技术领域
[0001] 本
发明涉及一种酿酒酵母及酿酒酵母制备琥珀酸的方法。
背景技术
[0002] 琥珀酸是一种常见的天然
有机酸，其分子式为C4H6O4，相对分子量118.09，琥珀酸本身的性质使它具有许多重要的化学反应特性，如卤化、脱
水、酯化、磺化、酰化、
氧化、还原等等，这就使琥珀酸能广泛地应用于合成化工、医药、食品等行业。
[0003] 在食品行业中，自从诺贝尔奖获得者Robert证明琥珀酸对人类新陈代谢有积极的作用，并且不会在体内富集之后，琥珀酸就开始被广泛应用于食品工业。它可以作为酸味剂、
抑菌剂以及pH改良剂、
增稠剂等；在医药行业中，琥珀酸可作为pH值调节剂，
防腐剂，助
溶剂等，还可以用来合成解毒剂、
镇静剂、抗生素以及
氨基酸和维生素等药物等；在化工行业中，琥珀酸可以用作离子螯合剂，用于电
镀行业以防止金属的
点蚀和溶蚀；另外，琥珀酸的衍
生物也是良好的
表面活性剂，是去垢剂、肥皂和破乳剂的组成成分，还可以用来生产脱毛剂、
清洗剂、牙膏等；在
饲料行业中，琥珀酸可以作为
反刍动物和
单胃动物的饲料添加剂来替代抗生素，从而减少抗生素的使用；能够作为抑菌剂杀灭
家畜肠道有害
微生物菌群；可以有效地降低饲料的pH值，提高消化率。
[0004] 目前，琥珀酸在化工行业的市场占据琥珀酸市场的主体部分，而运用于化工行业的琥珀酸都是通过化学法生产的，微生物
发酵法生产的琥珀酸基本用于食品行业。然而从环保成木及资源限度方面考虑，化学方法合成琥珀酸有诸多缺点，比如原材料紧缺、资源不可再生、污染严重以及成本高不足。相比化学合成法，微生物发酵法有几大优势。一方面，发酵法利用糖类等一些可再生资源，大大降低对石油及其他不可再生资源的依赖。其次，运用发酵法生产琥珀酸将大大降低生产成本。据报道，日本已经采用新的发酵法进行琥珀酸生产，该方法比用化学方法合成琥珀酸所需的成本降低了50％，通过进一步的研究，有望继续提高该发酵法的效能。另一方面，微生物发酵生产琥珀酸的同时能固定CO2，如果发酵法能大规模实行，发酵过程中将大量利用大气中的CO2，因CO2造成的
温室效应也将得到一定的遏制。微生物发酵法生产琥珀酸具有广阔的市场前景。
发明内容
[0005] 本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
[0006] 本发明还有一个目的是提供一种酿酒酵母及酿酒酵母制备琥珀酸的方法，其对自制工程菌株发酵工艺进行了优化，提高了琥珀酸的产量。
[0007] 为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae SC54-62，所述酿酒酵母被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.11733，保藏时间为：2015年11月25日。
[0008] 一种利用所述的酿酒酵母制备琥珀酸的方法，包括以下步骤：
[0009] 步骤一、
种子培养：将
权利要求1所述的酿酒酵母接种至种子培养基上，在100％CO2环境中、
温度为35～37℃、转速为200～400r/min下，培养20～25h，得到种子培养液；其中，酿酒酵母接种量为1％～3％；
[0010] 步骤二、发酵培养：将种子培养液接种至发酵培养基上，在100％CO2环境中，35～37℃、200～400r/min下，培养70-80h，得到发酵培养液；
[0011] 在发酵过程中，分别在发酵20h、35h、50h和65h时补加
试剂葡萄糖，每隔1h测定发酵液中葡萄糖的含量，控制葡萄糖残留控制在2.2％；
[0012] 其中，发酵培养基的pH值为5.8～6.6，种子培养液的接种量为5％；
[0013] 步骤三、向发酵培养液加入
硅藻土，过滤出菌丝体，用四氯化
碳浸泡菌丝体，在50～70℃水浴条件下过滤两次，每次过滤120～150min合并两次滤液，得到提取液；
[0014] 其中，浸泡菌丝体的四氯化碳的体积为发酵液体积的5～10倍
[0015] 步骤四、蒸去提取液中的四氯化碳，得到固体，用乙酸乙酯萃取固体，在萃取过程中，用浓度为20％的
氨水将乙酸乙酯的pH值控制在7.0，并且控制乙酸乙酯的温度在15～35℃，收集乙酸乙酯相，浓缩酸乙酯相，得到第一浓缩液，将第一浓缩液经过0.45μm微孔滤
膜过滤，得第一预纯化溶液，第一预纯化溶液用四氯化碳溶液调制pH至7.5，得到第二预纯化溶液，用阴离子交换
树脂吸附第二预纯化溶液，吸附完毕用水作为洗脱液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液浓缩至原洗脱液体积的1.5％，得到第二浓缩液，向第二浓缩液中加入异丙醇溶液或
硫酸氢铵溶液，将第二浓缩液的pH调至1.5，放置0℃条件下结晶12～15h，过滤得到白色晶体，即为琥珀酸，其纯度不低于99.0％。
[0016] 优选的是，利用所述的酿酒酵母制备琥珀酸的方法中，所述种子培养基包括以下组分：葡萄糖8～10g/L，酵母粉7～8g/L，酵母膏0.5～1.0g/L、
酪蛋白0.5～1.5g/L、KH2PO4 3～5g/L、MgSO4 8～50g/L、NaCl 1～3g/L、CH3COONa 1～2g/L；且种子培养基在0.1Mpa下，灭菌25～30min。
[0017] 优选的是，利用所述的酿酒酵母制备琥珀酸的方法中，所述发酵培养基包括以下组分：麦芽糖50～55g/L、D-山梨醇15～20g/L、酵母膏22～27g/L、MgCO3 40～43g/L、(NH4)2S04 3～5g/L、KH2PO4 3～5g/L、FeS04﹒7H2O 1～3g/L，且发酵培养基在0.1Mpa下，灭菌25～
30min。
[0018] 优选的是，利用所述的酿酒酵母制备琥珀酸的方法中，所述步骤四中，阴离子交换树脂与洗脱液的体积比为1:2。
[0019] 优选的是，利用所述的酿酒酵母制备琥珀酸的方法中，所述步骤四中，加入到第二缩液中加入异丙醇溶液的体积为第二浓缩液体积的3～4倍。
[0020] 本发明至少包括以下有益效果：第一、本发明为微生物发酵法制备琥珀酸，是一种重要的化工产品，成本低廉，可广泛应用到医药、食品、化工等领域，对它的研究开发具有很好的经济价值和应用潜
力；第二、本发明对高产菌株发酵工艺进行了优化，确定了厌氧发酵的补料分批发酵策略，提高了琥珀酸的产量，发酵水平平均不低于97.2g/L，达到国内领先水平；第三、本发明采用离子交换和结晶法，可在较低温度下进行，污染小，提取时间短，琥珀酸损失少，除去乳酸、
甲酸、乙酸等副产物，有效提高了琥珀酸的得率，整个工艺提取率转化率为0.90-0.99g/g。
[0021] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
[0022] 图1为本发明所述的酿酒酵母制备琥珀酸的
流程图。
具体实施方式
[0023] 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照
说明书文字能够据以实施。
[0024] 应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
[0026] 1、一种酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae SC54-62，其分类命名为酿酒酵母，所述酿酒酵母被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.11733，保藏时间为：2015年11月25日；保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0027] 实施例2、
[0028] 如图1所示，本发明提供一种实施例1所述的酿酒酵母制备琥珀酸的方法，包括以下步骤：
[0029] 经过紫外、紫外-亚硝基胍(NTG)复合诱变筛选得到复合诱变后的酿酒酵母酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)SC54-62。
[0030] 步骤一、种子培养：将实施例1所述的酿酒酵母接种至种子培养基上，在100％CO2环境中、温度为35℃、转速为200～400r/min下，培养20h，得到种子培养液；其中，酿酒酵母接种量为1％；
[0031] 步骤二、发酵培养：将种子培养液接种至发酵培养基上，在100％CO2环境中，35～37℃、200r/min下，培养70h，得到发酵培养液；
[0032] 在发酵过程中，分别在发酵20h、35h、50h和65h时补加试剂葡萄糖，每隔1h测定发酵液中葡萄糖的含量，控制葡萄糖残留控制在2.2％；
[0033] 其中，发酵培养基的pH值为5.8，种子培养液的接种量为5％；
[0034] 步骤三、向发酵培养液加入
硅藻土，过滤出菌丝体，用四氯化碳浸泡菌丝体，在50℃水浴条件下过滤两次，每次过滤120min合并两次滤液，得到提取液；其中，浸泡菌丝体的四氯化碳的体积为发酵液体积的5倍；
[0035] 步骤四、蒸去提取液中的四氯化碳，得到固体，用乙酸乙酯萃取固体，在萃取过程中，用浓度为20％的氨水将乙酸乙酯的pH值控制在7.0，并且控制乙酸乙酯的温度在15℃，收集乙酸乙酯相，浓缩酸乙酯相，得到第一浓缩液，将第一浓缩液经过0.45μm微孔滤膜过滤，得第一预纯化溶液，第一预纯化溶液用四氯化碳溶液调制pH至7.5，得到第二预纯化溶液，用阴离子交换树脂吸附第二预纯化溶液，吸附完毕用水作为洗脱液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液浓缩至原洗脱液体积的1.5％，得到第二浓缩液，向第二浓缩液中加入异丙醇溶液或硫酸氢铵溶液，将第二浓缩液的pH调至1.5，放置0℃条件下结晶12～15h，过滤得到白色晶体，即为琥珀酸，其纯度为99.17％。
[0036] 其中，
[0037] 种子培养基包括以下组分：葡萄糖8g/L，酵母粉7g/L，酵母膏0.5g/L、酪蛋白0.5g/L、KH2PO4 3g/L、MgSO4 8g/L、NaCl 1g/L、CH3COONa 1g/L；且种子培养基在0.1Mpa下，灭菌25min。
[0038] 发酵培养基包括以下组分：麦芽糖50g/L、D-山梨醇15g/L、酵母膏22g/L、MgCO3 40g/L、(NH4)2S04 3g/L、KH2PO4 3g/L、FeS04﹒7H2O 1g/L，且发酵培养基在0.1Mpa下，灭菌
25min。
[0039] 步骤四中，阴离子交换树脂与洗脱液的体积比为1:2；加入到第二缩液中加入异丙醇溶液的体积为第二浓缩液体积的3倍。
[0040] 实施例3、
[0041] 一、诱变酿酒酵母
[0042] 经过紫外、NTG复合诱变筛选得到复合诱变后的酿酒酵母酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)SC54-62。
[0043] 紫外诱变方法：
[0044] 诱变菌悬液：从甘油管(通用的低温冷藏所用的含有酿酒酵母的甘油管)中取出菌种，培养至16h后转接到种子培养基中，培养8h使细胞达到同步生长，离心，0.1mol/L，pH7.0
磷酸盐缓冲液无菌洗涤2次，取10mL菌液，加入到9cm无菌平皿中，放在磁力搅拌装置上，紫外灯功率15W，距离30cm，照射时间20～30s，稀释涂布在分离培养基平板上，挑选生长较好的单菌落，接种于斜面培养基中，37℃恒温培养24～48h，备用。
[0045] NTG复合诱变
[0046] 取紫外诱变后的菌株斜面，用0.1mol/LpH7.0磷酸盐缓冲液3～5ml无菌洗涤2次，亚硝基胍诱变终浓度为0.2mg/mL，于37℃摇床上振荡诱变时间为20～40min，然后取10mL处理后菌悬液，用0.16mol/L的
硫代硫酸钠溶液稀释终止反应。挑选生长较好的单菌落，接种于斜面培养基中，37℃恒温培养24-48h，备用。
[0047] 其中斜面培养基包括：
牛肉膏2.5～3.5g、蛋白胨9.0～11.0g、NaCl4.5-5.5g、琼脂13～17g，定容至1.0L，pH值6.8～7.2，采用高压
蒸汽灭菌，0.1MPa、121℃灭菌20min。灭菌结束后，趁热分装，待冷凝后置于-4℃
冰箱保存中保存。
[0048] 将经过诱变处理的菌体均匀涂布于平板培养基上，在厌氧条件下37℃恒温培养24～48h，挑选菌落直径大、黄色变色圈大的突变菌株接种于斜面培养基上，-4℃冰箱保藏。
[0049] 二、制备琥珀酸
[0050] 种子培养方法：将上述制备的酿酒酵母接种于盛有种子培养基的厌氧瓶中，抽
真空后充入CO2，100％CO2环境的厌氧瓶中，37℃、400r/min，厌氧培养25h，得到种子培养液，其中酿酒酵母的接种量为3％。
[0051] 发酵培养：以5％接种量(v/v)将种子培养液接入发酵培养基(1.25L/5L厌氧瓶)中，抽真空充CO2，100％CO2环境的厌氧中，37℃、400r/min、pH为6.2，发酵培养80h，[0052] 在发酵过程中，采用分批补料方式，分别在20h、35h、50h和65h，以15g/L的量补加葡萄糖，葡萄糖残留控制在2.2％。
[0053] 纯化：5L
发酵罐内获得的发酵液中微生物发酵完毕，发酵液加硅藻土过滤菌丝体，菌丝体用35L四氯化碳浸泡，在60℃水浴条件下过滤两次，每次150min，过滤得到25L浸泡液，得到过滤液即为提取液，蒸去溶媒，残渣用乙酸乙酯萃取，萃取过程中控制乙酸乙酯的温度为25℃、用20％氨水调节pH为7.0，分离出乙酸乙酯相，得萃取液，真空浓缩得1.5g左右第一浓缩液，第一浓缩液经过0.45μm微孔滤膜过滤，得澄清的第一预纯化溶液。第一预纯化溶液用0.5～1.0mol四氯化碳溶液调制pH至7.5，得到琥珀酸的第二预纯化溶液。用2L三乙基氨基乙基
纤维素阴离子交换树脂吸附，吸附完毕用4L水洗脱液，所得洗脱液经高效液相色谱测试纯度＝72.48％，减压浓缩洗脱液得到60mL第二浓缩液，向第二浓缩液加入240mL硫酸氢铵溶液，将第二浓缩液的pH调至1.5，放置0℃条件下结晶13h，在这个低的pH值下，过滤得到白色晶体，经高效液相色谱检测，纯度＝99.27％，琥珀酸浓度＝97.2g/L，产率速度＝2.42g/L·h，转化率＝0.994g/g。
[0054] 其中，
[0055] 种子培养基包括以下组分：葡葡萄糖10g/L，酵母粉8g/L，酵母膏1.0g/L、酪蛋白1.5g/L、KH2PO4 5g/L、MgSO4 50g/L、NaCl 3g/L、CH3COONa 2g/L；且种子培养基在0.1Mpa下，灭菌30min。
[0056] 发酵培养基包括以下组分：麦芽糖55g/L、D-山梨醇20g/L、酵母膏27g/L、MgCO3 43g/L、(NH4)2S04 5g/L、KH2PO4 5g/L、FeS04﹒7H2O 3g/L，且发酵培养基在0.1Mpa下，灭菌
30min。
[0057] 阴离子交换树脂与洗脱液的体积比为1:2；加入到第二缩液中加入异丙醇溶液的体积为第二浓缩液体积的4倍。
[0058] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的
修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
