维 素酶聚生体(包括β-葡糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶和阿拉伯呋喃 糖酶)装入反应器。将反应器置于保温箱，在50℃和19rpm下持续72 小时。在这些预处理和糖化之后，单体葡萄糖产量是4 1.7％并且单体木 糖产量是25.4％。葡萄糖总产量和木糖总产量分别是50.1％和53.2％。 这些数值是2次实验的平均值。
本申请要求享受2005年4月12日的美国临时申请号60/670437的权 益。
政府权力声明
本发明是在美国政府支持下，根据能源部授予的契约号04-03-CA -70224而完成的。政府对本发明具有一定的权力。
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