聚合物微粒及其用途
阅读：861发布：2021-07-27
专利汇可以提供聚合物微粒及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 聚合物 微粒及其用途。具体地，本发明涉及功能化的聚合物微粒、其制备方法、其引发细胞介导的免疫应答的用途以及 治疗 或 预防 疾病 或病况的用途，包括因细胞内病原体所引起的那些疾病或病况。，下面是聚合物微粒及其用途专利的具体信息内容。
1.引发受试者免疫应答的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与至少一个能够引发免疫应答的抗原融合的微粒形成蛋白。
2.引发受试者免疫应答的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与结合结构域融合的微粒形成蛋白，所述结合结构域与至少一个能够引发受试者免疫应答的抗原能够结合。
3.对受试者进行抗病原体免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与至少一个能够引发免疫应答的抗原融合的微粒形成蛋白。
4.对受试者进行抗病原体免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与结合结构域融合的微粒形成蛋白，所述结合结构域与至少一个能够引发受试者免疫应答的抗原能够结合。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述免疫应答包括细胞介导的免疫应答。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述免疫应答包括体液应答。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述受试者已受病原体感染或者已进行过抗病原体免疫。
8.权利要求2或4至7中任一项的方法，其中所述与能够引发免疫应答的抗原能够结合的结合结构域与内源抗原结合。
9.包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含与至少一个能够引发免疫应答的抗原融合的微粒形成蛋白。
10.包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含与至少一个结合结构域融合的微粒形成蛋白，所述结合结构域与能够引发免疫应答的抗原能够结合。
11.权利要求9或权利要求10的聚合物微粒，其中所述抗原能够引发细胞介导的免疫应答。
12.权利要求9至11中任一项的聚合物微粒，其中所述抗原能够引发体液免疫应答。
13.权利要求9至12中任一项的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含两个或更多不同的融合多肽。
14.权利要求9至13中任一项的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含两个或更多不同的抗原，或者两个或更多不同的能够结合抗原的结合结构域。
15.权利要求9至14中任一项的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含至少一个能够引发免疫应答的抗原和至少一个与能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域。
16.权利要求9至15中任一项的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒还包含至少一个与聚合物微粒结合或掺入聚合物微粒之中的物质。
17.权利要求16的聚合物微粒，其中所述物质为抗原、佐剂、免疫刺激分子、或其任意两项或更多项的组合。
18.权利要求9至17中任一项的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒是多价的。
19.权利要求16至18中任一项的聚合物微粒，其中所述物质通过交联与聚合物微粒结合。
20.包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含与至少一个能够引发免疫应答的抗原融合的微粒形成蛋白，用于对有需要的受试者引发免疫应答、或对受试者进行抗病原体免疫、或对有需要的受试者进行病原体感染诊断。
21.包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含与至少一个结合结构域融合的微粒形成蛋白，所述结合结构域与能够引发免疫应答的抗原能够结合，用于对有需要的受试者引发免疫应答、或对受试者进行抗病原体免疫、或对有需要的受试者进行病原体感染诊断。
22.前述权利要求中任一项的聚合物微粒，其中所述抗原为选自下组的生物的抗原：
分枝杆菌属(例如牛分枝杆菌、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、鸟分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种、分枝杆菌)、李斯特菌属(例如产单核细胞李斯特菌、李斯特菌)、沙门氏菌属(例如伤寒沙门氏菌)、耶尔森氏菌属(例如鼠疫耶尔森氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌)、炭疽芽孢杆菌、军团菌属(例如嗜肺军团菌、长滩军团菌、博兹曼军团菌、军团菌)、立克次体属(例如立氏立克次体、螨立克次体、康氏立克次体、西伯利亚立克次体、澳大利亚立克次体、日本立克次体、非洲立克次体、普氏立克次体、斑疹伤寒立克次体、立克次体)、衣原体属(例如肺炎衣原体、沙眼衣原体、衣原体)、嗜性衣原体属(例如鹦鹉热嗜性衣原体、流产嗜性衣原体)、链球菌属(例如肺炎链球菌、酿脓链球菌、无乳链球菌)、葡萄球菌属(金黄色葡萄球菌，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA))、埃立克体属(例如查菲埃立克体、嗜吞噬细胞埃立克体群、埃立克体)、贝氏柯克斯体、利什曼原虫、刚地弓形虫、克氏锥虫、组织胞浆菌、土拉热弗朗西斯氏菌、以及病毒，包括丙肝病毒、腺病毒、小核糖核酸病毒，包括柯萨奇病毒；甲肝病毒、脊髓灰质炎病毒、疱疹病毒科，包括EB病毒、1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、人巨细胞病毒、人疱疹病毒8型、水痘带状疱疹病毒；嗜肝DNA病毒，包括乙肝病毒；黄病毒科，包括丙肝病毒、黄热病毒、登革病毒、西尼罗病毒；逆转录病毒，包括人类免疫缺陷病毒(HIV)；正粘病毒，包括流感病毒；副粘病毒，包括麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒；乳头瘤病毒属，包括乳头瘤病毒；弹状病毒属，包括狂犬病毒；披膜病毒，包括风疹病毒；以及其他病毒，包括痘苗病毒、禽痘病毒、腺相关病毒、改良型痘苗病毒安卡拉株、塞姆利基森林病毒、痘病毒和冠状病毒；或所述抗原为任一上述抗原的至少一个抗原性部分或T细胞表位。
23.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中至少一种聚合物微粒是根据权利要求9至22中任一项的聚合物微粒。
24.组合物，包含权利要求9至22中任一项的聚合物微粒。
25.权利要求25的组合物，用于对有需要的受试者引发免疫应答、或对有需要的受试者进行疫苗接种、或对有需要的受试者进行抗病原体免疫、或对有需要的受试者进行病原体感染诊断。
26.权利要求25或权利要求26的组合物，其中所述组合物是疫苗。
27.权利要求9至22中任一项的聚合物微粒在制备药物中的用途，所述药物适于对有需要的受试者引发免疫应答、或对有需要的受试者进行疫苗接种、或对有需要的受试者进行抗病原体免疫、或对有需要的受试者进行病原体感染诊断。
28.根据权利要求27的用途，其中所述药物是疫苗。
29.表达构建体，所述表达构建体包含：
至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列；和
至少一个编码能够引发免疫应答的抗原的核酸序列，或至少一个编码与能够引发免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的核酸序列。
30.权利要求29的表达构建体，其中所述至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列和所述至少一个编码能够引发免疫应答的抗原的核酸序列或所述至少一个编码与能够引发免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的核酸序列作为单个开放阅读框存在。
31.权利要求29或30的表达构建体，其中所述表达构建体编码融合多肽，所述融合多肽包含微粒形成蛋白和能够引发免疫应答的抗原或与能够引发免疫应答的抗原能够结合的结合结构域。
32.权利要求29至31中任一项的表达构建体，其中所述构建体还包含编码下述蛋白的核酸：
i.至少一个硫解酶，或
ii.至少一个还原酶，或
iii.(i)和(ii)兼而有之。
33.权利要求29至32中任一项的表达构建体，其中所述构建体包含编码下述蛋白的核酸：
i.至少一个硫解酶，或
ii.至少一个还原酶，或
iii.至少一个聚合物合酶，或
iv.至少一个能够引发免疫应答的抗原，或
v.至少一个与至少一个能够引发免疫应答的抗原能够结合的结合结构域，或
vi.包含上述i)至v)中一项或多项的融合蛋白，或
vii.上述i)至vi)中的任一组合。
34.权利要求29至33中任一项的表达构建体，其中抗原是能够引发细胞介导的免疫应答的抗原。
35.生产聚合物微粒的方法，所述方法包括：
提供含有至少一个表达构建体的宿主细胞，所述至少一个表达构建体包含至少一个编码能够引发免疫应答的抗原的核酸序列，或至少一个编码与能够引发免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的核酸序列；在适合于所述表达构建体表达的条件下维持所述宿主细胞；和从宿主细胞中分离聚合物微粒。
36.诊断病原体感染的方法，其中所述方法包括向受试者给药至少一种权利要求9至
22中任一项的聚合物微粒，和检测指示病原体存在的反应。
37.权利要求36的方法，其中指示病原体存在的反应是迟发型超敏反应。
38.权利要求36的方法，其中指示病原体存在的反应是检测由受试者获得的样品中病原体抗体的存在。
39.权利要求36的方法，其中指示病原体存在的反应是检测所述样品中病原体反应性免疫细胞的存在。
40.生产聚合物微粒的方法，所述方法包括：
提供含有至少一个表达构建体的宿主细胞，所述至少一个表达构建体包含：
至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列，和
至少一个编码结核分枝杆菌抗原或结核分枝杆菌抗原结合结构域的核酸序列；
在适合于所述表达构建体表达的条件下维持所述宿主细胞；和
从宿主细胞中分离聚合物微粒。
41.权利要求40的方法，其中表达构建体处于高拷贝数载体之中。
42.权利要求40的方法，其中至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列与强启动子有效连接。
43.权利要求40的方法，其中在聚合物合酶底物或底物混合物的存在下维持宿主细胞，包括单体底物、能够被宿主细胞代谢形成聚合物合酶底物的前体底物。
44.权利要求40的方法，其中宿主细胞含有至少两个选自下组的不同表达构建体：
包含编码微粒形成蛋白和至少一个结核分枝杆菌抗原的核酸序列的构建体，或
包含编码微粒形成蛋白和至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域的核酸序列的构建体，或
包含编码佐剂的核酸序列的表达构建体，或
包含编码至少一个结核分枝杆菌抗原的核酸序列表达构建体。
45.权利要求40的方法，其中至少一个编码结核分枝杆菌抗原的核酸序列编码
ESAT-6。
46.权利要求40的方法，其中至少一个编码结核分枝杆菌抗原的核酸序列编码Ag85A。
47.权利要求40的方法，其中至少一个编码结核分枝杆菌抗原的核酸序列编码ESAT-6和Ag85A。
48.包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含与至少一个结核分枝杆菌抗原融合的微粒形成蛋白。
49.包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含与至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白。
50.权利要求48或权利要求49的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含两个或更多不同的融合多肽。
51.权利要求50的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含两个或更多不同的结核分枝杆菌抗原，或者两个或更多不同的结核分枝杆菌抗原结合结构域。
52.权利要求50或权利要求51的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含至少一个结核分枝杆菌抗原和至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域。
53.权利要求48至52中任一项的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒还包含至少一个与聚合物微粒结合或掺入聚合物微粒之中的物质，或其组合。
54.权利要求53的聚合物微粒，其中所述物质为抗原、佐剂或免疫刺激分子。
55.权利要求48至54中任一项的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒是多价的。
56.权利要求53至55中任一项的聚合物微粒，其中所述物质通过交联与聚合物微粒结合。
57.权利要求48至56中任一项的聚合物微粒，包含结核分枝杆菌ESAT-6抗原。
58.权利要求48至57中任一项的聚合物微粒，包含结核分枝杆菌Ag85A抗原。
59.权利要求58的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含ESAT-6抗原和Ag85A抗
原。
60.表达构建体，所述表达构建体包含：
至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列；和
至少一个编码结核分枝杆菌抗原的核酸序列，或至少一个编码结核分枝杆菌抗原结合结构域的核酸序列。
61.权利要求60的表达构建体，其中所述至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列和所述至少一个编码结核分枝杆菌抗原的核酸序列或所述至少一个编码结核分枝杆菌抗原结合结构域的核酸序列作为单个开放阅读框存在。
62.权利要求60或61的表达构建体，其中所述表达构建体编码融合多肽，所述融合多肽包含微粒形成蛋白和结核分枝杆菌抗原或结核分枝杆菌抗原结合结构域。
63.权利要求60至62中任一项的表达构建体，其中所述构建体还包含编码下述蛋白的核酸：
i.至少一个硫解酶，或
ii.至少一个还原酶，或
iii.(i)和(ii)兼而有之。
64.权利要求60至63中任一项的表达构建体，其中所述构建体包含编码下述蛋白的核酸：
i.至少一个硫解酶，或
ii.至少一个还原酶，或
iii.至少一个聚合物合酶，或
iv.至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原，或
v.至少一个与至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域，或
vi.包含上述i)至v)中一项或多项的融合蛋白，或
vii.上述i)至vi)中的任一组合。
65.对受试者进行抗结核免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与至少一个结核分枝杆菌抗原融合的微粒形成蛋白。
66.对受试者进行抗结核免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白。
67.引发受试者免疫应答的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与至少一个结核分枝杆菌抗原融合的微粒形成蛋白。
68.引发受试者免疫应答的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白。
69.权利要求65至68中任一项的方法，其中受试者感染有结核。
70.权利要求65至69中任一项的方法，其中受试者已经进行过抗结核免疫。
71.权利要求66或68至70中任一项的方法，其中结核分枝杆菌抗原结合结构域与内源结核分枝杆菌抗原结合。
72.权利要求65至71中任一项的方法，其中至少一种聚合物微粒包含两个或更多不同的融合多肽。
73.权利要求65至72中任一项的方法，其中至少一种聚合物微粒包含两个或更多不同的结核分枝杆菌抗原，或者两个或更多不同的结核分枝杆菌抗原结合结构域。
74.权利要求65至73中任一项的方法，其中至少一种聚合物微粒包含至少一个结核分枝杆菌抗原和至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域。
75.权利要求65至74中任一项的方法，其中至少一种聚合物微粒还包含至少一个与聚合物微粒结合或掺入聚合物微粒之中的物质，或其组合。
76.权利要求75的方法，其中所述物质为抗原、佐剂或免疫刺激分子。
77.权利要求65至74中任一项的方法，其中至少一种聚合物微粒是多价的。
78.权利要求75至77中任一项的方法，其中所述物质通过交联与聚合物微粒结合。
79.权利要求65至78中任一项的方法，其中至少一种聚合物微粒包含结核分枝杆菌ESAT-6抗原。
80.权利要求65至79中任一项的方法，其中至少一种聚合物微粒包含结核分枝杆菌Ag85A抗原。
81.权利要求65至80中任一项的方法，其中至少一种聚合物微粒包含的至少一个融合多肽包含ESAT-6抗原和Ag85A抗原。
82.权利要求65至81中任一项的方法，其中至少一种聚合物微粒包含选自下组的结核分枝杆菌抗原：Ag85B(MPT59)、Ag85B、Ag85C、MPT32、MPT51、MPT59、MPT63、MPT64、MPT83、MPB5、MPB59、MPB64、MTC28、Mtb2、Mtb8.4、Mtb9.9、Mtb32A、Mtb39、Mtb41、TB10.4、TB10C、TB11B、TB12.5、TB13A、TB14、TB15、TB15A、TB16、TB16A、TB17、TB18、TB21、TB20.6、TB24、TB27B、TB32、TB32A、TB33、TB38、TB40.8、TB51、TB54、TB64、CFP6、CFP7、CFP7A、CFP7B、CFP8A、CFP8B、CFP9、CFP10、CFP11、CFP16、CFP17、CFP19、CFP19A、CFP19B、CFP20、CFP21、CFP22、CFP22A、CFP23、CFP23A、CFP23B、CFP25、CFP25A、CFP27、CFP28、CFP28B、CFP29、CFP30A、CFP30B、CFP50、CWP32、hspX(α-晶型)、APA、结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)、ST-CF、PPE68、LppX、PstS-1、PstS-2、PstS-3、HBHA、GroEL、GroEL2、GrpES、LHP、19kDa脂蛋白、71kDa、RD1-ORF2、RD1-ORF3、RD1-ORF4、RD1-ORF5、RD1-ORF8、RD1-ORF9A、RD1-ORF9B、Rv1984c、Rv0577、Rv1827、BfrB、Tpx.Rv1352、Rv1810、PpiA、Cut2、FbpB、FbpA、FbpC、DnaK、FecB、Ssb、RplL、FixA、FixB、AhpC2、Rv2626c、Rv1211、Mdh、Rv1626、Adk、ClpP、SucD(Belisle et al，
2005；US7,037,510；US2004/0057963；US2008/0199493；US2008/0267990)；或任一上述抗原的至少一个抗原性部分或T细胞表位。
83.对受试者进行抗肝炎或抗流感免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与至少一个肝炎病毒抗原或至少一个流感病毒抗原融合的微粒形成蛋白，优选聚合物合酶。
84.对受试者进行抗肝炎或抗流感免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与能够结合至少一个肝炎病毒抗原或至少一个流感病毒抗原的结合结构域融合的微粒形成蛋白，优选聚合物合酶。
85.引发受试者免疫应答的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与至少一个肝炎病毒抗原或至少一个流感病毒抗原融合的微粒形成蛋白，优选聚合物合酶。
86.引发受试者免疫应答的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与能够结合至少一个肝炎病毒抗原或至少一个流感病毒抗原的结合结构域融合的微粒形成蛋白，优选聚合物合酶。
87.权利要求83至86中任一项的方法，其中免疫应答是细胞介导的免疫应答。
88.诊断肝炎病毒或流感病毒感染的方法，其中所述方法包括向受试者给药至少一种权利要求9至22中任一项的聚合物微粒，和检测指示肝炎病毒或流感病毒存在的反应。
89.权利要求88的方法，其中指示肝炎病毒或流感病毒存在的反应是迟发型超敏反应。
90.权利要求88的方法，其中指示肝炎病毒或流感病毒存在的反应是检测所述样品中针对肝炎病毒或流感病毒的抗体的存在。
91.权利要求88的方法，其中指示肝炎病毒或流感病毒存在的反应是检测所述样品中肝炎病毒或流感病毒反应性免疫细胞的存在。
92.权利要求88至91中任一项的方法，其中受试者感染有肝炎或流感。
93.权利要求88至92中任一项的方法，其中受试者已经进行过抗肝炎或抗流感免疫。
94.权利要求89或91至93中任一项的方法，其中能够结合肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的结合结构域与内源肝炎病毒抗原或流感病毒抗原结合。
95.权利要求88至94中任一项的方法，其中至少一种聚合物微粒包含两个或更多不同的融合多肽。
96.权利要求88至95中任一项的方法，其中至少一种聚合物微粒包含两个或更多不同的肝炎病毒抗原或两个或更多流感病毒抗原，或者两个或更多不同的能够结合肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的结合结构域。
97.权利要求88至96中任一项的方法，其中至少一种聚合物微粒包含至少一个肝炎病毒抗原或至少一个流感病毒抗原，和至少一个能够结合肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的结合结构域。
98.权利要求88至97中任一项的方法，其中至少一种聚合物微粒还包含至少一个与聚合物微粒结合或掺入聚合物微粒之中的物质，或其组合。
99.权利要求98的方法，其中所述物质为抗原、佐剂或免疫刺激分子。
100.权利要求88至99中任一项的方法，其中至少一种聚合物微粒是多价的。
101.权利要求98至100中任一项的方法，其中所述物质通过交联与聚合物微粒结合。
102.权利要求88至101中任一项的方法，其中至少一种聚合物微粒包含至少一个抗原或至少一个能够结合至少一个抗原的结合结构域，其中所述抗原来自选自下组的生物：病毒，包括丙肝病毒、腺病毒、小核糖核酸病毒，包括柯萨奇病毒；甲肝病毒、脊髓灰质炎病毒、疱疹病毒科，包括EB病毒、1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、人巨细胞病毒、人疱疹病毒8型、水痘带状疱疹病毒；嗜肝DNA病毒，包括乙肝病毒；黄病毒科，包括丙肝病毒；正粘病毒，包括流感病毒；或任一上述抗原的至少一个抗原性部分或T细胞表位。
103.生产聚合物微粒的方法，所述方法包括：
提供含有至少一个表达构建体的宿主细胞，所述至少一个表达构建体包含：
至少一个编码肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的核酸序列，或
至少一个编码能够结合肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的结合结构域的核酸序列；
在适合于所述表达构建体表达的条件下维持所述宿主细胞；和
从宿主细胞中分离聚合物微粒。
104.包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含与至少一个肝炎病毒抗原或至少一个流感病毒抗原融合的微粒形成蛋白。
105.包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含与至少一个能够结合肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的结合结构域融合的微粒形成蛋白。
106.权利要求104或权利要求105的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含两个或更多不同的融合多肽。
107.权利要求106的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含两个或更多不同的肝炎病毒抗原或两个或更多流感病毒抗原，或者两个或更多不同的能够结合肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的结合结构域。
108.权利要求106或权利要求107的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含至少一个肝炎病毒抗原或至少一个流感病毒抗原，和至少一个能够结合肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的结合结构域。
109.权利要求104至108中任一项的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒还包含至少一个与聚合物微粒结合或掺入聚合物微粒之中的物质，或其组合。
110.权利要求109的聚合物微粒，其中所述物质为抗原、佐剂或免疫刺激分子。
111.权利要求104至110中任一项的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒是多价的。
112.权利要求109至111中任一项的聚合物微粒，其中所述物质通过交联与聚合物微粒结合。
113.包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含与至少一个肝炎病毒抗原或至少一个流感病毒抗原融合的微粒形成蛋白，用于对有需要的受试者引发细胞介导的免疫应答、或对受试者进行抗肝炎或抗流感免疫、或对有需要的受试者进行肝炎病毒或流感病毒感染诊断。
114.包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含与至少一个能够结合肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的结合结构域融合的微粒形成蛋白，用于对有需要的受试者引发细胞介导的免疫应答、或对受试者进行抗肝炎或抗流感免疫、或对有需要的受试者进行肝炎病毒或流感病毒感染诊断。
115.权利要求104至114中任一项的聚合物微粒在制备药物中的用途，所述药物适于对有需要的受试者引发细胞介导的免疫应答、或对受试者进行抗肝炎或抗流感免疫、或对有需要的受试者进行肝炎病毒或流感病毒感染诊断。
116.表达构建体，所述表达构建体包含：
至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列；和
至少一个编码肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的核酸序列，或至少一个编码能够结合肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的结合结构域的核酸序列。
117.权利要求116的表达构建体，其中所述至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列和所述至少一个编码肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的核酸序列或所述至少一个编码能够结合肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的结合结构域的核酸序列作为单个开放阅读框存在。
118.权利要求116或117的表达构建体，其中所述表达构建体编码融合多肽，所述融合多肽包含微粒形成蛋白和肝炎病毒抗原或流感病毒抗原或能够结合肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的结合结构域。
119.权利要求116至118中任一项的表达构建体，其中所述构建体还包含编码下述蛋白的核酸：
i.至少一个硫解酶，或
ii.至少一个还原酶，或
iii.(i)和(ii)兼而有之。
120.权利要求116至119中任一项的表达构建体，其中所述构建体包含编码下述蛋白的核酸：
i.至少一个硫解酶，或
ii.至少一个还原酶，或
iii.至少一个聚合物合酶，或
iv.至少一个肝炎病毒抗原或至少一个流感病毒抗原，或
v.至少一个能够结合至少一个肝炎病毒抗原或至少一个流感病毒抗原的结合结构域，或
vi.包含上述i)至v)中一项或多项的融合蛋白，或
vii.上述i)至vi)中的任一组合。
聚合物微粒及其用途
技术领域
[0001] 本发明涉及重组蛋白及相关构建体和方法，还有聚合物微粒及其用途。具体地，本发明涉及功能化的聚合物微粒、其生产方法、及其引发免疫应答以及治疗或预防疾病或病况中的用途，包括那些因细胞内或细胞外病原体所致的疾病或病况。
[0002] 发明背景
[0003] 下文包括可用于理解本发明的信息。这并非承认本文提供的任何信息都是本文所述或所要求保护的发明的现有技术或与之相关，或具体或隐含引用的任何出版物或文献都是现有技术。
[0004] 病原体包括细胞内和细胞外病原体，已知引起多种有害的人类疾病，包括例如结核、肝炎、流感、麻疯病、李斯特氏菌病、伤寒症、痢疾、瘟疫、肺炎、斑疹伤寒症、衣原体病、炭疽病以及脑膜炎等等。本文涵盖生成由传统疫苗接种策略所引发的强大细胞介导的免疫应答和体液应答两种能力。
[0005] 例如，结核病(Tb)估计每年杀死超过200万人。目前用来治疗或预防结核的方法因为多药耐药性结核分枝杆菌的出现而受到挑战(Anderson，2007；Mustafa，2001)。Tb的治疗和预防因为该细胞内细菌不能进入宿主免疫系统而变得复杂化。
[0006] 期望开发出安全有效的方法来递送靶向疫苗，以克服常规疫苗递送系统的许多缺点。缺点包括费用增加，需要反复给药，主要是因为药效随着时间而减弱。生成免疫应答特别是细胞介导的免疫应答，也已经提出作为治疗多种其他疾病和病况[包括例如癌症]的方法。因此需要能够引发强大免疫应答的疫苗组合物，特别是能够引发细胞介导的免疫应答或体液应答或两种应答的组合物。
[0007] 聚羟基烷基羧酸酯、特别是聚羟基烷酸酯(PHA)的性能已经就其生物塑料应用、以及在医学、药学和食品工业应用中作为基质运送药物和其他活性剂的用途进行了研究。通过PHA分子生物工程化，能够操纵PHA分子的组成和表达以适应特定功能。
[0008] 本发明的目的是提供聚合物微粒用于治疗或预防不同的疾病和病况，包括例如通过免疫或疫苗接种来为有需要的受试者提供引发有效免疫应答的方法和组合物，或者至少为公众提供可用的选择。
[0009] 发明概述
[0010] 本文描述和要求保护的发明有许多特征和实施方案，包括但不限于此发明概述部分阐述、说明或述及的那些。其并非意在包罗万象，故本文描述和要求保护的发明并不局限或受限于此发明概述部分所确定的特征或非限制性实施方案，仅仅是出于举例说明而非限制目的而纳入这些特征或实施方案的。
[0011] 本发明公开了生产聚合物微粒的方法，所述方法包括提供含有至少一个表达构建体的宿主细胞，所述至少一个表达构建体包含：
[0012] 至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列；和
[0013] 至少一个编码能够引发免疫应答的抗原的核酸序列；或者
[0014] 至少一个编码与能够引发免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的核酸序列；
[0015] 在适合于所述表达构建体表达的条件下维持所述宿主细胞；和
[0016] 从宿主细胞中分离聚合物微粒。
[0017] 在一个实施方案中，所述方法包括提供含有至少一个表达构建体的宿主细胞，所述至少一个表达构建体包含：
[0018] 至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列；和
[0019] 至少一个编码能够例如引发细胞介导的免疫应答的抗原的核酸序列；或者
[0020] 至少一个编码与能够例如引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的核酸序列；
[0021] 在适合于所述表达构建体表达的条件下维持所述宿主细胞；和
[0022] 从宿主细胞中分离聚合物微粒。
[0023] 在一个实施方案中，所述微粒形成蛋白是聚合物合酶。
[0024] 在一个实施方案中，所述表达构建体是高拷贝数载体。
[0025] 在一个实施方案中，所述至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列与强启动子有效连接。
[0026] 在一个实施方案中，所述强启动子是病毒启动子或噬菌体启动子。
[0027] 在一个实施方案中，所述启动子是噬菌体启动子，例如T7噬菌体启动子。
[0028] 在一个实施方案中，在微粒形成蛋白底物、优选聚合物合酶底物或底物混合物的存在下维持宿主细胞，包括单体底物、能够被宿主细胞代谢形成所述微粒形成蛋白底物的前体底物。
[0029] 在一个实施方案中，宿主细胞含有至少两个不同的表达构建体。
[0030] 在宿主细胞含有至少两个不同的表达构建体的一些实施方案中，至少一个表达构建体选自下组：
[0031] 包含编码微粒形成蛋白和至少一个能够引发免疫应答的抗原的核酸序列的表达构建体，或
[0032] 包含编码微粒形成蛋白和与至少一个能够引发免疫应答(包括例如细胞介导的免疫应答)的抗原能够结合的结合结构域的核酸序列的表达构建体，或
[0033] 包含编码微粒形成蛋白和至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原的核酸序列的表达构建体，或
[0034] 包含编码微粒形成蛋白和与至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的核酸序列的表达构建体，或
[0035] 包含编码佐剂的核酸序列的表达构建体，或
[0036] 包含编码至少一个能够引发免疫应答的抗原的核酸序列的表达构建体，或
[0037] 包含编码至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原的核酸序列的表达构建体。
[0038] 在宿主细胞含有至少两个不同的表达构建体的其他实施方案中，一个表达构建体选自下组：
[0039] 包含编码微粒形成蛋白的核酸序列的表达构建体，或
[0040] 包含编码微粒大小决定蛋白的核酸序列的表达构建体，或
[0041] 包含编码聚合物调节蛋白的核酸序列的表达构建体。
[0042] 在宿主细胞含有至少两个不同的表达构建体的其他实施方案中，一个表达构建体包含编码微粒形成蛋白(优选聚合物合酶)和与至少一个能够引发免疫应答(例如细胞介导的免疫应答)的抗原能够结合的结合结构域的核酸序列，且至少一个表达构建体选自下组：
[0043] 包含编码微粒形成蛋白和至少一个能够引发免疫应答的抗原的核酸序列的表达构建体，或
[0044] 包含编码微粒形成蛋白和与至少一个能够引发免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的核酸序列的表达构建体，或
[0045] 包含编码微粒形成蛋白和至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原的核酸序列的表达构建体，或
[0046] 包含编码微粒形成蛋白和与至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的核酸序列的表达构建体，或
[0047] 包含编码佐剂的核酸序列的表达构建体，或
[0048] 包含编码至少一个能够引发免疫应答的抗原的核酸序列的表达构建体，或
[0049] 包含编码至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原的核酸序列的表达构建体。
[0050] 在一个实施方案中，宿主细胞含有混合的表达构建体群，其中每个表达构建体包含编码融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含：
[0051] 至少一个微粒形成蛋白，和
[0052] 至少一个能够引发免疫应答的抗原，或
[0053] 至少一个与至少一个能够引发免疫应答的抗原能够结合的结合结构域。
[0054] 在多种实施方案中，抗原是能够引发细胞介导的免疫应答的抗原。
[0055] 本发明另一方面涉及表达构建体，所述表达构建体包含：
[0056] 至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列；和
[0057] 至少一个编码能够引发免疫应答的抗原的核酸序列。
[0058] 在一个实施方案中，所述核酸编码能够引发细胞介导的免疫应答的抗原。
[0059] 本发明另一方面涉及表达构建体，所述表达构建体包含：
[0060] 至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列；和
[0061] 至少一个编码与能够引发免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的核酸序列。
[0062] 在多种实施方案中，抗原是能够引发细胞介导的免疫应答的抗原，或者结合结构域与能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合。
[0063] 在一个实施方案中，表达构建体编码的融合多肽包含微粒形成蛋白和能够引发免疫应答的抗原。
[0064] 在一个实施方案中，表达构建体编码的融合多肽包含微粒形成蛋白和与能够引发免疫应答的抗原能够结合的结合结构域。
[0065] 在一个实施方案中，所述至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列和所述至少一个编码能够引发免疫应答的抗原的核酸序列作为单个开放阅读框存在。
[0066] 在一个实施方案中，所述至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列和所述至少一个编码与能够引发免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的核酸序列作为单个开放阅读框存在。
[0067] 在一个实施方案中，所述至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列与强启动子有效连接。
[0068] 在一个实施方案中，所述表达构建体包含至少一个编码附加多肽的核酸序列。
[0069] 在一个实施方案中，所述表达构建体包含：
[0070] 至少一个编码融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含微粒形成蛋白和至少一个与能够引发免疫应答的抗原能够结合的结合结构域；和
[0071] 至少一个编码附加多肽的核酸序列，所述附加多肽结合融合多肽中与能够引发免疫应答的抗原能够结合的结合结构域。
[0072] 在一个实施方案中，所述附加多肽是融合多肽，包含微粒形成蛋白和至少一个能够引发免疫应答的抗原，例如能够引发细胞介导的免疫应答的抗原。
[0073] 在一个实施方案中，构建体还包含编码下述蛋白的核酸：
[0074] i.至少一个硫解酶，或
[0075] ii.至少一个还原酶，或
[0076] iii.(i)和(ii)兼而有之。
[0077] 在一个实施方案中，构建体包含编码下述蛋白的核酸：
[0078] i.至少一个硫解酶，
[0079] ii.至少一个还原酶，
[0080] iii.至少一个聚合物合酶，
[0081] iv.至少一个能够引发免疫应答的抗原，
[0082] v.至少一个与至少一个能够引发免疫应答的抗原能够结合的结合结构域，
[0083] vi.包含上述i)至v)中一项或多项的融合蛋白，
[0084] vii.上述i)至vi)中的任一组合。
[0085] 在一个实施方案中，所述表达构建体包含：
[0086] 至少一个编码融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含微粒形成蛋白和至少一个能够引发免疫应答(例如细胞介导的免疫应答)的抗原；和
[0087] 至少一个编码附加多肽的核酸序列，所述附加多肽包含与至少一个能够引发免疫应答(例如细胞介导的免疫应答)的抗原能够结合的结合结构域。
[0088] 在一个实施方案中，所述表达构建体包含：
[0089] 至少一个编码融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含微粒形成蛋白和至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原；和
[0090] 至少一个编码附加多肽的核酸序列，所述附加多肽包含与至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域。
[0091] 在一个实施方案中，所述附加多肽是融合多肽，包含微粒形成蛋白和与至少一个能够引发免疫应答(例如细胞介导的免疫应答)的抗原能够结合的结合结构域。
[0092] 本发明另一方面涉及包含本发明表达构建体的载体。
[0093] 在一个实施方案中，载体是高拷贝数载体。
[0094] 在一个实施方案中，载体是低拷贝数载体。
[0095] 本发明另一方面涉及宿主细胞，其含有如上文所定义的表达构建体或载体。
[0096] 在一个实施方案中，宿主细胞含有选自下组的表达构建体：
[0097] 包含编码微粒形成蛋白和至少一个能够引发免疫应答的抗原的核酸序列的表达构建体，或
[0098] 包含编码微粒形成蛋白和与至少一个能够引发免疫应答(例如细胞介导的免疫应答)的抗原能够结合的结合结构域的核酸序列的表达构建体，或
[0099] 包含编码微粒形成蛋白和至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原的核酸序列的表达构建体，或
[0100] 包含编码微粒形成蛋白和与至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的核酸序列的表达构建体，或
[0101] 包含编码佐剂的核酸序列的表达构建体，或
[0102] 包含编码至少一个能够引发免疫应答的抗原的核酸序列的表达构建体，或
[0103] 包含编码至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原的核酸序列的表达构建体。
[0104] 本发明另一方面涉及包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含与至少一个能够引发免疫应答(例如细胞介导的免疫应答)的抗原融合的微粒形成蛋白。
[0105] 本发明另一方面涉及包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含与结合结构域融合的微粒形成蛋白，所述结合结构域与能够引发免疫应答(例如细胞介导的免疫应答)的抗原能够结合。
[0106] 在一个实施方案中，所述聚合物微粒包含两个或更多不同的融合多肽。
[0107] 在一个实施方案中，所述聚合物微粒包含位于聚合物微粒表面的两个或更多不同的融合多肽。
[0108] 在一个实施方案中，所述聚合物微粒包含三个或更多不同的融合多肽，例如位于聚合物微粒表面的三个或更多不同的融合多肽。
[0109] 在一个实施方案中，所述聚合物微粒包含两个或更多不同的能够引发免疫应答(例如细胞介导的免疫应答)的抗原。
[0110] 在一个实施方案中，所述聚合物微粒包含至少两个或更多不同的能够引发免疫应答(例如细胞介导的免疫应答)的抗原的结合结构域。
[0111] 在一个实施方案中，所述聚合物微粒还包含至少一个与聚合物微粒结合或掺入聚合物微粒之中的物质，或其组合。
[0112] 在一个实施方案中，所述物质为抗原、佐剂或免疫刺激分子。
[0113] 在一个实施方案中，所述物质通过交联结合。
[0114] 在一个实施方案中，至少一种聚合物微粒包含至少一个选自下组的抗原：结核分枝杆菌(M.tuberculosis)抗原、丙肝病毒抗原、流感病毒抗原、土拉热弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)抗原、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)抗原、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)抗原、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)抗原、登革病毒抗原、埃博拉病毒抗原、西尼罗病毒抗原，包括本文所述的抗原之一。
[0115] 本发明另一方面涉及根据上文定义的方法生产的聚合物微粒。
[0116] 本发明另一方面涉及聚合物微粒组合物，其中所述聚合物微粒包含一个或多个融合多肽，所述融合多肽包含与至少一个能够引发免疫应答(例如细胞介导的免疫应答)的抗原融合的微粒形成蛋白。
[0117] 本发明另一方面涉及聚合物微粒组合物，其中所述聚合物微粒包含一个或多个融合多肽，所述融合多肽包含与结合结构域融合的微粒形成蛋白，所述结合结构域与至少一个能够引发免疫应答(例如细胞介导的免疫应答)的抗原能够结合。
[0118] 本发明另一方面涉及聚合物微粒组合物，其中所述聚合物微粒根据上文定义的方法生产。
[0119] 在多种实施方案中，组合物是疫苗组合物。在多种实施方案中，疫苗组合物还包含一种或多种佐剂或免疫刺激分子。
[0120] 本发明另一方面涉及诊断试剂，其包含如上文所定义的聚合物微粒组合物。
[0122] 在一个实施方案中，所述组合物含有同质聚合物微粒群。
[0123] 在一个实施方案中，所述组合物含有混合的聚合物微粒群。
[0124] 在一个实施方案中，所述组合物还包含如下一个或多个物质：
[0125] 一个或多个能够引发免疫应答(例如细胞介导的免疫应答)的抗原，
[0126] 一个或多个能够引发免疫应答(例如细胞介导的免疫应答)的抗原的一个或多个结合结构域，
[0127] 一个或多个佐剂，或
[0128] 一个或多个免疫刺激因子或分子。
[0129] 本发明另一方面涉及引发受试者免疫应答的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与至少一个能够引发受试者免疫应答的抗原融合的微粒形成蛋白。
[0130] 在一个实施方案中，免疫应答是细胞介导的免疫应答。在一个实施方案中，抗原是能够引发细胞介导的免疫应答的抗原。
[0131] 在一个实施方案中，免疫应答是体液免疫应答。在一个实施方案中，抗原是能够引发体液免疫应答的抗原。
[0132] 本发明另一方面涉及引发受试者免疫应答的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与结合结构域融合的微粒形成蛋白，所述结合结构域与至少一个能够引发受试者免疫应答的抗原能够结合，其中所述结合结构域结合了、受试者含有、或对受试者给药至少一个能够引发免疫应答的抗原。
[0133] 在一个实施方案中，免疫应答是细胞介导的免疫应答。在一个实施方案中，结合结构域与能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合。
[0134] 在一个实施方案中，所述方法涉及对受试者进行抗结核免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与至少一个能够引发细胞介导的或其他免疫应答抗原融合的微粒形成蛋白。
[0135] 在一个实施方案中，所述方法涉及对受试者进行抗结核免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与至少一个结合结构域融合的微粒形成蛋白，所述结合结构域与至少一个能够引发细胞介导的免疫应答抗原能够结合，其中所述与至少一个能够引发细胞介导的或其他免疫应答的抗原能够结合的结合结构域结合了、受试者含有、或对受试者给药至少一个能够引发免疫应答的抗原。
[0136] 在一个实施方案中，所述至少一种聚合物微粒存在于包含至少一个能够引发受试者免疫应答的抗原的组合物之中，例如包含至少一个能够引发受试者细胞介导的或其他免疫应答的抗原的组合物。
[0137] 在一个实施方案中，本发明涉及对感染了结核的受试者引发免疫应答的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药聚合物微粒，所述聚合物微粒包含与例如结核分枝杆菌抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白，优选聚合物合酶。
[0138] 在一个实施方案中，结核分枝杆菌抗原结合结构域与例如内源结核分枝杆菌抗原结合。
[0139] 本发明另一方面涉及用来引发受试者免疫应答(例如细胞介导的免疫应答)的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一个或多个融合多肽，其中至少一个融合多肽包含与至少一个能够引发受试者免疫应答的抗原融合的微粒形成蛋白，优选聚合物合酶。
[0140] 在一个实施方案中，免疫应答是细胞介导的免疫应答。在一个实施方案中，抗原是能够引发细胞介导的免疫应答的抗原。
[0141] 在一个实施方案中，免疫应答是体液免疫应答。在一个实施方案中，抗原是能够引发体液免疫应答的抗原。
[0142] 本发明另一方面涉及用来对有需要的受试者引发免疫应答的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一个或多个融合多肽，其中至少一个融合多肽包含与结合结构域融合的微粒形成蛋白，所述结合结构域与至少一个能够引发受试者免疫应答的抗原能够结合，其中所述结合结构域结合了、受试者含有、或对受试者给药至少一个能够引发免疫应答的抗原。
[0143] 在一个实施方案中，免疫应答是细胞介导的免疫应答。在一个实施方案中，结合结构域与能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合。在一个实施方案中，免疫应答是体液免疫应答。在一个实施方案中，抗原是能够引发体液免疫应答的抗原。
[0144] 在一个实施方案中，所述至少一种聚合物微粒存在于包含至少一个能够引发免疫应答(例如细胞介导的免疫应答)的抗原的组合物之中。
[0145] 在一个实施方案中，所述至少一种聚合物微粒存在于包含例如至少一个结核分枝杆菌抗原的组合物之中。
[0146] 在一个实施方案中，举例来说，所述至少一种聚合物微粒存在于包含至少一个选自下组的抗原的组合物之中：结核分枝杆菌抗原、丙肝病毒抗原、流感病毒抗原、土拉热弗朗西斯氏菌抗原、流产布鲁氏菌抗原、脑膜炎奈瑟菌抗原、炭疽芽孢杆菌抗原、登革病毒抗原、埃博拉病毒抗原、西尼罗病毒抗原，例如包括本文所述的抗原之一。
[0148] 在不同的实施方案中，受试者感染有肝炎、流感或结核。
[0149] 在另一实施方案中，受试者已进行过例如抗细胞内病原体免疫。例如，受试者已经接种过卡介苗(BCG)疫苗。
[0150] 在一个实施方案中，例如，受试者感染有细胞外病原体，或具有感染细胞外病原体的风险。在另一实施方案中，例如，受试者感染有、或具有感染生命周期主要是细胞外形式的病原体的风险。
[0151] 本发明另一方面涉及用来对感染有细胞内病原体或进行过抗细胞内病原体免疫的受试者引发免疫应答的聚合物微粒，其中至少一种聚合物微粒包含与结合结构域融合的微粒形成蛋白，优选聚合物合酶，所述结合结构域与至少一个能够引发免疫应答的抗原能够结合。
[0152] 也考虑如上所述的聚合物微粒在制备药物中的用途，所述药物用于对受试者进行抗细胞内病原体免疫、或对受试者(包括感染有细胞内病原体或进行过抗细胞内病原体免疫的受试者)引发免疫应答。
[0153] 本发明另一方面涉及用来对例如感染有细胞外病原体或进行过抗细胞外病原体免疫的受试者引发免疫应答的聚合物微粒，其中至少一种聚合物微粒包含与结合结构域融合的微粒形成蛋白，优选聚合物合酶，所述结合结构域与至少一个能够引发免疫应答的抗原能够结合。
[0154] 也考虑如上所述的聚合物微粒在制备药物中的用途，所述药物用于例如对受试者进行抗细胞外病原体免疫、或例如对受试者(包括感染有细胞外病原体或进行过抗细胞外病原体免疫的受试者)引发免疫应答。
[0155] 本发明还提供了用于对有需要的受试者进行疫苗接种的如本文所述的聚合物微粒。因此考虑如本文所述的聚合物微粒在制备用于对有需要的受试者进行疫苗接种的药物中的用途。
[0156] 本发明另一方面涉及诊断病原体感染的方法，其中所述方法包括向受试者给药至少一种本发明的聚合物微粒，和检测指示病原体存在的反应。
[0157] 在一个实施方案中，病原体是细胞内病原体。在另一实施方案中，病原体是细胞外病原体。
[0158] 在一个实施方案中，指示病原体(例如细胞内病原体)存在的反应是迟发型超敏反应。
[0159] 本发明另一方面涉及诊断病原体感染的方法，其中所述方法包括使从受试者获得样品与至少一种本发明的聚合物微粒接触，和检测指示病原体存在的反应。
[0160] 同样，在某些实施方案中，病原体是细胞内病原体、细胞外病原体、例如生命周期主要是细胞内形式的病原体、或例如生命周期主要是细胞外形式的病原体。
[0161] 在一个实施方案中，指示病原体存在的反应是检测所述样品中病原体抗体的存在。
[0162] 在一个实施方案中，指示病原体存在的反应是检测所述样品中病原体反应性免疫细胞的存在。
[0163] 在一个实施方案中，检测病原体抗体的存在是通过免疫测定法进行的。
[0164] 在一个实施方案中，检测病原体抗体的存在是通过ELISA、放射免疫测定分析或蛋白质印迹(Western Blot)进行的。
[0165] 在一个实施方案中，指示病原体存在的反应是检测所述样品中病原体反应性免疫细胞的存在。
[0166] 本发明另一方面提供了生产聚合物微粒的方法，所述方法包括：
[0167] 提供含有至少一个表达构建体的宿主细胞，所述至少一个表达构建体包含：
[0168] 至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列，和
[0169] 至少一个编码结核分枝杆菌抗原或结核分枝杆菌抗原结合结构域的核酸序列；
[0170] 在适合于表达构建体表达和聚合物微粒形成的条件下维持所述宿主细胞；和
[0171] 从宿主细胞中分离聚合物微粒。
[0172] 在宿主细胞含有至少两个不同的表达构建体的一些实施方案中，至少一个表达构建体选自下组：
[0173] 包含编码微粒形成蛋白和至少一个结核分枝杆菌抗原的核酸序列的表达构建体，或
[0174] 包含编码微粒形成蛋白和至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域的核酸序列的表达构建体，或
[0175] 包含编码佐剂的核酸序列的表达构建体，或
[0176] 包含编码至少一个结核分枝杆菌抗原的核酸序列的表达构建体。
[0177] 在宿主细胞含有至少两个不同的表达构建体的其他实施方案中，一个表达构建体包含编码微粒形成蛋白和与至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域的核酸序列，且至少一个表达构建体选自下组：
[0178] 包含编码微粒形成蛋白和至少一个结核分枝杆菌抗原的核酸序列的表达构建体，或
[0179] 包含编码微粒形成蛋白和至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域的核酸序列的表达构建体，或
[0180] 包含编码佐剂的核酸序列的表达构建体，或
[0181] 包含编码至少一个结核分枝杆菌抗原的核酸序列的表达构建体。
[0182] 在一个实施方案中，宿主细胞含有混合的表达构建体群，其中每个表达构建体包含编码融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含：
[0183] 至少一个微粒形成蛋白，和
[0184] 至少一个结核分枝杆菌抗原或至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域。
[0185] 本发明另一方面涉及表达构建体，所述表达构建体包含：
[0186] 至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列；和
[0187] 至少一个编码结核分枝杆菌抗原的核酸序列。
[0188] 本发明另一方面涉及表达构建体，所述表达构建体包含：
[0189] 至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列；和
[0190] 至少一个编码结核分枝杆菌抗原结合结构域的核酸序列。
[0191] 在一个实施方案中，表达构建体编码的融合多肽包含微粒形成蛋白和结核分枝杆菌抗原。
[0192] 在一个实施方案中，表达构建体编码的融合多肽包含微粒形成蛋白和结核分枝杆菌抗原结合结构域。
[0193] 在一个实施方案中，所述至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列和所述至少一个编码结核分枝杆菌抗原的核酸序列作为单个开放阅读框存在。
[0194] 在一个实施方案中，所述至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列和所述至少一个编码结核分枝杆菌抗原结合结构域的核酸序列作为单个开放阅读框存在。
[0195] 在一个实施方案中，所述表达构建体包含：
[0196] 至少一个编码融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含微粒形成蛋白和至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域；和
[0197] 至少一个编码附加多肽的核酸序列，所述附加多肽包含至少一个与融合多肽中结核分枝杆菌抗原结合结构域结合的多肽。
[0198] 在一个实施方案中，附加多肽是结核分枝杆菌抗原或包含至少一个结核分枝杆菌抗原。
[0199] 在一个实施方案中，附加多肽是融合多肽，包含微粒形成蛋白和至少一个结核分枝杆菌抗原。
[0200] 在一个实施方案中，所述表达构建体包含：
[0201] 至少一个编码融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含微粒形成蛋白和至少一个结核分枝杆菌抗原；和
[0202] 至少一个编码附加多肽的核酸序列，所述附加多肽包含至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域。
[0203] 在一个实施方案中，附加多肽是融合多肽，包含微粒形成蛋白和至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域。
[0204] 在一个实施方案中，宿主细胞含有选自下组的表达构建体：
[0205] 包含编码微粒形成蛋白和至少一个结核分枝杆菌抗原的核酸序列的表达构建体，或
[0206] 包含编码微粒形成蛋白和至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域的核酸序列的表达构建体，或
[0207] 包含编码佐剂的核酸序列的表达构建体，或
[0208] 包含编码至少一个结核分枝杆菌抗原的核酸序列的表达构建体。
[0209] 本发明另一方面涉及包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含与至少一个结核分枝杆菌抗原融合的微粒形成蛋白。
[0210] 本发明另一方面涉及包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含与至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白。
[0211] 在一个实施方案中，所述聚合物微粒包含两个或更多不同的结核分枝杆菌抗原。
[0212] 在一个实施方案中，所述聚合物微粒包含两个或更多不同的结核分枝杆菌抗原结合结构域。
[0213] 本发明另一方面涉及聚合物微粒组合物，其中所述聚合物微粒包含一个或多个融合多肽，所述融合多肽包含与至少一个结核分枝杆菌抗原融合的微粒形成蛋白。
[0214] 本发明另一方面涉及聚合物微粒组合物，其中所述聚合物微粒包含一个或多个融合多肽，所述融合多肽包含与至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白。
[0215] 在一个实施方案中，所述组合物还包含如下一个或多个物质：
[0216] 一个或多个结核分枝杆菌抗原，
[0217] 一个或多个结核分枝杆菌抗原结合结构域，
[0218] 一个或多个佐剂，或
[0219] 一个或多个免疫刺激因子或分子。
[0220] 本发明另一方面涉及对受试者进行抗结核免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与至少一个结核分枝杆菌抗原融合的微粒形成蛋白。
[0221] 本发明另一方面涉及对受试者进行抗结核免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白，其中所述结核分枝杆菌抗原结合结构域结合了、受试者含有、或对受试者给药至少一个结核分枝杆菌抗原。
[0222] 在一个实施方案中，聚合物微粒存在于包含至少一个结核分枝杆菌抗原的组合物之中。
[0223] 本发明另一方面涉及引发受试者免疫应答的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与至少一个结核分枝杆菌抗原融合的微粒形成蛋白。
[0224] 本发明另一方面涉及引发受试者免疫应答的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白，其中所述结核分枝杆菌抗原结合结构域结合了、受试者含有、或对受试者给药至少一个结核分枝杆菌抗原。
[0225] 在一个实施方案中，至少一种聚合物微粒存在于包含至少一个结核分枝杆菌抗原的组合物之中。
[0226] 在一个实施方案中，受试者感染有结核。
[0227] 在另一实施方案中，受试者已经进行过抗结核免疫。例如，受试者已经接种过卡介苗(BCG)(世界卫生组织-http://www.who.int)疫苗。
[0228] 本发明另一方面涉及对感染了结核的受试者引发免疫应答的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种聚合物微粒，其所述聚合物微粒包含与至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白。
[0229] 在一个实施方案中，结核分枝杆菌抗原结合结构域与内源结核分枝杆菌抗原结合。
[0230] 本发明另一方面涉及用来对受试者进行抗结核免疫的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一个或多个融合多肽，其中至少一个融合多肽包含与至少一个结核分枝杆菌抗原融合的微粒形成蛋白。
[0231] 本发明另一方面涉及用来对受试者进行抗结核免疫的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一个或多个融合多肽，其中至少一个融合多肽包含与至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白。
[0232] 本发明另一方面涉及用来引发受试者免疫应答的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一个或多个融合多肽，其中至少一个融合多肽包含与至少一个结核分枝杆菌抗原融合的微粒形成蛋白。
[0233] 本发明另一方面涉及用来引发受试者免疫应答的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一个或多个融合多肽，其中至少一个融合多肽包含与至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白。
[0234] 在一个实施方案中，所述聚合物微粒存在于包含至少一个结核分枝杆菌抗原的组合物之中。
[0235] 在一个实施方案中，受试者感染有结核。
[0236] 在另一实施方案中，受试者已经进行过抗结核免疫。例如，受试者已经接种过卡介苗(BCG)疫苗。
[0237] 本发明另一方面涉及用来对感染有结核或进行过抗结核免疫的受试者引发免疫应答的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含与至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白。
[0238] 也考虑如上所述的聚合物微粒在制备药物中的用途，所述药物用于对受试者进行抗结核免疫、或对受试者(包括感染有结核或进行过抗结核免疫的受试者)引发免疫应答。
[0239] 本发明另一方面涉及诊断受试者结核菌感染的方法，其中所述方法包括向受试者给药至少一种本发明的聚合物微粒，和检测指示结核分枝杆菌存在的反应。
[0240] 在一个实施方案中，指示结核分枝杆菌存在的反应是迟发型超敏反应。
[0241] 本发明另一方面涉及诊断受试者结核菌感染的方法，其中所述方法包括使从受试者获得样品与本发明的聚合物微粒接触，和检测指示结核分枝杆菌存在的反应。
[0242] 在一个实施方案中，指示结核分枝杆菌存在的反应是检测所述样品中结核分枝杆菌抗原抗体的存在。
[0243] 在一个实施方案中，结核分枝杆菌抗原抗体的存在通过免疫测定法检测。
[0244] 在一个实施方案中，检测结核分枝杆菌抗原抗体的存在是通过ELISA、放射免疫测定分析或蛋白质印迹(Western Blot)进行的。
[0245] 在一个实施方案中，指示细胞内病原体存在的反应是检测所述样品中结核分枝杆菌抗原反应性免疫细胞的存在。
[0246] 在一个实施方案中，结核分枝杆菌抗原反应性免疫细胞的存在通过细胞增殖测定法、包括FACS在内细胞分选测定法或原位杂交测定法来检测。
[0247] 本发明另一方面提供了生产聚合物微粒的方法，所述方法包括：
[0248] 提供含有至少一个表达构建体的宿主细胞，所述至少一个表达构建体包含：
[0249] 至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列，和
[0250] 至少一个编码肝炎病毒抗原或肝炎病毒抗原结合结构域的核酸序列；
[0251] 在适合于表达构建体表达和聚合物微粒形成的条件下维持所述宿主细胞；和
[0252] 从宿主细胞中分离聚合物微粒。
[0253] 在宿主细胞含有至少两个不同的表达构建体的一些实施方案中，至少一个表达构建体选自下组：
[0254] 包含编码微粒形成蛋白和至少一个肝炎病毒抗原的核酸序列的表达构建体，或[0255] 包含编码微粒形成蛋白和至少一个肝炎病毒抗原结合结构域的核酸序列的表达构建体，或
[0256] 包含编码佐剂的核酸序列的表达构建体，或
[0257] 包含编码至少一个肝炎病毒抗原的核酸序列的表达构建体。
[0258] 在宿主细胞含有至少两个不同的表达构建体的其他实施方案中，一个表达构建体包含编码微粒形成蛋白和与至少一个肝炎病毒抗原结合结构域的核酸序列，且至少一个表达构建体选自下组：
[0259] 包含编码微粒形成蛋白和至少一个肝炎病毒抗原的核酸序列的表达构建体，或[0260] 包含编码微粒形成蛋白和至少一个肝炎病毒抗原结合结构域的核酸序列的表达构建体，或
[0261] 包含编码佐剂的核酸序列的表达构建体，或
[0262] 包含编码至少一个肝炎病毒抗原的核酸序列的表达构建体。
[0263] 在一个实施方案中，宿主细胞含有混合的表达构建体群，其中每个表达构建体包含编码融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含：
[0264] 至少一个微粒形成蛋白，和
[0265] 至少一个肝炎病毒抗原或至少一个肝炎病毒抗原结合结构域。
[0266] 本发明另一方面涉及表达构建体，所述表达构建体包含：
[0267] 至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列；和
[0268] 至少一个编码肝炎病毒抗原的核酸序列。
[0269] 本发明另一方面涉及表达构建体，所述表达构建体包含：
[0270] 至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列；和
[0271] 至少一个编码肝炎病毒抗原结合结构域的核酸序列。
[0272] 在一个实施方案中，表达构建体编码的融合多肽包含微粒形成蛋白和肝炎病毒抗原。
[0273] 在一个实施方案中，表达构建体编码的融合多肽包含微粒形成蛋白和肝炎病毒抗原结合结构域。
[0274] 在一个实施方案中，所述至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列和所述至少一个编码肝炎病毒抗原的核酸序列作为单个开放阅读框存在。
[0275] 在一个实施方案中，所述至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列和所述至少一个编码肝炎病毒抗原结合结构域的核酸序列作为单个开放阅读框存在。
[0276] 在一个实施方案中，所述表达构建体包含：
[0277] 至少一个编码融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含微粒形成蛋白和至少一个肝炎病毒抗原结合结构域；和
[0278] 至少一个编码附加多肽的核酸序列，所述附加多肽包含至少一个与融合多肽中肝炎病毒抗原结合结构域结合的多肽。
[0279] 在一个实施方案中，附加多肽是肝炎病毒抗原或包含至少一个肝炎病毒抗原。
[0280] 在一个实施方案中，附加多肽是融合多肽，包含微粒形成蛋白和至少一个肝炎病毒抗原。
[0281] 在一个实施方案中，所述表达构建体包含：
[0282] 至少一个编码融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含微粒形成蛋白和至少一个肝炎病毒抗原；和
[0283] 至少一个编码附加多肽的核酸序列，所述附加多肽包含至少一个肝炎病毒抗原结合结构域。
[0284] 在一个实施方案中，附加多肽是融合多肽，包含微粒形成蛋白和至少一个肝炎病毒抗原结合结构域。
[0285] 在一个实施方案中，宿主细胞含有选自下组的表达构建体：
[0286] 包含编码微粒形成蛋白和至少一个肝炎病毒抗原的核酸序列的表达构建体，或[0287] 包含编码微粒形成蛋白和至少一个肝炎病毒抗原结合结构域的核酸序列的表达构建体，或
[0288] 包含编码佐剂的核酸序列的表达构建体，或
[0289] 包含编码至少一个肝炎病毒抗原的核酸序列的表达构建体。
[0290] 本发明另一方面涉及包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含与至少一个肝炎病毒抗原融合的微粒形成蛋白。
[0291] 本发明另一方面涉及包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含与至少一个肝炎病毒抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白。
[0292] 在一个实施方案中，所述聚合物微粒包含两个或更多不同的肝炎病毒抗原。
[0293] 在一个实施方案中，所述聚合物微粒包含两个或更多不同的肝炎病毒抗原结合结构域。
[0294] 本发明另一方面涉及聚合物微粒组合物，其中所述聚合物微粒包含一个或多个融合多肽，所述融合多肽包含与至少一个肝炎病毒抗原融合的微粒形成蛋白。
[0295] 本发明另一方面涉及聚合物微粒组合物，其中所述聚合物微粒包含一个或多个融合多肽，所述融合多肽包含与至少一个肝炎病毒抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白。
[0296] 在一个实施方案中，所述组合物还包含如下一个或多个物质：
[0297] 一个或多个肝炎病毒抗原，
[0298] 一个或多个肝炎病毒抗原结合结构域，
[0299] 一个或多个佐剂，或
[0300] 一个或多个免疫刺激因子或分子。
[0301] 本发明另一方面涉及对受试者进行抗肝炎免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与至少一个肝炎病毒抗原融合的微粒形成蛋白。
[0302] 本发明另一方面涉及对受试者进行抗肝炎免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与至少一个肝炎病毒抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白，其中所述肝炎病毒抗原结合结构域结合了、受试者含有、或对受试者给药至少一个肝炎病毒抗原。
[0303] 在一个实施方案中，聚合物微粒存在于包含至少一个肝炎病毒抗原的组合物之中。
[0304] 本发明另一方面涉及引发受试者免疫应答的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与至少一个肝炎病毒抗原融合的微粒形成蛋白。
[0305] 本发明另一方面涉及引发受试者免疫应答的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与至少一个肝炎病毒抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白，其中所述肝炎病毒抗原结合结构域结合了、受试者含有、或对受试者给药至少一个肝炎病毒抗原。
[0306] 在一个实施方案中，至少一种聚合物微粒存在于包含至少一个肝炎病毒抗原的组合物之中。
[0307] 在一个实施方案中，受试者感染有肝炎。
[0308] 在另一实施方案中，受试者已经进行过抗肝炎免疫。
[0309] 本发明另一方面涉及对感染了肝炎的受试者引发免疫应答的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种聚合物微粒，其所述聚合物微粒包含与至少一个肝炎病毒抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白。
[0310] 在一个实施方案中，肝炎病毒抗原结合结构域与内源肝炎病毒抗原结合。
[0311] 本发明另一方面涉及用来对受试者进行抗肝炎免疫的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一个或多个融合多肽，其中至少一个融合多肽包含与至少一个肝炎病毒抗原融合的微粒形成蛋白。
[0312] 本发明另一方面涉及用来对受试者进行抗肝炎免疫的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一个或多个融合多肽，其中至少一个融合多肽包含与至少一个肝炎病毒抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白。
[0313] 本发明另一方面涉及用来引发受试者免疫应答的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一个或多个融合多肽，其中至少一个融合多肽包含与至少一个肝炎病毒抗原融合的微粒形成蛋白。
[0314] 本发明另一方面涉及用来引发受试者免疫应答的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一个或多个融合多肽，其中至少一个融合多肽包含与至少一个肝炎病毒抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白。
[0315] 在一个实施方案中，所述聚合物微粒存在于包含至少一个肝炎病毒抗原的组合物之中。
[0316] 在一个实施方案中，受试者感染有肝炎。
[0317] 在另一实施方案中，受试者已经进行过抗肝炎免疫。
[0318] 本发明另一方面涉及用来对感染有肝炎或进行过抗肝炎免疫的受试者引发免疫应答的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含与至少一个肝炎病毒抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白。
[0319] 也考虑如上所述的聚合物微粒在制备药物中的用途，所述药物用于对受试者进行抗肝炎免疫、或对受试者(包括感染有肝炎或进行过抗肝炎免疫的受试者)引发免疫应答。
[0320] 本发明另一方面涉及诊断受试者肝炎病毒感染的方法，其中所述方法包括向受试者给药至少一种本发明的聚合物微粒，和检测指示肝炎病毒存在的反应。
[0321] 在一个实施方案中，指示肝炎病毒存在的反应是迟发型超敏反应。
[0322] 本发明另一方面涉及诊断受试者肝炎病毒感染的方法，其中所述方法包括使从受试者获得样品与本发明的聚合物微粒接触，和检测指示肝炎病毒存在的反应。
[0323] 在一个实施方案中，指示肝炎病毒存在的反应是检测所述样品中肝炎病毒抗原抗体的存在。
[0324] 在一个实施方案中，肝炎病毒抗原抗体的存在通过免疫测定法检测。
[0325] 在一个实施方案中，检测肝炎病毒抗原抗体的存在是通过ELISA、放射免疫测定分析或蛋白质印迹(Western Blot)进行的。
[0326] 在一个实施方案中，指示细胞内病原体存在的反应是检测所述样品中肝炎病毒抗原反应性免疫细胞的存在。
[0327] 在一个实施方案中，肝炎病毒抗原反应性免疫细胞的存在通过细胞增殖测定法、包括FACS在内细胞分选测定法或原位杂交测定法来检测。
[0328] 本发明另一方面提供了生产聚合物微粒的方法，所述方法包括：
[0329] 提供含有至少一个表达构建体的宿主细胞，所述至少一个表达构建体包含：
[0330] 至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列，和
[0331] 至少一个编码流感病毒抗原或流感病毒抗原结合结构域的核酸序列；
[0332] 在适合于表达构建体表达和聚合物微粒形成的条件下维持所述宿主细胞；和
[0333] 从宿主细胞中分离聚合物微粒。
[0334] 在宿主细胞含有至少两个不同的表达构建体的一些实施方案中，至少一个表达构建体选自下组：
[0335] 包含编码微粒形成蛋白和至少一个流感病毒抗原的核酸序列的表达构建体，或[0336] 包含编码微粒形成蛋白和至少一个流感病毒抗原结合结构域的核酸序列的表达构建体，或
[0337] 包含编码佐剂的核酸序列的表达构建体，或
[0338] 包含编码至少一个流感病毒抗原的核酸序列的表达构建体。
[0339] 在宿主细胞含有至少两个不同的表达构建体的其他实施方案中，一个表达构建体包含编码微粒形成蛋白和与至少一个流感病毒抗原结合结构域的核酸序列，且至少一个表达构建体选自下组：
[0340] 包含编码微粒形成蛋白和至少一个流感病毒抗原的核酸序列的表达构建体，或[0341] 包含编码微粒形成蛋白和至少一个流感病毒抗原结合结构域的核酸序列的表达构建体，或
[0342] 包含编码佐剂的核酸序列的表达构建体，或
[0343] 包含编码至少一个流感病毒抗原的核酸序列的表达构建体。
[0344] 在一个实施方案中，宿主细胞含有混合的表达构建体群，其中每个表达构建体包含编码融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含：
[0345] 至少一个微粒形成蛋白，和
[0346] 至少一个流感病毒抗原或至少一个流感病毒抗原结合结构域。
[0347] 本发明另一方面涉及表达构建体，所述表达构建体包含：
[0348] 至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列；和
[0349] 至少一个编码流感病毒抗原的核酸序列。
[0350] 本发明另一方面涉及表达构建体，所述表达构建体包含：
[0351] 至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列；和
[0352] 至少一个编码流感病毒抗原结合结构域的核酸序列。
[0353] 在一个实施方案中，表达构建体编码的融合多肽包含微粒形成蛋白和流感病毒抗原。
[0354] 在一个实施方案中，表达构建体编码的融合多肽包含微粒形成蛋白和流感病毒抗原结合结构域。
[0355] 在一个实施方案中，所述至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列和所述至少一个编码流感病毒抗原的核酸序列作为单个开放阅读框存在。
[0356] 在一个实施方案中，所述至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列和所述至少一个编码流感病毒抗原结合结构域的核酸序列作为单个开放阅读框存在。
[0357] 在一个实施方案中，所述表达构建体包含：
[0358] 至少一个编码融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含微粒形成蛋白和至少一个流感病毒抗原结合结构域；和
[0359] 至少一个编码附加多肽的核酸序列，所述附加多肽包含至少一个与融合多肽中流感病毒抗原结合结构域结合的多肽。
[0360] 在一个实施方案中，附加多肽是流感病毒抗原或包含至少一个流感病毒抗原。
[0361] 在一个实施方案中，附加多肽是融合多肽，包含微粒形成蛋白和至少一个流感病毒抗原。
[0362] 在一个实施方案中，所述表达构建体包含：
[0363] 至少一个编码融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含微粒形成蛋白和至少一个流感病毒抗原；和
[0364] 至少一个编码附加多肽的核酸序列，所述附加多肽包含至少一个流感病毒抗原结合结构域。
[0365] 在一个实施方案中，附加多肽是融合多肽，包含微粒形成蛋白和至少一个流感病毒抗原结合结构域。
[0366] 在一个实施方案中，宿主细胞含有选自下组的表达构建体：
[0367] 包含编码微粒形成蛋白和至少一个流感病毒抗原的核酸序列的表达构建体，或[0368] 包含编码微粒形成蛋白和至少一个流感病毒抗原结合结构域的核酸序列的表达构建体，或
[0369] 包含编码佐剂的核酸序列的表达构建体，或
[0370] 包含编码至少一个流感病毒抗原的核酸序列的表达构建体。
[0371] 本发明另一方面涉及包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含与至少一个流感病毒抗原融合的微粒形成蛋白。
[0372] 本发明另一方面涉及包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含与至少一个流感病毒抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白。
[0373] 在一个实施方案中，所述聚合物微粒包含两个或更多不同的流感病毒抗原。
[0374] 在一个实施方案中，所述聚合物微粒包含两个或更多不同的流感病毒抗原结合结构域。
[0375] 本发明另一方面涉及聚合物微粒组合物，其中所述聚合物微粒包含一个或多个融合多肽，所述融合多肽包含与至少一个流感病毒抗原融合的微粒形成蛋白。
[0376] 本发明另一方面涉及聚合物微粒组合物，其中所述聚合物微粒包含一个或多个融合多肽，所述融合多肽包含与至少一个流感病毒抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白。
[0377] 在一个实施方案中，所述组合物还包含如下一个或多个物质：
[0378] 一个或多个流感病毒抗原，
[0379] 一个或多个流感病毒抗原结合结构域，
[0380] 一个或多个佐剂，或
[0381] 一个或多个免疫刺激因子或分子。
[0382] 本发明另一方面涉及对受试者进行抗流感免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与至少一个流感病毒抗原融合的微粒形成蛋白。
[0383] 本发明另一方面涉及对受试者进行抗流感免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与至少一个流感病毒抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白，其中所述流感病毒抗原结合结构域结合了、受试者含有、或对受试者给药至少一个流感病毒抗原。
[0384] 在一个实施方案中，聚合物微粒存在于包含至少一个流感病毒抗原的组合物之中。
[0385] 本发明另一方面涉及引发受试者免疫应答的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与至少一个流感病毒抗原融合的微粒形成蛋白。
[0386] 本发明另一方面涉及引发受试者免疫应答的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种包含一个或多个融合多肽的聚合物微粒，其中至少一个融合多肽包含与至少一个流感病毒抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白，其中所述流感病毒抗原结合结构域结合了、受试者含有、或对受试者给药至少一个流感病毒抗原。
[0387] 在一个实施方案中，至少一种聚合物微粒存在于包含至少一个流感病毒抗原的组合物之中。
[0388] 在一个实施方案中，受试者感染有流感。
[0389] 在另一实施方案中，受试者已经进行过抗流感免疫。
[0390] 本发明另一方面涉及对感染了流感的受试者引发免疫应答的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药至少一种聚合物微粒，其所述聚合物微粒包含与流感病毒抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白。
[0391] 在一个实施方案中，流感病毒抗原结合结构域与内源流感病毒抗原结合。
[0392] 本发明另一方面涉及用来对受试者进行抗流感免疫的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一个或多个融合多肽，其中至少一个融合多肽包含与至少一个流感病毒抗原融合的微粒形成蛋白。
[0393] 本发明另一方面涉及用来对受试者进行抗流感免疫的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一个或多个融合多肽，其中至少一个融合多肽包含与至少一个流感病毒抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白。
[0394] 本发明另一方面涉及用来引发受试者免疫应答的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一个或多个融合多肽，其中至少一个融合多肽包含与至少一个流感病毒抗原融合的微粒形成蛋白。
[0395] 本发明另一方面涉及用来引发受试者免疫应答的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一个或多个融合多肽，其中至少一个融合多肽包含与至少一个流感病毒抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白。
[0396] 在一个实施方案中，所述聚合物微粒存在于包含至少一个流感病毒抗原的组合物之中。
[0397] 在一个实施方案中，受试者感染有流感。
[0398] 在另一实施方案中，受试者已经进行过抗流感免疫。
[0399] 本发明另一方面涉及用来对感染有流感或进行过抗流感免疫的受试者引发免疫应答的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含与至少一个流感病毒抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白。
[0400] 也考虑如上所述的聚合物微粒在制备药物中的用途，所述药物用于对受试者进行抗流感免疫、或对受试者(包括感染有流感或进行过抗流感免疫的受试者)引发免疫应答。
[0401] 本发明另一方面涉及诊断受试者流感感染的方法，其中所述方法包括向受试者给药至少一种本发明的聚合物微粒，和检测指示流感病毒存在的反应。
[0402] 在一个实施方案中，指示流感病毒存在的反应是迟发型超敏反应。
[0403] 本发明另一方面涉及诊断受试者流感感染的方法，其中所述方法包括使从受试者获得样品与本发明的聚合物微粒接触，和检测指示流感病毒存在的反应。
[0404] 在一个实施方案中，指示流感病毒存在的反应是检测所述样品中流感病毒抗原抗体的存在。
[0405] 在一个实施方案中，流感病毒抗原抗体的存在通过免疫测定法检测。
[0406] 在一个实施方案中，检测流感病毒抗原抗体的存在是通过ELISA、放射免疫测定分析或蛋白质印迹(Western Blot)进行的。
[0407] 在一个实施方案中，指示细胞内病原体存在的反应是检测所述样品中流感病毒抗原反应性免疫细胞的存在。
[0408] 在一个实施方案中，流感病毒抗原反应性免疫细胞的存在通过细胞增殖测定法、包括FACS在内细胞分选测定法或原位杂交测定法来检测。
[0409] 如下实施方案可涉及任何上述方面。
[0410] 在不同的实施方案中，微粒形成蛋白是聚合物合酶。
[0411] 在不同的实施方案中，聚合物微粒包含选自聚β-氨基酸、聚乳酸、聚硫酯和聚酯的聚合物。最优选聚合物包含聚羟基烷酸酯(PHA)，优选聚(3-羟基丁酸酯)(PHB)。
[0412] 在不同的实施方案中，聚合物微粒包含由磷脂单层包裹的聚合物微粒。
[0413] 在不同的实施方案中，聚合物微粒包含两个或更多不同的融合多肽。
[0414] 在不同的实施方案中，聚合物微粒包含位于聚合物微粒表面的两个或更多不同的融合多肽。
[0415] 在不同的实施方案中，聚合物微粒包含三个或更多不同的融合多肽，例如位于聚合物微粒表面的三个或更多不同的融合多肽。
[0416] 在不同的实施方案中，聚合物微粒还包含至少一个与聚合物微粒结合或掺入聚合物微粒之中的物质，或其组合。
[0417] 在不同的实施方案中，所述物质为抗原、佐剂或免疫刺激分子。
[0418] 在不同的实施方案中，所述物质通过交联与聚合物微粒结合。
[0419] 在不同的实施方案中，聚合物合酶与聚合物微粒结合、或与磷脂单层结合、或与两者均结合。
[0420] 在不同的实施方案中，聚合物合酶与其所形成的聚合物微粒共价或非共价结合。
[0421] 在不同的实施方案中，聚合物合酶是来自不动杆菌属(Acinetobacter)、弧菌属(Vibrio)、气单胞菌属(Aeromonas)、色杆菌属(Chromobacterium)、假单胞
菌属(Pseudomonas)、动胶菌属(Zoogloea)、产碱菌属(Alcaligenes)、代尔夫特菌
属(Delftia)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、红球
菌属(Rhodococcus)、戈登氏菌属(Gordonia)、红细菌属(Rhodobacter)、副球菌
属(Paracoccus)、立克次体属(Rickettsia)、柄杆菌属(Caulobacter)、甲基杆菌属
(Methylobacterium)、固氮根瘤菌属(Azorhizobium)、农杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、立克次体属(Rickettsia)、泉古菌门(Crenarchaeota)、集胞藻属(Synechocystis)、外硫红螺菌属(Ectothiorhodospira)、荚硫菌属(Thiocapsa)、囊硫菌属(Thyocystis)和异着色菌属(Allochromatium)的
1型PHA合酶；来自伯克霍尔德菌属和假单胞菌属的2型PHA合酶；或来自芽孢杆菌
属(Bacillus)的4型PHA合酶；更优选来自不动杆菌(Acinetobacter sp.)RA3849、霍
乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、斑点气单胞
菌(Aeromonas punctata)FA440、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)61-3、生枝动胶菌(Zoogloea ramigera)、肥大产碱菌(Alcaligenes latus)、产碱菌(Alcaligenes sp.)SH-69、食酸代尔夫特菌(Delftia acidovorans)、伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)DSMZ9242、真养雷尔氏菌(Ralstonia eutrophia)H16、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、赤红球菌(Rhodococcus rubber)PP2、戈登氏菌(Gordonia rubripertinctus)、普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)、集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803、沙氏外硫红螺菌(Ectothiorhodospira shaposhnikovii)N1、普氏荚硫菌(Thiocapsa pfennigii)9111、酒色异着色菌(Allochromatium vinosum)D、紫囊硫菌(Thyocystis violacea)2311、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)41、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)HA和深红红螺菌ATCC25903的1型PHA合酶；来自石竹
伯克霍尔德菌(Burkholderia caryophylli)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chloraphis)、假单胞菌Pseudomonas sp.)61-3、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)U、食油假单胞菌Pseudomonas oleovorans)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、食树脂假单胞菌(Pseudomonas resinovorans)、斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudolcaligenes)、恶臭假单胞菌BM01、硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducins)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chloraphis)的2型PHA合酶；以及来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和芽孢杆
菌(Bacillus sp.)INT005的4型PHA合酶。
菌属(Pseudomonas)、动胶菌属(Zoogloea)、产碱菌属(Alcaligenes)、代尔夫特菌
属(Delftia)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、红球
菌属(Rhodococcus)、戈登氏菌属(Gordonia)、红细菌属(Rhodobacter)、副球菌
属(Paracoccus)、立克次体属(Rickettsia)、柄杆菌属(Caulobacter)、甲基杆菌属
(Methylobacterium)、固氮根瘤菌属(Azorhizobium)、农杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、立克次体属(Rickettsia)、泉古菌门(Crenarchaeota)、集胞藻属(Synechocystis)、外硫红螺菌属(Ectothiorhodospira)、荚硫菌属(Thiocapsa)、囊硫菌属(Thyocystis)和异着色菌属(Allochromatium)的
1型PHA合酶；来自伯克霍尔德菌属和假单胞菌属的2型PHA合酶；或来自芽孢杆菌
属(Bacillus)的4型PHA合酶；更优选来自不动杆菌(Acinetobacter sp.)RA3849、霍
乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、斑点气单胞
菌(Aeromonas punctata)FA440、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)61-3、生枝动胶菌(Zoogloea ramigera)、肥大产碱菌(Alcaligenes latus)、产碱菌(Alcaligenes sp.)SH-69、食酸代尔夫特菌(Delftia acidovorans)、伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)DSMZ9242、真养雷尔氏菌(Ralstonia eutrophia)H16、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、赤红球菌(Rhodococcus rubber)PP2、戈登氏菌(Gordonia rubripertinctus)、普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)、集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803、沙氏外硫红螺菌(Ectothiorhodospira shaposhnikovii)N1、普氏荚硫菌(Thiocapsa pfennigii)9111、酒色异着色菌(Allochromatium vinosum)D、紫囊硫菌(Thyocystis violacea)2311、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)41、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)HA和深红红螺菌ATCC25903的1型PHA合酶；来自石竹
伯克霍尔德菌(Burkholderia caryophylli)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chloraphis)、假单胞菌Pseudomonas sp.)61-3、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)U、食油假单胞菌Pseudomonas oleovorans)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、食树脂假单胞菌(Pseudomonas resinovorans)、斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudolcaligenes)、恶臭假单胞菌BM01、硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducins)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chloraphis)的2型PHA合酶；以及来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和芽孢杆
菌(Bacillus sp.)INT005的4型PHA合酶。
[0422] 在其他实施方案中，聚合物合酶是来自革兰氏阴性及革兰氏阳性真细菌或来自古细菌的PHA聚合物合酶。
[0423] 在多个实例中，聚合物合酶可以包含来自保藏号分别为AY836680、AE004091、AB205104、AF109909、YP137339、AB049413and AF150670的钩虫贪铜菌(C.necator)、铜绿假单胞菌、酒色异着色菌、巨大芽孢杆菌、死海盐盒菌(H.marismortui)、致黄假单胞菌(P.aureofaciens)或恶臭假单胞菌的PHA聚合物合酶。
[0424] 其他适用于本发明的聚合物合酶包括来自如下分别以保藏号标识的生物的聚合物合酶：真养雷尔氏菌(A34341)、普氏荚硫菌(X93599)、斑点气单胞菌(O32472)、假单胞菌61-3(AB014757和AB014758)、类球红细菌(AAA72004)、紫色色杆菌(AAC69615)、泊库岛食烷菌(A.borkumensis)SK2(CAL17662)、泊库岛食烷菌SK2(CAL16866)、类
球红细菌KD131(ACM01571和YP002526072)、不透明红球菌(R.opacus)B4(BAH51880
和YP002780825)、多噬伯克霍尔德菌(B.multivorans)ATCC 17616(YP001946215和
BAG43679)、泊库岛食烷菌SK2(YP693934和YP693138)、深红红螺菌(AAD53179)、γ变形菌(gamma proteobacterium)HTCC5015(ZP05061661和EDY86606)、固氮弧菌(Azoarcus sp.)BH72(YP932525)、紫色色杆菌ATCC 12472(NP902459)、湖沉积杆菌(Limnobacter sp.)MED 105(ZP01915838 和 EDM82867)、M.algicola DG893(ZP01895922 和 EDM46004)、类球红细菌(CAA65833)、紫色色杆菌ATCC 12472(AAQ60457)、肥大产碱菌(AAD10274、AAD01209和 AAC83658)、嗜 麦 芽 窄 食 单 孢 菌(S.maltophilia)K279a(CAQ46418 和YP001972712)、茄科雷尔氏菌(R.solanacearum)IPO1609(CAQ59975和YP002258080)、多噬伯克霍尔德菌ATCC17616(YP001941448和BAG47458)、假单胞菌gl13(ACJ02400)、假
单胞菌gl06(ACJ02399)、假单胞菌gl01(ACJ02398)、根瘤菌(R.sp.)gl32(ACJ02397)、豌豆根瘤菌(R.leguminosarum bv.viciae)3841(CAK10329和YP770390)、固氮弧菌
BH72(CAL93638)、假单胞菌LDC-5(AAV36510)、L.nitroferrum 2002(ZP03698179)、索氏菌(Thauera sp.)MZ1T(YP002890098和ACR01721)、耐辐射甲基杆菌(M.radiotolerans)JCM 2831(YP001755078 和ACB24395)、甲 基 杆 菌 4-46(YP001767769 和 ACA15335)、L.nitroferrum 2002(EEG08921)、脱氮副球菌(BAA77257)、格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌
(M.gryphiswaldense)(ABG23018)、假单胞菌USM4-55(ABX64435和ABX64434)、嗜水气
单胞菌(AAT77261和AAT77258)、芽孢杆菌INT005(BAC45232和BAC45230)、恶臭假单胞
菌(AAM63409和AAM63407)、戈登氏菌(G.rubripertinctus)(AAB94058)、巨大芽孢杆菌(AAD05260)、食酸代尔夫特菌(BAA33155)、嗜丝氨酸副球菌(P.seriniphilus)(ACM68662)、假单胞菌14-3(CAK18904)、假单胞菌LDC-5(AAX18690)、假单胞菌PC17(ABV25706)、假单胞菌3Y2(AAV35431、AAV35429和AAV35426)、门多萨假单胞菌(AAM10546和AAM10544)、硝基还原假单胞菌(P.nitroreducens)(AAK19608)、类产碱假单胞菌(AAK19605)、食树脂假单胞菌(AAD26367和AAD26365)、假单胞菌USM7-7(ACM90523和ACM90522)、荧光假单
胞菌(P.fluorescens)(AAP58480)及其他未培养细菌(BAE02881、BAE02880、BAE02879、BAE02878、BAE02877、BAE02876、BAE02875、BAE02874、BAE02873、BAE02872、BAE02871、BAE02870、BAE02869、BAE02868、BAE02867、BAE0286、BAE02865、BAE02864、BAE02863、BAE02862、BAE02861、BAE02860、BAE02859、BAE02858、BAE02857、BAE07146、BAE07145、BAE07144、BAE07143、BAE07142、BAE07141、BAE07140、BAE07139、BAE07138、BAE07137、BAE07136、BAE07135、BAE07134、BAE07133、BAE07132、BAE07131、BAE07130、BAE07129、BAE07128、BAE07127、BAE07126、BAE07125、BAE07124、BAE07123、BAE07122、BAE07121、BAE07120、BAE07119、BAE07118、BAE07117、BAE07116、BAE07115、BAE07114、BAE07113、BAE07112、BAE07111、BAE07110、BAE07109、BAE07108、BAE07107、BAE07106、BAE07105、BAE07104、BAE07103、BAE07102、BAE07101、BAE07100、BAE07099、BAE07098、BAE07097、BAE07096、BAE07095、BAE07094、BAE07093、BAE07092、BAE07091、BAE07090、BAE07089、BAE07088、BAE07053、BAE07052、BAE07051、BAE07050、BAE07049、BAE07048、BAE07047、BAE07046、BAE07045、BAE07044、BAE07043、BAE07042、BAE07041、BAE07040、BAE07039、BAE07038、BAE07037、BAE07036、BAE07035、BAE07034、BAE07033、BAE07032、BAE07031、BAE07030、BAE07029、BAE07028、BAE07027、BAE07026、BAE07025、BAE07024、BAE07023、BAE07022、BAE07021、BAE07020、BAE07019、BAE07018、BAE07017、BAE07016、BAE07015、BAE07014、BAE07013、BAE07012、BAE07011、BAE07010、BAE07009、BAE07008、BAE07007、BAE07006、BAE07005、BAE07004、BAE07003、BAE07002、BAE07001、BAE07000、BAE06999、BAE06998、BAE06997、BAE06996、BAE06995、BAE06994、BAE06993、BAE06992、BAE06991、BAE06990、BAE06989、BAE06988、BAE06987、BAE06986、BAE06985、BAE06984、BAE06983、BAE06982、BAE06981、BAE06980、BAE06979、BAE06978、BAE06977、BAE06976、BAE06975、BAE06974、BAE06973、BAE06972、BAE06971、BAE06970、BAE06969、BAE06968、BAE06967、BAE06966、BAE06965、BAE06964、BAE06963、BAE06962、BAE06961、BAE06960、BAE06959、BAE06958、BAE06957、BAE06956、BAE06955、BAE06954、BAE06953、BAE06952、BAE06951、BAE06950、BAE06949、BAE06948、BAE06947、BAE06946、BAE06945、BAE06944、BAE06943、BAE06942、BAE06941、BAE06940、BAE06939、BAE06938、BAE06937、BAE06936、BAE06935、BAE06934、BAE06933、BAE06932、BAE06931、BAE06930、BAE06929、BAE06928、BAE06927、BAE06926、BAE06925、BAE06924、BAE06923、BAE06922、BAE06921、BAE06920、BAE06919、BAE06918、BAE06917、BAE06916、BAE06915、BAE06914、BAE06913、BAE06912、BAE06911、BAE06910、BAE06909、BAE06908、BAE06907、BAE06906、BAE06905、BAE06904、BAE06903、BAE06902、BAE06901、BAE06900、BAE06899、BAE06898、BAE06897、BAE06896、BAE06895、BAE06894、BAE06893、BAE06892、BAE06891、BAE06890、BAE06889、BAE06888、BAE06887、BAE06886、BAE06885、BAE06884、BAE06883、BAE06882、BAE06881、BAE06880、BAE06879、BAE06878、BAE06877、BAE06876、BAE06875、BAE06874、BAE06873、BAE06872、BAE06871、BAE06870、BAE06869、BAE06868、BAE06867、BAE06866、BAE06865、BAE06864、BAE06863、BAE06862、BAE06861、BAE06860、BAE06859、BAE06858、BAE06857、BAE06856、BAE06855、BAE06854、BAE06853和BAE06852)。
球红细菌KD131(ACM01571和YP002526072)、不透明红球菌(R.opacus)B4(BAH51880
和YP002780825)、多噬伯克霍尔德菌(B.multivorans)ATCC 17616(YP001946215和
BAG43679)、泊库岛食烷菌SK2(YP693934和YP693138)、深红红螺菌(AAD53179)、γ变形菌(gamma proteobacterium)HTCC5015(ZP05061661和EDY86606)、固氮弧菌(Azoarcus sp.)BH72(YP932525)、紫色色杆菌ATCC 12472(NP902459)、湖沉积杆菌(Limnobacter sp.)MED 105(ZP01915838 和 EDM82867)、M.algicola DG893(ZP01895922 和 EDM46004)、类球红细菌(CAA65833)、紫色色杆菌ATCC 12472(AAQ60457)、肥大产碱菌(AAD10274、AAD01209和 AAC83658)、嗜 麦 芽 窄 食 单 孢 菌(S.maltophilia)K279a(CAQ46418 和YP001972712)、茄科雷尔氏菌(R.solanacearum)IPO1609(CAQ59975和YP002258080)、多噬伯克霍尔德菌ATCC17616(YP001941448和BAG47458)、假单胞菌gl13(ACJ02400)、假
单胞菌gl06(ACJ02399)、假单胞菌gl01(ACJ02398)、根瘤菌(R.sp.)gl32(ACJ02397)、豌豆根瘤菌(R.leguminosarum bv.viciae)3841(CAK10329和YP770390)、固氮弧菌
BH72(CAL93638)、假单胞菌LDC-5(AAV36510)、L.nitroferrum 2002(ZP03698179)、索氏菌(Thauera sp.)MZ1T(YP002890098和ACR01721)、耐辐射甲基杆菌(M.radiotolerans)JCM 2831(YP001755078 和ACB24395)、甲 基 杆 菌 4-46(YP001767769 和 ACA15335)、L.nitroferrum 2002(EEG08921)、脱氮副球菌(BAA77257)、格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌
(M.gryphiswaldense)(ABG23018)、假单胞菌USM4-55(ABX64435和ABX64434)、嗜水气
单胞菌(AAT77261和AAT77258)、芽孢杆菌INT005(BAC45232和BAC45230)、恶臭假单胞
菌(AAM63409和AAM63407)、戈登氏菌(G.rubripertinctus)(AAB94058)、巨大芽孢杆菌(AAD05260)、食酸代尔夫特菌(BAA33155)、嗜丝氨酸副球菌(P.seriniphilus)(ACM68662)、假单胞菌14-3(CAK18904)、假单胞菌LDC-5(AAX18690)、假单胞菌PC17(ABV25706)、假单胞菌3Y2(AAV35431、AAV35429和AAV35426)、门多萨假单胞菌(AAM10546和AAM10544)、硝基还原假单胞菌(P.nitroreducens)(AAK19608)、类产碱假单胞菌(AAK19605)、食树脂假单胞菌(AAD26367和AAD26365)、假单胞菌USM7-7(ACM90523和ACM90522)、荧光假单
胞菌(P.fluorescens)(AAP58480)及其他未培养细菌(BAE02881、BAE02880、BAE02879、BAE02878、BAE02877、BAE02876、BAE02875、BAE02874、BAE02873、BAE02872、BAE02871、BAE02870、BAE02869、BAE02868、BAE02867、BAE0286、BAE02865、BAE02864、BAE02863、BAE02862、BAE02861、BAE02860、BAE02859、BAE02858、BAE02857、BAE07146、BAE07145、BAE07144、BAE07143、BAE07142、BAE07141、BAE07140、BAE07139、BAE07138、BAE07137、BAE07136、BAE07135、BAE07134、BAE07133、BAE07132、BAE07131、BAE07130、BAE07129、BAE07128、BAE07127、BAE07126、BAE07125、BAE07124、BAE07123、BAE07122、BAE07121、BAE07120、BAE07119、BAE07118、BAE07117、BAE07116、BAE07115、BAE07114、BAE07113、BAE07112、BAE07111、BAE07110、BAE07109、BAE07108、BAE07107、BAE07106、BAE07105、BAE07104、BAE07103、BAE07102、BAE07101、BAE07100、BAE07099、BAE07098、BAE07097、BAE07096、BAE07095、BAE07094、BAE07093、BAE07092、BAE07091、BAE07090、BAE07089、BAE07088、BAE07053、BAE07052、BAE07051、BAE07050、BAE07049、BAE07048、BAE07047、BAE07046、BAE07045、BAE07044、BAE07043、BAE07042、BAE07041、BAE07040、BAE07039、BAE07038、BAE07037、BAE07036、BAE07035、BAE07034、BAE07033、BAE07032、BAE07031、BAE07030、BAE07029、BAE07028、BAE07027、BAE07026、BAE07025、BAE07024、BAE07023、BAE07022、BAE07021、BAE07020、BAE07019、BAE07018、BAE07017、BAE07016、BAE07015、BAE07014、BAE07013、BAE07012、BAE07011、BAE07010、BAE07009、BAE07008、BAE07007、BAE07006、BAE07005、BAE07004、BAE07003、BAE07002、BAE07001、BAE07000、BAE06999、BAE06998、BAE06997、BAE06996、BAE06995、BAE06994、BAE06993、BAE06992、BAE06991、BAE06990、BAE06989、BAE06988、BAE06987、BAE06986、BAE06985、BAE06984、BAE06983、BAE06982、BAE06981、BAE06980、BAE06979、BAE06978、BAE06977、BAE06976、BAE06975、BAE06974、BAE06973、BAE06972、BAE06971、BAE06970、BAE06969、BAE06968、BAE06967、BAE06966、BAE06965、BAE06964、BAE06963、BAE06962、BAE06961、BAE06960、BAE06959、BAE06958、BAE06957、BAE06956、BAE06955、BAE06954、BAE06953、BAE06952、BAE06951、BAE06950、BAE06949、BAE06948、BAE06947、BAE06946、BAE06945、BAE06944、BAE06943、BAE06942、BAE06941、BAE06940、BAE06939、BAE06938、BAE06937、BAE06936、BAE06935、BAE06934、BAE06933、BAE06932、BAE06931、BAE06930、BAE06929、BAE06928、BAE06927、BAE06926、BAE06925、BAE06924、BAE06923、BAE06922、BAE06921、BAE06920、BAE06919、BAE06918、BAE06917、BAE06916、BAE06915、BAE06914、BAE06913、BAE06912、BAE06911、BAE06910、BAE06909、BAE06908、BAE06907、BAE06906、BAE06905、BAE06904、BAE06903、BAE06902、BAE06901、BAE06900、BAE06899、BAE06898、BAE06897、BAE06896、BAE06895、BAE06894、BAE06893、BAE06892、BAE06891、BAE06890、BAE06889、BAE06888、BAE06887、BAE06886、BAE06885、BAE06884、BAE06883、BAE06882、BAE06881、BAE06880、BAE06879、BAE06878、BAE06877、BAE06876、BAE06875、BAE06874、BAE06873、BAE06872、BAE06871、BAE06870、BAE06869、BAE06868、BAE06867、BAE06866、BAE06865、BAE06864、BAE06863、BAE06862、BAE06861、BAE06860、BAE06859、BAE06858、BAE06857、BAE06856、BAE06855、BAE06854、BAE06853和BAE06852)。
[0425] 在不同的实施方案中，聚合物合酶可通过使底物(R)-羟基酰基-CoA或其他CoA硫酯或其衍生物聚合或促进其聚合作用而用于在体外生产聚合物微粒。
[0427] 在不同的实施方案中，表达构建体处于高拷贝数载体之中。
[0428] 在不同的实施方案中，表达构建体包含至少一个编码附加多肽的核酸序列。
[0429] 在不同的实施方案中，构建体还包含编码下述蛋白的核酸：
[0430] i.至少一个硫解酶，或
[0431] ii.至少一个还原酶，或
[0432] iii.(i)和(ii)兼而有之。
[0433] 在不同的实施方案中，构建体包含编码下述蛋白的核酸：
[0434] i.至少一个硫解酶，
[0435] ii.至少一个还原酶，
[0436] iii.至少一个聚合物合酶，
[0437] iv.至少一个能够引发免疫应答的抗原，
[0438] v.至少一个与至少一个能够引发免疫应答的抗原能够结合的结合结构域，
[0439] vi.包含上述i)至v)中一项或多项的融合蛋白，
[0440] vii.上述i)至vi)中的任一组合。
[0441] 在不同的实施方案中，构建体包含编码下述蛋白的核酸：
[0442] i.至少一个硫解酶，
[0443] ii.至少一个还原酶，
[0444] iii.至少一个聚合物合酶，
[0445] iv.至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原，或
[0446] v.至少一个与至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域，
[0447] vi.包含上述i)至v)中一项或多项的融合蛋白，
[0448] vii.上述i)至vi)中的任一组合。
[0449] 在不同的实施方案中，所述至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列与强启动子有效连接。
[0450] 在不同的实施方案中，强启动子是病毒启动子或噬菌体启动子。
[0451] 在不同的实施方案中，启动子是噬菌体启动子，例如T7噬菌体启动子。
[0452] 在不同的实施方案中，在微粒形成蛋白底物、优选聚合物合酶底物或底物混合物的存在下维持宿主细胞，包括单体底物、能够被宿主细胞代谢形成所述微粒形成蛋白底物的前体底物。
[0453] 在不同的实施方案中，宿主细胞含有至少两个不同的表达构建体。
[0454] 在宿主细胞含有至少两个不同的表达构建体的多个实施方案中，一个表达构建体选自下组：
[0455] 包含编码微粒形成蛋白的核酸序列的表达构建体，或
[0456] 包含编码微粒大小决定蛋白的核酸序列的表达构建体，或
[0457] 包含编码聚合物调节蛋白的核酸序列的表达构建体。
[0458] 在不同的实施方案中，编码融合多肽的核酸序列包含：
[0459] 与编码微粒形成蛋白(优选聚合物合酶)的核酸序列的5’或3’端邻接的、编码能够引发受试者细胞介导的免疫应答的抗原、或与能够引发受试者细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的核酸序列；或
[0460] 通过期望长度的多核苷酸接头或间隔臂序列而与编码微粒形成蛋白(优选聚合物合酶)的核酸序列的5’或3’端间接融合的、编码能够引发受试者细胞介导的免疫应答的抗原、或与能够引发受试者细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的核酸序列；或
[0461] 任选地通过期望长度的多核苷酸接头或间隔臂序列而插入在编码微粒形成蛋白(优选聚合物合酶)的核酸序列之中的、编码能够引发受试者细胞介导的免疫应答的抗原、或与能够引发受试者细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的核酸序列；或[0462] 位于编码能够引发受试者细胞介导的免疫应答的抗原、或与能够引发受试者细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的核酸序列与编码微粒形成蛋白(优选聚合物合酶)的核酸序列之间的、编码蛋白酶切割位点的核酸序列；或
[0463] 位于编码能够引发受试者细胞介导的免疫应答的抗原、或与能够引发受试者细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的核酸序列与编码微粒形成蛋白(优选聚合物合酶)的核酸序列之间的、编码自我剪接元件的核酸序列；或
[0464] 其中两项或更多项的任意组合。
[0465] 在不同的实施方案中，至少一个融合多肽包含：
[0466] 与包含微粒形成蛋白(优选聚合物合酶)的氨基酸序列的N-或C-末端邻接的、包含能够引发细胞介导的免疫应答的抗原、或包含与能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的氨基酸序列；或
[0467] 通过期望长度的肽接头或间隔臂序列而与包含微粒形成蛋白(优选聚合物合酶)的氨基酸序列的N-或C-末端间接融合的、包含能够引发细胞介导的免疫应答的抗原、或与能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的氨基酸序列；或
[0468] 通过期望长度的肽接头或间隔臂序列而插入在包含微粒形成蛋白(优选聚合物合酶)的氨基酸序列之中的、包含能够引发细胞介导的免疫应答的抗原、或与能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的氨基酸序列；或
[0469] 位于包含能够引发细胞介导的免疫应答的抗原、或与能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的氨基酸序列与编码微粒形成蛋白(优选聚合物合酶)的氨基酸序列之间的、包含蛋白酶切割位点的氨基酸序列；或
[0470] 位于包含能够引发细胞介导的免疫应答的抗原、或与能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的氨基酸序列与编码微粒形成蛋白(优选聚合物合酶)的氨基酸序列之间的、包含自我剪接元件的氨基酸序列；或
[0471] 其中两项或更多项的任意组合。
[0472] 在不同的实施方案中，编码融合多肽的核酸包含：
[0473] 与编码微粒形成蛋白的核酸序列的5’或3’端邻接的、编码结核分枝杆菌抗原或结核分枝杆菌抗原结合结构域的核酸序列；或
[0474] 通过期望长度的多核苷酸接头或间隔臂序列而与编码微粒形成蛋白的核酸序列的5’或3’端间接融合的、编码结核分枝杆菌抗原或结核分枝杆菌抗原结合结构域的核酸序列；或
[0475] 任选地通过期望长度的多核苷酸接头或间隔臂序列而插入在编码微粒形成蛋白的核酸序列之中的、编码结核分枝杆菌抗原或结核分枝杆菌抗原结合结构域的核酸序列；或
[0476] 位于编码结核分枝杆菌抗原或结核分枝杆菌抗原结合结构域的核酸序列与编码微粒形成蛋白的核酸序列之间的、编码蛋白酶切割位点的核酸序列；或
[0477] 位于编码结核分枝杆菌抗原或结核分枝杆菌抗原结合结构域的核酸序列与编码微粒形成蛋白的核酸序列之间的、编码自我剪接元件的核酸序列；或
[0478] 其中两项或更多项的任意组合。
[0479] 在不同的实施方案中，至少一个融合多肽包含：
[0480] 与包含微粒形成蛋白的氨基酸序列的N-或C-末端邻接的、包含结核分枝杆菌抗原或结核分枝杆菌抗原结合结构域的氨基酸序列；或
[0481] 通过期望长度的肽接头或间隔臂序列而与包含微粒形成蛋白的氨基酸序列的N-或C-末端间接融合的、包含结核分枝杆菌抗原或结核分枝杆菌抗原结合结构域的氨基酸序列；或
[0482] 通过期望长度的肽接头或间隔臂序列而插入在包含微粒形成蛋白的氨基酸序列之中的、包含结核分枝杆菌抗原或结核分枝杆菌抗原结合结构域的氨基酸序列；或
[0483] 位于包含结核分枝杆菌抗原或结核分枝杆菌抗原结合结构域的氨基酸序列与编码微粒形成蛋白的氨基酸序列之间的、包含蛋白酶切割位点的氨基酸序列；或
[0484] 位于包含结核分枝杆菌抗原或结核分枝杆菌抗原结合结构域的氨基酸序列与编码微粒形成蛋白的氨基酸序列之间的、包含自我剪接元件的氨基酸序列；或
[0485] 其中两项或更多项的任意组合。
[0486] 在不同的实施方案中，表达构建体包含组成型或调控型启动子系统。
[0487] 在不同的实施方案中，调控型启动子系统是诱导型或阻遏型启动子系统。
[0488] 在不同的实施方案中，调控型启动子系统选自LacI、Trp、噬菌体γ和噬菌体RNA聚合酶启动子系统。
[0489] 在一个实施方案中，启动子是本领域技术人员已知的任何强启动子。合适的强启动子包括腺病毒启动子，例如腺病毒主要晚期启动子；或异源启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞病毒(RSV)启动子；猴病毒40(SV40)启动子；诱导型启动子，例如MMT启动子；金属硫蛋白启动子；热激启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人珠蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；逆转录病毒LTR；β-肌动蛋白启动子；人生长激素启动子；噬菌体启动子例如T7、SP6和T3RNA聚合酶启动子以及花椰菜花叶病毒35S(CaMV 35S)启动子。
[0490] 在不同的实施方案中，启动子是T7RNA聚合酶启动子，例如如公开号为WO2007/037706的PCT/NZ2006/000251中所述的T7RNA聚合酶启动子。
[0491] 在不同的实施方案中，细胞含有两个或更多不同的表达构建体，每个表达构建体编码不同的融合多肽。
[0492] 在不同的实施方案中，能够引发细胞介导的免疫应答的抗原是来自于细胞内病原体的抗原。
[0493] 在不同的实施方案中，能够引发细胞介导的免疫应答的抗原选自来自下组病原体的抗原：分枝杆菌属(Mycobacterium)(例如牛分枝杆菌(M.bovis)、结核分枝
杆菌(M.tuberculosis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、
鸟分枝杆菌(M.avium)、鸟分枝杆菌副结核亚种(M.aviumparatuberculosis)、分枝
杆菌(Mycobacterium sp.))、李斯特菌属(Listeria)(例如产单核细胞李斯特菌
(L.monocytogenes)、李斯特菌(Listeria sp.))、沙门氏菌属(Salmonella)(例如伤寒沙门氏菌(S.typhi))、耶尔森氏菌属(Yersinia)(例如鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)、假结核耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis))、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、军团菌属(Legionella)(例如嗜肺军团菌
(L.pneumophila)、长滩军团菌(L.longbeacha)、博兹曼军团菌(L.bozemanii)、军团菌(Legionella sp.))、立克次体属(Rickettsia)(例如立氏立克次体(R.rickettsii)、螨立克次体(R.akari)、康氏立克次体(R.conorii)、西伯利亚立克次体(R.siberica)、澳大利亚立克次体(R.australis)、日本立克次体(R.japonica)、非洲立克次体(R.africae)、普氏立克次体(R.prowazekii)、斑疹伤寒立克次体(R.typhi，)、立克次体(Rickettsia sp.))、衣原体属 (Chlamydia)(例如肺炎衣原 体(C.pneumoniae)、沙眼衣原 体
(C.trachomatis)、衣原体(Chlamydia sp.))、嗜性衣原体属(Clamydophila)(例如鹦鹉热嗜性衣原体(C.psittaci)、流产嗜性衣原体(C.abortus))、链球菌属(Streptococcus)(例如肺炎链球菌(S.pneumoniae)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、无乳链球菌(S.agalactiae))、葡萄球菌属(Staphylococcus)(金黄色葡萄球菌(S.aureus)，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA))、埃立克体属(Ehrlichia)(例如查菲埃立克体(E.chaffeensis)、嗜吞噬细胞埃立克体群、埃立克体(Ehrlichia sp.))、贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)、利什曼原虫(Leishmania sp.)、刚地弓形虫(Toxpolasma gondii)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、组织胞浆菌(Histoplasma sp.)、土拉热弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)、以及病毒，包括丙肝病毒、腺病毒、小核糖核酸病毒，包括柯萨奇病毒；甲肝病毒、脊髓灰质炎病毒、疱疹病毒科，包括EB病毒、1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、人巨细胞病毒、人疱疹病毒8型、水痘带状疱疹病毒；嗜肝DNA病毒，包括乙肝病毒；黄病毒科，包括丙肝病毒、黄热病毒、登革病毒、西尼罗病毒；逆转录病毒，包括人类免疫缺陷病毒(HIV)；正粘病毒，包括流感病毒；副粘病毒，包括麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒；乳头瘤病毒属，包括乳头瘤病毒；弹状病毒属，包括狂犬病毒；披膜病毒，包括风疹病毒；以及其他病毒，包括痘苗病毒、禽痘病毒、腺相关病毒、改良型痘苗病毒安卡拉株、塞姆利基森林病毒、痘病毒和冠状病毒；或所述抗原为任一上述抗原的至少一个抗原性部分或T细胞表位。
杆菌(M.tuberculosis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、
鸟分枝杆菌(M.avium)、鸟分枝杆菌副结核亚种(M.aviumparatuberculosis)、分枝
杆菌(Mycobacterium sp.))、李斯特菌属(Listeria)(例如产单核细胞李斯特菌
(L.monocytogenes)、李斯特菌(Listeria sp.))、沙门氏菌属(Salmonella)(例如伤寒沙门氏菌(S.typhi))、耶尔森氏菌属(Yersinia)(例如鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)、假结核耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis))、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、军团菌属(Legionella)(例如嗜肺军团菌
(L.pneumophila)、长滩军团菌(L.longbeacha)、博兹曼军团菌(L.bozemanii)、军团菌(Legionella sp.))、立克次体属(Rickettsia)(例如立氏立克次体(R.rickettsii)、螨立克次体(R.akari)、康氏立克次体(R.conorii)、西伯利亚立克次体(R.siberica)、澳大利亚立克次体(R.australis)、日本立克次体(R.japonica)、非洲立克次体(R.africae)、普氏立克次体(R.prowazekii)、斑疹伤寒立克次体(R.typhi，)、立克次体(Rickettsia sp.))、衣原体属 (Chlamydia)(例如肺炎衣原 体(C.pneumoniae)、沙眼衣原 体
(C.trachomatis)、衣原体(Chlamydia sp.))、嗜性衣原体属(Clamydophila)(例如鹦鹉热嗜性衣原体(C.psittaci)、流产嗜性衣原体(C.abortus))、链球菌属(Streptococcus)(例如肺炎链球菌(S.pneumoniae)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、无乳链球菌(S.agalactiae))、葡萄球菌属(Staphylococcus)(金黄色葡萄球菌(S.aureus)，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA))、埃立克体属(Ehrlichia)(例如查菲埃立克体(E.chaffeensis)、嗜吞噬细胞埃立克体群、埃立克体(Ehrlichia sp.))、贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)、利什曼原虫(Leishmania sp.)、刚地弓形虫(Toxpolasma gondii)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、组织胞浆菌(Histoplasma sp.)、土拉热弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)、以及病毒，包括丙肝病毒、腺病毒、小核糖核酸病毒，包括柯萨奇病毒；甲肝病毒、脊髓灰质炎病毒、疱疹病毒科，包括EB病毒、1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、人巨细胞病毒、人疱疹病毒8型、水痘带状疱疹病毒；嗜肝DNA病毒，包括乙肝病毒；黄病毒科，包括丙肝病毒、黄热病毒、登革病毒、西尼罗病毒；逆转录病毒，包括人类免疫缺陷病毒(HIV)；正粘病毒，包括流感病毒；副粘病毒，包括麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒；乳头瘤病毒属，包括乳头瘤病毒；弹状病毒属，包括狂犬病毒；披膜病毒，包括风疹病毒；以及其他病毒，包括痘苗病毒、禽痘病毒、腺相关病毒、改良型痘苗病毒安卡拉株、塞姆利基森林病毒、痘病毒和冠状病毒；或所述抗原为任一上述抗原的至少一个抗原性部分或T细胞表位。
[0494] 在不同的实施方案中，结核分枝杆菌抗原选自下组：早期分泌抗原靶蛋白(ESAT)-6、Ag85A、Ag85B(MPT59)、Ag85B、Ag85C、MPT32、MPT51、MPT59、MPT63、MPT64、MPT83、MPB5、MPB59、MPB64、MTC28、Mtb2、Mtb8.4、Mtb9.9、Mtb32A、Mtb39、Mtb41、TB10.4、TB10C、TB11B、TB12.5、TB13A、TB14、TB15、TB15A、TB16、TB16A、TB17、TB18、TB21、TB20.6、TB24、TB27B、TB32、TB32A、TB33、TB38、TB40.8、TB51、TB54、TB64、CFP6、CFP7、CFP7A、CFP7B、CFP8A、CFP8B、CFP9、CFP10、CFP11、CFP16、CFP17、CFP19、CFP19A、CFP19B、CFP20、CFP21、CFP22、CFP22A、CFP23、CFP23A、CFP23B、CFP25、CFP25A、CFP27、CFP28、CFP28B、CFP29、CFP30A、CFP30B、CFP50、CWP32、hspX(α-晶型)、APA、结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)、ST-CF、PPE68、LppX、PstS-1、PstS-2、PstS-3、HBHA、GroEL、GroEL2、GrpES、LHP、19kDa脂蛋白、71kDa、RD1-ORF2、RD1-ORF3、RD1-ORF4、RD1-ORF5、RD1-ORF8、RD1-ORF9A、RD1-ORF9B、Rv1984c、Rv0577、Rv1827、BfrB、Tpx.Rv1352、Rv1810、PpiA、Cut2、FbpB、FbpA、FbpC、DnaK、FecB、Ssb、RplL、FixA、FixB、AhpC2、Rv2626c、Rv1211、Mdh、Rv1626、Adk、ClpP、SucD(Belisle et al，
2005；US 7,037,510；US 2004/0057963；US 2008/0199493；US2008/0267990)，或任一上述抗原的至少一个抗原性部分或T细胞表位。
2005；US 7,037,510；US 2004/0057963；US 2008/0199493；US2008/0267990)，或任一上述抗原的至少一个抗原性部分或T细胞表位。
[0495] 在一个例子中，结核分枝杆菌抗原是早期分泌抗原靶蛋白(ESAT)-6、Ag85A、ESAT-6的至少一个抗原性部分、Ag85A的至少一个抗原性部分、或其中两项或更多项的任意组合，例如ESAT-6和Ag85A两项。
[0496] 在不同的实施方案中，与能够引发免疫应答的抗原能够结合的结合结构域，例如与能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域选自蛋白、蛋白片段、结合结构域、靶标结合结构域、结合蛋白、结合蛋白片段、抗体、抗体片段、抗体重链、抗体轻链、单链抗体、单域抗体(例如VHH)、Fab抗体片段、Fc抗体片段、Fv抗体片段、F(ab’)2抗体片段、Fab’抗体片段、单链Fv(scFv)抗体片段、T细胞受体、MHC I类分子、MHC II类分子或其组合。
[0497] 例如，在不同的实施方案中，结核分枝杆菌抗原结合结构域选自蛋白、蛋白片段、结合结构域、靶标结合结构域、结合蛋白、结合蛋白片段、抗体、抗体片段、抗体重链、抗体轻链、单链抗体、单域抗体(例如VHH)、Fab抗体片段、Fc抗体片段、Fv抗体片段、F(ab’)2抗体片段、Fab’抗体片段、单链Fv(scFv)抗体片段、T细胞受体、MHCI类分子、MHCII类分子或其组合。
[0498] 在不同的实施方案中，组合物含有同质聚合物微粒群。
[0499] 在不同的实施方案中，组合物含有混合的聚合物微粒群。
[0500] 免疫应答是细胞介导的免疫应答，或体液免疫应答，或细胞介导的免疫应答与体液免疫应答两者的组合。
[0501] 例如，免疫应答是细胞介导的免疫应答而没有显著的体液应答。例如，免疫应答是细胞介导的免疫应答，例如IFN-γ反应所指示的应答，而没有显著的IgA反应，或没有显著的IgE反应，或没有显著的IgG反应，包括没有显著的IgG1反应，或没有显著的IgG2反应，或没有显著的IgM反应。
[0502] 在另一个例子中，免疫应答是体液应答而没有显著的细胞介导的应答。
[0503] 会理解本发明的焦点在于引发免疫应答从而有效治疗或预防本文所述的疾病或病况。同样会理解，考虑到免疫应答的性质，引发细胞介导的免疫应答也可以引发体液应答，从而受试者对本发明方法的反应实际上可以是细胞介导的免疫应答与体液免疫应答两者的组合。
[0504] 所述及的本文公开的数字范围(例如1-10)旨在也并入对落在该范围内的所有有理数(例如1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9和10)以及落在该范围内的任何有理数范围(例如2-8、1.5-5.5和3.1-4.7)的述及，所以，本文明确公开的所有范围的所有亚范围都在此明确公开了。这些仅仅具体意图的例子而已，而且与此类似，所列举的最低值和最高值之间所有可能的数值组合应视为在已本申请中明确陈述。
[0505] 本发明更多的方面和优点会因为下面仅作为举例给出的说明而变得显而易见。
[0506] 在本说明书引用专利说明书、其他外部文献或其他信息来源的情况下，通常是出于提供讨论本发明技术特征的背景的目的。除非另有明确说明，对此类外部文献的引用在任何管辖区域内都不应阐释为承认此类文献或此类信息来源为现有技术或构成部分本领域的公知常识。
[0508] 根据仅作为举例说明的如下说明，参照附图，本发明的其他方面将变得显而易见。
[0509] 图1显示了抗Hep C抗体与Hep C聚合物微粒的结合。参见本文实施例4。
[0510] 图2显示了免疫接种了抗丙肝病毒的不同聚合物微粒疫苗的小鼠中的IgG1抗体反应。EC50指给出半数最大光密度的血清滴度的倒数。检测水平为25。*表示与其他组别差异显著(p＜0.05)。细线表示SEM。参见本文实施例4。
[0511] 图3显示了免疫接种了抗丙肝病毒的不同聚合物微粒疫苗的小鼠中的IgG2c抗体反应。EC50指给出半数最大光密度的血清滴度的倒数。检测水平为25。*表示与其他组别差异显著(p＜0.05)。细线表示SEM。参见本文实施例4。
[0512] 图4显示了免疫接种了抗肝炎病毒的不同聚合物微粒疫苗的小鼠中的IFN-γ反应。*表示与其他组别差异显著(p＜0.05)。细线表示SEM。参见本文实施例4。
[0513] 图5显示了以0-90μg展示Ag85A-ESAT-6的聚合物微粒或30μg重组Ag85A-ESAT-6免疫接种3次的小鼠中的抗体反应。*表示与PBS免疫接种的对照组相比反应显著更大(p＜0.01)。**表示与其他所有疫苗接种组相比反应显著更大(p＜0.01)。
参见本文实施例5。
参见本文实施例5。
[0514] 图6显示了以30μg野生型聚合物微粒、Ag85A-ESAT-6聚合物微粒、含Emulsigen的Ag85A-ESAT-6聚合物微粒免疫接种3次的小鼠或未进行免疫接种的小鼠中的抗体反应。*表示与PBS免疫接种的对照组相比反应显著更大(p＜0.01)。**表示与其他所有疫苗接种组相比反应显著更大(p＜0.01)。参见本文实施例5。
[0515] 图7显示了以0-90μg展示Ag85A-ESAT-6的聚合物微粒或30μg重组Ag85A-ESAT-6免疫接种3次的小鼠中的IFN-γ反应。*表示与PBS免疫接种的对照组相比反应显著更大(p＜0.01)。**表示与其他所有疫苗接种组相比反应显著更大(p＜0.01)。
参见本文实施例5。
参见本文实施例5。
[0516] 图8显示了以30μg野生型聚合物微粒、Ag85A-ESAT-6聚合物微粒、含Emulsigen的Ag85A-ESAT-6聚合物微粒免疫接种3次的小鼠或未进行免疫接种的小鼠中的IFN-γ反应。*表示与PBS免疫接种的对照组相比反应显著更大(p＜0.01)。**表示与其他所有疫苗接种组相比反应显著更大(p＜0.01)。参见本文实施例6。
[0517] 图9显示了抗ESAT-6抗体与Ag85a-ESAT-6聚合物微粒的结合。参见本文实施例5。
[0518] 图10显示了小鼠在用不同聚合物微粒疫苗进行疫苗接种、随后用牛分枝杆菌激发之后的肺培养结果。*表示与非疫苗接种组的统计学差异(p＜0.05)。细线表示SEM。参见本文实施例6。
[0519] 图11显示了小鼠在用不同聚合物微粒疫苗进行疫苗接种之后的脾培养结果。*表示与非疫苗接种组的统计学差异(p＜0.05)。细线表示SEM。参见本文实施例6。
[0520] 图12显示了小鼠在用不同聚合物微粒疫苗进行疫苗接种、随后用牛分枝杆菌激发之后的IgG1抗体反应。EC50指给出半数最大光密度的血清滴度的倒数。检测水平为25。*表示与其他组别差异显著(p＜0.05)。细线表示SEM。参见本文实施例6。
[0521] 图13显示了小鼠在用不同聚合物微粒疫苗进行疫苗接种、随后用牛分枝杆菌激发之后的IgG2c抗体反应。EC50指给出半数最大光密度的血清滴度的倒数。检测水平为25。*表示与其他组别差异显著(p＜0.05)。细线表示SEM。参见本文实施例6。
[0522] 发明详述
[0523] 本发明涉及聚合物微粒及其用途。具体地，本发明涉及功能化的聚合物微粒，例如生产功能化聚合物微粒的方法，及其治疗或预防不同疾病和病况的用途，包括那些因病原体所致或与之相关的疾病或病况，包括本文所鉴定的或所述的那些病原体。
[0524] 本发明功能化的聚合物微粒可以包含一个或多个表面结合的融合多肽，而且也可以包含一个或多个掺入或吸附于聚合物微粒核的物质，一个或多个结合于表面结合的融合多肽的物质，或其组合。
[0525] 1.定义
[0526] 术语“编码区”或“开放阅读框”(ORF)是指基因组DNA序列或cDNA序列的有义链，其在适宜调控序列的控制之下产生转录产物和/或多肽。编码序列通过5’翻译起始密码子和3’翻译终止密码子的存在而鉴别。在插入到遗传构建体中的情况下，“编码序列”有效连接于启动子和终止子序列时能够表达。
[0527] 如本说明书所用的术语“包含”表示“至少部分地包括”。在阐释本说明书中每一个包括术语“包含”的陈述时，除以该术语开场之外的其他特征也可以存在。相关术语例如“含有”和“包括”应以相同方式进行阐释。
[0528] 如本文所用的术语“偶联剂是指适于与至少一个物质或另一偶联剂结合的无机或有机化合物，所述另一偶联剂适于在一侧结合偶联剂而另一侧结合至少一个物质。适宜偶联剂的例子，及其应用的示例性方法(包括适于化学修饰本发明的微粒或融合蛋白的方法)在公开号为WO2004/020623(Bemd Rehm)的PCT/DE2003/002799中提出，在此全文并入作为参考。
[0529] 术语“表达构建体”是指遗传构建体，包括允许插入的多核苷酸分子转录和任选的将转录物翻译成多肽的元件。表达构建体典型地按5’至3’方向包含：
[0530] (1)在待引入构建体的宿主细胞中有功能的启动子，
[0531] (2)待表达的多核苷酸，和
[0532] (3)在待引入构建体的宿主细胞中有功能的终止子。
[0533] 本发明的表达构建体插入到可复制的载体中用于克隆或表达，或者整合到宿主基因组中。
[0534] 适合调整而 适应本发明 应用的表达 构建体的例 子在公开号 为WO2004/020623(Bernd Rehm)的PCT/DE2003/002799以及公开号为WO2007/037706(Bernd Rehm)的PCT/NZ2006/000251中提供，在此全文并入作为参考。
[0535] 如本文所用的术语“形成聚合物微粒”和“聚合物微粒形成”是指如本文所讨论的微粒形成蛋白的活性。
[0536] 多肽“片段”是多肽中行使酶活或结合活性所需功能和/或提供多肽三维结构的亚序列。
[0537] 如本文所用的术语“融合多肽”是指包含两个或更多氨基酸序列的多肽，例如两个或更多的多肽结构域通过相应的氨基和羧基残基以肽键融合从而形成单个连续的多肽。应当理解，两个或更多氨基酸序列可以直接融合，或者借助接头或间隔臂或附加多肽而通过其相应的氨基和羧基末端间接地融合。
[0538] 在一个实施方案中，包含融合多肽的氨基酸序列之一包含微粒形成蛋白。
[0539] 在一个实施方案中，包含融合多肽的氨基酸序列之一包含结核分枝杆菌抗原、结核分枝杆菌抗原结合结构域、或融合配偶体。
[0540] 如本文所用的术语“融合配偶体”是指多肽，例如蛋白、蛋白片段、结合结构域、靶标结合结构域、结合蛋白、结合蛋白片段、抗体、抗体片段、抗体重链、抗体轻链、单链抗体、单域抗体(例如VHH)、Fab抗体片段、Fc抗体片段、Fv抗体片段、F(ab’)2抗体片段、Fab’抗体片段、单链Fv(scFv)抗体片段、抗体结合结构域(例如ZZ结构域)、抗原、抗原决定簇、表位、半抗原、免疫原、免疫原片段、生物素、生物素衍生物、亲和素、链霉亲和素、底物、酶、抗体酶、辅因子、受体、受体片段、受体亚单位、受体亚单位片段、配体、抑制因子、激素、凝集素、多聚组氨酸、偶联结构域、DNA结合结构域、FLAG表位、半胱氨酸残基、文库肽、报告肽、亲和纯化肽，或其中任何两项或多项的任意组合。
[0541] 应当理解，上文所列的两个或更多个多肽能够形成融合配偶体。
[0542] 在一个实施方案中，融合多肽的氨基酸序列通过接头或间隔臂间接融合，例如，所述融合多肽的氨基酸序列的排列顺序为：聚合物合酶-接头-能够引发免疫应答的抗原、或能够引发免疫应答的抗原-接头-聚合物合酶、或聚合物合酶-接头-能够引发免疫应答的抗原的结合结构域、或能够引发免疫应答的抗原的结合结构域-接头-聚合物合酶。在其他实施方案中，融合多肽的氨基酸序列通过附加多肽间接融合或者或包含附加多肽，排列顺序为：聚合物合酶-附加多肽-能够引发免疫应答的抗原、或聚合物合酶-附加多肽-能够引发免疫应答的抗原的结合结构域、或聚合物合酶-接头-能够引发免疫应答的抗原-附加多肽、或聚合物合酶-接头-能够引发免疫应答的抗原的结合结构域-附加多肽。同样，此处明确考虑聚合物合酶的N-末端延伸。
[0543] 免疫应答包括细胞介导的和体液免疫应答。
[0544] 在一个实施方案中，融合多肽的氨基酸序列通过接头或间隔臂间接融合，例如，所述融合多肽的氨基酸序列的排列顺序为：聚合物合酶-接头-结核分枝杆菌抗原、或结核分枝杆菌抗原-接头-聚合物合酶、或聚合物合酶-接头-结核分枝杆菌抗原结合结构域、或结核分枝杆菌抗原结合结构域-接头-聚合物合酶。在其他实施方案中，融合多肽的氨基酸序列通过附加多肽间接融合或者或包含附加多肽，排列顺序为：聚合物合酶-附加多肽-结核分枝杆菌抗原、或聚合物合酶-附加多肽-结核分枝杆菌抗原结合结构域、或聚合物合酶-接头-结核分枝杆菌抗原-附加多肽、或聚合物合酶-接头-结核分枝杆菌抗原结合结构域-附加多肽。同样，此处明确考虑聚合物合酶的N-末端延伸。
[0545] 根据本发明的融合多肽还可以包含插入在另一多肽序列之中的一个或多个多肽序列。例如，诸如蛋白酶识别序列的多肽序列插入到包含微粒结合结构域的蛋白质的可变区中。
[0546] 便利地，本发明的融合多肽由单个核酸序列编码，其中该核酸序列包含至少两个分别编码多肽或多肽结构域的亚序列。在某些实施方案中，所述至少两个亚序列以“同一阅读框”存在以构成单个开放阅读框从而编码如本文所讨论的融合多肽。在其他实施方案中，所述至少两个亚序列以“不同阅读框”存在，并被核糖体阅读框移码位点或促进阅读框移码的其他序列隔开，从而在翻译后形成融合多肽。在某些实施方案中，所述至少两个亚序列是邻接的。在其他实施方案中，例如在上文所讨论的那些至少两个多肽或多肽结构域通过附加多肽间接融合的情况下，所述至少两个亚序列是不邻接的。
[0547] “结合结构域”或“能够结合......的结构域”旨在表示互补结合对中的一半，可以包括上文所列的结合对。例如，抗体-抗原、抗体-抗体结合结构域、生物素-链霉亲和素、受体-配体、酶-抑制因子对。靶标结合结构域将结合样品中的靶分子，为例如抗体或抗体片段。多肽结合结构域将结合多肽，为例如抗体或抗体片段、或来自受体或信号传导蛋白的结合结构域。
[0548] 为结合结构域所结合的物质的例子包括：蛋白、蛋白片段、肽、多肽、多肽片段、抗体、抗体片段、抗体结合结构域、抗原、抗原片段、抗原决定簇、表位、半抗原、免疫原、免疫原片段、药物活性剂、生物活性剂、佐剂或其中任何两项或多项的任意组合。这样的物质为根据本发明方法所分析的样品中的“靶组分”。
[0549] 从而，“与能够引发免疫应答的抗原能够结合的结构域”及其语法意义上的等同体应理解为是指互补结合对中的一个组分，其中另一组分是能够引发免疫应答的抗原。
[0550] 同样，“与能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结构域”及其语法意义上的等同体应理解为是指互补结合对中的一个组分，其中另一组分是能够引发细胞介导的免疫应答的抗原。例如，“能够结合结核分枝杆菌抗原的结构域”也可以称为“结核分枝杆菌抗原结合结构域”，是能够结合一个或多个结核分枝杆菌抗原的结构域。
[0551] 从而，“结核分枝杆菌抗原结合结构域”是能够结合一个或多个结核分枝杆菌抗原的结构域。
[0552] 如本文所用的“结核分枝杆菌抗原”是来源于结核分枝杆菌的抗原。同样，其他抗原也以其来源生物进行标识。
[0553] 短语“能够引发免疫应答的抗原”是指当与免疫系统的一个或多个因子(例如一个或多个抗体或一个或多个细胞)接触时能够引发或上调免疫系统反应性的抗原，例如上调一个或多个T细胞群，例如增加CD8+T细胞活CD4+T细胞活性或数量，或上调一个或多个B细胞群，例如能够产生特异于该抗原或能够结合该抗原的抗体的一个或多个B细胞群，或增加一个或多个抗体群的数量或活性。
[0554] 短语“能够引发细胞介导的免疫应答的抗原”是指当与免疫系统的一个或多个细胞接触时能够引发或上调免疫系统反应性的抗原，例如上调一个或多个T细胞群，例如增加CD8+T细胞活CD4+T细胞活性或数量。
[0555] 术语“遗传构建体”是指多核苷酸分子，通常为双链DNA，可以有其他多核苷酸分子(插入的多核苷酸分子)例如但不限于cDNA分子插入其中。遗传构建体可以含有允许插入的多核苷酸分子转录和任选的将转录物翻译成多肽的必要元件。插入的多核苷酸分子来源于宿主细胞、或来源于不同的细胞或生物体和/或为重组多核苷酸。一旦进入宿主细胞，遗传构建体整合到宿主染色体DNA中。在一个实例中，遗传构建体与载体相连。
[0556] 术语“宿主细胞”是指细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或动物细胞，例如哺乳动物宿主细胞，其为1)天然PHA微粒生产宿主细胞，或2)携带表达构建体的宿主细胞，所述表达构建体包含编码至少一个硫解酶和还原酶和任选的包涵体蛋白phasin的核酸序列。需要哪些基因来补充宿主细胞聚合物微粒形成所缺少的那些将取决于宿主细胞的基因组成以及培养基中所提供的底物。
[0557] 如本文所用的术语“接头或间隔臂是指将两个或更多个多肽或编码两个或更多个多肽的两个或更多个核酸序列间接融合起来的氨基酸或核苷酸序列。在一些实事方案中，接头或间隔臂长约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或约100个氨基酸或核苷酸。在其他实施方案中，接头或间隔臂长约100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或约1000个氨基酸或核苷酸。而在其他实施方案中，接头或间隔臂长约1至约1000个氨基酸或核苷酸、长约10至约1000、长约50至约1000、长约100至约1000、长约200至约1000、长约300至约1000、长约400至约1000、长约500至约1000、长约600至约1000、长约700至约1000、长约800至约1000或长约900至约1000个氨基酸或核苷酸。
[0558] 在一个实施方案中，接头或间隔臂可以包含限制性酶识别位点。在另一实施方案中，接头或间隔臂可以包含蛋白酶切割识别序列，例如肠激酶、凝血酶或Xa因子识别序列，或自身剪接元件例如蛋白内含子。在另一实施方案中，接头或间隔臂促进融合多肽的独立折叠。
[0559] 如本文所用的术语“混合群”是指两个或更多个实体群，落在混合群范围内的每个实体群与落在该混合群范围内的另一实体群在一些方面存在差异。例如，当用来表述混合的表达构建体群时，是指两个或更多个表达构建体群，其中每个表达构建体群就该群成员所编码的融合多肽而言、或就构建体的一些其他方面(例如构建体中存在的启动子的身份)而言存在差异。或者，当用来表述混合的融合多肽群时，是指两个或更多个融合多肽群，其中每个融合多肽群就多肽，例如聚合物合酶、能够引发细胞介导的免疫应答的抗原、或与能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域、该群所含的成员而言存在差异。例如，在治疗结核病的用途的情况下，混合的融合多肽群是指两个或更多个融合多肽群，其中每个融合多肽群就多肽，例如聚合物合酶、结核分枝杆菌抗原或结核分枝杆菌抗原结合结构域、该群所含的成员而言存在差异。与此相似，在肝炎或流感的情况下，混合的融合多肽群是指两个或更多个融合多肽群，其中每个融合多肽群就多肽、例如聚合物合酶、肝炎病毒抗原或肝炎病毒抗原结合结构域、流感病毒抗原或流感病毒抗原结合结构域、该群所含的成员而言存在差异。还有，当述及混合的微粒群时，是指两个或更多个微粒群，其中每个微粒群就融合多肽或该群所携带成员而言存在差异。
[0560] 如本文所用的术语“核酸”是指脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸碱基或天然核苷酸已知类似物或其混合物的单链或双链形式的聚合物。除非另有说明，该术语包括对具体序列及其互补序列的引述。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文可互换使用。
[0561] “有效连接”表示待表达的序列置于调控元件的控制之下，调控元件包括启动子、组织特异性调控元件、瞬时调控元件、增强子、阻遏子和终止子。
[0562] 术语“过表达”通常是指宿主细胞中基因产物的产量超过了正常或未转化宿主细胞中的产量水平。当术语“过表达”用来表述信使RNA水平时，优选表示表达水平比对照宿主细胞或未转化细胞中通常观察到的高至少大约3倍。更优选表达水平比对照宿主细胞或未转化细胞中通常观察到的高至少大约5倍、大约10倍、大约15倍、大约20倍、大约25倍、大约30倍、大约35倍、大约40倍、大约45倍、大约50倍、大约55倍、大约60倍、大约65倍、大约70倍、大约75倍、大约80倍、大约85倍、大约90倍、大约95倍、或大约100倍或以上。
[0563] mRNA的水平利用本领域技术人员已知的多种技术中的任何一种测量，包括但不限于：RNA印迹(Northern blot)分析和RT-PCR，包括定量RT-PCR。
[0564] 如本文所用的术语“微粒形成蛋白”是指参与微粒形成的蛋白。例如，其可以选自下组的蛋白：聚合物解聚酶、聚合物调控蛋白、聚合物合酶和微粒大小决定蛋白。优选微粒形成蛋白选自下组：硫解酶、还原酶、聚合物合酶和包涵体蛋白phasin。微粒形成蛋白例如合酶可以通过使底物或底物衍生物聚合形成聚合物微粒而催化形成聚合物微粒。或者，微粒形成蛋白例如硫解酶、还原酶、或包涵体蛋白phasin可以通过促进聚合化作用而促进聚合物微粒形成。例如，硫解酶或还原酶可以催化产生聚合酶的适宜底物。包涵体蛋白phasin可以控制所形成的聚合物微粒的大小。优选聚合物微粒形成蛋白包含微粒结合结构域和微粒形成结构域。
[0565] 如本文所用，术语“微粒形成反应混合物”在宿主细胞或表达构建体包含合酶催化结构域的情况下至少是指聚合物合酶底物，或者在宿主细胞或表达构建体包含其他微粒形成蛋白或并非聚合物合酶催化结构域的微粒结合结构域的情况下至少是指聚合物合酶及其底物。
[0566] “微粒大小决定蛋白”是指控制微粒大小的蛋白。其可以例如来源于包涵体蛋白phasin样蛋白家族，优选选自来自雷尔氏菌属、产碱菌属和假单胞菌属的蛋白，更优选来自真养雷尔氏菌包涵体蛋白phasin基因phaP和来自食油假单胞菌的包涵体蛋白phasin基因phaF。包涵体蛋白phasin为分子量14-28kDa的两性蛋白，与聚合物微粒的疏水表面紧密结合。这也可以包含结合微粒并决定微粒大小的其他宿主细胞蛋白。
[0567] 术语“病原体”或“细胞内病原体”或“微生物”是指至少部分其繁殖或生命周期存在于宿主细胞内的任何生物，无论是在细胞质中还是在液泡内。细胞内病原体包括病毒(例如CMV、HIV)、细菌(分枝杆菌属、李斯特菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属(Shigella)、耶尔森氏菌属、布鲁氏菌属、芽孢杆菌属、军团菌属、立克次体属、衣原体属、嗜性衣原体属、链球菌属、葡萄球菌属、埃立克体属、弗朗西斯氏菌属、肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌)、原生动物(例如，弓形虫属)、真菌和细胞内寄生虫(例如疟原虫属(Plasmodium))。
[0568] 将会理解病原体典型地是宿主特异性的。从而，本发明的方法和组合物适合于改良(用于)对特定宿主物种进行抗特定病原体免疫，包括进行抗物种特异性病原体免疫。例如，对人类进行抗病原体免疫，包括人特异性病原体，例如分枝杆菌属(例如牛分枝杆菌、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、鸟分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种、分枝杆菌)、李斯特菌属(例如产单核细胞李斯特菌、李斯特菌)、沙门氏菌属(例如伤寒沙门氏菌)、耶尔森氏菌属(例如鼠疫耶尔森氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌)、炭疽芽孢杆菌、军团菌属(例如嗜肺军团菌、长滩军团菌、博兹曼军团菌、军团菌)、立克次体属(例如立氏立克次体、螨立克次体、康氏立克次体、西伯利亚立克次体、澳大利亚立克次体、日本立克次体、非洲立克次体、普氏立克次体、斑疹伤寒立克次体、立克次体)、衣原体属(例如肺炎衣原体、沙眼衣原体、衣原体)、嗜性衣原体属(例如鹦鹉热嗜性衣原体、流产嗜性衣原体)、链球菌属(例如肺炎链球菌、酿脓链球菌、无乳链球菌)、葡萄球菌属(例如金黄色葡萄球菌)、埃立克体属(例如查菲埃立克体、嗜吞噬细胞埃立克体群、埃立克体)、贝氏柯克斯体、利什曼原虫、刚地弓形虫、克氏锥虫、组织胞浆菌、土拉热弗朗西斯氏菌、以及腺病毒、痘苗病毒、禽痘病毒、腺相关病毒、改良型痘苗病毒安卡拉株、塞姆利基森林病毒、痘病毒和疱疹病毒。
[0569] 其他属的细胞内病原体具有宽泛的宿主特异性，包括例如布鲁氏菌属物种。布鲁氏菌属为革兰氏阴性不运动型没有荚膜的球杆菌。布鲁氏菌属是布鲁氏菌病的病因。不同布鲁氏菌属物种的例子包括羊布鲁氏菌(B.melitensis)、流产布鲁氏菌、猪布鲁氏菌(B.suis)、绵羊布鲁氏菌(B.ovis)、鳍型布鲁氏菌(B.pinnipediae)和沙林鼠布鲁氏菌(B.neotomae)。
[0570] 在其他实施例中，对非人类受试者进行抗病原体免疫，包括物种特异性病原体。例如对牛、乌鸦和绵羊受试者进行抗分枝杆菌免疫，包括例如牛分枝杆菌、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、鸟分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种及其他分枝杆菌。
[0571] 从而，“受试者”为动物，例如哺乳动物，包括哺乳动物伴侣动物或人类。代表性的伴侣动物包括猫、马和犬。代表性的农业动物包括牛、绵羊、鹿和猪。在一个实施方案中，人类为成人、儿童或婴幼儿，包括免疫受损的成人、儿童或婴幼儿，或进行了抗病原体免疫接种的、感染了病原体的、接触了病原体的、或具有病原体感染或接触风险的成人、儿童或婴幼儿。
[0572] 术语“治疗”及其派生词(包括作为名词的“治疗”)应解释为其最宽广可能的含义。该术语不应理解为暗示治疗受试者直至完全康复。从而“治疗”广义地包括特定病况症状发作或严重性的缓解和/或预防。
[0573] 如本文所用的“聚合物调控蛋白”是指调控参与聚合物微粒形成的phaA、phaB和phaC基因转录的蛋白。其通过与微粒表面结合而免受转录调控。此类调控蛋白的一个例子是来自真养雷尔氏菌YP_725943的包涵体蛋白phasin阻遏子(phaR)，其与包涵体蛋白phasin样基因的启动子结合，其表达产物调控所形成的聚合物微粒的大小，并防止phasin基因通读。因为phasin阻遏子结合在所形成的聚合物微粒的表面，释放了启动子上的位点，所以下面的基因转录能够开始。如本文所用的“聚合物合酶”是指能够通过使底物或底物衍生物聚合形成聚合物微粒而催化形成聚合物微粒的蛋白。已经从＞45种不同的细菌中获得了88种PHA合酶基因的核苷酸序列，它们在一级结构、底物特异性和亚单位组成方面均有所不同(Rehm，2007)。
[0574] 聚合物合酶至少包含位于合酶蛋白C-末端的合酶催化结构域，其介导聚合物的聚合反应以及合酶蛋白与微粒核心的连接。用于本发明的聚合物合酶在Rehm，2003中详细说明，在此全文并入作为参考。例如，聚合物合酶是来自不动杆菌属、弧菌属、气单胞菌属、色杆菌属、假单胞菌属、动胶菌属、产碱菌属、代尔夫特菌属、伯克霍尔德菌属、雷尔氏菌属、红球菌属、戈登氏菌属、红细菌属、副球菌属、立克次体属、柄杆菌属、甲基杆菌属、固氮根瘤菌属、农杆菌属、根瘤菌属、中华根瘤菌属、立克次体属、泉古菌门、集胞藻属、外硫红螺菌属、荚硫菌属、囊硫菌属和异着色菌属的1型PHA合酶；来自伯克霍尔德菌属和假单胞菌属的2型PHA合酶；或来自芽孢杆菌属(Bacillus)的4型PHA合酶；更优选来自不动杆菌RA3849、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、斑点气单胞菌FA440、嗜水气单胞菌、紫色色杆菌、假单胞菌61-3、生枝动胶菌、肥大产碱菌、产碱菌SH-69、食酸代尔夫特菌、伯克霍尔德菌DSMZ9242、真养雷尔氏菌H16、洋葱伯克霍尔德菌、赤红球菌PP2、戈登氏菌(Gordonia rubripertinctus)、普氏立克次体、集胞藻PCC6803、沙氏外硫红螺菌N1、普氏荚硫菌9111、酒色异着色菌D、紫囊硫菌2311、类球红细菌、脱氮副球菌、荚膜红细菌、新月柄杆菌、扭脱甲基杆菌、茎瘤固氮根瘤菌、根癌农杆菌、苜蓿中华根瘤菌41、深红红螺菌HA和深红红螺菌ATCC25903的1型PHA合酶；来自石竹伯克霍尔德菌、绿针假单胞菌、假单胞菌61-3、恶臭假单胞菌U、食油假单胞菌、铜绿假单胞菌、食树脂假单胞菌、斯氏假单胞菌、门多萨假单胞菌、类产碱假单胞菌、恶臭假单胞菌BM01、硝基还原假单胞菌、绿针假单胞菌的2型PHA合酶；
以及来自巨大芽孢杆菌和芽孢杆菌INT005的4型PHA合酶。
以及来自巨大芽孢杆菌和芽孢杆菌INT005的4型PHA合酶。
[0575] 其他可适用于本发明的聚合物合酶包括来自如下分别以保藏号标识的生物的聚合物合酶：钩虫贪铜菌(AY836680)、铜绿假单胞菌(AE004091)、酒色异着色菌(AB205104)、巨大芽孢杆菌(AF109909)、死海盐盒菌(YP137339)、致黄假单胞菌(AB049413)、恶臭假单胞菌(AF150670)、真养雷尔氏菌(A34341)、普氏荚硫菌(X93599)、斑点气单胞菌(O32472)、假单胞菌61-3(AB014757和AB014758)、类球红细菌(AAA72004)、紫色色杆菌(AAC69615)、泊库岛食烷菌SK2(CAL17662)、泊库岛食烷菌SK2(CAL16866)、类球红细菌KD131(ACM01571和YP002526072)、不透明红球菌B4(BAH51880和YP002780825)、多噬伯克霍尔德菌ATCC17616(YP001946215和BAG43679)、泊库岛食烷菌SK2(YP693934和YP693138)、深红红螺菌(AAD53179)、γ变形菌HTCC5015(ZP05061661和EDY86606)、固氮弧菌BH72(YP932525)、紫色色杆菌ATCC 12472(NP902459)、湖沉积杆菌MED105(ZP01915838和EDM82867)、
M.algicola DG893(ZP01895922和EDM46004)、类球红细菌(CAA65833)、紫色色杆菌ATCC
12472(AAQ60457)、肥大产碱菌(AADl0274、AAD01209和AAC83658)、嗜麦芽窄食单孢菌K279a(CAQ46418和YP001972712)、茄科雷尔氏菌IP01609(CAQ59975和YP002258080)、多噬伯克霍尔德菌ATCC 17616(YP001941448和BAG47458)、假单胞菌gl13(ACJ02400)、假单胞菌gl06(ACJ02399)、假单胞菌gl01(ACJ02398)、根瘤菌gl32(ACJ02397)、豌豆根瘤菌3841(CAK10329和YP770390)、固氮弧菌BH72(CAL93638)、假单胞菌LDC-5(AAV36510)、L.nitroferrum 2002(ZP03698179)、索氏菌MZ1T(YP002890098和ACR01721)、耐辐射甲基杆菌JCM 2831(YP001755078和ACB24395)、甲基杆菌4-46(YP001767769和ACA15335)、
L.nitroferrum 2002(EEG08921)、脱氮副球菌(BAA77257)、格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌
(M.gryphiswaldense)(ABG23018)、假单胞菌USM4-55(ABX64435和ABX64434)、嗜水气
单胞菌(AAT77261和AAT77258)、芽孢杆菌INT005(BAC45232和BAC45230)、恶臭假单胞
菌(AAM63409和AAM63407)、戈登氏菌(Gordonia rubripertinctus)(AAB94058)、巨大
芽孢杆菌(AAD05260)、食酸代尔夫特菌(BAA33155)、嗜丝氨酸副球菌(ACM68662)、假单胞菌14-3(CAK18904)、假单胞菌LDC-5(AAX18690)、假单胞菌PC17(ABV25706)、假单胞菌
3Y2(AAV35431、AAV35429和AAV35426)、门多萨假单胞菌(AAM10546和AAM10544)、硝基还原假单胞菌(AAK19608)、类产碱假单胞菌(AAK19605)、食树脂假单胞菌(AAD26367和AAD26365)、假单胞菌USM7-7(ACM90523和ACM90522)、荧光假单胞菌(AAP58480)及其他未培养细菌(BAE02881、BAE02880、BAE02879、BAE02878、BAE02877、BAE02876、BAE02875、BAE02874、BAE02873、BAE02872、BAE02871、BAE02870、BAE02869、BAE02868、BAE02867、BAE0286、 BAE02865、BAE02864、BAE02863、BAE02862、BAE02861、BAE02860、BAE02859、BAE02858、BAE02857、BAE07146、BAE07145、BAE07144、BAE07143、BAE07142、BAE07141、BAE07140、BAE07139、BAE07138、BAE07137、BAE07136、BAE07135、BAE07134、BAE07133、BAE07132、BAE07131、BAE07130、BAE07129、BAE07128、BAE07127、BAE07126、BAE07125、BAE07124、BAE07123、BAE07122、BAE07121、BAE07120、BAE07119、BAE07118、BAE07117、BAE07116、BAE07115、BAE07114、BAE07113、BAE07112、BAE07111、BAE07110、BAE07109、BAE07108、BAE07107、BAE07106、BAE07105、BAE07104、BAE07103、BAE07102、BAE07101、BAE07100、BAE07099、BAE07098、BAE07097、BAE07096、BAE07095、BAE07094、BAE07093、BAE07092、BAE07091、BAE07090、BAE07089、BAE07088、BAE07053、BAE07052、BAE07051、BAE07050、BAE07049、BAE07048、BAE07047、BAE07046、BAE07045、BAE07044、BAE07043、BAE07042、BAE07041、BAE07040、BAE07039、BAE07038、BAE07037、BAE07036、BAE07035、BAE07034、BAE07033、BAE07032、BAE07031、BAE07030、BAE07029、BAE07028、BAE07027、BAE07026、BAE07025、BAE07024、BAE07023、BAE07022、BAE07021、BAE07020、BAE07019、BAE07018、BAE07017、BAE07016、BAE07015、BAE07014、BAE07013、BAE07012、BAE07011、BAE07010、BAE07009、BAE07008、BAE07007、BAE07006、BAE07005、BAE07004、BAE07003、BAE07002、BAE07001、BAE07000、BAE06999、BAE06998、BAE06997、BAE06996、BAE06995、BAE06994、BAE06993、BAE06992、BAE06991、BAE06990、BAE06989、BAE06988、BAE06987、BAE06986、BAE06985、BAE06984、BAE06983、BAE06982、BAE06981、BAE06980、BAE06979、BAE06978、BAE06977、BAE06976、BAE06975、BAE06974、BAE06973、BAE06972、BAE06971、BAE06970、BAE06969、BAE06968、BAE06967、BAE06966、BAE06965、BAE06964、BAE06963、BAE06962、BAE06961、BAE06960、BAE06959、BAE06958、BAE06957、BAE06956、BAE06955、BAE06954、BAE06953、BAE06952、BAE06951、BAE06950、BAE06949、BAE06948、BAE06947、BAE06946、BAE06945、BAE06944、BAE06943、BAE06942、BAE06941、BAE06940、BAE06939、BAE06938、BAE06937、BAE06936、BAE06935、BAE06934、BAE06933、BAE06932、BAE06931、BAE06930、BAE06929、BAE06928、BAE06927、BAE06926、BAE06925、BAE06924、BAE06923、BAE06922、BAE06921、BAE06920、BAE06919、BAE06918、BAE06917、BAE06916、BAE06915、BAE06914、BAE06913、BAE06912、BAE06911、BAE06910、BAE06909、BAE06908、BAE06907、BAE06906、BAE06905、BAE06904、BAE06903、BAE06902、BAE06901、BAE06900、BAE06899、BAE06898、BAE06897、BAE06896、BAE06895、BAE06894、BAE06893、BAE06892、BAE06891、BAE06890、BAE06889、BAE06888、BAE06887、BAE06886、BAE06885、BAE06884、BAE06883、BAE06882、BAE06881、BAE06880、BAE06879、BAE06878、BAE06877、BAE06876、BAE06875、BAE06874、BAE06873、BAE06872、BAE06871、BAE06870、BAE06869、BAE06868、BAE06867、BAE06866、BAE06865、BAE06864、BAE06863、BAE06862、BAE06861、BAE06860、BAE06859、BAE06858、BAE06857、BAE06856、BAE06855、BAE06854、BAE06853和BAE06852)。
M.algicola DG893(ZP01895922和EDM46004)、类球红细菌(CAA65833)、紫色色杆菌ATCC
12472(AAQ60457)、肥大产碱菌(AADl0274、AAD01209和AAC83658)、嗜麦芽窄食单孢菌K279a(CAQ46418和YP001972712)、茄科雷尔氏菌IP01609(CAQ59975和YP002258080)、多噬伯克霍尔德菌ATCC 17616(YP001941448和BAG47458)、假单胞菌gl13(ACJ02400)、假单胞菌gl06(ACJ02399)、假单胞菌gl01(ACJ02398)、根瘤菌gl32(ACJ02397)、豌豆根瘤菌3841(CAK10329和YP770390)、固氮弧菌BH72(CAL93638)、假单胞菌LDC-5(AAV36510)、L.nitroferrum 2002(ZP03698179)、索氏菌MZ1T(YP002890098和ACR01721)、耐辐射甲基杆菌JCM 2831(YP001755078和ACB24395)、甲基杆菌4-46(YP001767769和ACA15335)、
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(M.gryphiswaldense)(ABG23018)、假单胞菌USM4-55(ABX64435和ABX64434)、嗜水气
单胞菌(AAT77261和AAT77258)、芽孢杆菌INT005(BAC45232和BAC45230)、恶臭假单胞
菌(AAM63409和AAM63407)、戈登氏菌(Gordonia rubripertinctus)(AAB94058)、巨大
芽孢杆菌(AAD05260)、食酸代尔夫特菌(BAA33155)、嗜丝氨酸副球菌(ACM68662)、假单胞菌14-3(CAK18904)、假单胞菌LDC-5(AAX18690)、假单胞菌PC17(ABV25706)、假单胞菌
3Y2(AAV35431、AAV35429和AAV35426)、门多萨假单胞菌(AAM10546和AAM10544)、硝基还原假单胞菌(AAK19608)、类产碱假单胞菌(AAK19605)、食树脂假单胞菌(AAD26367和AAD26365)、假单胞菌USM7-7(ACM90523和ACM90522)、荧光假单胞菌(AAP58480)及其他未培养细菌(BAE02881、BAE02880、BAE02879、BAE02878、BAE02877、BAE02876、BAE02875、BAE02874、BAE02873、BAE02872、BAE02871、BAE02870、BAE02869、BAE02868、BAE02867、BAE0286、 BAE02865、BAE02864、BAE02863、BAE02862、BAE02861、BAE02860、BAE02859、BAE02858、BAE02857、BAE07146、BAE07145、BAE07144、BAE07143、BAE07142、BAE07141、BAE07140、BAE07139、BAE07138、BAE07137、BAE07136、BAE07135、BAE07134、BAE07133、BAE07132、BAE07131、BAE07130、BAE07129、BAE07128、BAE07127、BAE07126、BAE07125、BAE07124、BAE07123、BAE07122、BAE07121、BAE07120、BAE07119、BAE07118、BAE07117、BAE07116、BAE07115、BAE07114、BAE07113、BAE07112、BAE07111、BAE07110、BAE07109、BAE07108、BAE07107、BAE07106、BAE07105、BAE07104、BAE07103、BAE07102、BAE07101、BAE07100、BAE07099、BAE07098、BAE07097、BAE07096、BAE07095、BAE07094、BAE07093、BAE07092、BAE07091、BAE07090、BAE07089、BAE07088、BAE07053、BAE07052、BAE07051、BAE07050、BAE07049、BAE07048、BAE07047、BAE07046、BAE07045、BAE07044、BAE07043、BAE07042、BAE07041、BAE07040、BAE07039、BAE07038、BAE07037、BAE07036、BAE07035、BAE07034、BAE07033、BAE07032、BAE07031、BAE07030、BAE07029、BAE07028、BAE07027、BAE07026、BAE07025、BAE07024、BAE07023、BAE07022、BAE07021、BAE07020、BAE07019、BAE07018、BAE07017、BAE07016、BAE07015、BAE07014、BAE07013、BAE07012、BAE07011、BAE07010、BAE07009、BAE07008、BAE07007、BAE07006、BAE07005、BAE07004、BAE07003、BAE07002、BAE07001、BAE07000、BAE06999、BAE06998、BAE06997、BAE06996、BAE06995、BAE06994、BAE06993、BAE06992、BAE06991、BAE06990、BAE06989、BAE06988、BAE06987、BAE06986、BAE06985、BAE06984、BAE06983、BAE06982、BAE06981、BAE06980、BAE06979、BAE06978、BAE06977、BAE06976、BAE06975、BAE06974、BAE06973、BAE06972、BAE06971、BAE06970、BAE06969、BAE06968、BAE06967、BAE06966、BAE06965、BAE06964、BAE06963、BAE06962、BAE06961、BAE06960、BAE06959、BAE06958、BAE06957、BAE06956、BAE06955、BAE06954、BAE06953、BAE06952、BAE06951、BAE06950、BAE06949、BAE06948、BAE06947、BAE06946、BAE06945、BAE06944、BAE06943、BAE06942、BAE06941、BAE06940、BAE06939、BAE06938、BAE06937、BAE06936、BAE06935、BAE06934、BAE06933、BAE06932、BAE06931、BAE06930、BAE06929、BAE06928、BAE06927、BAE06926、BAE06925、BAE06924、BAE06923、BAE06922、BAE06921、BAE06920、BAE06919、BAE06918、BAE06917、BAE06916、BAE06915、BAE06914、BAE06913、BAE06912、BAE06911、BAE06910、BAE06909、BAE06908、BAE06907、BAE06906、BAE06905、BAE06904、BAE06903、BAE06902、BAE06901、BAE06900、BAE06899、BAE06898、BAE06897、BAE06896、BAE06895、BAE06894、BAE06893、BAE06892、BAE06891、BAE06890、BAE06889、BAE06888、BAE06887、BAE06886、BAE06885、BAE06884、BAE06883、BAE06882、BAE06881、BAE06880、BAE06879、BAE06878、BAE06877、BAE06876、BAE06875、BAE06874、BAE06873、BAE06872、BAE06871、BAE06870、BAE06869、BAE06868、BAE06867、BAE06866、BAE06865、BAE06864、BAE06863、BAE06862、BAE06861、BAE06860、BAE06859、BAE06858、BAE06857、BAE06856、BAE06855、BAE06854、BAE06853和BAE06852)。
[0576] PHA合酶蛋白的N-末端片段(约氨基酸1-200或1-150或1-100)高度可变，并且在一些实例中缺失或替换为抗原、抗原结合结构域、或另一融合配偶体，而不会使酶失活或防止合酶借助于聚合物微粒结合结构域(即C-末端片段)与聚合物核心共价相连。合酶
的聚合物微粒结合结构域至少包含介导聚合物核心聚合以及聚合物微粒形成的合酶蛋白的催化结构域。
的聚合物微粒结合结构域至少包含介导聚合物核心聚合以及聚合物微粒形成的合酶蛋白的催化结构域。
[0577] 在一些实施方案中，PHA合酶蛋白的C-末端片段进行了修饰、部分缺失或部分替换为能够引发免疫应答的抗原、与能够引发免疫应答的抗原能够结合的结合结构域、或另一融合配偶体，而不会使酶失活或防止合酶与聚合物微粒共价相连。
[0578] 在某些情况下，能够引发免疫应答的抗原、与能够引发免疫应答的抗原能够结合的结合结构域、或另一融合配偶体与PHA合酶蛋白的N-末端或C-末端融合，而不会使酶失活或防止合酶与聚合物微粒共价相连。与此相似，在其他情况下，能够引发免疫应答的抗原、与能够引发免疫应答的抗原能够结合的结合结构域、或另一融合配偶体插入在PHA合酶蛋白之中，或者实际上位于微粒形成蛋白之中。PhaC融合蛋白的例子在本领域已知，且已在本文提出。
[0579] 在一个实例中，PHA合酶蛋白的N-末端片段(约氨基酸1-200或1-150或1-100)高度可变，并且缺失或替换为结核分枝杆菌抗原、结核分枝杆菌抗原结合结构域、肝炎病毒抗原、肝炎病毒抗原结合结构域、流感病毒抗原、或流感病毒抗原结合结构域、或另一融合配偶体，而不会使酶失活或防止合酶借助于聚合物微粒结合结构域(即C-末端片段(此结构域借助疏水相互作用结合))与聚合物核心共价相连(共价相连通过新生聚酯突出的活性位点发生)。合酶的聚合物微粒结合结构域至少包含介导聚合物微粒聚合以及聚合物微粒形成的合酶蛋白的催化结构域。
[0580] PHA合酶蛋白的C-末端片段也可以进行修饰、部分缺失或部分替换为例如结核分枝杆菌抗原、结核分枝杆菌抗原结合结构域、肝炎病毒抗原、肝炎病毒抗原结合结构域、流感病毒抗原、或流感病毒抗原结合结构域、或另一融合配偶体，而不会使酶失活或防止合酶与聚合物微粒共价相连。
[0581] 在某些情况下，结核分枝杆菌抗原、结核分枝杆菌抗原结合结构域、肝炎病毒抗原、肝炎病毒抗原结合结构域、流感病毒抗原、或流感病毒抗原结合结构域、或另一融合配偶体与PHA合酶蛋白的N-末端或C-末端融合，而不会使酶失活或防止合酶与聚合物微粒共价相连。与此相似，在其他情况下，结核分枝杆菌抗原、结核分枝杆菌抗原结合结构域、肝炎病毒抗原、肝炎病毒抗原结合结构域、流感病毒抗原、或流感病毒抗原结合结构域、或另一融合配偶体插入在PHA合酶蛋白之中，或者实际上位于微粒形成蛋白之中。PhaC融合蛋白的例子在本领域已知，且已在本文提出。
[0582] 如本文所用的“聚合物解聚酶”是指能够将既有的聚合物(例如见于聚合物微粒中的聚合物)水解成水溶性单体和寡聚体的蛋白。聚合物解聚酶的例子发生在广泛多种的PHA降解细菌和真菌之中，包括来自Paucimonas lemoignei的PhaZ1-PhaZ7细胞外解聚酶、来自食酸菌(Acidovorax sp.)、粪产碱菌(A.faecalis)(AE122和T1菌株)、食酸代尔夫特菌(丛毛单胞菌)(Delftia)(Comamonas)acidovorans)菌株YM1069、睾丸酮丛毛
单胞菌(Comamonas testosteroni)、丛毛单胞菌(Comamonas sp.)、纤发菌(Leptothrix sp.)菌株HS、假单胞菌菌株GM101(保藏号AF293347)、荧光假单胞菌菌株GK13、斯氏假单胞菌、皮氏雷尔氏菌(R.pickettii)(A1和K1菌株，保藏号JO4223、D25315)、脱叶链霉菌(S.exfoliatus)K10和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的PhaZ解聚酶(参见
Jendrossek D.，and Handrick，R.，Microbial Degredation of Polyhydroxyalkanoates，Annual Review of Microbiology，2002，56：403-32)。
单胞菌(Comamonas testosteroni)、丛毛单胞菌(Comamonas sp.)、纤发菌(Leptothrix sp.)菌株HS、假单胞菌菌株GM101(保藏号AF293347)、荧光假单胞菌菌株GK13、斯氏假单胞菌、皮氏雷尔氏菌(R.pickettii)(A1和K1菌株，保藏号JO4223、D25315)、脱叶链霉菌(S.exfoliatus)K10和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的PhaZ解聚酶(参见
Jendrossek D.，and Handrick，R.，Microbial Degredation of Polyhydroxyalkanoates，Annual Review of Microbiology，2002，56：403-32)。
[0583] 如本文所用的术语“多肽”囊括任何长度的氨基酸链，但优选至少5个氨基酸，包括全长蛋白，其中氨基酸残基通过共价肽键相连。本发明的多肽为纯化的天然产物，或者部分或完全利用重组或合成技术生产。该术语可以指多肽、多肽聚集体例如二聚体或其他多聚体、融合多肽、多肽变体、或其衍生物。
[0585] 术语“终止子”是指终止转录的序列，见于翻译序列下游基因的3’非翻译末端。终止子是mRNA稳定性的重要决定因素，并且在一些情况下发现具有空间调控功能。
[0586] 在表述结合于、吸附至或掺入聚合物微粒时，术语“物质”旨在表示为融合配偶体所结合的物质或能够吸附至或掺入聚合物微粒的物质。
[0587] 如本文所用的术语“变体”是指与具体标识的序列不同的多核苷酸或多肽序列，其中进行了一个或多个核苷酸或氨基酸残基缺失、取代或添加。变体为天然存在的等位基因变体、或非天然存在的变体。变体来自相同或其他物种，并且可以涵盖同源物、旁系同源物和直系同源物。在某些实施方案中，多核苷酸和多肽变体拥有与野生型多核苷酸或多肽相同或相似的生物活性。述及多核苷酸和多肽的术语“变体”涵盖如本文所定义的所有形式的多核苷酸和多肽。
[0588] 多核苷酸和多肽变体
[0589] 如本文所用的术语“多核苷酸”表示任何长度的单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，但优选至少15个核苷酸，并且作为非限制性的例子包括基因的编码和非编码序列、有义和反义互补序列、外显子、内含子、基因组DNA、cDNA、前mRNA、mRNA、rRNA、siRNA、miRNA、tRNA、核酶、重组多肽、分离的和纯化的天然存在的DNA或RNA序列、合成的RNA和DNA序列、核酸探针、引物和片段。许多核酸类似物在本领域已知并且也考虑在内。
[0590] 本文提供的多核苷酸序列的“片段”是连续核苷酸的亚序列，优选长至少15个核苷酸。本发明的片段优选包含本发明多核苷酸的至少20个核苷酸、更优选至少30个核苷酸、更优选至少40个核苷酸、更优选至少50个核苷酸、最优选至少60个连续核苷酸。多核苷酸序列片段可用在反义、基因沉默、三螺旋或核酶技术之中，或作为引物、探针、纳入在微阵列之中、或在基于多核苷酸的选择方法中使用。
[0592] 优选本发明启动子多核苷酸序列片段包含本发明启动子多核苷酸序列的至少20个、更优选至少30个、更优选至少40个、更优选至少50个、更优选至少100个、更优选至少200个、更优选至少300个、更优选至少400个、更优选至少500个、更优选至少600个、更优选至少700个、更优选至少800个、更优选至少900个、最优选至少1000个连续核苷酸。
[0593] 术语“引物”是指短的多核苷酸，通常具有游离3’OH基团，其与模板杂交而用于引发与该模板互补的多核苷酸聚合反应。这样的引物优选长至少5个、更优选至少6个、更优选至少7个、更优选至少9个、更优选至少10个、更优选至少11个、更优选至少12个、更优选至少13个、更优选至少14个、更优选至少15个、更优选至少16个、更优选至少17个、更优选至少18个、更优选至少19个、更优选至少20个核苷酸。
[0594] 术语“探针”是指短的多核苷酸，其用来在基于杂交的测定法中检测与该探针互补的多核苷酸序列。探针可以由如本文所定义的多核苷酸“片段”组成。优选这样的探针长至少5个、更优选至少10个、更优选至少20个、更优选至少30个、更优选至少40个、更优选至少50个、更优选至少100个、更优选至少200个、更优选至少300个、更优选至少400个、最优选至少500个核苷酸。
[0595] 如本文所用的术语“变体”是指与具体标识的序列不同的多核苷酸或多肽序列，其中进行了一个或多个核苷酸或氨基酸残基缺失、取代或添加。变体为天然存在的等位基因变体、或非天然存在的变体。变体来自相同或其他物种，并且可以涵盖同源物、旁系同源物和直系同源物。在某些实施方案中，多核苷酸和多肽变体拥有与野生型多核苷酸或多肽相同或相似的生物活性。述及多核苷酸和多肽的术语“变体”涵盖如本文所定义的所有形式的多核苷酸和多肽。
[0596] 多核苷酸变体
[0597] 变体多核苷酸序列优选与指定的多核苷酸序列呈现出至少50％、更优选至少51％、 至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少％、 至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少
82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少
90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少
98％或至少99％的同一性。就指定多核苷酸序列的至少20个核苷酸位置、优选至少50个核苷酸位置、至少100个核苷酸位置的比较窗口或全长来寻找同一性。
82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少
90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少
98％或至少99％的同一性。就指定多核苷酸序列的至少20个核苷酸位置、优选至少50个核苷酸位置、至少100个核苷酸位置的比较窗口或全长来寻找同一性。
[0598] 多核苷酸序列的同一性可按如下方式来确定。利用可由NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)公开获得的BLASTN(来自BLAST程序套，2.2.10版[2004年10月])通过bl2seq(Tatiana A.Tatusova，Thomas L.Madden(1999)，″Blast2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences″，FEMSMicrobiol Lett.174：
247-250)将目标多核苷酸序列与候选多核苷酸序列进行比较。使用bl2seq的默认参数，不过应当关闭对低复杂度部分的过滤。
247-250)将目标多核苷酸序列与候选多核苷酸序列进行比较。使用bl2seq的默认参数，不过应当关闭对低复杂度部分的过滤。
[0599] 可利用如下unix命令行参数来检查多核苷酸序列的同一性：
[0600] bl2seq-i nucleotideseq1-j nucleotideseq2-F F-p blastn
[0602] 多核苷酸序列的同一性也可以利用全局序列比对程序(例如Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453)就候选和目标多核苷酸序列重叠部分的全长来计算。Needleman-Wunsch全局序列比对算法的完整执行见可由http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/获得的EMBOSS包(Rice，P.Longden，I.and Bleasby，A.EMBOSS：The European Molecular Biology OpenSoftware Suite，Trends in Genetics June
2000，vol 16，No 6.pp.276-277)中的needle程序。欧洲生物信息研究所(European
Bioinformatics Institute)服务器也于http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/在线提供执行两序列间的EMBOSS-needle全局比对工具。
2000，vol 16，No 6.pp.276-277)中的needle程序。欧洲生物信息研究所(European
Bioinformatics Institute)服务器也于http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/在线提供执行两序列间的EMBOSS-needle全局比对工具。
[0603] 或者可利用GAP程序，其计算两序列的最佳全局比对而不会对末端缺口进行罚分。GAP在如下文献中说明：Huang，X.(1994)On Global Sequence Alignment.Computer Applications in the Biosciences 10，227-235。
[0604] 本发明的多核苷酸变体也涵盖与一个或多个具体标识的序列呈现出相似性的序列，其很可能保留了那些序列的等同功能，这不可能合理预期会随机发生。就多肽而言，此类序列相似性利用可公开获得的来自NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)的BLAST程序套(2.2.10版[2004年10月])中的bl2seq程序来确定。
[0605] 可利用如下unix命令行参数来检查多核苷酸序列的相似性：
[0606] bl2seq-i nucleotideseq1-j nucleotideseq2-F F-p tblastx
[0607] 参数-F F关闭对低复杂度区段的过滤。参数-p为序列对选择适当的算法。该程序寻找序列间的相似性区域，并就每一个这样的区域给出“E值”报告，其为在固定参照大小的含随机序列的数据库中预期偶然见到此类匹配的预期次数。数据库的大小由bl2seq程序默认设置。对于远远小于1的小E值而言，该E值约等于此类随机匹配的概率。
[0608] 变体多核苷酸序列优选与任一具体标识的序列相比呈现出小于1x10-10、更优选小-20 -30 -40 -50 -60 -70 -80于1x10 、小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 、-90 -100 -110 -120 -123
小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 或小于1x10 的E值。
小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 或小于1x10 的E值。
[0609] 或者，本发明的变体多核苷酸与指定的多核苷酸序列或其互补物在严谨条件下杂交。
[0610] 术语“在严谨条件下杂交”及其语法意义上的等同体是指多核苷酸分子在限定的温度和盐浓度条件下与靶多核苷酸分子(例如DNA或RNA印迹如Southern印迹或Northern印迹上固定的靶多核苷酸分子)杂交的能力。在严谨杂交条件下杂交的能力可通过最初在低严谨条件下杂交、而后提高严谨性至期望的严谨性来确定。
[0611] 就长度超过约100个碱基的多核苷酸分子而言，典型的严谨杂交条件比天然双链体的解链温度(Tm)低不超过25-30℃(例如10℃)(一般性地参见Sambrook et al.，Eds，1987，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.Cold Spring Harbor Press；
Ausubel et al.，1987，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing)。
大于约100个碱基的多核苷酸分子的Tm可按照公式Tm＝81.5+0.41％(G+C-log(Na+)来计算(Sambrook et al.，Eds，1987，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.Cold Spring Harbor Press；Bolton and McCarthy，1962，PNAS 84：1390)。长度大于100个碱基的多核苷酸的典型严谨条件为这样的杂交条件，例如以6X SSC，0.2％SDS溶液预洗；65℃，
6X SSC，0.2％SDS过夜杂交；接着于65℃以1X SSC，0.1％SDS洗两次，每次30分钟，并于
65℃以0.2X SSC，0.1％SDS洗两次，每次30分钟。
Ausubel et al.，1987，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing)。
大于约100个碱基的多核苷酸分子的Tm可按照公式Tm＝81.5+0.41％(G+C-log(Na+)来计算(Sambrook et al.，Eds，1987，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.Cold Spring Harbor Press；Bolton and McCarthy，1962，PNAS 84：1390)。长度大于100个碱基的多核苷酸的典型严谨条件为这样的杂交条件，例如以6X SSC，0.2％SDS溶液预洗；65℃，
6X SSC，0.2％SDS过夜杂交；接着于65℃以1X SSC，0.1％SDS洗两次，每次30分钟，并于
65℃以0.2X SSC，0.1％SDS洗两次，每次30分钟。
[0612] 就长度小于100个碱基的多核苷酸分子而言，例示性的严谨杂交条件是比Tm低5-10℃。一般而言，长度小于100bp的多核苷酸分子的Tm降低约(500/寡核苷酸长度)℃。
[0613] 就公知为肽核酸(PNA)的DNA模拟物(Nielsen et al.，Science.1991Dec6；254(5037)：1497-500)而言，Tm值比DNA-DNA或DNA-RNA杂合体要高，可利用Giesen et al.，Nucleic Acids Res.1998Nov 1；26(21)：5004-6中所述的公式来计算。长度小于
100bp的DNA-PNA杂合体的例示性严谨杂交条件比Tm低5-10℃。
100bp的DNA-PNA杂合体的例示性严谨杂交条件比Tm低5-10℃。
[0614] 本发明的变体多核苷酸也涵盖于本发明的序列不同，但是由于遗传密码子的简并性，其编码的多肽与本发明多核苷酸所编码的多肽具有相似的活性。不改变多肽氨基酸序列的序列变异为“沉默变异”。除ATG(甲硫氨酸)和TGG(色氨酸)以外，在一些实例中，通过本领域认可的技术来改变成同一氨基酸的其他密码子，例如在特定宿主生物体中优化密码子表达。
[0615] 本发明也包括导致所编码的多肽中一个或几个氨基酸保守取代而不显著改变其生物活性的多核苷酸变异。技术人员会明了进行表型沉默的氨基酸取代的方法(参见例如Bowie et al.，1990，Science 247，1306)。
[0616] 由于沉默变异和所编码多肽序列中保守取代而致的变态多核苷酸可如之前所述利用可公开获得的来自NCBI(ftp://ttp.ncbi.nih.gov/blast/)的BLAST程序套(2.2.10版[2004年10月])中的bl2seq程序借助tblastx算法来确定。
[0617] 多肽变体
[0618] 就多肽而言的术语“变体”涵盖天然存在的、重组以及合成产生的多肽。变体多肽序列优选与本发明的序列呈现出至少50％、更优选至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少％、 至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少
85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少
93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。就本发明多肽的至少20个氨基酸位置、优选至少50个氨基酸位置、至少100个氨基酸位置的比较窗口或就全长来寻找同一性。
85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少
93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。就本发明多肽的至少20个氨基酸位置、优选至少50个氨基酸位置、至少100个氨基酸位置的比较窗口或就全长来寻找同一性。
[0619] 多肽序列同一性可按如下方式来确定。利用可由NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)公开获得的BLASTP(来自BLAST程序套，2.2.10版[2004年10月])通过bl2seq将目标多肽序列与候选多肽序列进行比较。使用bl2seq的默认参数，不过应当关闭对低复杂度区域的过滤。
[0620] 多肽序列的同一性也可以利用全局序列比对程序就候选和目标多核苷酸序列重叠部分的全长来计算。如上文所讨论的EMBOSS-needle(可获自http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/) 和 GAP(Huang，X.(1994)On Global SequenceAlignment.Computer
Applications in the Biosciences 10，227-235)也是计算多肽序列同一性的适宜的全局序列比对程序。
Applications in the Biosciences 10，227-235)也是计算多肽序列同一性的适宜的全局序列比对程序。
[0621] 本发明的多肽变体也涵盖与一个或多个具体标识的序列呈现出相似性的序列，其很可能保留了那些序列的等同功能，这不可能合理预期会随机发生。就多肽而言，此类序列相似性利用可公开获得的来自NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)的BLAST程序套(2.2.10版[2004年10月])中的bl2seq程序来确定。可利用如下unix命令行参数来检
查多肽序列的相似性：
查多肽序列的相似性：
[0622] bl2seq-i peptideseq1-j peptideseq2-F F-p blastp
[0623] 变体多肽序列优选与任一具体标识的序列相比呈现出小于1x10-10、更优选小于-20 -30 -40 -50 -60 -70 -801x10 、小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 、小于-90 -100 -110 -120 -123
1x10 、小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 或小于1x10 的E值。
1x10 、小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 或小于1x10 的E值。
[0624] 参数-F F关闭对低复杂度区段的过滤。参数-p为序列对选择适当的算法。该程序寻找序列间的相似性区域，并就每一个这样的区域给出“E值”报告，其为在固定参照大小的含随机序列的数据库中预期偶然见到此类匹配的预期次数。数据库的大小由bl2seq程序默认设置。对于远远小于1的小E值而言，该E值约等于此类随机匹配的概率。
[0625] 本发明也包括所述多肽中不显著改变其生物活性的一个或几个氨基酸保守取代。技术人员会明了进行表型沉默的氨基酸取代的方法(参见例如Bowie et al.，1990，Science 247，1306)。
[0626] 本发明的多肽变体也涵盖由编码多肽的核酸产生、但是与野生型多肽不同的多肽，这是由于加工不同从而具有改变了的氨基酸序列。例如，因为初级RNA转录物的替代剪接模式与产生野生型多肽的不同而产生的变体。
[0627] 术语“载体”是指多核苷酸分子，通常为双链DNA，用来将遗传构建体输送到宿主细胞中。在某些实例中，载体能够在至少一个另外的宿主系统例如大肠杆菌中复制。
[0628] 2.病原体
[0629] 应理解本发明的聚合物微粒、方法和组合物部分地涉及预防或治疗病原体、包括细胞内病原体所致的疾病。从而，来源于细胞内病原体的抗原适合用于本发明，可由本领域技术人员来选择。代表性的细胞内病原体在下文更详细地说明，但本领域技术人员将会理解，按照本文所述的方法，通过选择一个或多个来自靶细胞内病原体的抗原或者能够结合来自该靶细胞内病原体的抗原的结合结构域，本发明可应用于任何与细胞内病原体相关的疾病或病情。
[0630] 分枝杆菌属来自放线菌纲(Actinobacteria)。该属包括已知会引起哺乳动物严重疾病的病原体，包括结核病和麻风病。病原体物种的例子包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌(M.africanum)、田鼠分枝杆菌(M.microti)、麻风分枝杆菌(麻疯病)、鸟分枝杆菌副结核亚种(与人类克罗恩病和绵羊约内氏病相关)。
[0631] 李斯特菌属物种为革兰氏阳性杆菌。该属最著名的病原体是产单核细胞李斯特菌，为李斯特菌病的致病因子。伊万诺夫李斯特菌(Listeria ivanovii)是反刍动物病原体，仅罕见地为人类疾病的致病因子。
[0632] 志贺氏菌属为与大肠杆菌和沙门氏菌属密切相关的革兰氏阴性无芽孢的杆状细菌。志贺氏菌属为人类志贺菌病(痢疾)的致病因子，仅感染灵长类动物而非其他哺乳动物。
[0633] 耶尔森氏菌属为革兰氏阴性杆状细菌。具体的人类病原体包括引起耶尔森氏菌病的小肠结肠炎耶尔森氏菌，为瘟疫致病因子的鼠疫耶尔森氏菌，以及最不常见的病原体假结核耶尔森氏菌。耶尔森氏菌属涉及反应性关节炎的致病因子之一。
[0634] 布鲁氏菌属为革兰氏阴性不运动型没有荚膜的球杆菌。布鲁氏菌属是布鲁氏菌病的病因。不同布鲁氏菌属物种的例子包括羊布鲁氏菌和感染绵羊的绵羊布鲁氏菌，感染牛的流产布鲁氏菌，感染猪的猪布鲁氏菌，由海洋哺乳动物分离的鳍型布鲁氏菌和沙林鼠布鲁氏菌。人类通常通过接触感染动物(绵羊、牛或猪)的体液或由其获得的食物产品例如未经巴斯德消毒的奶液和奶酪而被感染。
[0635] 军团菌属为革兰氏阴性细菌。最著名的物种嗜肺军团菌引起军团菌病或军团菌病或退伍军人症。
[0636] 立克次体属为运动型革兰氏阴性无芽孢细菌。立克次体属物种由许多蜱类、蚤类和虱类作为寄生虫携带，引起诸如落矶山斑点热(立氏立克次体)、立克次体痘(螨立克次体)、纽扣热(康氏立克次体)、西伯利亚蜱传斑疹伤寒(西伯利亚立克次体)、澳大利亚蜱传斑疹伤寒(澳大利亚立克次体)、东方斑点热(日本立克次体)、非洲蜱咬热(非洲立克次体)、流行性斑疹伤寒(普氏立克次体)和地方性斑疹伤寒(斑疹伤寒立克次体)等疾病。
[0637] 沙门氏菌属为杆状革兰氏阴性无芽孢运动型肠杆菌，引起人类和许多动物疾病，包括伤寒热、副伤寒热和沙门氏菌病。
[0638] 衣原体属是细菌的一个属，包括人类病原体沙眼衣原体。嗜性衣原体属为相关的细菌，包括人类病原体引起肺炎的肺炎嗜性衣原体，引起呼吸道鹦鹉热的鹦鹉热嗜性衣原体，和与人类流产相关的流产嗜性衣原体。
[0640] 葡萄球菌属为革兰氏阳性菌，是常见的食物中毒的病因。
[0641] 疟原虫属为寄生性原生动物。感染这些寄生虫已知引起疟疾(恶性疟原虫)(P.falciparum)。
[0642] 2.1结核病
[0643] 结核病是严重的全球卫生问题，每年造成全球200万以上的人死亡。该病由结核分枝杆菌所致。该菌一般地通过吸入而入侵肺部，引起肺部感染，可最终扩散至身体其他部分，包括中枢神经系统、淋巴系统、循环系统、泌尿生殖系统、肠胃系统、骨骼、关节和皮肤(Dietrich，2006；Mustafa，2001)。多种形式的农业动物结核病，例如牛结核病和约内氏病也对产量具有重大的负面影响。
[0644] 结核分枝杆菌感染的扩散受免疫系统的限制。许多个体仅仅表现出咳嗽发热症状。然而，约30％的个体不能充分控制感染，罹患原发性疾病。除此之外，该病能够在个体体内休眠，数年或数十年后再次感染这些个体。因此，结核分枝杆菌在传染性细菌中很独特，因为它能够逃逸免疫应答，并经过长期的顽固性非复制期或慢复制期存活下来。
[0645] 结核菌感染分三个阶段。第一急性期阶段以细菌在机体器官中增殖为特征。免疫应答很快出现，控制感染，最终导致细菌载量下降。急性期之后，确立第二潜伏期。在此第二阶段，细菌载量维持在稳定的低水平上。结核分枝杆菌从急性期的活跃繁殖状态转变成潜伏期的休眠状态。可能发生第三再活动期，从而该菌再次开始复制。影响第三阶段的因素在很大程度上依然未知(Barnes andCave，2003)。
[0646] 据认为在整个感染的不同阶段免疫应答的抗原特异性发生了变化，因为该菌在从活跃复制向休眠状态转变期间能够调节基因表达。
[0647] 2.2肝炎
[0648] 肝炎是通常由不同肝炎病毒所致的疾病的总称。肝炎的其他成因包括包括酒精、毒素、药物和自身免疫病。肝炎是一种肝脏炎症，症状包括身体不适、肌肉和关节疼痛、食欲丧失、以及一些病例中的黄疸和最终的肝衰竭。肝炎可以是急性和慢性的，在该病慢性患者中观察到了硬化。
[0649] 2.3流感
[0650] 流行性感冒(更常称为“流感”)由正粘病毒科的RNA病毒所致。流感每年造成250,000-500,000的人死亡。常见症状包括寒战、发热、喉痛、肌肉疼和疼痛、头痛、咳嗽、虚弱和疲乏。在一些病例中，流感可引起肺炎，对于年幼和年老的人是一种潜在的致命性病况。流感可通过空气传播，或通过直接接触感染的鸟类粪便或鼻液而传播。
[0651] 存在着三型流感病毒(甲、乙和丙)，都具有相似的结构。病毒粒子表面展示有两个大的糖蛋白、血凝素和神经氨酸酶，它们参与病毒与靶细胞的结合，病毒基因组向靶细胞的转移，以及病毒子代从感染细胞中的释放。血凝素有16个已知的亚型(H1至H16)，而神经氨酸酶有9个亚型(N1至N9)。
[0652] 2.4当前的治疗策略
[0653] 用来抵御细胞内病原体的当前的治疗策略包括抗已知抗原的疫苗，或对感染有细胞内细菌病原体的患者进行抗生素治疗。
[0654] 无论是感染前的预防，还是感染发生后的治疗，都没有抵御细胞内病原体再活动的合适疫苗，促使我们急需抗细胞内病原体的新的改进的治疗策略。
[0655] 例如，目前仅有的结核菌疫苗是卡介苗(BCG)，其含有牛分枝杆菌活的减毒株。BCG在控制结核菌感染方面功效有限。虽然该免疫似乎对儿童提供抗原发性疾病保护作用，但其针对成年型结核菌病(潜伏之后再活动)的保护功效减小(世界卫生组织-http://www.who.int)。在结核病流行的许多第三世界国家BCG的功效有限也已有报道。另外，BCG疫苗是活疫苗，不适合对免疫受损的患者给药。虽然据报道BCG疫苗降低结核分枝杆菌向脾脏(及其他器官)的传播，但其并不阻止肺部细菌的生长。
[0656] 无论是感染前的预防，还是感染发生后的治疗，都没有抵御再活动的合适疫苗，还有与活疫苗相关的其他问题，促使我们急需抗细胞内病原体包括结核菌、肝炎病毒或流感病毒的新的改进的治疗策略。
[0657] 3.免疫应答
[0658] 3.1.细胞介导的应答
[0659] 细胞介导的免疫主要是由T淋巴细胞介导的。致病性抗原在抗原提呈细胞(例如巨噬细胞、B淋巴细胞和树突细胞)表面表达，与主要组织相容性MHC I类或MHC II类分子结合。提呈的与MHC II类分子偶联的致病性抗原激活辅助(CD4+)T细胞应答。在该T细胞与抗原-MHC II类分子复合物结合之后，CD4+T细胞增殖，释放细胞因子，包括γ干扰素(IFN-γ)和白介素2(IL-2)、IL-4、IL-7和IL-12。
[0660] 提呈的与MHC I类分子偶联的致病性抗原激活激活细胞毒性(CD8+)T细胞应答。在该T细胞与抗原-MHC I类分子复合物结合之后，CD8+细胞分泌穿孔素，导致病原体细胞裂解，膨胀和死亡。或者，CD8+细胞诱导程序性细胞死亡和凋亡。对CD8+T细胞的激活通过CD4+T细胞释放特定细胞因子而放大。
[0661] 细胞介导的免疫应答据认为对于抗多种病原体的免疫力至关重要，包括细胞内病原体例如结核分枝杆菌。
[0662] 用来评估和监测受试者细胞介导的应答的发生和进程的方法在本领域公知。便利的示例性方法包括评估与细胞介导的应答相关的一个或多个细胞因子的存在或水平，例如本文所鉴定的那些。与此相似，用来评估和监测细胞介导的应答的发生和进程的基于细胞的方法适合用于本发明，并且可以包括细胞增殖或活化测定法，包括目的在于鉴定一群或多群免疫细胞例如T淋巴细胞的活化或扩增的测定法。
[0663] 在某些实施方案中，优选本发明中既引发细胞介导的免疫应答又引发体液应答的方法。
[0664] 在其他实施方案中，优选本发明中主要引发细胞介导的应答的方法。此类方法可以包括引发细胞介导的免疫应答而没有显著的体液应答或没有任何可检测的体液应答的方法。在一个实例中，免疫应答是细胞介导的免疫应答，例如IFN-γ反应所指示的应答，而没有显著的IgA反应，或没有显著的IgE反应，或没有显著的IgG反应，包括没有显著的IgG1反应，或没有显著的IgG2反应，或没有显著的IgM反应。
[0665] 3.2.体液应答
[0666] 体液免疫应答是由B细胞所产生的分泌抗体介导的。所述分泌抗体与入侵病原休表面上呈现的抗原结合，将它们标记出来进行破坏。
[0667] 已有人提出组合的细胞介导的和体液应答(例如作为已经起始的细胞介导的应答的后果发生)将会有益于实现更为高度敏感的针对细胞内病原体的免疫应答或者增强抗细胞内病原体的保护作用水平。
[0668] 同样，用来评估和监测体液应答的发生和进程的方法在本领域公知。这包括抗体结合测定法、ELISA、皮肤点刺试验等等。
[0669] 4.抗原
[0670] 将会理解有许多来自不同病原生物的抗原已经进行过表征，并适合用于本发明。考虑能够引发免疫应答的所有抗原，不论目前表征过与否。
[0671] 4.1结核菌抗原
[0672] 将会理解有许多结核分枝杆菌抗原已经进行过表征，并适合用于本发明。考虑能够引发免疫应答的所有结核分枝杆菌抗原，不论目前表征过与否。
[0673] 适合用于本发明的示例性结核分枝杆菌抗原包括：早期分泌抗原靶蛋白(ESAT)-6、Ag85A、Ag85B(MPT59)、Ag85B、Ag85C、MPT32、MPT51、MPT59、MPT63、MPT64、MPT83、MPB5、MPB59、MPB64、MTC28、Mtb2、Mtb8.4、Mtb9.9、Mtb32A、Mtb39、Mtb41、TB10.4、TB10C、TB11B、TB12.5、TB13A、TB14、TB15、TB15A、TB16、TB16A、TB17、TB18、TB21、TB20.6、TB24、TB27B、TB32、TB32A、TB33、TB38、TB40.8、TB51、TB54、TB64、CFP6、CFP7、CFP7A、CFP7B、CFP8A、CFP8B、CFP9、CFP10、CFP11、CFP16、CFP17、CFP19、CFP19A、CFP19B、CFP20、CFP21、CFP22、CFP22A、CFP23、CFP23A、CFP23B、CFP25、CFP25A、CFP27、CFP28、CFP28B、CFP29、CFP30A、CFP30B、CFP50、CWP32、hspX(α-晶型)、APA、结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)、ST-CF、PPE68、LppX、PstS-1、PstS-2、PstS-3、HBHA、GroEL、GroEL2、GrpES、LHP、19kDa脂蛋白、71kDa、RD1-ORF2、RD1-ORF3、RD1-ORF4、RD1-ORF5、RD1-ORF8、RD1-ORF9A、RD1-ORF9B、Rv1984c、Rv0577、Rv1827、BfrB、Tpx.Rv1352、Rv1810、PpiA、Cut2、FbpB、FbpA、FbpC、DnaK、FecB、Ssb、RplL、FixA、FixB、AhpC2、Rv2626c、Rv1211、Mdh、Rv1626、Adk、ClpP、SucD(Belisle et al，
2005；US7,037,510；US2004/0057963；US2008/0199493；US2008/0267990)，或任一上述抗原的至少一个抗原性部分或T细胞表位。
2005；US7,037,510；US2004/0057963；US2008/0199493；US2008/0267990)，或任一上述抗原的至少一个抗原性部分或T细胞表位。
[0674] 本发明考虑单个结核分枝杆菌抗原的应用。不过，也具体考虑依赖于应用两个或更多个结核分枝杆菌抗原的实施方案。
[0675] 在各种实例中，所述两个或更多个抗原作为包含两个或更多个结核分枝杆菌抗原(包括选自上述抗原的两个或更多个结核分枝杆菌抗原)的融合蛋白而生产。
[0676] 4.2肝炎病抗原
[0677] 许多肝炎病毒抗原已经进行过表征，并适合用于本发明。示例性的丙肝病毒抗原包括C-p22、E1-gp35、E2-gp70、NS1-p7、NS2-p23、NS3-p70、NS4A-p8、NS4B-p27、NS5A-p56/58和NS5B-p68，各个(无论是单独还是组合)都适合用于本发明。考虑能够引发免疫应答的所有肝炎病毒抗原，不论目前表征过与否。
[0678] 4.3流感抗原
[0679] 许多流感病毒抗原已经进行过表征，并适合用于本发明。适合用于本发明的示例性流感病毒抗原包括：PB、PB2、PA、血凝素(HA)或神经氨酸酶(NA)蛋白中任一、NP、M和NS，各个(无论是单独还是组合)都适合用于本发明。考虑能够引发免疫应答的所有流感病毒抗原，不论目前表征过与否。
[0680] 4.4炭疽菌抗原
[0681] 许多炭疽芽孢杆菌抗原已经鉴定为潜在的疫苗开发候选抗原，并可用于本发明。例如，PA83为一个这样的用于疫苗开发的抗原。目前，仅有一个FDA批准的炭疽病疫苗，称为“吸附炭疽疫苗”(AVA)或 该疫苗来源于吸附在铝佐剂上的炭疽芽孢杆菌无
荚膜株的无细胞上清液。PA是AVA中的主要免疫原。适合用于本发明的其他示例性炭疽菌抗原包括保护性抗原(PA或PA63)、LF和EF(蛋白)、聚γ-(D-谷氨酸)胶囊、孢子抗原(内孢子特异性组分)、BclA(外孢子特异性蛋白、BxpB(孢子结合蛋白)和分泌蛋白。考虑能够引发免疫应答的所有炭疽菌抗原，不论目前表征过与否。
荚膜株的无细胞上清液。PA是AVA中的主要免疫原。适合用于本发明的其他示例性炭疽菌抗原包括保护性抗原(PA或PA63)、LF和EF(蛋白)、聚γ-(D-谷氨酸)胶囊、孢子抗原(内孢子特异性组分)、BclA(外孢子特异性蛋白、BxpB(孢子结合蛋白)和分泌蛋白。考虑能够引发免疫应答的所有炭疽菌抗原，不论目前表征过与否。
[0682] 4.5土拉菌抗原
[0683] 许多土拉热弗朗西斯氏菌抗原已经鉴定为潜在的疫苗开发候选抗原，并可用于本发明。例如，AcpA和IglC为适合于疫苗开发的抗原。适合用于本发明的其他示例性土拉菌抗原包括O-抗原、CPS、外膜蛋白(例如FopA)、脂蛋白(例如Tul4)、分泌蛋白和脂多糖。考虑能够引发免疫应答的所有土拉菌抗原，不论目前表征过与否。
[0684] 4.6布鲁氏菌抗原
[0685] 许多流产布鲁氏菌抗原已经鉴定为潜在的疫苗开发候选抗原，并可用于本发明。例如，Omp16为一个这样的用于疫苗开发的抗原。适合用于本发明的其他示例性布鲁氏菌抗原包括O-抗原、脂多糖、外膜蛋白(例如Omp16)、分泌蛋白、核糖体蛋白(例如L7和L12)、细菌铁蛋白、p39(推定的周质结合蛋白)、groEL(热激蛋白)、二氧四氢喋啶合酶(lumazine synthase)、BCSP31表面蛋白、PAL16.5OM脂蛋白、过氧化氢酶、26kDa周质蛋白、3l kDa Omp31、28kDa Omp、25kDa Omp和10kDA Om脂蛋白。考虑能够引发免疫应答的所有布鲁氏菌抗原，不论目前表征过与否。
[0686] 4.7脑膜炎抗原
[0687] 许多脑膜炎奈瑟菌抗原已经鉴定为潜在的疫苗开发候选抗原，并可用于本发明。例如，Cys6、PorA、PorB、FetA和ZnuD为适合用于疫苗开发的抗原。适合用于本发明的其他示例性脑膜炎抗原包括O-抗原、H因子结合蛋白(fHbp)、TbpB、NspA、NadA、外膜蛋白、B群CPS、分泌蛋白和脂多糖。考虑能够引发免疫应答的所有脑膜炎抗原，不论目前表征过与否。
[0688] 4.8登革病毒抗原
[0689] 许多黄病毒抗原已经鉴定为潜在的疫苗开发候选抗原以治疗登革热，并可用于本发明。例如，登革病毒被膜蛋白E1-E4和膜蛋白M1-M4为适合用于疫苗开发的抗原。适合用于本发明的其他示例性登革病毒抗原包括C、preM、1、2A、2B、3、4A、4B和5。考虑能够引发免疫应答的所有登革病毒抗原，不论目前表征过与否。
[0690] 4.9埃博拉病毒抗原
[0691] 许多埃博拉病毒抗原已经鉴定为潜在的疫苗开发候选抗原以治疗埃博拉病毒感染，并可用于本发明。例如，丝状病毒科扎伊尔型埃博拉病毒和苏丹型埃博拉病毒相应的病毒体刺突糖蛋白前体抗原ZEBOV-GP和SEBOV-GP适合用于疫苗开发。适合用于本发明的其他示例性埃博拉病毒抗原包括NP、vp35、vp40、GP、vp30、vp24和L。考虑能够引发免疫应答的所有埃博拉病毒抗原，不论目前表征过与否。
[0692] 4.10西尼罗病毒抗原
[0693] 许多西尼罗病毒抗原已经鉴定为潜在的疫苗开发候选抗原以治疗感染，并可用于本发明。例如，来自西尼罗病毒(WNV)的黄病毒被膜抗原(E)是在WNV病毒体表面表达的一种无毒蛋白(WNVE)，适合用于疫苗开发。适合用于本发明的其他示例性WNV抗原包括Cp、Prm、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。考虑能够引发免疫应答的所有西尼罗病毒抗原，不论目前表征过与否。
[0694] 上文所列或所引述的抗原仅为本发明的示例而非限制。
[0695] 5.表达构建体
[0696] 产生和利用表达构建体在微生物、植物细胞或动物细胞(细胞表达系统)中或在无细胞表达系统中表达融合多肽的方法，以及含有可用于形成本发明所用聚合物微粒的表达构建体的宿主细胞在本领域公知(例如，Sambrook et al.，1987；Ausubel et al.，1987)。
[0697] 在一个实施方案中，用于本发明方法的表达构建体插入到可复制的载体中用于克隆或表达，或在另一实施方案中，整合到宿主基因组中。多种载体可公开获得。载体为例如质粒、粘粒、病毒粒子或噬菌体的形式。适当的核酸序列可通过多种方法插入到载体中。一般而言，利用本领域已知的技术将DNA插入到适当的限制性内切核酸酶位点。载体组分一般包括但不限于：一个或多个信号序列、复制原点、一个或多个可选择标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。含有一个或多个这些组分的适宜载体的构建采用本领域已知的标准连接技术。
[0698] 表达和克隆载体均含有使载体能够在一种或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列。对于多种细菌、酵母和病毒而言，此类序列是公知的。
[0699] 在一个实施方案中，表达构建体存在于高拷贝数载体之中。
[0700] 在一个实施方案中，高拷贝数载体选自那些在每个宿主细胞中以20-3000个拷贝存在的载体。
[0701] 在一个实施方案中，高拷贝数载体含有高拷贝数复制原点(ori)，例如ColE1或ColE1衍生的复制原点。例如，ColE-1衍生的复制原点可以构成pUC19复制原点。
[0702] 众多适合用于本发明载体的高拷贝数复制原点在本领域公知。这包括来自pBR322及其衍生质粒的ColE1衍生的复制原点以及其他高拷贝数复制原点，例如M13FR ori或p15A ori。2μ质粒原点适用于酵母，而多种病毒原点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用作为哺乳动物细胞的克隆载体。
[0703] 优选高拷贝数复制原点包含ColE1衍生的pUC19复制原点。
[0704] 限制性位点位于复制原点之中，从而将插入片段克隆到该限制性位点会使该原点失活，使之不能指导载体复制。或者，至少一个限制性位点位于该原点之内，从而将插入片段克隆到该限制性位点会使之仅能够支持载体以低拷贝数或单拷贝数复制。
[0705] 表达和克隆载体一般会含有选择基因，也成为可选择标记，以检测所转化的宿主细胞中该载体的存在。典型的选择基因编码(a)赋予抗生素或其他毒素例如青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素抗性的蛋白；(b)补充营养缺陷型的蛋白；或(c)供应不能够从复合培养基中获得的关键养分的蛋白，例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
[0706] 常用于植物转化的可选择标记包括赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II基因(NPT II)；赋予壮观霉素和链霉素抗性的aadA基因；用于Ignite(AgrEvo)和
Basta(Hoechst)抗性的膦丝菌素乙酰转移酶(bar基因)；以及用于潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)。
Basta(Hoechst)抗性的膦丝菌素乙酰转移酶(bar基因)；以及用于潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)。
[0707] 用于哺乳动物细胞的适宜可选择标记的例子是能够鉴定有能力摄入表达构建体的细胞的那些标记，例如DHFR或胸苷激酶。采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是如Urlaub et al.，1980所述制备和传代的DHFR活性缺陷型CHO细胞系。用于酵母的适宜选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb et al.，1979；Kingsman et al.，1979；Tschemper et al.，1980)。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变株例如ATCC No.44076或PEP4-1提供选择标记[Jones，Genetics，85：12(1977)]。
[0708] 可用于形成聚合物微粒的表达构建体优选包括启动子，其控制至少一个编码聚合物合酶、微粒形成蛋白或融合多肽的核酸表达。
[0709] 多种潜在宿主细胞所识别的启动子是公知的。适合用于原核宿主的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统[Chang et al.，1978；Goeddel et al.，1979)、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统[Goeddel，Nucleic Acids Res.，8：4057(1980)；EP36,776]、以及杂合启动子例如tac启动子[deBoer et al.，1983)。用于细菌系统的启动子还会含有Shine-Dalgarno(S.D.)序列，其与编码聚合物合酶、微粒形成蛋白或融合多肽的核酸有效连接。
[0710] 用于酵母宿主的适宜启动子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶[Hitzemanetal.，1980)或其他糖酵解酶[Hess et al.，1968；Holland，1978)的启动子，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、
3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。
3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。
[0711] 其他为诱导型启动子的酵母启动子具有以生长条件控制转录的额外优势，有醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。
[0712] 用于植物宿主细胞、包括单子叶或双子叶植物的组织或器官的适宜启动子的例子包括细胞、组织和器官特异性启动子，细胞周期特异性启动子，瞬时启动子，诱导型启动子，在大多数植物组织中有活性的组成型启动子，以及重组启动子。启动子的选择将取决于所期望的克隆多核苷酸的时间和空间表达。启动子来自宿主细胞、或来源于其他植物、病毒及植物致病性细菌和真菌的基因。本领域技术人员无需过度的劳动，就能够选择适合用于修饰和调节应用包含本发明多核苷酸序列的基因构建体的表达构建体的启动子。组成型植物启动子的例子包括CaMV 35S启动子、胭脂碱合酶启动子和章鱼碱合酶启动子、以及来自玉米的Ubi 1启动子。在特定组织中或者响应内部发育信号或外部非生物或生物胁迫而有活性的植物启动子在科研文献中有说明。示例性的启动子描述在例如WO02/00894中，在此并入作为参考。
[0713] 用于哺乳动物宿主细胞的适宜启动子的例子由病毒基因组获得的启动子，例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如2型腺病毒)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和猴病毒40(SV40)；异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子；以及热激启动子，只要此类启动子与宿主细胞系统相容即可。
[0714] 在一些实例中，通过在载体中插入增强子序列而增加高等真核细胞中表达构建体的转录。增强子为DNA的顺式作用元件，通常约10-300bp，其作用于启动子而增加其转录。目前已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)。不过一般人们会使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括位于复制原点下游(bp 100-270)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制原点下游的多瘤病毒增强子、以及腺病毒增强子。通常增强子剪接到载体中聚合物合酶、微粒形成蛋白或融合多肽编码核酸5′或3′的位置，但优选位于启动子的5′侧。
[0715] 在真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类或来自其他多细胞生物的有核细胞)中使用的表达载体还会含有终止转录以及稳定mRNA所必需的序列。此类序列常来自于真核或病毒DNA或cDNA的5’和偶尔的3’非翻译区。这些区域中含有转录为mRNA非翻译区多聚腺苷酸化区段的核苷酸区段，所述mRNA编码聚合物合酶、微粒形成蛋白或融合多肽。
[0716] 在一个实施方案中，表达构建体含有上游诱导型启动子，例如受阿拉伯糖诱导的BAD启动子。
[0717] 在一个实施方案中，表达构建体含有组成型或调控型启动子系统。
[0718] 在一个实施方案中，调控型启动子系统是诱导型或阻遏型启动子系统。
[0719] 尽管在生产重组蛋白方面期望使用强启动子，但这些启动子的调控至关重要，因为组成型过表达异源蛋白导致生长速度、质粒稳定性和培养物生存能力下降。
[0720] 许多启动子受到阻遏子与操纵子(启动子下游区域)相互作用的调控。最著名的操纵子来自lac操纵元和噬菌体A。有关大肠杆菌调控型启动子的综述见Friehs &
Reardon，1991中的表1。
Reardon，1991中的表1。
[0721] 标准细菌培养与涉及重组大肠杆菌的培养之间的一个主要差异在于生长阶段与生产阶段或诱导阶段的分隔。重组蛋白生产往往利用调控型启动子，在生长阶段(此时启动子“关闭”，宿主细胞的代谢负荷轻)实现高细胞密度生长，而后在诱导阶段(在诱导之后“开启”启动子)实现高速的异源蛋白生产。
[0722] 在一个实施方案中，调控型启动子系统选自LacI、Trp、噬菌体γ和噬菌体RNA聚合酶启动子系统。
[0723] 在一个实施方案中，启动子系统选自lac或Ptac启动子和lacI阻遏子，或trp启动子和rpR阻遏子。
[0724] 在一个实施方案中，LacI阻遏子因为添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)而失活，IPTG与活性LacI阻遏子结合导致操纵子解离从而允许表达。
[0725] 在一个实施方案中，trp启动子系统应用具有明确色氨酸浓度的合成培养基，从而当浓度降至低于阈值水平时该系统变成自身诱导型。在一个实施方案中，添加3-β-吲哚-丙烯酸而使TrpR阻遏子失活。
[0726] 在一个实施方案中，启动子系统可以利用噬菌体γ阻遏子cI。此阻遏子利用γ原噬菌体，通过与两个称为OL和OR的操纵子相互作用而阻止全体裂解基因的表达。这些操纵子分别与两个强启动子PL和PR重叠。cI阻遏子的存在阻止了RNA聚合酶的结合。cI阻遏子可通过紫外辐射或用丝裂霉素C处理细胞而失活。允许重组多肽表达的一个更为便利的方法是应用温度敏感型的cI阻遏子cI857。携带基于γ的表达系统的宿主细胞可在低温培养至对数中期，然后移至高温以诱导重组多肽的表达。
[0727] 一种广泛使用的表达系统利用噬菌体T7RNA聚合酶，其仅识别见于T7DNA的启动子而非宿主细胞启动子中存在的启动子。因此，表达构建体可以含有重组基因与之融合的一个T7启动子(通常启动子位于基因10之前)。编码T7RNA聚合酶的基因位于该表达构建体中、另一相容的表达构建体中或者整合在宿主细胞染色体之中。在所有三种情况下，基因都与允许其在表达阶段进行转录和翻译的诱导型启动子融合。
[0728] 大肠杆菌菌株BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS(Invitrogen，CA)为携带T7RNA聚合酶基因的宿主细胞的例子(有一些非常适合的可商购的大肠杆菌菌株含有T7RNA聚合酶基因，例如KRX and XJ(自溶性))。其他携带T7RNA聚合酶基因的细胞株在本领域已知，例如T7RNA聚合酶基因整合在其基因组中的铜绿假单胞菌ADD1976(Brunschwig & Darzins，1992)，以及T7RNA聚合酶基因整合在其基因组中在phaP启动子控制之下的钩虫贪铜菌
((Cupriavidus necator)(从前称作真养雷尔氏菌)(Barnard et al.，2004)。
((Cupriavidus necator)(从前称作真养雷尔氏菌)(Barnard et al.，2004)。
[0729] T7RNA聚合酶与宿主细胞酶相比具有3个优点：第一其仅由一个亚单位组成，第二其发挥更高的处理性能，第三其对利福平不敏感。后一个特征可特别地通过在诱导编码T7RNA聚合酶的基因之后大约10分钟添加此抗生素来增强融合蛋白的含量。在那时候，已经合成了足够的聚合酶，从而允许融合蛋白高水平表达，并抑制宿主细胞酶，防止质粒以及染色体上的所有其他基因进一步表达。抑制细菌RNA聚合酶而非T7RNA聚合酶的其他抗生素在本领域已知，例如链霉溶菌素和曲张链菌素。
[0730] 由于所有的启动子系统都有渗漏表达，编码T7RNA聚合酶的基因低水平表达在重组多肽编码毒性蛋白的情况下对细胞可能是有害的。在生长阶段存在的这些聚合酶分子可通过表达T7编码的溶菌酶基因来进行抑制。该溶菌酶为双功能蛋白，切割宿主细胞细胞壁中的链键，并通过与T7RNA聚合酶结合而选择性抑制T7RNA聚合酶，这是一种确保T7感染期间可控的转录爆发的反馈机制。大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS是携带组成型表达T7溶菌酶的质粒的宿主细胞的一个例子。
[0731] 在一个实施方案中，启动子系统利用诸如API或APR等启动子，它们通过温度变化而被诱导或“开启”以起始诱导周期，例如通过将温度由30-37℃升高到42℃来起始诱导周期。
[0732] 强启动子可以在体内生产期间增强微粒表面的融合多肽密度。
[0733] 优选的融合多肽包含：
[0734] 聚合物合酶，和包含如下的融合配偶体：
[0735] (i)至少一个能够引发免疫应答的抗原，或
[0736] (ii)与至少一个能够引发免疫应答的抗原能够结合的结合结构域，或
[0737] (iii)(i)和(ii)兼而有之。
[0738] 用于本文的编码(i)和(ii)两者的核酸序列包含编码聚合物合酶的核酸和编码能够引发细胞介导的免疫应答的抗原的核酸，或者包含编码聚合物合酶的核酸序列和编码与能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的核酸。一经表达，融合多肽即能够形成或促进形成聚合物微粒。
[0739] 在一个实施方案中，编码至少一个聚合物合酶的核酸序列通过期望长度的多核苷酸结构或间隔臂序列，与编码微粒形成蛋白的核酸序列和编码能够引发细胞介导的免疫应答的抗原的核酸，或与编码微粒形成蛋白优选聚合物合酶的核酸和编码与能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的核酸间接融合。
[0740] 在一个实施方案中，编码至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原或与至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的融合多肽的氨基酸序列，与包含聚合物合酶的氨基酸序列的C-末端邻接。
[0741] 在一个实施方案中，包含至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原或与能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的融合多肽的氨基酸序列，通过期望长度的促进融合多肽独立折叠的肽接头或间隔臂，与包含聚合物合酶片段的氨基酸序列的N-末端间接融合。
[0742] 在一个实施方案中，编码至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原或与能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的融合多肽的氨基酸序列，与包含微粒形成蛋白、优选聚合物合酶或C-末端合酶片段的氨基酸序列的N-末端邻接。
[0743] 在一个实施方案中，编码至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原或与能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的融合多肽的氨基酸序列，通过期望长度的促进融合多肽独立折叠的肽接头或间隔臂，与包含微粒形成蛋白、优选聚合物合酶或N-末端聚合物合酶片段的氨基酸序列的C-末端间接融合。
[0744] 在一个实施方案中，编码至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原或与至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的融合多肽的氨基酸序列，与编码解聚酶或C-末端解聚酶片段的氨基酸序列的N-末端邻接。
[0745] 在涉及结核病治疗或预防的不同实施方案中，示例性的融合多肽包含：
[0746] 聚合物合酶，和包含如下的融合配偶体：
[0747] (i)至少一个结核分枝杆菌抗原，或
[0748] (ii)与至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域，或
[0749] (iii)(i)和(ii)兼而有之。
[0750] 用于本文的编码(i)和(ii)两者的核酸序列包含编码聚合物合酶的核酸和编码结核分枝杆菌抗原的核酸，或者包含编码聚合物合酶的核酸序列和编码结核分枝杆菌抗原结合结构域的核酸。一经表达，融合多肽即能够形成或促进形成聚合物微粒。
[0751] 在一个实施方案中，编码至少一个聚合物合酶的核酸序列通过期望长度的多核苷酸结构或间隔臂序列，与编码微粒形成蛋白的核酸序列和编码结核分枝杆菌抗原的核酸，或与编码微粒形成蛋白的核酸和编码结核分枝杆菌抗原结合结构域的核酸间接融合。
[0752] 在一个实施方案中，编码至少一个结核分枝杆菌抗原或至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域的融合多肽的氨基酸序列，与包含聚合物合酶的氨基酸序列的C-末端邻接。
[0753] 在一个实施方案中，包含至少一个结核分枝杆菌抗原或至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域的融合多肽的氨基酸序列，通过期望长度的促进融合多肽独立折叠的肽接头或间隔臂，与包含聚合物合酶片段的氨基酸序列的N-末端间接融合。
[0754] 在一个实施方案中，编码至少一个结核分枝杆菌抗原或至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域的融合多肽的氨基酸序列，与包含微粒形成蛋白或C-末端合酶片段的氨基酸序列的N-末端邻接。
[0755] 在一个实施方案中，编码至少一个结核分枝杆菌抗原或至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域的融合多肽的氨基酸序列，通过期望长度的促进融合多肽独立折叠的肽接头或间隔臂，与包含微粒形成蛋白或N-末端聚合物合酶片段的氨基酸序列的C-末端间接融合。
[0756] 在一个实施方案中，编码至少一个结核分枝杆菌抗原或至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域的融合多肽的氨基酸序列，与编码解聚酶或C-末端解聚酶片段的氨基酸序列的N-末端邻接。
[0757] 在涉及肝炎治疗或预防的不同实施方案中，示例性的融合多肽包含：
[0758] 聚合物合酶，和包含如下的融合配偶体：
[0759] (i)至少一个肝炎病毒抗原，或
[0760] (ii)与至少一个肝炎病毒抗原结合结构域，或
[0761] (iii)(i)和(ii)兼而有之。
[0762] 用于本文的编码(i)和(ii)两者的核酸序列包含编码聚合物合酶的核酸和编码肝炎病毒抗原的核酸，或者包含编码聚合物合酶的核酸序列和编码肝炎病毒抗原结合结构域的核酸。一经表达，融合多肽即能够形成或促进形成聚合物微粒。
[0763] 在一个实施方案中，编码至少一个聚合物合酶的核酸序列通过期望长度的多核苷酸结构或间隔臂序列，与编码微粒形成蛋白的核酸序列和编码肝炎病毒抗原的核酸，或与编码微粒形成蛋白的核酸和编码肝炎病毒抗原结合结构域的核酸间接融合。
[0764] 在一个实施方案中，编码至少一个肝炎病毒抗原或至少一个肝炎病毒抗原结合结构域的融合多肽的氨基酸序列，与包含聚合物合酶的氨基酸序列的C-末端邻接。
[0765] 在一个实施方案中，包含至少一个肝炎病毒抗原或至少一个肝炎病毒抗原结合结构域的融合多肽的氨基酸序列，通过期望长度的促进融合多肽独立折叠的肽接头或间隔臂，与包含聚合物合酶片段的氨基酸序列的N-末端间接融合。
[0766] 在一个实施方案中，编码至少一个肝炎病毒抗原或至少一个肝炎病毒抗原结合结构域的融合多肽的氨基酸序列，与包含微粒形成蛋白或C-末端合酶片段的氨基酸序列的N-末端邻接。
[0767] 在一个实施方案中，编码至少一个肝炎病毒抗原或至少一个肝炎病毒抗原结合结构域的融合多肽的氨基酸序列，通过期望长度的促进融合多肽独立折叠的肽接头或间隔臂，与包含微粒形成蛋白或N-末端聚合物合酶片段的氨基酸序列的C-末端间接融合。
[0768] 在一个实施方案中，编码至少一个肝炎病毒抗原或至少一个肝炎病毒抗原结合结构域的融合多肽的氨基酸序列，与编码解聚酶或C-末端解聚酶片段的氨基酸序列的N-末端邻接。
[0769] 在涉及流感治疗或预防的不同实施方案中，示例性的融合多肽包含：
[0770] 聚合物合酶，和包含如下的融合配偶体：
[0771] (i)至少一个流感病毒抗原，或
[0772] (ii)与至少一个流感病毒抗原结合结构域，或
[0773] (iii)(i)和(ii)兼而有之。
[0774] 用于本文的编码(i)和(ii)两者的核酸序列包含编码聚合物合酶的核酸和编码流感病毒抗原的核酸，或者包含编码聚合物合酶的核酸序列和编码流感病毒抗原结合结构域的核酸。一经表达，融合多肽即能够形成或促进形成聚合物微粒。
[0775] 在一个实施方案中，编码至少一个聚合物合酶的核酸序列通过期望长度的多核苷酸结构或间隔臂序列，与编码微粒形成蛋白的核酸序列和编码流感病毒抗原的核酸，或与编码微粒形成蛋白的核酸和编码流感病毒抗原结合结构域的核酸间接融合。
[0776] 在一个实施方案中，编码至少一个流感病毒抗原或至少一个流感病毒抗原结合结构域的融合多肽的氨基酸序列，与包含聚合物合酶的氨基酸序列的C-末端邻接。
[0777] 在一个实施方案中，包含至少一个流感病毒抗原或至少一个流感病毒抗原结合结构域的融合多肽的氨基酸序列，通过期望长度的促进融合多肽独立折叠的肽接头或间隔臂，与包含聚合物合酶片段的氨基酸序列的N-末端间接融合。
[0778] 在一个实施方案中，编码至少一个流感病毒抗原或至少一个流感病毒抗原结合结构域的融合多肽的氨基酸序列，与包含微粒形成蛋白或C-末端合酶片段的氨基酸序列的N-末端邻接。
[0779] 在一个实施方案中，编码至少一个流感病毒抗原或至少一个流感病毒抗原结合结构域的融合多肽的氨基酸序列，通过期望长度的促进融合多肽独立折叠的肽接头或间隔臂，与包含微粒形成蛋白或N-末端聚合物合酶片段的氨基酸序列的C-末端间接融合。
[0780] 在一个实施方案中，编码至少一个流感病毒抗原或至少一个流感病毒抗原结合结构域的融合多肽的氨基酸序列，与编码解聚酶或C-末端解聚酶片段的氨基酸序列的N-末端邻接。
[0781] 根据本发明融合多肽的一个优点在于，修饰与聚合物微粒表面结合的蛋白并不影响参与聚合物微粒形成的蛋白的功能。例如，聚合物合酶的功能在重组多肽与其N-末端融合时得以保留，从而导致在微粒表面产生重组多肽。如果蛋白的功能性还是因为融合而削弱，那么这个缺点可通过行使相同功能并以活性状态存在的其他微粒形成蛋白来弥补。
[0782] 这样就可以确保聚合物微粒上结合的重组多肽借助于微粒形成蛋白进行稳定键合。
[0783] 应理解，融合多肽中蛋白的排布顺序取决于质粒中所含核酸的基因序列的次序。
[0784] 例如，可能期望产生这样的融合多肽，其中能够引发细胞介导的免疫应答的抗原或与至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域与聚合物合酶间接融合。术语“间接融合”是指这样的融合多肽，其所包含的微粒形成蛋白优选聚合物合酶，和至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原或与至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域，通过可以是期望在融合多肽中表达的任何蛋白的附加蛋白分隔开。
[0785] 在述及结核病治疗情形下的微粒时，可能期望产生这样的融合多肽，其中结核分枝杆菌抗原或至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域与聚合物合酶间接融合。与此类似，在述及肝炎或流感治疗的情形时，可能期望产生这样的融合多肽，其中肝炎病毒抗原或流感病毒抗原或至少一个肝炎病毒抗原结合结构域或至少一个流感病毒抗原结合结构域与聚合物合酶间接融合。术语“间接融合”是指这样的融合多肽，其所包含的微粒形成蛋白和至少一个结核分枝杆菌抗原或至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域，通过可以是期望在融合多肽中表达的任何蛋白的附加蛋白分隔开。与此类似，该术语可以指这样的融合多肽，其所包含的微粒形成蛋白和至少一个肝炎病毒抗原或至少一个肝炎病毒抗原结合结构域，通过可以是期望在融合多肽中表达的任何蛋白的附加蛋白分隔开。或者，该术语可以指这样的融合多肽，其所包含的微粒形成蛋白和至少一个流感病毒抗原或至少一个流感病毒抗原结合结构域，通过可以是期望在融合多肽中表达的任何蛋白的附加蛋白分隔开。
[0786] 在一个实施方案中，附加蛋白选自微粒形成蛋白、或融合多肽、或促进融合多肽独立折叠的接头或间隔臂，如上文所讨论的那样。在该实施方案中，将有必要对质粒中的基因序列进行排序，以反映期望排列的融合多肽。
[0787] 在一个实施方案中，能够引发细胞介导的免疫应答的抗原或与至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域可与聚合物合酶直接融合。术语“直接融合”在本文用来表示两个或更多个肽借助于肽键相连。
[0788] 例如，在涉及结核病治疗或预防的不同实施方案中，结核分枝杆菌抗原或至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域可与聚合物合酶直接融合。
[0789] 术语“直接融合”在本文用来表示两个或更多个肽借助于肽键相连。
[0790] 在涉及肝炎治疗或预防的不同实施方案中，肝炎病毒抗原或至少一个肝炎病毒抗原结合结构域可与聚合物合酶直接融合。
[0791] 在涉及肝炎治疗或预防的不同实施方案中，流感病毒抗原或至少一个流感病毒抗原结合结构域可与聚合物合酶直接融合。
[0792] 术语“直接融合”在本文用来表示两个或更多个肽借助于肽键相连。
[0793] 也可以形成这样的微粒，其中微粒包含至少两个与聚合物微粒结合的截然不同的融合多肽。例如，可以结合聚合物微粒的第一融合多肽包含与聚合物合酶融合的、能够引发细胞介导的免疫应答的抗原或与至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域。在述及结核病治疗的情形时，微粒包含可以结合聚合物微粒的第一融合多肽，所述融合多肽包含例如与聚合物合酶融合的结核分枝杆菌抗原或至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域。在述及肝炎治疗的情形时，微粒包含可以结合聚合物微粒的第一融合多肽，所述融合多肽包含例如与聚合物合酶融合的肝炎病毒抗原或至少一个肝炎病毒抗原结合结构域。在述及流感治疗的情形时，微粒包含可以结合聚合物微粒的第一融合多肽，所述融合多肽包含例如与聚合物合酶融合的流感病毒抗原或至少一个流感病毒抗原结合结构域。
[0794] 在一个实施方案中，表达构建体在体内表达。优选表达构建体是在微生物优选大肠杆菌中表达的质粒。
[0795] 在一个实施方案中，表达构建体在体外表达。优选表达构建体利用无细胞表达系统在体外表达。
[0796] 在一个实施方案中，一个或多个基因可以插入在单个表达构建体中，或一个或多个基因可以整合到宿主细胞基因组中。在所有情况下，都可以通过如上文所述的启动子来控制表达。
[0797] 在一个实施方案中，表达构建体还编码至少一个附加融合多肽，所述附加融合多肽包含能够引发细胞介导的免疫应答的抗原或与能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域和微粒形成蛋白，优选聚合物合酶，如上文所讨论的那样。
[0798] 在一个实施方案中，表达构建体还编码至少一个附加融合多肽，所述附加融合多肽包含结核分枝杆菌抗原或至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域和微粒形成蛋白，如上文所讨论的那样。
[0799] 在一个实施方案中，表达构建体还编码至少一个附加融合多肽，所述附加融合多肽包含肝炎病毒抗原或至少一个肝炎病毒抗原结合结构域和微粒形成蛋白，如上文所讨论的那样。
[0800] 在一个实施方案中，表达构建体还编码至少一个附加融合多肽，所述附加融合多肽包含流感病毒抗原或至少一个流感病毒抗原结合结构域和微粒形成蛋白，如上文所讨论的那样。
[0801] 可用于本文的质粒在实施例中显示，并在公开号为WO2004/020623(Bernd Rehm)的PCT/DE2003/002799和公开号为WO2007/037706(Bernd Rehm)的PCT/NZ2006/000251中详细说明，分别整体并入作为参考。
[0802] 将会理解，能够引发细胞介导的免疫应答的抗原的结合结构域，能够结合至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原，例如受试者体内存在的能够引发细胞介导的免疫应答的抗原，其中对该受试者给药了与能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域、或者欲对该受试者引发免疫应答。
[0803] 在结核病治疗的情形下，将会理解结核分枝杆菌抗原结合结构域能够结合至少一个结核分枝杆菌抗原，例如受试者体内存在的结核分枝杆菌抗原，其中对该受试者给药了结核分枝杆菌抗原结合结构域、或者欲对该受试者引发免疫应答。与此类似，在肝炎治疗的情形下，将会理解肝炎病毒抗原结合结构域能够结合至少一个肝炎病毒抗原，例如受试者体内存在的肝炎病毒抗原，其中对该受试者给药了肝炎病毒抗原结合结构域、或者欲对该受试者引发免疫应答。在流感治疗的情形下，将会理解流感病毒抗原结合结构域能够结合至少一个流感病毒抗原，例如受试者体内存在的流感病毒抗原，其中对该受试者给药了流感病毒抗原结合结构域、或者欲对该受试者引发免疫应答。
[0804] 6.用于微粒生产的宿主
[0805] 本发明的微粒便利地利用如本文所述的一个或多个表达构建体在宿主细胞中生产。本发明的聚合物微粒可通过使宿主细胞表达所述表达构建体而生产。这可通过首先将表达构建体引入宿主细胞或宿主细胞的先祖细胞中而实现，例如通过用表达构建体转化或转染宿主细胞或宿主细胞的先祖细胞，或以其他方式确保表达构建体存在于宿主细胞之中。
[0806] 转化之后，在适合于表达构建体中的融合多肽表达和聚合物微粒形成的条件下维持转化的宿主细胞。如本领域已知的那样，此类条件包括适合于所选择的表达构建体例如质粒在适宜生物体中表达的那些条件。例如，特别是期望高产量或过表达的情况下，在培养基中提供允许融合多肽的微粒形成蛋白组分形成聚合物微粒的适宜底物。
[0807] 从而，本发明提供了生产聚合物微粒的方法，所述方法包括：
[0808] 提供含有至少一个表达构建体的宿主细胞，所述表达构建体包含：
[0809] 至少一个编码微粒形成蛋白、优选聚合物合酶的核酸序列；和
[0810] 至少一个编码能够引发细胞介导的免疫应答的抗原或与能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的核酸序列；
[0811] 在适合于表达构建体表达和聚合物微粒形成的条件下维持所述宿主细胞；和
[0812] 从宿主细胞中分离聚合物微粒。
[0813] 在一个实施方案中，发明提供了生产聚合物微粒的方法，所述方法包括：
[0814] 提供含有至少一个表达构建体的宿主细胞，所述表达构建体包含：
[0815] 至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列；和
[0816] 至少一个编码例如结核分枝杆菌抗原或结核分枝杆菌抗原结合结构域的核酸序列；
[0817] 在适合于表达表达构建体和聚合物合酶形成聚合物微粒的条件下维持所述宿主细胞；和
[0818] 从宿主细胞中分离聚合物微粒以制备包含聚合物微粒的组合物。
[0819] 在一个实施方案中，发明提供了生产聚合物微粒的方法，所述方法包括：
[0820] 提供含有至少一个表达构建体的宿主细胞，所述表达构建体包含：
[0821] 至少一个编码微粒形成蛋白的核酸序列；和
[0822] 至少一个编码肝炎病毒抗原或肝炎病毒抗原结合结构域或者流感病毒抗原或流感病毒抗原结合结构域的核酸序列；
[0823] 在适合于表达表达构建体和聚合物合酶形成聚合物微粒的条件下维持所述宿主细胞；和
[0824] 从宿主细胞中分离聚合物微粒以制备包含聚合物微粒的组合物。
[0825] 优选宿主细胞为例如细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或动物细胞，优选分离的或非人类宿主细胞。在谨记本文讨论的考虑事项之后，生产重组聚合物微粒的本领域公知方法(例如Sambrook et al.，1987；Ausubel et al.，1987)中可用的宿主细胞往往适合用于本发明的方法。
[0826] 适宜的原核宿主细胞包括例如：真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)如大肠杆菌。多种大肠杆菌菌株可公开获得，例如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC31,446)；大肠杆菌X1776(ATCC31,537)；大肠杆菌菌株W3110(ATCC27,325)和K5772(ATCC53,635)。其他适宜的原核宿主细胞包括其他肠杆菌科成员，例如埃希氏菌(Escherichia spp.)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属例如伤寒沙门氏菌、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)和志贺氏菌属，以及芽孢杆菌属例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、假单胞菌属例如铜绿假单胞菌、及放线菌(Actinomycetes)例如链霉菌属(Streptomyces)、红球菌属、棒状杆菌属(Corynebacterium)和分枝杆菌属(Mycobaterium)。
[0827] 例如，在一些实施方案中，可以使用大肠杆菌菌株W3110，因为它是重组DNA产物发酵中常见的宿主菌株。优选宿主细胞分泌最小量的蛋白水解酶。例如，可以修饰菌株W3110以实现编码宿主内源蛋白质的基因的遗传突变，此类宿主的实例包括大肠杆菌W3110菌株1A2，其具有完整的tonA基因型；大肠杆菌W3110菌株9E4，其具有完整的tonA ptr3基因型；大肠杆菌W3110菌株27C7(ATCC 55,244)，其具有完整的tonA ptr3phoAE15(argF-lac)169degPompT kanr基因型；大肠杆菌W3110菌株37D6，其具有完整的tonA ptr3phoAE15(argF-lac)169 degP ompT rbs7ilvG kanr基因型；大肠杆菌W3110菌株40B4，其为具有非卡那霉素抗性degP缺失突变的菌株37D6。
[0828] 例如，在一些优选的实施方案中，可以使用不产生脂多糖内毒素的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌株。乳酸乳球菌菌株的例子包括MG1363和乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subspecies cremoris)NZ9000。
[0829] 例如，除了原核生物，真核细胞微生物例如丝状真菌或酵母也是用于本发明方法的适宜的克隆和表达宿主。例子包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，一
种常用的低等真核宿主微生物。其他例子包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces
pombe)(Beach and Nurse，1981；EP139,383)、克 鲁 维 酵 母 属 (Kluyveromyces) 宿主(美国专利No.4,943,529；Fleer et al.，1991)例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)
(MW98-8C、CBS683、CBS4574；Louvencourt et al.，1983)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC16,045)、维克汉姆克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC24,178)、瓦尔特克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906；Van den Berg et al，1990)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)
(EP402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP183,070；Sreekrishna et al.，
1988)；假丝酵母属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(Case et al.，1979)；许旺酵母属(Schwanniomyces)例如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)(EP394,538，1990年10月31日公开)；以及
丝状真菌例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)(WO91/00357，1991年1月10日公开)，以黑曲霉属(Aspergillus)宿主例如构巢曲霉
(A.nidulans)(Ballance et al.，1983；Tilburn et al.，1983；Yelton et al.，1984)和黑曲霉(A.niger)(Kelly and Hynes，1985)。甲基营养酵母适用于本文，包括选自以下属的能够在甲醇上生长的酵母：汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属、克勒克酵母属(Kloeckera)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)、和红酵母属(Rhodotorula)。作为此类酵母例子的具体物种清单可见于Anthony，1982。
种常用的低等真核宿主微生物。其他例子包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces
pombe)(Beach and Nurse，1981；EP139,383)、克 鲁 维 酵 母 属 (Kluyveromyces) 宿主(美国专利No.4,943,529；Fleer et al.，1991)例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)
(MW98-8C、CBS683、CBS4574；Louvencourt et al.，1983)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC16,045)、维克汉姆克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC24,178)、瓦尔特克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906；Van den Berg et al，1990)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)
(EP402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP183,070；Sreekrishna et al.，
1988)；假丝酵母属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(Case et al.，1979)；许旺酵母属(Schwanniomyces)例如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)(EP394,538，1990年10月31日公开)；以及
丝状真菌例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)(WO91/00357，1991年1月10日公开)，以黑曲霉属(Aspergillus)宿主例如构巢曲霉
(A.nidulans)(Ballance et al.，1983；Tilburn et al.，1983；Yelton et al.，1984)和黑曲霉(A.niger)(Kelly and Hynes，1985)。甲基营养酵母适用于本文，包括选自以下属的能够在甲醇上生长的酵母：汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属、克勒克酵母属(Kloeckera)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)、和红酵母属(Rhodotorula)。作为此类酵母例子的具体物种清单可见于Anthony，1982。
[0830] 无脊椎宿主细胞的实例包括昆虫细胞，例如果蝇(Drosophila)S2和灰翅夜蛾(Spodoptera)Sf9；以及植物细胞，例如棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的细胞培养物。已经鉴定了众多杆状病毒和变体以及对应的来自例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)等宿主的
许可性昆虫宿主细胞。多种用于转染的病毒株可公开获得，例如苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica NPV)L-1变体和家蚕核多角体病毒NPV的Bm-5株，并且此类病毒可用作为本文本发明的病毒，特别是用来转染草地贪夜蛾细胞。
许可性昆虫宿主细胞。多种用于转染的病毒株可公开获得，例如苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica NPV)L-1变体和家蚕核多角体病毒NPV的Bm-5株，并且此类病毒可用作为本文本发明的病毒，特别是用来转染草地贪夜蛾细胞。
[0831] 可用的哺乳动物细胞系的例子有SV40转化的CV1猴肾细胞系(COS-7，ATCCCRL 1651)；人胚肾细胞系(293或经亚克隆进行悬浮培养的293细胞，Graham et al.，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞系(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub et al.，1980)；小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather，1980)；猴肾细胞(CV
1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCCCRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺癌细胞(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather et al.，1982)；MRC 5细胞；FS4细胞；以及肝癌细胞系(Hep G2)。
1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCCCRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺癌细胞(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather et al.，1982)；MRC 5细胞；FS4细胞；以及肝癌细胞系(Hep G2)。
[0832] 例如，在能够引发细胞介导的免疫应答的抗原或者与能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域、或者结核分枝杆菌抗原或结核分枝杆菌抗原结合结构域、或者肝炎病毒抗原或肝炎病毒抗原结合结构域、或者流感病毒抗原或流感病毒抗原结合结构域需要一种或多种翻译后修饰例如糖基化作用的情况下，将优选真核生物细胞系，特别是哺乳动物细胞系。例如，一个或多个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原可能需要翻译后修饰而具有免疫原性或更优化的免疫原性，因此可以在能进行此类翻译后修饰的表达宿主中有效地表达。
[0833] 在一个实施方案中，宿主细胞是具有氧化性胞浆的细胞，例如大肠杆菌Origami菌株(Novagen)。
[0834] 在另一实施方案中，宿主细胞是具有还原性胞浆的细胞，优选大肠杆菌。
[0835] 例如，宿主细胞可以选自以下的属：雷尔氏菌属、产碱菌属、假单胞菌属和盐二型菌属(Halobiforma)。例如，优选所使用的微生物选自下组：真养雷尔氏菌、肥大产碱菌、大肠杆菌、脆假单胞菌Pseudomonas fragi)、恶臭假单胞菌、食油假单胞菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌和盐二型菌(Halobiforma haloterrestris)。该组既包括天然地能够生产生物相容性生物可降解微粒的微生物，又包括比如像大肠杆菌等由于其基因组成不能如此的微生物。如上文所述而引入为使后者所述微生物能够生产微粒所需的基因。
[0836] 极端嗜盐古细菌生产的聚合物微粒具有更低水平的蛋白非特异性结合，使得从这些细胞中分离和纯化微粒更为容易。
[0837] 原则上，任何可培养的宿主细胞均可通过上述方法用来生产聚合物微粒，即便是宿主细胞由于不同的代谢而不能够产生形成聚合物微粒所需的底物。在这样的情况下，向培养基中添加必要的底物，而后由已经引入细胞的基因所表达的蛋白将其转化成聚合物微粒。
[0838] 用来使后者所述宿主细胞能够生产聚合物微粒的基因包括例如硫解酶、还原酶或聚合物合酶，例如来自真养雷尔氏菌的phaA硫解酶、phaB酮脂酰还原酶或phaC合酶。需要哪些基因来补充宿主细胞聚合物微粒形成所缺少的那些将取决于宿主细胞的基因组成以及培养基中所提供的底物。
[0839] 参与形成聚羟基烷酸酯(PHA)微粒的基因和蛋白，以及有关微粒形成的总体考虑事项在Madison，et al，1999；公开的PCT国际申请WO2004/020623(Bernd Rehm)；和Rehm，2003；Brockelbank JA.et al.，2006；Peters and Rehm，2006； et al，(2006)
以及Rehm(2006)中报道，全都并入本文作为参考。
以及Rehm(2006)中报道，全都并入本文作为参考。
[0840] 单独的聚合物合酶可在任何以(R)-羟基酰基-CoA或其他CoA硫酯或其衍生物为底物的宿主细胞中使用。
[0841] 聚合物微粒也可以在体外形成。例如，优选使用无细胞表达系统。在这样的系统中提供聚合物合酶。优选纯化的聚合物合酶，例如可通过重组生产获得的，或在能够进行蛋白翻译的无细胞系统中获得的，可通过引入编码编码聚合物合酶的表达构建体而由无细胞系统自身获得的聚合物合酶。为了产生允许微粒体外形成的环境，培养基中应当包括聚合物微粒形成所必需的底物。
[0842] 聚合物合酶可利用例如(R)-羟基酰基-CoA或其他CoA硫酯作为底物而用于在体内生产功能化聚合物微粒。
[0843] 在进行体外聚合物微粒生产之前，融合多肽可利用细胞分选仪、离心、过滤或亲和层析而从裂解的细胞中纯化。
[0844] 体外聚合物微粒形成能够优化控制表面组成，包括融合多肽覆盖水平、磷脂组成等等。
[0845] 应理解，聚合物微粒的特征可以通过控制生产聚合物微粒的条件加以影响或控制。例如，这可以包括宿主细胞的基因组成，例如生产大颗粒的细胞分裂突变体，如Peters and Rehm，2005中所述。还有维持宿主细胞的条件，例如温度，底物的存在，一个或多个微粒形成蛋白例如微粒大小决定蛋白的存在，聚合物调控蛋白的存在，等等。
[0846] 在一个实施方案中，聚合物微粒一个期望的特征是持久性。术语“持久性”是指聚合物微粒在选定的环境中抗降解的能力。聚合物微粒另一个期望的特征是其通过聚合物合酶或微粒形成蛋白形成，并在微粒组装期间结合于聚合物合酶或微粒形成蛋白的C-或N-末端。
[0847] 在本发明的一些实施方案中，期望在宿主细胞中实现表达构建体的过表达。特定表达构建体的过表达机制在本领域公知，并取决于构建体自身、待表达它的宿主、以及其他因素，包括期望或需要的过表达程度。例如，可通过如下方式实现过表达：i)利用强启动子，例如在原核宿主中利用T7RNA聚合酶启动子系统；ii)利用高拷贝数质粒，例如含有colE1复制原点的质粒；或iii)稳定信使RNA，例如通过应用融合序列进行；或iv)通过例如优化密码子使用、核糖体结合位点或终止位点等来优化翻译。过表达的益处允许在期望时生产较小的微粒以及生产更高数目的聚合物微粒。
[0848] 形成聚合物微粒的聚合物的组成可以影响聚合物微粒的机械或理化性能。例如聚合物组成有别的聚合物微粒可能半寿期不同，或者可能以不同的速率释放生物活性物质，特别是药物活性成分。例如，由C6-C143-羟基脂肪酸组成的聚合物微粒由于该聚合物的低结晶度而呈现出较高的聚合物降解速度。增加聚合物骨架上侧链相对大的聚合物组份的分子比，通常会降低结晶度，产生更为突出的弹性性能。通过控制按照本发明所述方法中的聚合物组成，可相应地影响聚合物微粒的生物可降解性，从而影响聚合物微粒(以及存在情况下微粒上的一个或多个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原或者能够引发细胞介导的免疫应答的抗原的结合结构域、或者微粒上的一个或多个结核分枝杆菌抗原或结核分枝杆菌抗原结合结构域、或者肝炎病毒抗原或肝炎病毒抗原结合结构域、或者流感病毒抗原或流感病毒抗原结合结构域)在例如给药受试者体内的持续时间，或影响聚合物微粒上或聚合物微粒中存在的生物活性物质特别是药物活性剂或护肤成分的释放速率。
[0849] 优选在培养基中引入至少一种具有功能性侧基的脂肪酸作为形成聚合物微粒的底物，其中特别优选引入至少一种羟基脂肪酸和/或至少一种巯基脂肪酸和/或至少一种β-氨基脂肪酸。“具有功能性侧基的脂肪酸”应理解为表示饱和或不饱和的脂肪酸。这也包括含有选自下组的功能性侧基的脂肪酸：甲基、烷基、羟基、苯基、巯基、伯胺基、仲胺基和叔胺基、醛基、酮基、醚基、羰基、O-酯基、硫酯基、羧酸酰胺基、半缩醛基、缩醛基、磷酸单酯基团和磷酸双酯基团。底物的使用根据聚合物微粒期望的组成和期望的性能来决定。
[0850] 底物或底物混合物可以含有至少一种任选取代的氨基酸、乳酸盐、酯或者饱和或不饱和的脂肪酸，优选酰基-CoA。
[0851] 在一个实施方案中，底物混合物中提供佐剂、免疫调节因子或分子，例如免疫刺激因子或分子、或可用于制备疫苗的其他化合物，从而在聚合物微粒形成期间掺入到聚合物微粒之中，或扩散到聚合物微粒之中。
[0852] 聚合物微粒可以包含选自例如聚β-氨基酸、聚乳酸、聚硫酯和聚酯的聚合物。最优选聚合物包含聚羟基烷酸酯(PHA)，优选聚(3-羟基丁酸酯)(PHB)。
[0853] 聚合物合酶或聚合物微粒包含由磷脂单层包裹的聚合物微粒。优选所述微粒形成蛋白横跨所述脂单层。
[0854] 聚合物合酶或微粒形成蛋白优选与聚合物微粒结合、或与磷脂单层结合、或与两者均结合。
[0855] 微粒形成蛋白优选与其所形成的聚合物微粒共价或非共价结合。
[0856] 优选聚合物微粒至少约1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的表面积覆盖有融合多肽。
[0857] 在某些情况下，可能期望控制本发明方法所产生的微粒的大小，以例如产生特别适合给定应用的微粒。例如，可能期望产生相对大的包含一个或多个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原的聚合物微粒，以例如引发强大的细胞介导的免疫应答。例如，在用于治疗结核病的微粒情况下，可能期望产生相对大的包含一个或多个结核分枝杆菌抗原的聚合物微粒，以例如引发强大的细胞介导的免疫应答。类似的情形可适用于肝炎或流感的治疗，可能期望产生相对大的包含一个或多个肝炎病毒抗原或一个或多个流感病毒抗原的聚合物微粒，以例如引发强大的细胞介导的免疫应答。控制聚合物微粒大小的方法在公开号为WO2004/020623的PCT/DE2003/002799和公开号为WO2007/037706的PCT/NZ2006/000251中有说明。
[0858] 例如，在一些实施方案中，微粒大小通过控制微粒形成蛋白的表达、或如果存在的话通过控制微粒大小决定蛋白的表达进行控制。
[0859] 例如，在本发明的其他实施方案中，微粒大小控制可通过控制底物的可利用性、例如培养基中底物的可利用性来实现。在某些实例中，按足以控制聚合物微粒大小的量向培养基中添加底物。
[0860] 应理解可以组合应用此类方法，从而可以对微粒大小实现更为有效的控制。
[0861] 例如，在不同的实施方案中，可以控制微粒大小以产生粒径约10nm至3μm、优选约10nm至约900nm、约10nm至约800nm、约10nm至约700nm、约10nm至约600nm、约10nm至约500nm、约10nm至约400nm、约10nm至约300nm、约10nm至约200nm、特别优选约10nm至约100nm的微粒。
[0862] 例如，在其他实施方案中，可以控制微粒大小以产生粒径约10nm至约90nm、约10nm至约80nm、约10nm至约70nm、约10nm至约60nm、约10nm至约50nm、约10nm至约40nm、约10nm至约30nm、或约10nm至约20nm的微粒。
[0863] 具体考虑平均聚合物大小的其他范围，例如包括落在上述范围之内的范围，例如粒径约50至约500nm、约150至约250nm、或约100至约500nm等的聚合物微粒。
[0864] 例如，在不同的实施方案中，所产生的微粒中有90％粒径约200nm或以下、80％粒径约150nm或以下、60％粒径约100nm或以下、45％粒径约80nm或以下、40％粒径约60nm或以下、25％粒径约50nm或以下、5％粒径约35nm或以下。
[0865] 例如，在不同的实施方案中，所述方法产生平均粒径小于约200nm、小于约150nm或小于约110nm的聚合物微粒。
[0866] 7.组合物和制剂
[0867] 本发明的聚合物微粒可配制成适合用于本发明方法多种不同应用的组合物，例如，经配制用于经由特定路径给药，或经配制用于贮存，可在其生产宿主细胞外面稳定地维持为微粒，并且可对这些微粒进行设计以适应许多应用。
[0868] 例如，在一个实施方案中，配制本文可用的组合物以允许通过任何选择的路径对受试者给药，包括但不限于口服或肠胃外(包括局部、皮下、肌内和静脉注射)给药。
[0869] 因此，例如根据本发明可用的药物组合物可以用根据目的给药路径和标准药学实践所选择的适宜的可药用载体(包括赋形剂、稀释剂、辅剂及其组合)来配制。例如，如本领域公知的那样，旨在进行疫苗接种的药物组合物可以含有一个或多个佐剂或免疫刺激剂。例如，根据本发明可用的组合物可作为粉剂、液剂、片剂或胶囊剂口服给药，或作为膏剂、霜剂或洗剂局部给药。适宜的制剂可以含有需要的附加药剂，包括乳化剂、抗氧化剂、调味剂或着色剂，并且可以调整以适合速释、延迟释药、调控释药、持续释药、脉冲释药或控释。
[0870] 因此，本发明也涉及用于治疗人类或其他哺乳动物疾病、紊乱和/或病况及如本文所公开的其他紊乱的、包含一种或多种本发明聚合物微粒的剂量、剂型、制剂、组合物和/或器械，包括本文所公开的那些。应用包含一种或多种本发明聚合物微粒的这些剂型、制剂组合物和/或器械能够有效治疗这些病况。例如，本发明提供了包含一种或多种本发明聚合物微粒、例如一种或多种包含Tb抗原的聚合物微粒的剂型、制剂、器械和/或组合物。可配制本发明的剂型、制剂、器械和/或组合物，以优化生物利用度、免疫原性，或使血浆、血液或组织浓度维持在免疫原性或治疗范围内，包括维持一段时间。例如，也可以利用控释递药制品来优化作用部位的抗原浓度。.
[0871] 可配制本发明的剂型、制剂、器械和/或组合物进行周期性给药，例如以提供对一种或多种本发明聚合物微粒的持续接触。用来引发有益免疫应答的策略，例如采用一次或多次“加强”疫苗的策略在本领域公知，并且可以采用这样的策略来实施本发明。
[0872] 药物组合物和剂型可以通过肠胃外路径给药，并且在引发免疫应答的方法的某些实施方案中，例如本文所述的那些，将优选此路径。肠胃外剂型的例子包括活性剂水溶液、等渗盐水或5％葡萄糖液，或其他可药用的赋形剂。例如，环糊精或本领域技术人员公知的其他增溶剂可用作为药物赋形剂来递送治疗剂。
[0873] 适合于口服给药的剂型例子包括但不限于：能够提供治疗有效量的本发明聚合物微粒的片剂、胶囊剂、锭剂或类似形式，或任何液剂形式例如糖浆剂、水剂、乳剂等。胶囊剂可以含有任何标准的可药用材料例如明胶或纤维素。片剂可以按照常规方法通过压制活性成分与固体载体及润滑剂的混合物来配置。固体载体的例子包括淀粉和糖、膨润土。活性成分可以以含有粘合剂例如乳糖或甘露醇、常规填充剂和压片剂的硬壳片剂或胶囊剂的形式给药。
[0874] 适合于透皮给药的剂型例子包括但不限于：透皮贴剂、透皮绷带等。适合于局部给药本发明组合物和制剂的剂型例子为任何洗剂、棒剂、喷剂、膏剂、糊剂、霜剂、凝胶剂等，直接施用于皮肤，或借助于媒介如敷剂、贴剂等。
[0875] 适合于栓剂给药本发明组合物和制剂的剂型例子包括任何插入体孔、特别是直肠、阴道和尿道插入的固体剂型。
[0876] 适合于注射本发明组合物和制剂的剂型例子包括借助于快速浓注递药，例如通过静脉注射、皮下、真皮下和肌内给药单次或多次给药或口服给药。
[0877] 适合于储库给药本发明组合物和制剂的剂型例子包括本发明聚合物微粒的小丸或小圆柱，或本发明聚合物微粒的置于生物可降解聚合物、微乳剂、脂质体中的任何固体剂型或微胶囊剂型。
[0878] 本发明组合物和制剂的输注器械的例子包括含有一种或多种本发明聚合物微粒的输注泵，以期望的量给药期望的剂量数或以稳定状态给药，并且包括植入式药泵。
[0880] 适合于透粘膜递送本发明组合物和制剂的剂型的例子包括灌肠剂贮液、阴道栓剂、棉塞、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂、雾化溶液、粉剂以及除活性成分外还含有本领域已知适宜的载体的类似制剂。具体考虑适合于吸入或吹入本发明组合物和制剂的剂型，包括处于可药用水性或有机溶剂或其混合物之中的含组合物的溶液和/或混悬液，和/或粉剂。透粘膜递送本发明组合物和制剂可以利用任何粘膜，但常利用鼻腔、口腔、阴道和直肠组织。适合于鼻腔给药本发明组合物和制剂的剂型可以以液体形式给药，例如鼻腔喷剂、鼻腔滴剂，或通过雾化器以气雾剂给药，包括聚合物微粒的水性或油性溶液。当载体为固体时，鼻腔给药制剂包括粒径例如小于约100μm的粗粉，优选更小，最优选小于约50μm，其通过吸气的方式给药，即通过鼻道从靠近鼻部的粉剂容器中迅速吸入。本发明的制剂可制备为水性溶液，例如处于生理盐水中，采用苯甲醇或其他适宜防腐剂、增强生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或本领域已知的增溶剂或分散剂的溶液。
[0881] 适合于口腔给药本发明组合物和制剂的剂型的例子包括锭剂、片剂等，处于可药用水性或有机溶剂或其混合物之中的含组合物的溶液和/或混悬液，和/或粉剂。
[0882] 适合于舌下给药本发明组合物和制剂的剂型的例子包括锭剂、片剂等，处于可药用水性或有机溶剂或其混合物之中的含组合物的溶液和/或混悬液，和/或粉剂。
[0883] 适合于眼部给药本发明组合物和制剂的剂型的例子包括插入剂，和/或处于可药用水性或有机溶剂之中的含组合物的溶液和/或混悬液。
[0884] 可用于递送本发明组合物和制剂的组合物剂型的例子，包括疫苗和控释药物剂型，可见于例如Sweetman，S.C.(Ed.).Martindale.The Complete Drug Reference，
33rd Edition，Pharmaceutical Press，Chicago，2002，2483PP.；Aulton，M.E.(Ed.)Pharmaceutics.The Science of Dosage Form Design.Churchill Livingstone，
Edinburgh，2000，734pp.；和Ansel，H.C.，Allen，L.V.and Popovich，N.G.Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，7thEd.，Lippincott 1999，676PP.。制备递药系统所采用的赋形剂在本领域技术人员已知的多种出版物中有说明，包括例如Kibbe，E.H.Handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd Ed.，American Pharmaceutical Association，Washington，2000，665pp。USP还提供了调控释药口服剂型的例子，包括配制为片剂或胶囊剂的那些剂型。参见例如The United States Pharmacopeia 23/
National Formulary 18，The United States Pharmacopeial Convention，Inc.，
Rockville MD，1995(以下记做“USP”)，其中也描述了用来确定缓释和延迟释药片剂和胶囊剂释药能力的具体试验。有关缓释和延迟释药药品释药的USP测试以剂量单位药
物溶解所用的测试时间为基础。关于多种测试仪器和方法的说明可见于USP。F.D.A提
供了有关缓释剂型分析的更多指南(参见Guidance for Industry.Extended release
oral dosage forms：development，evaluation，and application of in vitro/in vivo correlations.Rockville，MD：Center for Drug Evaluation and Research，Food and Drug Administration，1997)。
33rd Edition，Pharmaceutical Press，Chicago，2002，2483PP.；Aulton，M.E.(Ed.)Pharmaceutics.The Science of Dosage Form Design.Churchill Livingstone，
Edinburgh，2000，734pp.；和Ansel，H.C.，Allen，L.V.and Popovich，N.G.Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，7thEd.，Lippincott 1999，676PP.。制备递药系统所采用的赋形剂在本领域技术人员已知的多种出版物中有说明，包括例如Kibbe，E.H.Handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd Ed.，American Pharmaceutical Association，Washington，2000，665pp。USP还提供了调控释药口服剂型的例子，包括配制为片剂或胶囊剂的那些剂型。参见例如The United States Pharmacopeia 23/
National Formulary 18，The United States Pharmacopeial Convention，Inc.，
Rockville MD，1995(以下记做“USP”)，其中也描述了用来确定缓释和延迟释药片剂和胶囊剂释药能力的具体试验。有关缓释和延迟释药药品释药的USP测试以剂量单位药
物溶解所用的测试时间为基础。关于多种测试仪器和方法的说明可见于USP。F.D.A提
供了有关缓释剂型分析的更多指南(参见Guidance for Industry.Extended release
oral dosage forms：development，evaluation，and application of in vitro/in vivo correlations.Rockville，MD：Center for Drug Evaluation and Research，Food and Drug Administration，1997)。
[0885] 本发明剂型的更多例子包括但不限于：调控释药(MR)剂型，包括延迟释药(DR)剂型；延时释药(PA)剂型；控释(CR)剂型；缓释(ER)剂型；定时释药(TR)剂型；和长效释药(LA)剂型。这些术语大部分用来描述口服给药的剂型，但是这些术语可适用于本文所述的任何剂型、制剂、组合物和/或器械。这些制剂在给药后实现总药物的延缓释放，和/或在给药后以小量均分间歇性释药、和/或通过递药系统控制以可控的速率慢速释药、和/或以不变的恒定速率释药、和/或以比普通制剂显著更长的时间释药。
[0886] 在某些实施方案中，一种或多种本发明的聚合物微粒、或包含一个或多个抗原的一种或多种本发明的聚合物微粒的治疗有效量是约1ug/kg至约1g/kg。示例性的治疗有效的剂量范围包括例如约1μg/kg至约500mg/kg、约1μg/kg至约400mg/kg、约1μg/kg至约300mg/kg、约1μg/kg至约200mg/kg、约1μg/kg至约100mg/kg、约1μg/kg至约90mg/kg、约1μg/kg至约80mg/kg、约1μg/kg至约70mg/kg、约1μg/kg至约60mg/kg、约1μg/kg至约50mg/kg、约5μg/kg至约50mg/kg、约10μg/kg至约50mg/kg、约50μg/kg至约50mg/kg、约100μg/kg至约50mg/kg、约200μg/kg至约50mg/kg、约300μg/kg至约50mg/kg、约400μg/kg至约50mg/kg、约500μg/kg至约50mg/kg、约600μg/kg至约50mg/kg、约
700μg/kg至约50mg/kg、约800μg/kg至约50mg/kg、约900μg/kg至约50mg/kg、约1mg/kg至约50mg/kg、约5mg/kg至约50mg/kg、约10mg/kg至约50mg/kg、约15mg/kg至约50mg/kg、约20mg/kg至约50mg/kg、约25mg/kg至约50mg/kg、约30mg/kg至约50mg/kg、约35mg/kg至约50mg/kg、约40mg/kg至约50mg/kg、或约45mg/kg至约50mg/kg。
700μg/kg至约50mg/kg、约800μg/kg至约50mg/kg、约900μg/kg至约50mg/kg、约1mg/kg至约50mg/kg、约5mg/kg至约50mg/kg、约10mg/kg至约50mg/kg、约15mg/kg至约50mg/kg、约20mg/kg至约50mg/kg、约25mg/kg至约50mg/kg、约30mg/kg至约50mg/kg、约35mg/kg至约50mg/kg、约40mg/kg至约50mg/kg、或约45mg/kg至约50mg/kg。
[0887] 其他治疗有效的剂量范围包括例如约1mg/kg至约1g/kg、约1.5mg/kg至约950mg/kg、约2mg/kg至约900mg/kg、约3mg/kg至约850mg/kg、约4mg/kg至约800mg/kg、约5mg/kg至约750mg/kg、约5mg/kg至约700mg/kg，5mg/kg至约600mg/kg、约5mg/kg至约
500mg/kg、约10mg/kg至约400mg/kg、约10mg/kg至约300mg/kg、约10mg/kg至约200mg/kg、约10mg/kg至约250mg/kg、约10mg/kg至约200mg/kg、约10mg/kg至约200mg/kg、约10mg/kg至约150mg/kg、约10mg/kg至约100mg/kg、约10mg/kg至约75mg/kg、约10mg/kg至约
50mg/kg、或约15mg/kg至约35mg/kg。
500mg/kg、约10mg/kg至约400mg/kg、约10mg/kg至约300mg/kg、约10mg/kg至约200mg/kg、约10mg/kg至约250mg/kg、约10mg/kg至约200mg/kg、约10mg/kg至约200mg/kg、约10mg/kg至约150mg/kg、约10mg/kg至约100mg/kg、约10mg/kg至约75mg/kg、约10mg/kg至约
50mg/kg、或约15mg/kg至约35mg/kg。
[0888] 在本发明靶向人类受试者的一些实施方案中，一种或多种本发明的聚合物微粒、或包含一个或多个抗原的一种或多种本发明的聚合物微粒的治疗有效量是例如约10mg至约10g每剂。其他治疗有效的剂量范围包括例如约20mg至约9g、约30mg至约8g、约40mg至约7g、约50mg至约6g、约60mg至约5g、约70mg至约4g、约80mg至约3g、约100mg至约2g、约100mg至约1.5g、约200mg至约1400mg、约200mg至约1300mg、约200mg至约1200mg、约200mg至约1100mg，about 200mg至约1000mg、约300mg至约900mg、约300mg至约800、约300mg至约700mg、或约300mg至约600mg每剂。
[0889] 本发明还部分地提供了包含一种或多种本发明的聚合物微粒的低剂量组合物、制剂和器械。例如，低剂量组合物、制剂等以足以提供例如下述剂量的量给药：约0.001mg/kg至约5mg/kg、约0.01mg/kg至约4.5mg/kg、约0.02mg/kg至约4mg/kg、约0.02至约3.5mg/kg、约0.02mg/kg至约3mg/kg、约0.05mg/kg至约2.5mg/kg、约0.05mg/kg至约2mg/kg、约0.05-0.1mg/kg至约5mg/kg、约0.05-0.1mg/kg至约4mg/kg、约0.05-0.1mg/kg至约3mg/kg、约0.05-0.1mg/kg至约2mg/kg、约0.05-0.1mg/kg至约1mg/kg，和/或落在本文所示种种范围内的任何其他剂量或剂量范围的一种或多种本发明的聚合物微粒、或包含一个或多个抗原的一种或多种本发明的聚合物微粒。
[0890] 本文所述的剂量可以按单次剂量、多次剂量或均分剂量给药。例如，如免疫学领域所公知的那样，所述剂量可以在一个疗程内一次、两次、三次、四次或更多次给药。
[0891] 根据本发明可用的组合物的功效可在体外和体内进行评价。参见例如下文的实施例。简而言之，可以在体外或在体内测试组合物诱导细胞介导的免疫应答的能力。对于体内研究，可对动物(例如小鼠)饲喂或注射组合物，然后评估其引发免疫应答的效果。基于这些结果，可确定合适的剂量范围和给药路径。
[0892] 在本发明的一些实施方案中，治疗有效量是有效引发免疫应答的量，例如血液中的IFN-γ浓度约0.5ng/mL至约20ng/mL、约0.5ng/mL至约15ng/mL、约0.5ng/mL至约10ng/mL、约0.5ng/mL至约9ng/mL、约1ng/mL至约8ng/mL、约2ng/mL至约7ng/mL、或约
3ng/mL至约6ng/mL。
3ng/mL至约6ng/mL。
[0893] 在一些情况下，包括感染后或长期感染期间，观察到IFN-γ血液浓度升高，因此在确定基线时这种浓度升高应当考虑在内，针对此基线来评估本发明聚合物微粒所引发的有效免疫应答。
[0894] 8.用聚合物微粒进行治疗
[0895] 已近发现聚合物微粒例如聚羟基烷酸酯聚合物微粒，可以在其生产宿主细胞外面稳定地维持为微粒，并且可对这些微粒进行设计以适应许多应用。
[0896] 功能化的聚合物微粒可以包含一个或多个表面结合的能够引发细胞介导的或其他免疫应答的抗原，一个或多个与能够引发细胞介导的或其他免疫应答的抗原的结合结构域结合的物质，或其组合。
[0897] 例如，在一个实施方案中，物质在微粒形成期间固定在微粒的表面，结合于与能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域，或通过荷载、扩散或掺入而整合到微粒中。
[0898] 例如，在用于结核病治疗的情形下，聚合物微粒可以包含一个或多个表面结合的结核分枝杆菌抗原，一个或多个与结核分枝杆菌抗原结合结构域结合的物质，或其组合。
[0899] 在一个实施方案中，物质在微粒形成期间固定在微粒表面上，与例如结核分枝杆菌抗原结合结构域结合，或通过荷载、扩散或掺入而整合到微粒中。也具体考虑例如通过交联而使之共价连接于聚合物微粒表面。
[0900] 在一个实施方案中，所述物质选自例如下组清单：蛋白或蛋白片段、肽、多肽、抗体或抗体片段、抗体结合结构域、抗原、抗原决定簇、表位、免疫原或其片段、或其中两项或多项的任意组合。
[0901] 在一个实施方案中，来自细胞内病原体的DNA可进行片段化，并插入到编码包含聚合物合酶的融合多肽的表达构建体中。这样，利用公知的可升级的细菌生产系统，能够产生展示细胞内病原体抗原决定簇的聚合物微粒，利用来自感染患者的血清进行筛选，并鉴定、分离和生产抗原提呈微粒。
[0902] 在一个实施方案中，多个能够引发细胞介导的(或其他)免疫应答的抗原固定在聚合物微粒的表面。
[0903] 在一个实施方案中，来自例如结核分枝杆菌的DNA可进行片段化，并插入到编码包含聚合物合酶的融合多肽的表达构建体中。这样，利用公知的可升级的细菌生产系统，能够产生展示例如结核分枝杆菌抗原决定簇的聚合物微粒，利用来自感染患者的血清进行筛选，并鉴定、分离和生产抗原提呈微粒。
[0904] 例如，在一个实施方案中，多个结核分枝杆菌或其他抗原固定在聚合物微粒的表面。
[0905] 与此类似，在不同的实施方案中，来自例如肝炎病毒或来自流感病毒的DNA可进行片段化，并插入到编码包含聚合物合酶的融合多肽的表达构建体中。这样，利用公知的可升级的细菌生产系统，能够产生展示肝炎病毒抗原决定簇或流感病毒抗原决定簇的聚合物微粒，利用来自感染患者的血清进行筛选，并鉴定、分离和生产抗原提呈微粒。
[0906] 在一个实施方案中，多个肝炎病毒或流感病毒抗原抗原固定在聚合物微粒的表面。
[0907] 本发明一方面涉及携带一个或多个抗原的聚合物微粒引发免疫应答的能力。在一个实施方案中，聚合物微粒包含至少一个与聚合物微珠融合的、能够引发细胞介导的或其他免疫应答的抗原。在聚合物微粒表面展示至少一个能够引发细胞介导的或其他免疫应答的抗原，以刺激针对该抗原性部分的最佳免疫应答。
[0908] 在一个实施方案中，携带一个或多个抗原的聚合物微粒引发免疫应答。在一个实施方案中，聚合物微粒包含例如至少一个与聚合物微珠融合的结核分枝杆菌抗原。在聚合物微粒表面展示例如至少一个结核分枝杆菌抗原，以刺激针对该抗原性部分的最佳免疫应答。
[0909] 在一个实施方案中，携带一个或多个抗原的聚合物微粒引发针对肝炎病毒的免疫应答。在一个实施方案中，聚合物微粒包含例如至少一个与聚合物微珠融合的肝炎病毒抗原。在聚合物微粒表面展示例如至少一个肝炎病毒抗原，以刺激针对该抗原性部分的最佳免疫应答。在一个实施方案中，聚合物微粒包含例如至少一个与聚合物微珠融合的流感病毒抗原。在聚合物微粒表面展示例如至少一个流感病毒抗原，以刺激针对该抗原性部分的最佳免疫应答。考虑其他抗原，如本文所指出的那样。
[0910] 例如，在一个实施方案中，组合物中存在、或者微粒中或微粒上存在不止一个抗原、或组合的抗原和佐剂或其他免疫调节因子或分子例如免疫刺激因子或分子。典型地，存在组合的抗原、佐剂或其他免疫调节因子或分子将会进一步增强免疫应答。
[0911] 例如，在一个实施方案中，本发明提供了多期疫苗组合物。所述杂合疫苗展示特异于结核菌感染多个阶段的不同抗原。例如，早期抗原与潜伏期抗原共表达。特异于多个病原体包括细胞内病原体的抗原在本领域公知，并且示例病原体的代表性抗原在本文说明。
[0912] 本发明也涉及引发受试者细胞介导的(和/或其他)免疫应答的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药包含例如融合于与能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的微粒形成蛋白优选聚合物合酶的聚合物微粒。
[0913] 在该实施方案中，在对受试者给药之后，与能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域，可以与能够引发细胞介导的免疫应答的内源抗原结合。应理解，包含与能够引发细胞介导的免疫应答的抗原能够结合的结合结构域的聚合物微粒，与能够引发细胞介导的免疫应答的内源抗原结合，能够引发或增强受试者的免疫应答。
[0914] 例如，在给药包含例如至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域的微粒之前，受试者体内存在的能够引发细胞介导的免疫应答、但不能引发受试者有效的免疫应答的抗原，在与微粒结合之后，能够引发有效的免疫应答或有效增强受试者的免疫应答。
[0915] 在一个实施方案中，本发明提供了对例如感染有结核的、或例如之前进行过抗结核免疫的受试者引发免疫应答的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药包含与例如结核分枝杆菌抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白的聚合物微粒。
[0916] 例如，在该实施方案中，在对受试者给药之后，结核分枝杆菌抗原结合结构域可以与内源结核分枝杆菌抗原结合。应理解，包含结核分枝杆菌抗原结合结构域的聚合物微粒，与例如内源结核分枝杆菌抗原结合，能够引发或增强受试者的免疫应答。
[0917] 例如，在给药包含例如至少一个结核分枝杆菌抗原结合结构域的微粒之前，受试者体内存在的、但不能引发受试者有效的免疫应答的结核分枝杆菌抗原，在与微粒结合之后，能够引发有效的免疫应答或有效增强受试者的免疫应答。
[0918] 在一个实施方案中，本发明提供了对例如感染有肝炎的、或之前进行过抗肝炎免疫的受试者引发免疫应答的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药包含与肝炎病毒抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白的聚合物微粒。
[0919] 例如，在该实施方案中，在对受试者给药之后，肝炎病毒抗原结合结构域可以与内源肝炎病毒抗原结合。应理解，包含肝炎病毒抗原结合结构域的聚合物微粒，与例如内源肝炎病毒抗原结合，能够引发或增强受试者的免疫应答。
[0920] 例如，在给药包含例如至少一个肝炎病毒抗原结合结构域的微粒之前，受试者体内存在的、但不能引发受试者有效的免疫应答的肝炎病毒抗原，在与微粒结合之后，能够引发有效的免疫应答或有效增强受试者的免疫应答。
[0921] 例如，在一个实施方案中，本发明提供了对例如感染有流感的、或之前进行过抗流感免疫的受试者引发免疫应答的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者给药包含与流感病毒抗原结合结构域融合的微粒形成蛋白的聚合物微粒。
[0922] 例如，在该实施方案中，在对受试者给药之后，流感病毒抗原结合结构域可以与内源流感病毒抗原结合。应理解，包含流感病毒抗原结合结构域的聚合物微粒，与例如内源流感病毒抗原结合，能够引发或增强受试者的免疫应答。
[0923] 例如，在给药包含例如至少一个流感病毒抗原结合结构域的微粒之前，受试者体内存在的、但不能引发受试者有效的免疫应答的流感病毒抗原，在与微粒结合之后，能够引发有效的免疫应答或有效增强受试者的免疫应答。
[0924] 应理解本发明提供了对给药受试者引发免疫应答的微粒、组合物和方法。优选地，针对利用本发明的微粒、组合物和方法提呈给受试者的一个或多个抗原所引发的免疫应答的幅度大于针对单独的抗原(即，没有本发明的微粒或组合物，或者通过并非本文提供的方法提呈)所引发的幅度。对免疫应答特别是细胞介导的免疫应答幅度进行量化的方法在本领域公知。
[0925] 9.免疫应答调理剂
[0926] 在某些实施方案中，会期望生产展示包含至少一个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原的融合蛋白的聚合物微粒。或者，期望包含至少一个或多个能够引发细胞介导的免疫应答的抗原连同佐剂或其他免疫应答调理剂的融合蛋白来引发免疫应答。
[0927] 在某些情况下，会期望生产展示包含至少一个能够引发体液免疫应答的抗原的融合蛋白的聚合物微粒。或者，期望包含至少一个或多个能够引发体液免疫应答的抗原连同佐剂或其他免疫应答调理剂的融合蛋白引发免疫应答。
[0928] 例如，在结核病的治疗中，会期望生产展示包含至少一个结核分枝杆菌抗原的融合蛋白的聚合物微粒，其中该聚合物微粒与一个或多个佐剂或其他免疫系统调理剂一起给药。或者，期望包含融合蛋白(其包含一个或多个结核分枝杆菌抗原)和例如佐剂或其他免疫应答调理剂的聚合物微粒来引发免疫应答。在肝炎的治疗中，会期望生产展示包含至少一个肝炎病毒抗原的融合蛋白的聚合物微粒，其中该聚合物微粒与一个或多个佐剂或其他免疫系统调理剂一起给药。或者，期望包含融合蛋白(其包含一个或多个肝炎病毒抗原)和佐剂或其他免疫应答调理剂的聚合物微粒来引发免疫应答。在流感的治疗中，会期望生产展示包含至少一个流感病毒抗原的融合蛋白的聚合物微粒，其中该聚合物微粒与一个或多个佐剂或其他免疫系统调理剂一起给药。或者，期望包含融合蛋白(其包含一个或多个流感病毒抗原)和佐剂或其他免疫应答调理剂的聚合物微粒来引发免疫应答。
[0929] 在一个实例中，本发明的聚合物微粒可以包含一个或多个抗原连同一个或多个toll样受体，包括一个或多个能够与下组的一个或多个配体结合的toll样受体：LPS、脂蛋白、脂肽、鞭毛蛋白、双链RNA、未甲基化的CpG岛、或细菌或病毒DNA或RNA。与此相似，本发明的组合物可以包含含一个或多个Tb抗原的聚合物群、含一个或多个免疫调节分子例如一个或多个toll样受体的聚合物群。
[0930] 存在一个或多个免疫调节分子可用于引发体液特异的免疫应答或细胞介导的特异性免疫应答，或引发包含体液和细胞介导的应答两者组合的免疫应答。
[0931] 具体抗原可以选自任何已知的结核分枝杆菌抗原，包括上文所述和本文引用文献中所述的那些。可以选择抗原从而产生适合于治疗或进行抗早期感染免疫的疫苗。可选地，提供了包含来自早期和潜伏期感染的抗原的多期疫苗。例如，提供了包含展示Ag85A-ESAT-6融合蛋白的聚合物微粒的疫苗递送系统。另一个例子可以包括表达Ag85A抗原和适合于刺激抗结核病免疫应答的已知佐剂的聚合物微粒。
[0932] 具体抗原可以选自任何能够引发细胞介导的免疫应答的已知抗原，包括上文所述和本文引用文献中所述的那些。可以选择抗原从而产生适合于治疗或进行抗早期感染免疫的疫苗。可选地，提供了包含来自早期和潜伏期感染的抗原的多期疫苗。
[0933] 本发明由前述内容组成，也设想下文仅作为举例给出的构架。实施例
[0934] 实施例1-质粒构建和在大肠杆菌中生产PHA聚合物微粒
[0935] 本实施例描述了为在大肠杆菌中生产聚合物微粒所用质粒的构建以及所述聚合物微粒免疫原性的分析，所述聚合物微粒展示结核抗原Ag-85A和ESAT-6、丙肝病毒核心抗原、以及H1型流感病毒血凝素(HA)抗原。
[0936] 材料和方法
[0937] 1.大肠杆菌菌株的培养
[0938] 大肠杆菌DH5α(Invitrogen)在补加有1％(w/w)葡萄糖和75μg/mL氨苄青霉TM
素的Difco Luria Broth(见表1)培养基中培养。大肠杆菌BL21(Invitrogen)在补加有TM
1％(w/w)葡萄糖、75μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL氯霉素的Difco LuriaBroth培养基中培养。
素的Difco Luria Broth(见表1)培养基中培养。大肠杆菌BL21(Invitrogen)在补加有TM
1％(w/w)葡萄糖、75μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL氯霉素的Difco LuriaBroth培养基中培养。
[0939] 表1：DifcoTM Luria Broth培养基
[0940]
[0941] 2.质粒构建
[0942] 本实施例中使用的所有质粒和寡核苷酸列于表2。
[0943] 酶PhaA和PhaB由质粒pMCS69编码。对于结核抗原聚合物微粒而言，质粒DK1.2-Ag85A-ESAT-6含有由Ag85A编码区(不含分泌信号序列)(N-端组分)和
ESAT-6编码区(C-端组分)组成的杂合基因。利用引物Ag85A-SpeI[SEQ ID No.3]和
ESAT-6-SpeI[SEQ ID No.4]通过PCR技术由此质粒分离得到编码Ag85A-ESAT-6融合蛋白、且包括翻译起始位点和起始密码子的DNA片段，并连入XbaI、ClaI核酸内切酶处理的pHAS载体中而生成pHAS-Ag85A-ESAT-6质粒。
ESAT-6编码区(C-端组分)组成的杂合基因。利用引物Ag85A-SpeI[SEQ ID No.3]和
ESAT-6-SpeI[SEQ ID No.4]通过PCR技术由此质粒分离得到编码Ag85A-ESAT-6融合蛋白、且包括翻译起始位点和起始密码子的DNA片段，并连入XbaI、ClaI核酸内切酶处理的pHAS载体中而生成pHAS-Ag85A-ESAT-6质粒。
[0944] 始于3’OH端片段的Ag85A-ESAT6融合蛋白编码序列如SEQ ID No.1所示，其衍生氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0945] 对于丙肝病毒抗原聚合物微粒而言，由DNA 2.0合成Hep C DNA的SpeI/NotI片段，亚克隆到pET-14b-scFv-PhaC载体中，从而形成pET-14bHep-PhaC。
[0946] 始于3’OH端片段的HepC-PhaC融合蛋白编码序列如SEQ ID No.7所示，其衍生氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
[0947] 对于HA抗原聚合物微粒而言，由GenScript合成全长血凝素序列的SpeI/NotI片段。此片段亚克隆到pET-14b-scFv-PhaC载体中，从而形成pET-14b血凝素-PhaC。为创建更短的血凝素抗原H1部分，利用pET-14b血凝素-PhaC作为模板以表2中所述的引物扩增了H1序列。SpeI/SunI片段亚克隆到pET-14b血凝素-PhaC中，从而形成pET-14b H3之HA1-PhaC。XhoI/BamHI片段亚克隆到pET-14b PhaC-接头-MalE中，从而形成pET-14b PhaC-接头-H3之HA1。
[0948] 始于3’OH端片段的H3之HA1-PhaC融合蛋白编码序列如SEQ ID No.11所示，其衍生氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。
[0949] 表2：质粒和寡核苷酸
[0950]
[0951]
[0952] 3.展示Ag85A-ESAT-6的聚合物微粒的生产
[0953] 将pHAS-Ag85A-ESAT-6及pHAS质粒引入拥有pMCS69质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。如上文所述，在适合于生产生物聚酯聚合物微粒的条件下培养转化株。然后如下文所述分别评估生产Ag85A-ESAT-6聚合物微粒或野生型聚合物微粒的能力。
[0954] 4.气相色谱质谱(GC-MS)
[0955] 拥有不同质粒的细菌细胞的聚酯含量与其体内的PhaC合酶活性相对应。通过气相色谱质谱(GC-MS)分析评估所积累的聚酯量来确定PhaC合酶活性，特别是评估PhaC-Tb抗原融合蛋白是否仍然催化聚酯合成及介导胞内颗粒形成。在通过酸催化的甲醇解作用将聚酯转化为3-羟基甲酯之后通过GC-MS来定量确定聚酯含量。
[0956] 结果
[0957] 对携带pHAS-Ag85A-ESAT-6和pMCS69、或者携带pHAS和pMCS69的细胞所进行的GC-MS分析确认了聚羟基丁酸聚酯的存在。还进一步利用尼罗红染色通过荧光显微镜检确认了胞内聚酯包涵体的存在。
[0958] 讨论
[0959] 携带pHAS-Ag85A-ESAT-6和pMCS69的细胞中存在聚羟基丁酸，这表明phaC聚酯合酶域作为三联融合蛋白存在时保留了聚合物合酶活性。
[0960] 实施例2-质粒构建和在乳酸乳球菌中生产PHA聚合物微粒
[0961] 本实施例描述了为在乳酸乳球菌中生产展示结核抗原Ag-85A和ESAT-6的聚合物微粒所用质粒的构建。
[0962] 材料和方法
[0963] 1.质粒构建
[0964] 本实施例中使用的所有质粒和乳酸乳球菌列于表3。编码抗原Ag85A/ESAT6的基因由GenScript公司(Piscataway，NJ)合成。调整密码子使用以适应乳酸乳球菌的密码子偏好。
[0965] 通过NdeI消化pUC57-ZZ获得了含有部分nisA启动子(PnisA)的pUC57-ZZ片段，并与NdeI消化的pUC57-ESAT6连接以获得pUC57-nisESAT6。将pUC57-nisESAT6中含有部分PnisA和Ag85A/ESAT6基因的BstBI-BamHI片段插入pNZ-AB中phaB上游的相应位点处，得到了pNZ-ESAT6-B。为了将pNZ-CAB中含phaC和phaA的片断引入pNZ-ESAT6-B中，两个质粒都用NheI和BamHI水解，并将pNZ-CAB的phaCA片段插入到pNZ-ESAT6-B中，得到了pNZ-ESAT6-CAB。
[0966] 始于3’OH端片段的nisA启动子(PnisA)编码序列如SEQ ID No.3所示，其衍生氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0967] 对于肝炎病毒抗原聚合物微粒而言，为在乳酸乳球菌中表达而对Hep CDNA序列进行了密码子优化，并由GenScript合成为NcoI/NheI片段。将该片段亚克隆到表3所述的pNZ-CAB质粒中，从而形成了pNZ-HepC-PhaCAB。
[0968] 始于3’OH端片段的HepC-PhaC(pNZ)融合蛋白编码序列如SEQ ID No.9所示，其衍生氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。
[0969] 表3：质粒和寡核苷酸
[0970]
[0971] 实施例3-聚酯聚合物微粒的分离和融合蛋白的表征
[0972] 本实施例描述了表面展示Ag85A-ESAT-6的生物聚酯聚合物微粒的表征。
[0973] 材料和方法
[0974] 1.聚酯聚合物微粒的分离
[0975] 通过破碎细菌，对全细胞裂解物于4℃以4000g离心15分钟使聚酯聚合物微粒沉降来分离聚酯颗粒。借助甘油梯度超速离心来纯化聚合物微粒。
[0976] 2.蛋白浓度测定
[0977] 根据厂商说明(Bio-Rad)利用Bio-Rad蛋白测定法来测定聚合物微粒上所附蛋白的浓度。在浓度测定之后，蛋白通过SDS-PAGE分离，并用SimplyBlue安全染料
(Invitrogen)染色。
(Invitrogen)染色。
[0978] 利用Gel DocTM XR来检测相对于聚合物微粒上所附总蛋白量而言的Ag85A-ESAT-6PhaC融合蛋白 的量，并利用Quantity One软 件(4.6.2版，Bio-Rad
Laboratories)来进行分析。从胶上切下目的蛋白，并利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)来进行胰蛋白酶酶解肽的指纹分析。
Laboratories)来进行分析。从胶上切下目的蛋白，并利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)来进行胰蛋白酶酶解肽的指纹分析。
[0979] 3.ELISA
[0980] Maxisorb板(Nunc)用纯化了的、在碳酸盐-重碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)(Sigma-Aldrich)中稀释了的Ag85A-ESAT-6聚合物微粒或野生型聚合物微粒4℃过夜包
被。利用该缓冲液进行系列稀释，蛋白浓度范围1mg/ml到0.015mg/ml。洗板并在25℃封闭2小时(见表4)。
被。利用该缓冲液进行系列稀释，蛋白浓度范围1mg/ml到0.015mg/ml。洗板并在25℃封闭2小时(见表4)。
[0981] 板随之以PBS-Tween 20清洗，与小鼠抗ESAT-6抗体(Abcam)一起孵育，清洗，然后再与用含1％(w/v)BSA的PBS稀释了的马抗小鼠IgG∶辣根过氧化物酶缀
合物(Sigma-Aldrich)在室温一起孵育1小时。再次清洗后，加邻苯二胺(OPD)底物
(Sigma-Aldrich)，板在室温孵育30分钟。
合物(Sigma-Aldrich)在室温一起孵育1小时。再次清洗后，加邻苯二胺(OPD)底物
(Sigma-Aldrich)，板在室温孵育30分钟。
[0982] 用0.5M H2SO4终止反应，并记录495nm的光吸收值。
[0983] 4.流式细胞术分析
[0984] 25μg纯化了的Ag85A-ESAT-6聚合物微粒或野生型聚合物微粒用冰冻的流式细胞术分析缓冲液清洗两次(见表4)，并与小鼠抗ESAT-6抗体(Abcam)一起孵育。在清洗之后，聚合物微粒用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的大鼠抗小鼠抗体(BD Pharmingen，CA，USA)染色，置于冰上暗孵育30分钟，并再次清洗。利用BD FACScalibur(BD Biosciences，CA，USA)来采集各个样品的至少10,000个事件，并利用CellQuest软件来分析。
[0985] 表4：缓冲液
[0986]
[0987] 结果
[0988] 聚合物微粒展示了高水平的蛋白，这是通过表观分子量分别为102kDa和63kDa的突出的Ag85A-ESAT-6-PhaC和PhaC蛋白电泳带确定的。这些蛋白的身份利用MALDI-TOF-MS通过胰蛋白酶酶解肽的指纹分析得到了确认。ELISA表明Ag85A-ESAT-6聚合物微粒以剂量依赖性的方式与抗ESAT-6抗体结合，而野生型聚合物微粒不与该抗体结合。流式细胞术分析显示＞98％的Ag85A-ESAT-6聚合物微粒结合抗ESAT-6抗体。
[0989] 讨论
[0990] 本实施例的结果表明，在重组大肠杆菌中成功表达了编码三联融合蛋白Ag85A-ESAT-6-PhaC的杂合基因，从而导致了过量生产表面表达所述融合蛋白的聚酯聚合物微粒。
[0991] 实施例4-流感病毒聚合物微粒疫苗的免疫原性
[0992] 本实施例描述了为在转化的宿主(此处为大肠杆菌)中生产聚合物微粒所用质粒的构建以及所述聚合物微粒免疫原性的分析，所述聚合物微粒同时展示流感病毒抗原神经氨酸酶、M1流感病毒衣壳蛋白和血凝素。具有这些抗原的微粒可用作为抗流感病的预防性和治疗性疫苗。
[0993] 材料和方法
[0994] 所 有 动 物 实 验 都 得 到 了 AgResearch Grasslands Animal EthicsCommittee(Palmerston North，New Zealand)的批准。
[0995] 1.大肠杆菌菌株的培养
[0996] 大肠杆菌DH5α(Invitrogen)在如实施例1表1所详述的、补加有1％(w/w)葡TM
萄糖和75μg/mL氨苄青霉素的Difco Luria Broth(见表1)培养基中培养。大肠杆菌
BL21(Invitrogen)在补加有1％(w/w)葡萄糖、75μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL氯霉素的TM
Difco Luria Broth或限定培养基中培养。
萄糖和75μg/mL氨苄青霉素的Difco Luria Broth(见表1)培养基中培养。大肠杆菌
BL21(Invitrogen)在补加有1％(w/w)葡萄糖、75μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL氯霉素的TM
Difco Luria Broth或限定培养基中培养。
[0997] 2.质粒构建
[0998] 本实施例中的所有质粒和寡核苷酸列于表5。酶PhaA和PhaB由质粒pMCS69编码。
[0999] 为生产展示神经氨酸酶抗原的聚合物微粒，对编码神经氨酸酶的基因进行了密码子优化，并由GenScript公司合成为SpeI/SunI以及XhoI/BamHI片段。SpeI/SunI片段插入到pET-14b H3之HA1-PhaC质粒中，得到了pET-14b-NA-PhaC质粒。XhoI/BamHI片段亚克隆到pET-14b-PhaC-接头-MalE中，得到了pET-14b-PhaC-接头-NA质粒。
[1000] 为生产展示M1流感病毒衣壳蛋白的聚合物微粒，对M1基因序列进行了密码子优化，并由GenScript合成为SpeI/SunI以及XhoI/BamHI片段。SpeI/SunI片段插入到
pET-14b H3之HA1-PhaC质粒中，得到了pET-14b-M1-PhaC质粒。XhoI/BamHI片段亚克隆到pET-14b-PhaC-接头-MalE中，得到了pET-14b-PhaC-接头-M1质粒。
pET-14b H3之HA1-PhaC质粒中，得到了pET-14b-M1-PhaC质粒。XhoI/BamHI片段亚克隆到pET-14b-PhaC-接头-MalE中，得到了pET-14b-PhaC-接头-M1质粒。
[1001] 为生产同时展示所有三种流感病毒抗原的聚合物微粒，将来自pET-14b-NA-PhaC质 粒 的 XbaI/NotI 片 段 亚 克 隆 到 pET-14b-PhaC- 接 头 -M1 质 粒 中，得 到pET-14b-NA-PhaC-接头-M1质粒。利用如实施例1表2所述的BamH1H3引物PCR扩增了血凝素-PhaC。相应的BamH1/BlpI片段亚克隆到pET-14b-NA-PhaC-接头-M1质粒中，得到了pET-14b-NA-PhaC-接头-M1/血凝素-PhaC质粒。
[1002] NA-PhaC融合蛋白和PhaC-接头-NA融合蛋白的构建体分别如SEQ ID No.17和19所示，其衍生氨基酸序列分别如SEQ ID No.18和20所示。M1-PhaC融合蛋白和PhaC-接头-M1融合蛋白的构建体分别如SEQ ID No.21和23所示，其衍生氨基酸序列分别如SEQ ID No.22和24所示。NA-PhaC-接头-M1融合蛋白的构建体如SEQ ID No.25所示，其衍生氨基酸序列如SEQ ID No.26所示。血凝素-PhaC融合蛋白的构建体如SEQ ID No.27所示，其衍生氨基酸序列如SEQ ID No.28所示。
[1003] 表5：质粒和寡核苷酸
[1004]
[1005]
[1006] 3.AcpA-IglC展示微粒的生产
[1007] 将pET-14b-PhaC- 接 头-NA、pET-14b-PhaC- 接 头-M1、pET-14b-NA-PhaC- 接头-M1/血凝素-PhaC以及pHAS质粒引入拥有pMCS69质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。如实施例1所述在适合于生产生物聚酯微粒的条件下培养转化株。如下文所述分别评估生产NA、M1或NA-M1-血凝素微粒或野生型微粒的能力。
[1008] 4.气相色谱质谱(GC-MS)
[1009] 拥有不同质粒的细菌细胞的聚酯含量与其体内的PhaC合酶活性相对应。通过气相色谱质谱(GC-MS)分析评估所积累的聚酯量来确定phaC合酶活性，特别是来确认
PhaC-NA、Pha-M1及PhaC-NA-M1-HA融合蛋白催化聚酯合成及介导胞内颗粒形成。在通过酸催化的甲醇解作用将聚酯转化为3-羟基甲酯之后通过GC-MS来定量确定聚酯含量。
PhaC-NA、Pha-M1及PhaC-NA-M1-HA融合蛋白催化聚酯合成及介导胞内颗粒形成。在通过酸催化的甲醇解作用将聚酯转化为3-羟基甲酯之后通过GC-MS来定量确定聚酯含量。
[1010] 5.聚酯微粒的分离
[1011] 通过破碎细菌，对全细胞裂解物于4℃以4000g离心15分钟使聚酯微粒沉降来分离聚酯颗粒。借助甘油梯度超速离心来纯化微粒。
[1012] 6.蛋白浓度测定
[1013] 根据厂商说明(Bio-Rad)利用Bio-Rad蛋白测定法来测定微粒上所附蛋白的浓度。在浓度测定之后，蛋白通过SDS-PAGE分离，并用SimplyBlue安全染料(Invitrogen)染色。
[1014] 利用Gel DocTM XR来检测相对于微粒上所附总蛋白量而言的PhaC-NA、Pha-M1及PhaC-NA-M1-HA融合 蛋白的 量，并利 用Quantity One软件(4.6.2 版，Bio-RadLaboratories)来进行分析。从胶上切下目的蛋白，并利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)来进行胰蛋白酶酶解肽的指纹分析，这能够鉴定到融合蛋白结构域。
[1015] 7.ELISA
[1016] Maxisorb板(Nunc)用纯化了的、在碳酸盐-重碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)(Sigma-Aldrich)中稀释了的PorA-C-PorB微粒或HA、M1、NA-M1-HA微粒或野生型微粒4℃过夜包被。利用该缓冲液进行系列稀释，蛋白浓度范围1mg/ml到0.015mg/ml。洗板并在
25℃封闭2小时(见表4)。
25℃封闭2小时(见表4)。
[1017] 板随之以PBS-Tween 20清洗，与针对不同抗原所产生的小鼠抗体一起孵育，清洗，然后再与用含1％(w/v)BSA的PBS稀释了的马抗小鼠IgG∶辣根过氧化物酶缀
合物(Sigma-Aldrich)在室温一起孵育1小时。再次清洗后，加邻苯二胺(OPD)底物
(Sigma-Aldrich)，板在室温孵育30分钟。
合物(Sigma-Aldrich)在室温一起孵育1小时。再次清洗后，加邻苯二胺(OPD)底物
(Sigma-Aldrich)，板在室温孵育30分钟。
[1018] 用0.5M H2SO4终止反应，并记录495nm的光吸收值。
[1019] 8.流式细胞术分析
[1020] 25μg不同的纯化了的抗原展示微粒或野生型微粒用如实施例3表4所述的冰冻的流式细胞术分析缓冲液清洗两次，并与小鼠抗抗原抗体一起孵育。在清洗之后，微粒用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的大鼠抗小鼠抗体(BD Pharmingen，CA，USA)染色，置于冰上暗孵育30分钟，并再次清洗。利用BD FACScalibur (BDBiosciences，CA，USA)来采集各个样品的至少10,000个事件，并利用CellQuest软件来分析。
[1021] 9.小鼠免疫接种
[1022] 对6-8周龄的C57BL/6雌鼠(Malaghan Institute，Wellington，NZ)以2周的间隔进行3次肌内免疫接种。3个处理组设置如下：
[1023] a)个体免疫接种野生型微粒(即，由携带pHAS和pMCS69的细菌细胞制备的微粒)；
[1024] b)个体仅免疫接种抗原微粒(即，由携带编码不同抗原-PhaC融合蛋白的质粒和pMCS69的细菌细胞制备的微粒)；
[1025] c)个体免疫接种与20％EmulsigenTM佐剂(MVP Laboratories)混合的不同抗原微粒。
[1026] 各实验设置均纳入了未接种疫苗的对照动物。
[1027] 10.免疫测定
[1028] 小鼠在末次免疫接种后3周麻醉，采血，离心，收集血清，冷冻于-20℃以备分析之用。
[1029] 然后对小鼠实施安乐死，取出脾脏，通过80目网筛制备单细胞悬液。脾红细胞(RBC)利用含17mM TRIS-HCl和140mM NH4Cl的溶液裂解。清洗之后，RBC在补加有2mM谷氨酸(Invitrogen)、100U/mL青霉素(Invitrogen)、100μg/mL链霉素(Invitrogen)、5x -510 M 2-巯基乙醇(Sigma)和5％(w/w)胎牛血清(Invitrogen)的达尔伯克改良伊格尔培
养基(Dulbecco’s Modified Eagle media，DMEM)中培养。
养基(Dulbecco’s Modified Eagle media，DMEM)中培养。
[1030] 细胞要么仅在培养基中、要么在含有相应抗原的培养基中于37℃在10％CO2中温育。
[1031] 11.IFN-γ定量
[1032] 在4天温育之后，取培养物上清液，冷冻于-20℃以备分析之用。根据厂商说明利用商购抗体和标准品(BD Pharmingen)通过ELISA(BD Biosciences)来测量上清液中的IFN-γ水平。
[1033] 12.血清抗体定量
[1034] 利用固定化了的用于捕获抗体的抗原展示微粒通过ELISA来测量血清抗体。
[1035] 13.统计学分析
[1036] IFN-γ和抗体反应的分析通过Kruskal-Wallis单因素方差分析(ANOVA)来进行。
[1037] 结果
[1038] 在重组大肠杆菌中表达编码不同抗原-PhaC融合蛋白的相应杂合基因，能够生产表面展示这些融合蛋白的聚酯微粒。
[1039] 对所有在pMCS69存在下携带pET-14b-PhaC-接头-NA、pET-14b-PhaC-接头-M1、pET-14b-NA-PhaC-接头-M1/血凝素-PhaC和pHAS质粒的细胞进行GC-MS分析来确认聚羟基丁酸聚酯的存在。还进一步利用尼罗红染色通过荧光显微镜检来确认胞内聚酯包涵体的存在。
[1040] 所有在pMCS69存在下携带质粒pET-14b-PhaC-接头-NA、pET-14b-PhaC-接头-M1、pET-14b-NA-PhaC-接头-M1/血凝素-PhaC和pHAS(野生型对照)的细胞中存在聚
羟基丁酸，表明phaC聚酯合酶域作为单一或三联融合蛋白存在时保留了聚合物合酶活性。
羟基丁酸，表明phaC聚酯合酶域作为单一或三联融合蛋白存在时保留了聚合物合酶活性。
[1041] 聚合物微粒展示了高水平的蛋白，这是通过表观分子量与由这些融合蛋白序列推断的分子量直接相对应的突出的蛋白电泳带确定的。这些蛋白的身份利用MALDI-TOF-MS通过胰蛋白酶酶解肽的指纹分析得以确认。ELISA结果表明这些不同抗原展示微粒以剂量依赖性的方式与相应的抗抗原抗体结合，而野生型微粒表现出明显更低的抗体结合。流式细胞术分析结果优选地表明＞98％的抗原微粒结合抗抗原抗体。
[1042] 优选地，在免疫接种之后未在任何一只动物中观察到明显的毒性，在实验开展期间小鼠体重并无显著的组间差异，且所有组的小鼠都增重了。免疫接种聚酯微粒的小鼠会在接种部位形成小肿块(直径2.5mm)，但通常不会形成脓疮或化脓，且典型地在整个试验期间是健康的，行为正常，皮毛品质良好。
[1043] 10-100μg剂量的抗原微粒对于在小鼠中生成显著的抗体反应而言是最佳的。此剂量与单独的10-100μg剂量的野生型微粒相比，诱导显著更高的抗体滴度。也可以测试和应用其他剂量。另一实验包括未免疫接种的对照小鼠，对含或不含佐剂的微珠制剂进行了比较，评价结果是与未接种疫苗的小鼠相比，给予抗原微粒的两个疫苗接种组均诱导了显著更高的抗原特异性血清抗体反应。在免疫接种佐以Emulsigen的抗原微粒的小鼠中观察到最高的抗体反应。在两组实验中，IgG1同种型的抗体反应均典型地比IgG2的反应更强。
[1044] 与仅免疫接种了野生型微粒或PBS的小鼠相比，免疫接种了10-100μg抗原微粒的小鼠中细胞介导的抗原应答也显著增强，且仅免疫接种了野生型微粒的小鼠与PBS免疫接种的对照小鼠相比，在细胞介导的应答方面一般无明显差异。
[1045] 10-100μg野生型微粒(无流感病毒抗原)免疫接种3次的小鼠中针对抗原的IFN-γ反应与PBS免疫接种的对照小鼠相比一般不会出现明显差异。相反，在抗原微粒免疫接种3次的小鼠中，以及以抗原微粒和Emulsigen免疫接种3次的小鼠中，可以观察到针对各抗原的IFN-γ反应显著更高。如所预期的那样，在以抗原微粒和Emulsigen免疫接种
3次的小鼠中观察到的针对各抗原的IFN-γ反应比所有其他疫苗接种组显著更高。
3次的小鼠中观察到的针对各抗原的IFN-γ反应比所有其他疫苗接种组显著更高。
[1046] 所述展示神经氨酸酶、M1衣壳蛋白或血凝素抗原的工程化聚酯微粒能够产生抗原特异性的细胞介导的应答，并显著增加IgG1和IgG2抗体的产生。
[1048] 实施例5-土拉热弗朗西斯氏菌聚合物微粒疫苗的免疫原性
[1049] 本实施例描述了为在转化的宿主(此处为大肠杆菌)中生产聚合物微粒所用质粒的构建以及所述聚合物微粒免疫原性的分析，所述聚合物微粒同时展示土拉热弗朗西斯氏菌抗原AcpA和IglC。具有这些抗原的微粒可用作为抗土拉菌病的预防性和治疗性疫苗。
[1050] 材料和方法
[1051] 所 有 动 物 实 验 都 得 到 了 AgResearch Grasslands Animal EthicsCommittee(Palmerston North，New Zealand)的批准。
[1052] 1.质粒构建和在大肠杆菌中生产PHA微粒
[1053] 本实施例中的所有质粒和寡核苷酸列于表6。酶PhaA和PhaB由质粒pMCS69编码。
[1054] 为生产同时展示两种土拉热弗朗西斯氏菌抗原的聚合物微粒，对编码AcpA和IglC抗原的基因进行了密码子优化，由GenScript公司合成，以亚克隆到pET-14b
M-PhaC-接头-MalE的XbaI-SpeI位点及XhoI-BamHI位点，与聚合物微珠形成酶PhaC进行N-末端融合及C-末端融合。AcpA编码基因插入在XbaI-SpeI位点，而IglC编码基因插入在同一质粒的XhoI-BamHI位点。两个基因插入片段均与原始质粒中替换了的M和MalE编码区阅读框相同，得到了pET14B-AcpA-C-IglC质粒。
M-PhaC-接头-MalE的XbaI-SpeI位点及XhoI-BamHI位点，与聚合物微珠形成酶PhaC进行N-末端融合及C-末端融合。AcpA编码基因插入在XbaI-SpeI位点，而IglC编码基因插入在同一质粒的XhoI-BamHI位点。两个基因插入片段均与原始质粒中替换了的M和MalE编码区阅读框相同，得到了pET14B-AcpA-C-IglC质粒。
[1055] AcpA-C-IglC融合蛋白的构建体如SEQ ID No.29所示，其衍生氨基酸序列如SEQ ID No.30所示。
[1056] 表6：质粒和寡核苷酸
[1057]
[1058] 将pET14B-AcpA-C-IglC和pHAS质粒引入拥有pMCS69质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。如实施例1所述在适合于生产生物聚酯微粒的条件下培养转化株。如下文所述分别评估生产AcpA-IglC微粒或野生型微粒的能力。
[1059] 2.聚酯微粒的分离
[1060] 通过破碎细菌，对全细胞裂解物于4℃以4000g离心15分钟使聚酯微粒沉降来分离聚酯颗粒。借助甘油梯度超速离心来纯化微粒。
[1061] 如实施例3所述，利用Bio-Rad蛋白测定法来测定微粒上所附蛋白的浓度。
[1062] 利用Gel DocTM XR来检测相对于微粒上所附总蛋白量而言的AcpA-PhaC-IglC融合蛋白的量，利用Quantity One软件(4.6.2版，Bio-Rad Laboratories)来进行分析，并如实施例3所述来鉴定目的蛋白。
[1063] 3.ELISA
[1064] 土拉热弗朗西斯氏菌聚合物微粒的免疫反应性如实施例3所述通过酶联免疫吸附试验(ELISA)来确定。简而言之，Maxisorb板(Nunc)用纯化了的、在碳酸盐-重碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)(Sigma-Aldrich)中稀释了的PorA-C-PorB微粒或AcpA-IglC微粒或野生型微粒4℃过夜包被。利用该缓冲液进行系列稀释，蛋白浓度范围1mg/ml到0.015mg/ml。洗板并在25℃封闭2小时。
[1065] 板随之以PBS-Tween 20清洗，与针对不同抗原所产生的小鼠抗体一起孵育，清洗，然后再与用含1％(w/v)BSA的PBS稀释了的马抗小鼠IgG∶辣根过氧化物酶缀
合物(Sigma-Aldrich)在室温一起孵育1小时。再次清洗后，加邻苯二胺(OPD)底物
(Sigma-Aldrich)，板在室温孵育30分钟。
合物(Sigma-Aldrich)在室温一起孵育1小时。再次清洗后，加邻苯二胺(OPD)底物
(Sigma-Aldrich)，板在室温孵育30分钟。
[1066] 用0.5M H2SO4终止反应，并记录495nm的光吸收值。
[1067] 4.小鼠免疫接种
[1068] 对6-8周龄的C57BL/6雌鼠(Malaghan Institute，Wellington，NZ)以2周的间隔进行3次肌内免疫接种。3个处理组设置如下：
[1069] a)个体免疫接种野生型微粒(即，由携带pHAS和pMCS69的细菌细胞制备的微粒)；
[1070] b)个体仅免疫接种抗原微粒(即，由携带编码不同抗原-PhaC融合蛋白的质粒和pMCS69的细菌细胞制备的微粒)；
[1071] c)个体免疫接种与20％EmulsigenTM佐剂(MVP Laboratories)混合的不同抗原微粒。
[1072] 各实验设置均纳入了未接种疫苗的对照动物。
[1073] 5.免疫测定
[1074] 小鼠在末次免疫接种后3周麻醉，采血，离心，收集血清，冷冻于-20℃以备分析之用。
[1075] 然后对小鼠实施安乐死，取出脾脏，通过80目网筛制备单细胞悬液。如实施例4所述来处理脾红细胞(RBC)。
[1076] 6.IFN-γ定量
[1077] 在4天温育之后，取培养物上清液，冷冻于-20℃以备分析之用。根据厂商说明利用商购抗体和标准品(BD Pharmingen)通过ELISA(BD Biosciences)来测量上清液中的IFN-γ水平。
[1078] 7.血清抗体定量
[1079] 利用固定化了的用于捕获抗体的抗原展示微粒通过ELISA来测量血清抗体。
[1080] 8.统计学分析
[1081] IFN-γ和抗体反应的分析通过Kruskal-Wallis单因素方差分析(ANOVA)来进行。
[1082] 结果
[1083] 对所有在pMCS69存在下携带pET14B-AcpA-C-IglC和pHAS质粒的细胞进行GC-MS分析来确认聚羟基丁酸聚酯的存在。还进一步利用尼罗红染色通过荧光显微镜检来确认胞内聚酯包涵体的存在。
[1084] 所有在pMCS69存在下携带质粒pET14B-AcpA-C-IglC和pHAS(野生型对照)的细胞中存在聚羟基丁酸，表明phaC聚酯合酶域作为单一或三联融合蛋白存在时保留了聚合物合酶活性。
[1085] 聚合物微粒展示了高水平的蛋白，这是通过表观分子量与由融合蛋白序列推断的分子量直接相对应的突出的蛋白电泳带确定的。这些蛋白的身份利用MALDI-TOF-MS通过胰蛋白酶酶解肽的指纹分析得以确认。ELISA结果表明这些不同抗原展示微粒以剂量依赖性的方式与相应的抗抗原抗体结合，而野生型微粒表现出明显更低的抗体结合。流式细胞术分析结果优选地表明＞98％的抗原微粒结合抗抗原抗体。
[1086] 在重组大肠杆菌中表达编码不同抗原-PhaC融合蛋白的相应杂合基因，能够生产表面展示所述融合蛋白的聚酯微粒。
[1087] 优选地，在免疫接种之后未在任何一只动物中观察到明显的毒性，在实验开展期间小鼠体重并无显著的组间差异，且所有组的小鼠都增重了。免疫接种聚酯微粒的小鼠会在接种部位形成小肿块(直径2.5mm)，但通常不会形成脓疮或化脓，且典型地在整个试验期间是健康的，行为正常，皮毛品质良好。
[1088] 10-100μg剂量的抗原微粒对于在小鼠中生成显著的抗体反应而言是最佳的。此剂量与单独的10-100μg剂量的野生型微粒相比，诱导显著更高的抗体滴度。也可以测试和应用其他剂量。另一实验包括未免疫接种的对照小鼠，对含或不含佐剂的微珠制剂进行了比较，评价结果是与未接种疫苗的小鼠相比，给予抗原微粒的两个疫苗接种组均诱导了显著更高的抗原特异性血清抗体反应。在免疫接种佐以Emulsigen的抗原微粒的小鼠中观察到最高的抗体反应。在两组实验中，IgG1同种型的抗体反应均典型地比IgG2的反应更强。
[1089] 与仅免疫接种了野生型微粒或PBS的小鼠相比，免疫接种了10-100μg抗原微粒的小鼠中细胞介导的抗原应答也显著增强，且仅免疫接种了野生型微粒的小鼠与PBS免疫接种的对照小鼠相比，在细胞介导的应答方面一般无明显差异。
[1090] 10-100μg野生型微粒(无土拉热弗朗西斯氏菌抗原)免疫接种3次的小鼠中针对抗原的IFN-γ反应与PBS免疫接种的对照小鼠相比一般不会出现明显差异。相反，在抗原微粒免疫接种3次的小鼠中，以及以抗原微粒和Emulsigen免疫接种3次的小鼠中，可以观察到针对各抗原的IFN-γ反应显著更高。如所预期的那样，在以抗原微粒和Emulsigen免疫接种3次的小鼠中观察到的针对各抗原的IFN-γ反应比所有其他疫苗接种组显著更高。
[1091] 所述同时展示AcpA和IglC抗原的工程化聚酯微粒能够产生抗原特异性的细胞介导的应答，并显著增加IgG1和IgG2抗体的产生。
[1092] 除了产生体液和细胞介导的免疫应答之外，没有诸如体重减轻的不良副作用，且注射部位没有脓疮和化脓，这都表明所述聚酯微粒耐受良好、安全无毒。
[1093] 实施例6-流产布鲁氏菌聚合物微粒疫苗的免疫原性
[1094] 本实施例描述了为在转化的宿主(此处为大肠杆菌)中生产聚合物微粒所用质粒的构建以及所述聚合物微粒免疫原性的分析，所述聚合物微粒展示流产布鲁氏菌抗原Omp16。如本实施例中所生产的展示该抗原的聚合物微粒可用作为抗布鲁氏菌病的预防性和治疗性疫苗。
[1095] 材料和方法
[1096] 所 有 动 物 实 验 都 得 到 了 AgResearch Grasslands Animal EthicsCommittee(Palmerston North，New Zealand)的批准。
[1097] 1.过表达质粒的构建
[1098] 本实施例中的所有质粒和寡核苷酸列于表7。
[1099] β-酮硫解酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶由质粒pMCS69编码，并通过催化乙酰辅酶A转化成3-羟基丁酰-辅酶A而为聚合物合酶供应底物。
[1100] 为生产展示流产布鲁氏菌抗原Omp16的聚合物微粒，对编码Omp16抗原的基因进行了密码子优化，由GenScript公司合成，以亚克隆到pET-14b PhaC-接头-GFP的
XhoI-BamHI位点，与聚合物微珠形成酶PhaC进行C-末端融合。omp16编码基因插入在
XhoI-BamHI位点。该基因插入片段与原始质粒中替换了的GFP编码区阅读框相同，得到了pET14B-C-omp16质粒。
XhoI-BamHI位点，与聚合物微珠形成酶PhaC进行C-末端融合。omp16编码基因插入在
XhoI-BamHI位点。该基因插入片段与原始质粒中替换了的GFP编码区阅读框相同，得到了pET14B-C-omp16质粒。
[1101] PhaC-omp16融合蛋白的构建体如SEQ ID No.31所示，其衍生氨基酸序列如SEQ ID No.32所示。
[1102] 表7：质粒和寡核苷酸
[1103]
[1104]
[1105] 2.Omp16展示微粒的生产
[1106] 将pET14B-C-omp16和pHAS质粒引入拥有pMCS69质粒的大肠杆菌KRX细胞中。如实施例1所述在适合于生产生物聚酯微粒的条件下培养转化株。
[1107] 3.聚酯微粒的分离
[1108] 如实施例3所述分离聚酯颗粒。如实施例3所述利用Bio-Rad蛋白测定法来测定微粒上所附蛋白的浓度，并如实施例3所述利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)来鉴定目的蛋白。
[1109] 4.ELISA
[1110] 流产布鲁氏菌聚合物微粒的免疫反应性如实施例3所述利用针对不同抗原所产生的小鼠抗体通过酶联免疫吸附试验(ELISA)来确定。
[1111] 5.小鼠免疫接种
[1112] 对6-8周龄的C57BL/6雌鼠(Malaghan Institute，Wellington，NZ)以2周的间隔进行2次腹膜内(i.p.)免疫接种。3个处理组设置如下：
[1113] a)个体免疫接种野生型微粒(即，由携带pHAS和pMCS69的细菌细胞制备的微粒)；
[1114] b)个体仅免疫接种抗原微粒(即，由携带编码不同抗原-PhaC融合蛋白的质粒和pMCS69的细菌细胞制备的微粒)；TM
[1115] c)个体免疫接种与20％Emulsigen 佐剂(MVP Laboratories)混合的不同抗原微粒。
[1116] 各实验设置均纳入了未接种疫苗的对照动物。
[1117] 6.免疫测定
[1118] 小鼠在末次免疫接种后3周麻醉，采血，离心，收集血清，冷冻于-20℃以备分析之用。然后对小鼠实施安乐死，取出脾脏，通过80目网筛制备单细胞悬液。脾红细胞(RBC)利用含17mM TRIS-HCl和140mM NH4Cl的溶液裂解。清洗之后，RBC在补加有2mM谷氨酸-5
(Invitrogen)、100U/mL青霉素(Invitrogen)、100μg/mL链霉素(Invitrogen)、5x10 M
2-巯基乙醇(Sigma)和5％(w/w)胎牛血清(Invitrogen)的达尔伯克改良伊格尔培养基
(Dulbecco’s Modified Eagle media，DMEM)中培养。细胞要么仅在培养基中、要么在含有相应抗原的培养基中于37℃在10％CO2中温育。
(Invitrogen)、100U/mL青霉素(Invitrogen)、100μg/mL链霉素(Invitrogen)、5x10 M
2-巯基乙醇(Sigma)和5％(w/w)胎牛血清(Invitrogen)的达尔伯克改良伊格尔培养基
(Dulbecco’s Modified Eagle media，DMEM)中培养。细胞要么仅在培养基中、要么在含有相应抗原的培养基中于37℃在10％CO2中温育。
[1119] 7.IFN-γ定量
[1120] 在4天温育之后，取培养物上清液，冷冻于-20℃以备分析之用。根据厂商说明利用商购抗体和标准品(BD Pharmingen)通过ELISA(BD Biosciences)来测量上清液中的IFN-γ水平。
[1121] 8.血清抗体定量
[1122] 利用固定化了的用于捕获抗体的抗原展示微粒通过ELISA来测量血清抗体。
[1123] 9.统计学分析
[1124] IFN-γ和抗体反应的分析通过Kruskal-Wallis单因素方差分析(ANOVA)来进行。
[1125] 结果
[1126] 对所有在pMCS69存在下携带pET14B-C-omp16和pHAS质粒的细胞进行GC-MS分析来确认聚羟基丁酸聚酯的存在。还进一步利用尼罗红染色通过荧光显微镜检来确认胞内聚酯包涵体的存在。
[1127] 所有在pMCS69存在下携带质粒pET14B-C-omp16和pHAS(野生型对照)的细胞中存在聚羟基丁酸，表明PhaC聚酯合酶域作为单一或三联融合蛋白存在时保留了聚合物合酶活性。
[1128] 聚合物微粒展示了高水平的蛋白，这是通过表观分子量与由相应融合蛋白序列推断的分子量直接相对应的突出的蛋白电泳带确定的。这些蛋白的身份利用MALDI-TOF-MS通过胰蛋白酶酶解肽的指纹分析得以确认。ELISA结果表明这些不同抗原展示微粒以剂量依赖性的方式与相应的抗抗原抗体结合，而野生型微粒表现出明显更低的抗体结合。流式细胞术分析结果优选地表明＞95％的抗原微粒结合抗抗原抗体。在重组大肠杆菌中表达编码该PhaC-抗原融合蛋白的相应杂合基因，能够生产表面展示所述融合蛋白的聚酯微粒。
[1129] 优选地在免疫接种之后未在任何一只动物中观察到明显的毒性，在实验开展期间小鼠体重并无显著的组间差异，且所有组的小鼠都增重了(数据未显示)。免疫接种聚酯微粒的小鼠典型地在整个试验期间是健康的，行为正常，皮毛品质良好。
[1130] 约10-50μg剂量范围的抗原微粒在小鼠中生成显著的抗体反应。此剂量与单独的10-50μg剂量的野生型微粒相比，诱导显著更高的抗体滴度。也可以测试和应用其他剂量，例如50-500μg。另一实验包括未免疫接种的对照小鼠，对含或不含佐剂的微珠制剂进行了比较，评价结果是与未接种疫苗的小鼠相比，给予抗原微粒的两个疫苗接种组均诱导了显著更高的抗原特异性血清抗体反应。在免疫接种佐以Emulsigen的抗原微粒的小鼠中观察到最高的抗体反应。在两组实验中，IgG1同种型的抗体反应均典型地比IgG2的反应更强。
[1131] 与仅免疫接种了野生型微粒或PBS的小鼠相比，免疫接种了10-50μg抗原微粒的小鼠中细胞介导的抗原应答也显著增强，且仅免疫接种了野生型微粒的小鼠与PBS免疫接种的对照小鼠相比，在细胞介导的应答方面一般无明显差异。
[1132] 10-50μg野生型微粒(无流产布鲁氏菌抗原)免疫接种2次的小鼠中针对抗原的IFN-γ反应与PBS免疫接种的对照小鼠相比一般不会出现明显差异。相反，在抗原微粒免疫接种2次的小鼠中，以及以抗原微粒和Emulsigen免疫接种2次的小鼠中，观察到针对各抗原的IFN-γ反应显著更高。如所预期的那样，在以抗原微粒和Emulsigen免疫接种2次的小鼠中观察到的针对各抗原的IFN-γ反应比所有其他疫苗接种组显著更高。
[1133] 所述展示Omp16抗原的工程化聚酯微粒能够产生抗原特异性的细胞介导的应答，并显著增加IgG1和IgG2抗体的产生。
[1134] 除了产生体液和细胞介导的免疫应答之外，没有诸如体重减轻的不良副作用，且注射部位没有脓疮和化脓，这都表明所述聚酯微粒耐受良好、安全无毒。
[1135] 实施例7-脑膜炎奈瑟菌聚合物微粒疫苗的免疫原性
[1136] 本实施例描述了为在转化的宿主(此处为大肠杆菌)中生产聚合物微粒所用质粒的构建以及所述聚合物微粒免疫原性的分析，所述聚合物微粒展示脑膜炎奈瑟菌抗原PorA、PorB、FetA、ZnuD以及化学交联的或非共价结合的脑膜炎奈瑟菌B群荚膜多糖(CPS)。
具有这些抗原的微粒可用作为抗脑膜炎的预防性和治疗性疫苗。
具有这些抗原的微粒可用作为抗脑膜炎的预防性和治疗性疫苗。
[1137] 材料和方法
[1138] 所 有 动 物 实 验 都 得 到 了 AgResearch Grasslands Animal EthicsCommittee(Palmerston North，New Zealand)的批准。
[1139] 1.质粒构建
[1140] 本实施例中的所有质粒和寡核苷酸列于表8。
[1141] PhaA和PhaB酶由质粒pMCS69编码。利用引物Cys6-XbaI[SEQ ID No.55]和PhaC-C-BamHI[SEQ ID No.56]，由分离自真养雷氏菌H16的基因组DNA作为模板，通
过PCR技术获得了编码6x半胱氨酸-PhaC融合蛋白、且包括翻译起始位点和起始密码
子的DNA片段。该PCR产物连入XbaI、BamHI核酸内切酶处理的pET14B载体中而生成
pET-14b-Cys6-PhaC质粒。
过PCR技术获得了编码6x半胱氨酸-PhaC融合蛋白、且包括翻译起始位点和起始密码
子的DNA片段。该PCR产物连入XbaI、BamHI核酸内切酶处理的pET14B载体中而生成
pET-14b-Cys6-PhaC质粒。
[1142] 为生产同时展示两种脑膜炎奈瑟菌抗原的聚合物微粒，对编码PorA、PorB、FetA、ZnuD抗原的基因进行了密码子优化，由GenScript公司合成，以亚克隆到pET-14b M-PhaC-接头-MalE的XbaI-SpeI位点及XhoI-BamHI位点，与聚合物微珠形成酶PhaC进行N-末端融合及C-末端融合。PorA编码基因插入在XbaI-SpeI位点，而PorB编码基因插入在同一质粒的XhoI-BamHI位点。两个基因插入片段均与原始质粒中替换了的M和MalE编码区阅读框相同，得到了pET 14B-PorA-C-PorB质粒。
[1143] FetA编码基因插入在XbaI-SpeI位点，而ZnuD编码基因插入在同一质粒的XhoI-BamHI位点。两个基因插入片段均与原始质粒中替换了的M和MalE编码区阅读框相同，得到了pET14B-FetA-C-ZnuD质粒。
[1144] Cys6-PhaC融合蛋白的构建体如SEQ ID No.33所示，其衍生氨基酸序列如SEQ ID No.34所示。PorA-C-PorB融合蛋白的构建体如SEQ ID No.35所示，其衍生氨基酸序列如SEQ ID No.36所示。FetA-C-ZnuD融合蛋白的构建体如SEQID No.37所示，其衍生氨基酸序列如SEQ ID No.38所示。
[1145] 表8：质粒和寡核苷酸
[1146]
[1147]
[1148] 2.Cys-6、PorA/B和FetA/ZnuD展示微粒的生产
[1149] 将pET-14b-Cys6-PhaC、pET 14B-PorA-C-PorB、pET 14B-FetA-C-ZnuD和pHAS质粒引入拥有pMCS69质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。如实施例1所述在适合于生产生物聚酯微粒的条件下培养转化株。
[1150] 3.聚酯微粒的分离
[1151] 通过破碎细菌，对全细胞裂解物于4℃以4000g离心15分钟使聚酯微粒沉降来分离聚酯颗粒。借助甘油梯度超速离心来纯化微粒。
[1152] 如实施例3所述，利用Bio-Rad蛋白测定法来测定微粒上所附蛋白的浓度。在浓度测定之后，蛋白通过SDS-PAGE分离，并用SimplyBlue安全染料(Invitrogen)染色。
[1153] 利用Gel DocTM XR来检测相对于微粒上所附总蛋白量而言的Cys6-C、PorA-C-PorB或FetA-C-ZnuD融合蛋白的量，并利用Quantity One软件(4.6.2版，Bio-Rad Laboratories)来进行分析。利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)来鉴定目的蛋白。至于Cys6-C，利用N-端测序法来确认PhaCN-末端6个半胱氨酸残基的存在。
[1154] 4.脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖CPS与Cys6聚酯微粒的化学交联
[1155] 荚膜多糖(CPS)与Cys6微粒的化学交联如之前Annunziao et al.所述利用纯化的脑膜炎奈瑟菌CPS和化学交联剂PMPI(N-[p-马来酰亚胺基苯基]异氰酸酯)而实现。PMPI是进行羟基与巯基偶联的异型双功能交联剂，能够使脑膜炎奈瑟菌CPS和展示6个半胱氨酸残基的聚合物微粒进行共价偶联，所述6个半胱氨酸残基设计在聚合物微粒形成酶即真养雷氏菌PHA合酶的N末端。
[1156] 5.脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖CPS与特异性抗体展示聚酯微粒的非共价结合
[1157] 通过接种兔子而产生CPS特异性抗体。对单特异性多克隆血清进行A蛋白亲和纯化。所得到的纯化了的IgG结合到展示ZZ结构域的聚酯微粒上。这些微粒随之与脑膜炎奈瑟菌CPS以1∶1的干重比一起孵育30分钟。这能够使CPS与聚酯微粒特异性地非共价结合。
[1158] 6.ELISA
[1159] 脑膜炎奈瑟菌聚合物微粒的免疫反应性如实施例3所述利用针对不同抗原所产生的小鼠抗体通过酶联免疫吸附试验(ELISA)来确定。
[1160] 7.小鼠免疫接种
[1161] 对6-8周龄的C57BL/6雌鼠(Malaghan Institute，Wellington，NZ)以2周的间隔进行3次肌内免疫接种。3个处理组设置如下：
[1162] a)个体免疫接种野生型微粒(即，由携带pHAS和pMCS69的细菌细胞制备的微粒)；
[1163] b)个体仅免疫接种抗原微粒(即，由携带编码不同抗原-PhaC融合蛋白的质粒和pMCS69的细菌细胞制备的微粒)；
[1164] c)个体免疫接种与20％EmulsigenTM佐剂(MVP Laboratories)混合的不同抗原微粒。
[1165] 各实验设置均纳入了未接种疫苗的对照动物。
[1166] 8.免疫测定
[1167] 小鼠在末次免疫接种后3周麻醉，采血，离心，收集血清，冷冻于-20℃以备分析之用。
[1168] 然后对小鼠实施安乐死，取出脾脏，通过80目网筛制备单细胞悬液。如实施例4所述来处理脾红细胞(RBC)。
[1169] 9.IFN-γ定量
[1170] 在4天温育之后，取培养物上清液，冷冻于-20℃以备分析之用。如实施例4所述，通过ELISA(BD Biosciences)来测量上清液中的IFN-γ水平。
[1171] 10.血清抗体定量
[1172] 利用固定化了的用于捕获抗体的抗原展示微粒通过ELISA来测量血清抗体。
[1173] 11.统计学分析
[1174] IFN-γ和抗体反应的分析通过Kruskal-Wallis单因素方差分析(ANOVA)来进行。
[1175] 结果
[1176] 对 所 有 在pMCS69存 在 下 携 带 pET-14b-Cys6-PhaC、pET14B-PorA-C-PorB、pET14B-FetA-C-ZnuD和pHAS质粒的细胞进行GC-MS分析来确认聚羟基丁酸聚酯的存在。还进一步利用尼罗红染色通过荧光显微镜检来确认胞内聚酯包涵体的存在。
[1177] 所有在pMCS69存在下携带质粒pET-14b-Cys6-PhaC、pET14B-PorA-C-PorB、pET14B-FetA-C-ZnuD和pHAS(野生型对照)的细胞中存在聚羟基丁酸，表明phaC聚酯合酶域作为单一或三联融合蛋白存在时保留了聚合物合酶活性。
[1178] 聚合物微粒展示了高水平的蛋白，这是通过表观分子量与由相应融合蛋白序列推断的分子量直接相对应的突出的蛋白电泳带确定的。这些蛋白的身份利用MALDI-TOF-MS通过胰蛋白酶酶解肽的指纹分析得以确认。ELISA结果表明这些不同抗原展示微粒以剂量依赖性的方式与相应的抗抗原抗体结合，而野生型微粒表现出明显更低的抗体结合。流式细胞术分析结果优选地表明＞98％的抗原微粒结合抗抗原抗体。
[1179] 在重组大肠杆菌中表达编码不同抗原-PhaC融合蛋白的相应杂合基因，能够生产表面展示所述融合蛋白的聚酯微粒。
[1180] 优选地，在免疫接种之后未在任何一只动物中观察到明显的毒性，在实验开展期间小鼠体重并无显著的组间差异，且所有组的小鼠都增重了。免疫接种聚酯微粒的小鼠会在接种部位形成小肿块(直径2.5mm)，但通常不会形成脓疮或化脓，且所有小鼠典型地在整个试验期间是健康的，行为正常，皮毛品质良好。
[1181] 5-50μg剂量的抗原微粒在小鼠中生成显著的抗体反应。此剂量与单独的5-50μg剂量的野生型微粒相比，诱导显著更高的抗体滴度。也可以测试和应用其他剂量。
另一实验包括未免疫接种的对照小鼠，对含或不含佐剂的微珠制剂进行了比较，评价结果是与未接种疫苗的小鼠相比，给予抗原微粒的两个疫苗接种组均诱导了显著更高的抗原特异性血清抗体反应。在免疫接种佐以Emulsigen的抗原微粒的小鼠中观察到最高的抗体反应。在两组实验中，IgG1同种型的抗体反应均典型地比IgG2的反应更强。
另一实验包括未免疫接种的对照小鼠，对含或不含佐剂的微珠制剂进行了比较，评价结果是与未接种疫苗的小鼠相比，给予抗原微粒的两个疫苗接种组均诱导了显著更高的抗原特异性血清抗体反应。在免疫接种佐以Emulsigen的抗原微粒的小鼠中观察到最高的抗体反应。在两组实验中，IgG1同种型的抗体反应均典型地比IgG2的反应更强。
[1182] 与仅免疫接种了野生型微粒或PBS的小鼠相比，免疫接种了5-50μg抗原微粒的小鼠中细胞介导的抗原应答也显著增强，且仅免疫接种了野生型微粒的小鼠与PBS免疫接种的对照小鼠相比，在细胞介导的应答方面一般无明显差异。
[1183] 40μg野生型微粒(无脑膜炎奈瑟菌抗原)免疫接种3次的小鼠中针对抗原的IFN-γ反应与PBS免疫接种的对照小鼠相比一般不会出现明显差异。相反，在抗原微粒免疫接种3次的小鼠中，以及以抗原微粒和Emulsigen免疫接种3次的小鼠中，会观察到针对各抗原的IFN-γ反应显著更高。如所预期的那样，在以抗原微粒和Emulsigen免疫接种3次的小鼠中观察到的针对各抗原的IFN-γ反应比所有其他疫苗接种组显著更高。
[1184] 所述展示抗原PorA、PorB、FetA、ZnuD和CPS的工程化聚酯微粒能够产生抗原特异性的细胞介导的应答，并显著增加IgG1和IgG2抗体的产生。
[1185] 除了产生体液和细胞介导的免疫应答之外，没有诸如体重减轻的不良副作用，且注射部位没有脓疮和化脓，这都表明所述聚酯微粒耐受良好、安全无毒。
[1186] 实施例8-炭疽芽孢杆菌聚合物微粒疫苗的免疫原性
[1187] 本实施例描述了为在转化的宿主(此处为大肠杆菌)中生产聚合物微粒所用质粒的构建以及所述聚合物微粒免疫原性的分析，所述聚合物微粒展示炭疽芽孢杆菌抗原PA83——炭疽毒素的一个无毒亚基。如本实施例中所生产的展示该抗原的聚合物微粒可用作为炭疽病的预防性和治疗性疫苗。
[1188] 材料和方法
[1189] 所 有 动 物 实 验 都 得 到 了 AgResearch Grasslands Animal EthicsCommittee(Palmerston North，New Zealand)的批准。
[1190] 1.质粒的构建
[1191] 本实施例中的所有质粒和寡核苷酸列于表9。酶PhaA和PhaB由质粒pMCS69编码。
[1192] 为生产展示炭疽芽孢杆菌PA83抗原(为炭疽毒素无毒亚基PA的截短型变体)的聚合物微粒，对编码抗原PA83的基因进行了密码子优化，并由GenScript公司合成，以亚克隆到pET-14b PhaC-接头-GFP的XhoI-BamHI位点，与聚合物微珠形成酶PhaC进行C-末
端融合。PA83编码基因插入在XhoI-BamHI位点。该基因插入片段与原始质粒中替换了的GFP编码区阅读框相同，得到了pET14B-PhaC-PA83质粒。
端融合。PA83编码基因插入在XhoI-BamHI位点。该基因插入片段与原始质粒中替换了的GFP编码区阅读框相同，得到了pET14B-PhaC-PA83质粒。
[1193] PhaC-PA83融合蛋白的构建体如SEQ ID No.39所示，其衍生氨基酸序列如SEQ ID No.40所示。
[1194] 表9：质粒和寡核苷酸
[1195]
[1196] 2.PA83展示微粒的生产
[1197] 将pET14B-C-PA83和pHAS质粒引入拥有pMCS69质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。如实施例1所述在适合于生产生物聚酯微粒的条件下培养转化株。
[1198] 3.气相色谱质谱(GC-MS)
[1199] 拥有不同质粒的细菌细胞的聚酯含量与其体内的PhaC合酶活性相对应。通过气相色谱质谱(GC-MS)分析评估所积累的聚酯量来确定PhaC合酶活性，特别是评估PhaC-炭疽芽孢杆菌抗原融合蛋白是否仍然催化聚酯合成及介导胞内颗粒形成。在通过酸催化的甲醇解作用将聚酯转化为3-羟基甲酯之后通过GC-MS来定量确定聚酯含量。
[1200] 4.聚酯微粒的分离
[1201] 如实施例3所述分离聚酯颗粒，并如实施例3所述利用Bio-Rad蛋白测定法来测定微粒上所附蛋白的浓度。
[1202] 5.ELISA
[1203] 炭疽芽孢杆菌聚合物微粒的免疫反应性如实施例3所述利用针对不同抗原所产生的小鼠抗体通过酶联免疫吸附试验(ELISA)来确定。
[1204] 6.流式细胞术分析
[1205] 25μg不同的纯化了的抗原展示微粒或野生型微粒用如实施例3表4所述的冰冻的流式细胞术分析缓冲液清洗两次，并与小鼠抗抗原抗体一起孵育。在清洗之后，微粒用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的大鼠抗小鼠抗体(BD Pharmingen，CA，USA)染色，置于冰上暗孵育30分钟，并再次清洗。利用BD FACScalibur (BDBiosciences，CA，USA)来采集各个样品的至少10,000个事件，并利用CellQuest软件来分析。
[1206] 7.小鼠免疫接种
[1207] 对6-8周龄的C57BL/6雌鼠(Malaghan Institute，Wellington，NZ)以2周的间隔进行3次肌内免疫接种。3个处理组设置如下：
[1208] a)个体免疫接种野生型微粒(即，由携带pHAS和pMCS69的细菌细胞制备的微粒)；
[1209] b)个体仅免疫接种抗原微粒(即，由携带编码不同抗原-PhaC融合蛋白的质粒和pMCS69的细菌细胞制备的微粒)；
[1210] c)个体免疫接种与20％EmulsigenTM佐剂(MVP Laboratories)混合的不同抗原微粒。
[1211] 各实验设置均纳入了未接种疫苗的对照动物。
[1212] 8.免疫测定
[1213] 小鼠在末次免疫接种后3周麻醉，采血，离心，收集血清，冷冻于-20℃以备分析之用。
[1214] 然后对小鼠实施安乐死，取出脾脏，通过80目网筛制备单细胞悬液。脾红细胞(RBC)利用含17mM TRIS-HCl和140mM NH4Cl的溶液裂解。清洗之后，RBC在补加有2mM谷氨-5酸(Invitrogen)、100U/mL青霉素(Invitrogen)、100μg/mL链霉素(Invitrogen)、5x10 M
2-巯基乙醇(Sigma)和5％(w/w)胎牛血清(Invitrogen)的达尔伯克改良伊格尔培养基
(Dulbecco’s Modified Eagle media，DMEM)中培养。
2-巯基乙醇(Sigma)和5％(w/w)胎牛血清(Invitrogen)的达尔伯克改良伊格尔培养基
(Dulbecco’s Modified Eagle media，DMEM)中培养。
[1215] 9.IFN-γ定量
[1216] 在4天温育之后，取培养物上清液，冷冻于-20℃以备分析之用。根据厂商说明利用商购抗体和标准品(BD Pharmingen)通过ELISA(BD Biosciences)来测量上清液中的IFN-γ水平。
[1217] 10.血清抗体定量
[1218] 利用固定化了的用于捕获抗体的抗原展示微粒通过ELISA来测量血清抗体。
[1219] 11.统计学分析
[1220] IFN-γ和抗体反应的分析通过Kruskal-Wallis单因素方差分析(ANOVA)来进行。
[1221] 结果
[1222] 对所有在pMCS69存在下携带pET14B-C-PA83和pHAS质粒的细胞进行GC-MS分析来确认聚羟基丁酸聚酯的存在。还进一步利用尼罗红染色通过荧光显微镜检来确认胞内聚酯包涵体的存在。
[1223] 所有在pMCS69存在下携带质粒pET14B-C-PA83和pHAS(野生型对照)的细胞中存在聚羟基丁酸，表明PhaC聚酯合酶域作为单一或三联融合蛋白存在时保留了聚合物合酶活性。
[1224] 聚合物微粒展示了高水平的蛋白，这是通过表观分子量与由相应融合蛋白序列推断的分子量直接相对应的突出的蛋白电泳带确定的。这些蛋白的身份利用MALDI-TOF-MS通过胰蛋白酶酶解肽的指纹分析得以确认。ELISA结果表明这些不同抗原展示微粒以剂量依赖性的方式与相应的抗抗原抗体结合，而野生型微粒表现出明显更低的抗体结合。流式细胞术分析结果优选地表明＞96％的抗原微粒结合抗抗原抗体。
[1225] 在重组大肠杆菌中表达编码该PhaC-抗原融合蛋白的相应杂合基因，能够生产表面展示所述融合蛋白的聚酯微粒。
[1226] 优选地，在免疫接种之后未在任何一只动物中观察到明显的毒性，在实验开展期间小鼠体重并无显著的组间差异，且所有组的小鼠都增重了(数据未显示)。免疫接种聚酯微粒的小鼠会在接种部位形成小肿块(直径2.5mm)，但通常不会形成脓疮或化脓，且典型地在整个试验期间是健康的，行为正常，皮毛品质良好。
[1227] 40μg剂量的抗原微粒足以在小鼠中生成显著的抗体反应。此剂量与单独的40μg剂量的野生型微粒相比，诱导显著更高的抗体滴度。也可以测试和应用其他剂量。另一实验包括未免疫接种的对照小鼠，对含或不含佐剂的微珠制剂进行了比较，评价结果是与未接种疫苗的小鼠相比，给予抗原微粒的两个疫苗接种组均诱导了显著更高的抗原特异性血清抗体反应。在免疫接种佐以Emulsigen的抗原微粒的小鼠中可观察到最高的抗体反应。在两组实验中，IgG1同种型的抗体反应均典型地比IgG2的反应更强。
[1228] 与仅免疫接种了野生型微粒或PBS的小鼠相比，免疫接种了10μg或40μg抗原微粒的小鼠中细胞介导的抗原应答也显著增强，且仅免疫接种了野生型微粒的小鼠与PBS免疫接种的对照小鼠相比，在细胞介导的应答方面一般无明显差异。
[1229] 40μg野生型微粒(无炭疽芽孢杆菌抗原)免疫接种3次的小鼠中针对抗原的IFN-γ反应与PBS免疫接种的对照小鼠相比一般不会出现明显差异。相反，在抗原微粒免疫接种3次的小鼠中，以及以抗原微粒和Emulsigen免疫接种3次的小鼠中，可以观察到针对各抗原的IFN-γ反应显著更高。如所预期的那样，在以抗原微粒和Emulsigen免疫接种
3次的小鼠中观察到的针对各抗原的IFN-γ反应比所有其他疫苗接种组显著更高。
3次的小鼠中观察到的针对各抗原的IFN-γ反应比所有其他疫苗接种组显著更高。
[1230] 所述展示PA83抗原的工程化聚酯微粒能够产生抗原特异性的细胞介导的应答，并显著增加IgG1和IgG2抗体的产生。
[1231] 除了产生体液和细胞介导的免疫应答之外，没有诸如体重减轻的不良副作用，且注射部位没有脓疮和化脓，这都表明所述聚酯微粒耐受良好、安全无毒。
[1232] 实施例9-丙肝病毒聚合物微粒疫苗在小鼠体内的免疫原性
[1233] 本实施例描述了用包含Hep-C抗原的聚合物微粒对哺乳动物模型进行免疫接种。
[1234] 材料和方法
[1235] 所 有 动 物 实 验 都 得 到 了 AgResearch Grasslands Animal EthicsCommittee(Palmerston North，New Zealand)的批准。
[1236] 1.质粒构建和聚酯聚合物微粒的分离
[1237] 如实施例1所述构建了用来以大肠杆菌作为宿主生产展示丙肝病毒核心抗原的聚合物微粒的质粒。
[1238] 通过破碎细菌，对全细胞裂解物于4℃以6000g离心15分钟使聚合物微粒沉降来分离聚酯颗粒。借助甘油梯度超速离心来纯化微粒。根据厂商说明(Bio-Rad)利用
TM
Bio-Rad蛋白测定法来测定蛋白浓度。利用Gel Doc XR来检测相对于聚合物微粒上所附总蛋白量而言的Hep C:PhaC融合蛋白的量，并利用Quantity One软件(4.6.2版，Bio-Rad Laboratories)来进行分析。Hep C抗原约占大肠杆菌中聚合物微粒总蛋白的6.7％，占乳酸乳球菌中聚合物微粒总蛋白的25％。目的蛋白的身份利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)得到了确认。
TM
Bio-Rad蛋白测定法来测定蛋白浓度。利用Gel Doc XR来检测相对于聚合物微粒上所附总蛋白量而言的Hep C:PhaC融合蛋白的量，并利用Quantity One软件(4.6.2版，Bio-Rad Laboratories)来进行分析。Hep C抗原约占大肠杆菌中聚合物微粒总蛋白的6.7％，占乳酸乳球菌中聚合物微粒总蛋白的25％。目的蛋白的身份利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)得到了确认。
[1239] 2.ELISA
[1240] Hep C聚合物微粒的免疫反应性如实施例3所述是通过酶联免疫吸附试验(ELISA)确定的。清洗之后，板与小鼠抗Hep C抗体(Devatal，USA)一起孵育，用PBST清洗，然后与用含1％(w/v)BSA的PBS稀释了的生物素化抗小鼠IgG(Sigma-Aldrich)在室温一起孵育1小时。于室温再孵育1小时之后，用PBST洗板，加链霉亲合素-HRP缀合物，再孵育1小时。再次清洗后，加邻苯二胺(OPD)底物(Sigma-Aldrich)，板在室温孵育30分钟。
[1241] 在VERSAax酶标仪上记录490nm的光吸收值。
[1242] 3.小鼠免疫接种
[1243] 对6-8周龄的C57BL/6雌鼠(Malaghan Institute，Wellington，NZ)隔周进行3次皮下免疫接种，但商购重组Hep C抗原处理组除外。所述商购重组Hep C抗原(来源于大肠杆菌)由Devatal公司(USA)公司获得，含有丙肝病毒核衣壳免疫显性区域。据供货商显示，通过10％PAGE(考马斯亮蓝染色)确定抗原纯度＞95％，
[1244] 6个处理组(每组n＝6)设置如下：
[1245] a)个体免疫接种处于完全弗氏佐剂(CFA)中的商购Hep C抗原(30μg)——仅接种疫苗1次。
[1246] b) 个 体 免 疫 接 种 商 购 Hep C 抗 原 (30μg) 和 EmulsigenTM 佐 剂(MVPLaboratories)——仅接种疫苗1次。
[1247] c)个体免疫接种PBS和20％EmulsigenTM佐剂(MVP Laboratories)。
[1248] d)个体免疫接种与20％EmulsigenTM佐剂(MVP Laboratories)混合的Hep C聚合物微粒(10μg)。
[1249] e)个体免疫接种与20％EmulsigenTM佐剂(MVP Laboratories)混合的Hep C聚合物微粒(30μg)。
[1250] f)个体免疫接种与20％EmulsigenTM佐剂(MVP Laboratories)混合的野生型聚合物微粒(大肠杆菌宿主)。
[1251] 各实验设置均纳入了未接种疫苗的对照动物。
[1252] 4.免疫测定
[1253] 小鼠在末次免疫接种后3周按每克体重应用87μg氯胺酮(ParnellLaboratories，Australia)和2.6μg盐酸甲苯噻嗪(Bayer，Germany)进行麻醉。采血，离心，收集血清，冷冻于-20℃以备分析之用。
[1254] 然后对小鼠实施安乐死，取出脾脏，通过80目网筛制备单细胞悬液。如实施例4所述来处理脾红细胞(RBC)。细胞要么仅在培养基中、要么在含有5μg/mL重组Hep C抗原的培养基中于37℃在10％CO2中温育。
[1255] 5.IFN-γ定量
[1256] 在4天温育之后，取培养物上清液，冷冻于-20℃以备分析之用。根据厂商说明利用商购抗体和标准品(BD Pharmingen)通过ELISA(BD Biosciences)来测量上清液中的IFN-γ水平。
[1257] 6.血清抗体定量
[1258] 按照厂商建议利用抗Hep C单克隆抗体(Devatal)通过ELISA来测量血清抗体。简而言之，Maxisorb(Nunc)板用3μg/mL重组Hep C过夜包被，用1％BSA封闭，并用PBST清洗。添加系列稀释的血清(1∶50到1∶156250)并孵育。清洗之后，添加抗小鼠IgG1:HRP或IgG2c:HRP(ICL，USA)并孵育微孔板。洗板，加TMB作为底物，之后在VERSAmax酶标仪上进行450nm的读出。
[1259] 对抗Hep C单克隆抗体进行了滴定并纳入作为IgG1板的阳性对照。结果表达为1∶50稀释血清450nm处的光密度。
[1260] 7.统计学分析
[1261] IFN-γ和抗体反应的分析通过Kruskal-Wallis单因素方差分析(ANOVA)来进行，显著性水平P＜0.05。
[1262] 结果
[1263] 如图1所示，Hep C聚合物微粒的反应性表现为对Hep C抗体的剂量依赖性反应。
[1264] 10μg/mL剂量的Hep C聚合物微粒与30μg/mL Hep C聚合物微粒相比，引发了更大的IgG1抗体反应和更大的IgG2抗体反应(分别参见图2和3)。与单独的重组Hep C抗原相比，两种剂量的Hep C聚合物微粒引发的IgG1和IgG2抗体反应均明显减弱(分别
参见图2和3)。
参见图2和3)。
[1265] 如图4所示，与免疫接种了野生型聚合物微粒(P＜0.05)、单独的重组Hep C抗原(P＜0.05)或单独的PBS(p＜0.05)的小鼠相比，在免疫接种30μg Hep C聚合物微粒的小鼠中细胞介导的针对Hep C核心抗原的应答显著增强。实际上，仅免疫接种抗原的小鼠与PBS免疫接种的对照小鼠相比在细胞介导的应答方面没有明显差异。
[1266] 讨论
[1267] 在大肠杆菌中生产的展示Hep C核心抗原的工程化聚合物微粒能够针对Hep C抗原刺激产生靶向细胞介导的应答。值得注意的是，免疫接种单独的抗原(即，不含本发明聚合物微粒的抗原)在引发细胞介导的应答方面是无效的，不过能够引发强的体液应答。
[1268] 与IgG1应答相比，本发明的Hep C聚合物微粒能够引发更强的IgG2体液应答。IgG2抗体参与刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，这些数据支持Hep C聚合物微粒能够直接和间接地有效刺激互补方面的细胞介导的应答的这一观点。
[1269] 这些结果证明了该疫苗递送系统引发不同层面免疫应答的多功能性和潜能，从而有效引发细胞介导的免疫应答，而对低效率体液应答的刺激次之。
[1270] 没有诸如体重减轻的不良副作用，且注射部位没有脓疮和化脓，这都证明所述聚酯微粒耐受良好、安全无毒。
[1271] 实施例10-登革病毒聚合物微粒的免疫原性
[1272] 本实施例描述了为在转化的宿主(此处为大肠杆菌)中生产聚合物微粒所用质粒的构建以及所述聚合物微粒免疫原性的分析，所述聚合物微粒展示登革病毒的被膜蛋白(E)和膜蛋白(M)，两者均为该病毒体表面表达的免疫原性蛋白。如本实施例中所生产的具有该抗原的聚合物微粒可用作为抗登革病毒的预防性和治疗性疫苗。
[1273] 材料和方法
[1274] 所 有 动 物 实 验 都 得 到 了 AgResearch Grasslands Animal EthicsCommittee(Palmerston North，New Zealand)的批准。
[1275] 1.过表达质粒的构建
[1276] 本实施例中的所有质粒和寡核苷酸列于表10。β-酮硫解酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶由质粒pMCS69编码，并通过催化乙酰辅酶A转化成3-羟基丁酰-辅酶A而为聚合物合酶供应底物。
[1277] 为生产展示登革病毒血清型1-4E和M的聚合物微粒，对编码E和M抗原的基因进行了密码子优化，由GenScript公司合成，以亚克隆到pET-14b M-PhaC-接头-MalE的XbaI-SpeI位点及XhoI-BamHI位点，与聚合物微珠形成酶PhaC进行N-末端融合及C-末端融合。omp16编码基因插入在XhoI-BamHI位点。该基因插入片段与原始质粒中替换了的GFP编码区阅读框相同，得到了pET14B-C-omp16质粒。
[1278] E1-PhaC-M1融合蛋白的构建体如SEQ ID No.41所示，其衍生氨基酸序列如SEQ ID No.42所示。E2-PhaC-M2融合蛋白的构建体如SEQ ID No.43所示，其衍生氨基酸序列如SEQ ID No.44所示。E3-PhaC-M3融合蛋白的构建体如SEQID No.45所示，其衍生氨基酸序列如SEQ ID No.46所示。E4-PhaC-M1融合蛋白的构建体如SEQ ID No.47所示，其衍生氨基酸序列如SEQ ID No.48所示。
[1279] 表10：质粒和寡核苷酸
[1280]
[1281] 2.登革病毒血清型1-4E和M展示微粒的生产
[1282] 将pET14B-E1-C-M1、pET14B-E2-C-M2、pET14B-E3-C-M3或pET14B-E4-C-M4与pHAS质粒引入拥有pMCS69质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。如实施例1所述在适合于生产生物聚酯微粒的条件下培养转化株。如下文所述分别评估生产登革病毒E-PhaC-M微粒或野生型微粒的能力。
[1283] 3.气相色谱质谱(GC-MS)
[1284] 拥有不同质粒的细菌细胞的聚酯含量与其体内的PhaC合酶活性相对应。通过气相色谱质谱(GC-MS)分析评估所积累的聚酯量来确定PhaC合酶活性，特别是确认PhaC-登革病毒血清型1-4E和M抗原融合蛋白催化聚酯合成及介导胞内颗粒形成。在通过酸催化的甲醇解作用将聚酯转化为3-羟基甲酯之后通过GC-MS来定量确定聚酯含量。
[1285] 4.聚酯微粒的分离
[1286] 通过破碎细菌，对全细胞裂解物于4℃以4000g离心15分钟使聚酯微粒沉降来分离聚酯颗粒。借助甘油梯度超速离心来纯化微粒。
[1287] 如实施例3所述，利用Bio-Rad蛋白测定法来测定微粒上所附蛋白的浓度。在浓度测定之后，蛋白通过SDS-PAGE分离，并用SimplyBlue安全染料(Invitrogen)染色。利用Gel DocTM XR来检测相对于微粒上所附总蛋白量而言的E-PhaC-M融合蛋白的量，并利用Quantity One软件(4.6.2版，Bio-Rad Laboratories)来进行分析。从胶上切下目的蛋白，并利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)来进行胰蛋白酶酶解肽的指纹分析，这能够鉴定到融合蛋白结构域。
[1288] 5.ELISA
[1289] 登革病毒聚合物微粒的免疫反应性如实施例3所述通过酶联免疫吸附试验(ELISA)来确定。简而言之，Maxisorb板(Nunc)用纯化了的、在碳酸盐-重碳酸盐包被
缓冲液(pH 9.6)(Sigma-Aldrich)中稀释了的E-PhaC-M微粒或野生型微粒4℃过夜包
被。利用该缓冲液进行系列稀释，蛋白浓度范围1mg/ml到0.015mg/ml。洗板并在25℃封闭2小时(见表4)。板随之以PBS-Tween 20清洗，与针对不同抗原所产生的小鼠抗体一
起孵育，清洗，然后再与用含1％(w/v)BSA的PBS稀释了的马抗小鼠IgG∶辣根过氧化物酶缀合物(Sigma-Aldrich)在室温一起孵育1小时。再次清洗后，加邻苯二胺(OPD)底物(Sigma-Aldrich)，板在室温孵育30分钟。用0.5M H2SO4终止反应，并记录495nm的光吸收值。
缓冲液(pH 9.6)(Sigma-Aldrich)中稀释了的E-PhaC-M微粒或野生型微粒4℃过夜包
被。利用该缓冲液进行系列稀释，蛋白浓度范围1mg/ml到0.015mg/ml。洗板并在25℃封闭2小时(见表4)。板随之以PBS-Tween 20清洗，与针对不同抗原所产生的小鼠抗体一
起孵育，清洗，然后再与用含1％(w/v)BSA的PBS稀释了的马抗小鼠IgG∶辣根过氧化物酶缀合物(Sigma-Aldrich)在室温一起孵育1小时。再次清洗后，加邻苯二胺(OPD)底物(Sigma-Aldrich)，板在室温孵育30分钟。用0.5M H2SO4终止反应，并记录495nm的光吸收值。
[1290] 6.流式细胞术分析
[1291] 30μg不同的纯化了的抗原展示微粒或野生型微粒用如实施例3表4所述的冰冻的流式细胞术分析缓冲液清洗两次，并与小鼠抗抗原抗体一起孵育。在清洗之后，微粒用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的大鼠抗小鼠抗体(BD Pharmingen，CA，USA)染色，置于冰上暗孵育30分钟，并再次清洗。利用BD FACScalibur(BD Biosciences，CA，USA)来采集各个样品的至少15,000个事件，并利用CellQuest软件来分析。
[1292] 7.小鼠免疫接种
[1293] 对6-8周龄的C57BL/6雌鼠(Malaghan Institute，Wellington，NZ)以2周的间隔进行2次腹膜内(i.p.)免疫接种。3个处理组设置如下：
[1294] a)个体免疫接种野生型微粒(即，由携带pHAS和pMCS69的细菌细胞制备的微粒)；
[1295] b)个体仅免疫接种抗原微粒(即，由携带编码不同抗原-PhaC融合蛋白的质粒和pMCS69的细菌细胞制备的微粒)；和
[1296] c)个体免疫接种与20％EmulsigenTM佐剂(MVP Laboratories)混合的不同抗原微粒。
[1297] 各实验设置均纳入了未接种疫苗的对照动物。
[1298] 8.免疫测定
[1299] 小鼠在末次免疫接种后3周麻醉，采血，离心，收集血清，冷冻于-20℃以备分析之用。然后对小鼠实施安乐死，取出脾脏，通过80目网筛制备单细胞悬液。如实施例4所述来处理脾红细胞(RBC)。
[1300] 9.空斑减少中和试验
[1301] 通过空斑减少中和试验来研究免疫接种小鼠血清中登革病毒中和抗体的存在。系列稀释的血清进行热灭活，与100个空斑形成单位的同源和异源血清型病毒混合，然后在37℃孵育1小时。所述血清病毒混合物与Vero单层细胞一起孵育1小时，然后铺上一层含琼脂糖的培养基。在试验第5天对病毒空斑进行染色。空斑数目减少80％的最高稀释度即为空斑减少中和试验80(PRNT80)。
[1302] 10.细胞因子和趋化因子的定量
[1303] 在4天温育之后，取培养物上清液，冷冻于-20℃以备分析之用。根据厂商说明利用商购抗体和标准品(EBiosciene)通过ELISA和/或FACS(EBioscience)来测量上清液中的细胞因子和趋化因子水平。
[1304] 11.小鼠病毒保护试验
[1305] 利用小鼠激发模型来确定含和不含佐剂的登革病毒E和M抗原提呈微粒制剂的功效。如上文第1节材料和方法部分所述，利用1、5和10μg的剂量，对13天的断奶小鼠进行免疫接种。在免疫接种之后，小鼠用100LD50的登革病毒小鼠适应株进行脑内注射(IC)激发。在激发后21天监测发病率和死亡率。
[1306] 12.血清抗体定量
[1307] 利用固定化了的用于捕获抗体的抗原展示微粒通过ELISA来测量血清抗体。
[1308] 13.统计学分析
[1309] 细胞因子、趋化因子和抗体反应的分析通过Kruskal-Wallis单因素方差分析(ANOVA)来进行。
[1310] 结果
[1311] 对所有在pMCS69存在下携带pET14B-E1-C-M1、pET14B-E2-C-M2、pET14B-E3-C-M3或pET14B-E4-C-M4和pHAS质粒的细胞进行GC-MS分析来确认聚羟基丁酸聚酯的存在。还进一步利用尼罗红染色通过荧光显微镜检来确认胞内聚酯包涵体的存在。所有在pMCS69存在下携带质粒pET14B-E1-C-M1、pET14B-E2-C-M2、pET14B-E3-C-M3或pET14B-E4-C-M4和pHAS(野生型对照)的细胞中存在聚羟基丁酸，表明PhaC聚酯合酶域作为单一或三联融合蛋白存在时保留了聚合物合酶活性。
[1312] 微粒展示了高水平的蛋白，这是通过表观分子量与由相应融合蛋白序列推断的分子量直接相对应的突出的蛋白电泳带确定的。这些蛋白的身份利用MALDI-TOF-MS通过胰蛋白酶酶解肽的指纹分析得以确认。ELISA结果表明这些不同抗原展示微粒以剂量依赖性的方式与相应的抗抗原抗体结合，而野生型微粒表现出明显更低的抗体结合。流式细胞术分析结果优选地表明＞97％的抗原微粒结合抗抗原抗体。在重组大肠杆菌中表达编码所述PhaC-抗原融合蛋白的相应杂合基因，能够生产表面展示所述融合蛋白的聚酯微粒。
[1313] 优选地，在免疫接种之后未在任何一只动物中观察到明显的毒性，在实验开展期间小鼠体重并无显著的组间差异，且所有组的小鼠都增重了(数据未显示)。免疫接种聚酯微粒的小鼠典型地在整个试验期间是健康的，行为正常，皮毛品质良好。
[1314] 约10到约50μg剂量范围的抗原微粒在小鼠中生成显著的抗体反应。此剂量与单独的10-50μg剂量的野生型微粒相比，诱导显著更高的抗体滴度。也可以测试和应用其他剂量，例如50-100μg的各抗原展示微珠(E1-C-M1、E2-C-M2、E3-C-M3和E4-C-M4)。另一实验包括未免疫接种的对照小鼠，对含或不含佐剂的微珠制剂进行了比较，与未接种疫苗的小鼠相比，给予抗原微粒的两个疫苗接种组均诱导了显著更高的抗原特异性血清抗体反应。在免疫接种佐以Emulsigen的抗原微粒的小鼠中观察到了最高的抗体反应。在两组实验中，IgG1同种型的抗体反应均典型地比IgG2的反应更强。
[1315] 与仅免疫接种了野生型微粒或PBS的小鼠相比，免疫接种了10-50μg抗原微粒的小鼠中细胞介导的抗原应答也显著增强，且仅免疫接种了野生型微粒的小鼠与PBS免疫接种的对照小鼠相比，在细胞介导的应答方面一般无明显差异。
[1316] 在空斑减少中和试验中，免疫接种野生型微粒的小鼠血清与PBS免疫接种的对照小鼠一般无明显差别。在空斑减少中和试验中，与仅免疫接种野生型微粒的小鼠血清相比，免疫接种了1∶1∶1∶1混合登革病毒血清型1-4E-M微粒制剂的小鼠的血清中和滴度显著更高。在空斑减少中和试验中，对于异源登革病毒血清型而言，与仅含一种登革病毒血清型E和M提呈微珠的制剂相比，免疫接种了1∶1∶1∶1混合登革病毒血清型1-4E-M
微粒制剂的小鼠的血清中和滴度显著更高。
微粒制剂的小鼠的血清中和滴度显著更高。
[1317] 10-50μg野生型微粒免疫接种2次的小鼠中针对抗原的趋化因子和细胞因子反应与PBS免疫接种的对照小鼠相比一般不会出现明显差异。相反，在抗原微粒免疫接种2次的小鼠中，以及以抗原微粒和Emulsigen免疫接种2次的小鼠中，观察到针对各抗原的趋化因子和细胞因子反应显著更高。如所预期的那样，在以抗原微粒和Emulsigen免疫接种2次的小鼠中观察到的针对各抗原的趋化因子和细胞因子反应比所有其他疫苗接种组显著更高。所述展示登革病毒血清型1-4E和M蛋白抗原的工程化聚酯微粒能够产生抗原特异性的细胞介导的应答，并显著增加IgG1和IgG2抗体的产生。
[1318] 免疫接种了PBS或野生型微粒的小鼠在病毒激发之后预期会死亡，两组之间没有任何明显差异。而免疫接种了含和不含佐剂的登革病毒血清型1-4E和M提呈微粒的小鼠预期会受到保护，其中含佐剂制剂的保护作用更佳。
[1319] 除了产生体液和细胞介导的免疫应答之外，没有诸如体重减轻的不良副作用，且注射部位没有脓疮和化脓，这都表明所述聚酯微粒耐受良好、安全无毒。
[1320] 实施例11-埃博拉病毒聚合物微粒疫苗的免疫原性
[1321] 本实施例描述了为在大肠杆菌中生产聚合物微粒所用质粒的构建以及所述聚合物微粒免疫原性的分析，所述聚合物微粒分别或者同时展示丝状病毒科扎伊尔型埃博拉病毒和苏丹型埃博拉病毒的病毒体刺突糖蛋白前体抗原(分别为ZEBOV-GP和SEBOV-GP)。两种抗原均可用于疫苗开发。
[1322] 材料和方法
[1323] 所 有 动 物 实 验 都 得 到 了 AgResearch Grasslands Animal EthicsCommittee(Palmerston North，New Zealand)的批准。
[1324] 1.介导融合蛋白过量生产和聚合物微珠形成的质粒的构建
[1325] 本实施例中使用的所有质粒和寡核苷酸列于表11。
[1326] 聚羟基丁酸生物合成酶即β-酮硫解酶和R-专一性乙酰乙酰辅酶A还原酶由质粒pMCS69编码。为生产同时展示两种埃博拉病毒的病毒体刺突糖蛋白前体抗原的聚合物微粒，对编码所述来自扎伊尔型埃博拉病毒和苏丹型埃博拉病毒的病毒体刺突糖蛋白前体抗原的基因进行了密码子优化，由GenScript公司合成，以亚克隆到pET-14b M-PhaC-接头-MalE的XbaI-SpeI位点及XhoI-BamHI位点，与聚合物微珠形成酶PhaC进行N-末端融
合及C-末端融合。ZEBOV-GP编码基因插入在XbaI-SpeI位点，而SEBOV-GP编码基因插入在同一质粒的XhoI-BamHI位点。两个基因插入片段阅读框相同，需要替换掉原始质粒中的M和MalE编码区。这样得到了pET14B-ZEBOVGP-C-SEBOVGP质粒。可选地，SEBOV-GP编码基因可插入在XbaI-SpeI位点，而ZEBOV-GP编码基因可插入在同一质粒的XhoI-BamHI位点，生成质粒pET 14B-SEBOVGP-C-ZEBOVGP。
合及C-末端融合。ZEBOV-GP编码基因插入在XbaI-SpeI位点，而SEBOV-GP编码基因插入在同一质粒的XhoI-BamHI位点。两个基因插入片段阅读框相同，需要替换掉原始质粒中的M和MalE编码区。这样得到了pET14B-ZEBOVGP-C-SEBOVGP质粒。可选地，SEBOV-GP编码基因可插入在XbaI-SpeI位点，而ZEBOV-GP编码基因可插入在同一质粒的XhoI-BamHI位点，生成质粒pET 14B-SEBOVGP-C-ZEBOVGP。
[1327] ZEBOVGP-C-SEBOVGP融合蛋白的构建体如SEQ ID No.49所示，其衍生氨基酸序列如EQ ID No.50所示。SEBOVGP-C-ZEBOVGP融合蛋白的构建体如SEQ ID No.51所示，其衍生氨基酸序列如SEQ ID No.52所示。
[1328] 表11：质粒和寡核苷酸
[1329]
[1330] 2.ZEBOVGP-SEBOVGP展示微粒的生产
[1331] 将pET 14B-ZEBOVGP-C-SEBOVGP或pET 14B-ZEBOVGP-C-SEBOVGP和pHAS质粒引入拥有pMCS69质粒的大肠杆菌KRX细胞中。如实施例1所述在适合于生产生物聚酯微粒
的条件下培养转化株。然后如下文所述分别评估生产ZEBOVGP-SEBOVGP微粒或野生型微粒的能力。
的条件下培养转化株。然后如下文所述分别评估生产ZEBOVGP-SEBOVGP微粒或野生型微粒的能力。
[1332] 3.聚酯微粒的分离
[1333] 如实施例3所述分离聚酯颗粒。如实施例3所述利用Bio-Rad蛋白测定法来测定微粒上所附蛋白的浓度。在浓度测定之后，蛋白通过SDS-PAGE分离，并用SimplyBlue安全TM染料(Invitrogen)染色。利用Gel Doc XR来检测分别相对于聚合物微粒上所附总蛋白量而言的ZEBOVGP-PhaC-SEBOVGP或SEBOVGP-PhaC-ZEBOVGP融合蛋白的量，并利用Quantity One软件(4.6.2版，Bio-Rad Laboratories)来进行分析。利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)来鉴定目的蛋白，这能够鉴定到融合蛋白结构域。。
[1334] 4.ELISA
[1335] 埃博拉病毒聚合物微粒的免疫反应性如实施例3所述通过酶联免疫吸附试验(ELISA)来确定。简而言之，Maxisorb板(Nunc)用纯化了的、在碳酸盐-重碳酸
盐包被缓冲液(pH 9.6)(Sigma-Aldrich)中稀释了的ZEBOVGP-PhaC-SEBOVGP微粒、
SEBOVGP-PhaC-ZEBOVGP微粒或野生型微粒4℃过夜包被。利用该缓冲液进行系列稀释，蛋白浓度范围1mg/ml到0.015mg/ml。洗板并在25℃封闭2小时(见表4)。板随之以
PBS-Tween 20清洗，与针对不同抗原所产生的小鼠抗体一起孵育，清洗，然后再与用含1％(w/v)BSA的PBS稀释了的马抗小鼠IgG∶辣根过氧化物酶缀合物(Sigma-Aldrich)在室温一起孵育1小时。再次清洗后，加邻苯二胺(OPD)底物(Sigma-Aldrich)，板在室温孵育30分钟。用0.5M H2SO4终止反应，并记录495nm的光吸收值。
盐包被缓冲液(pH 9.6)(Sigma-Aldrich)中稀释了的ZEBOVGP-PhaC-SEBOVGP微粒、
SEBOVGP-PhaC-ZEBOVGP微粒或野生型微粒4℃过夜包被。利用该缓冲液进行系列稀释，蛋白浓度范围1mg/ml到0.015mg/ml。洗板并在25℃封闭2小时(见表4)。板随之以
PBS-Tween 20清洗，与针对不同抗原所产生的小鼠抗体一起孵育，清洗，然后再与用含1％(w/v)BSA的PBS稀释了的马抗小鼠IgG∶辣根过氧化物酶缀合物(Sigma-Aldrich)在室温一起孵育1小时。再次清洗后，加邻苯二胺(OPD)底物(Sigma-Aldrich)，板在室温孵育30分钟。用0.5M H2SO4终止反应，并记录495nm的光吸收值。
[1336] 5.小鼠免疫接种
[1337] 对6-8周龄的C57BL/6雌鼠(Malaghan Institute，Wellington，NZ)以2周的间隔进行3次肌内免疫接种。3个处理组设置如下：
[1338] a)个体免疫接种野生型微粒(即，由携带pHAS和pMCS69的细菌细胞制备的微粒)；
[1339] b)个体仅免疫接种抗原微粒(即，由携带编码不同抗原-PhaC融合蛋白的质粒和pMCS69的细菌细胞制备的微粒)；
[1340] c)个体免疫接种与20％EmulsigenTM佐剂(MVP Laboratories)混合的不同抗原微粒。
[1341] 各实验设置均纳入了未接种疫苗的对照动物。
[1342] 6.免疫测定
[1343] 小鼠在末次免疫接种后3周麻醉，采血，离心，收集血清，冷冻于-20℃以备分析之用。然后对小鼠实施安乐死，取出脾脏，通过80目网筛制备单细胞悬液。脾红细胞(RBC)利用含17mM TRIS-HCl和140mM NH4Cl的溶液裂解。清洗之后，RBC在补加有2mM谷氨酸-5
(Invitrogen)、100U/mL青霉素(Invitrogen)、100μg/mL链霉素(Invitrogen)、5x10 M
2-巯基乙醇(Sigma)和5％(w/w)胎牛血清(Invitrogen)的达尔伯克改良伊格尔培养基
(Dulbecco’s Modified Eagle media，DMEM)中培养。
(Invitrogen)、100U/mL青霉素(Invitrogen)、100μg/mL链霉素(Invitrogen)、5x10 M
2-巯基乙醇(Sigma)和5％(w/w)胎牛血清(Invitrogen)的达尔伯克改良伊格尔培养基
(Dulbecco’s Modified Eagle media，DMEM)中培养。
[1344] 7.空斑减少中和试验
[1345] 通过空斑减少中和试验来研究免疫接种小鼠血清中埃博拉病毒中和抗体的存在。系列稀释的血清进行热灭活，与100个空斑形成单位的同源和异源病毒混合，然后在37℃孵育1小时。所述血清病毒混合物与Vero单层细胞一起孵育1小时，然后铺上一层含琼脂糖的培养基。在试验第10-12天对病毒空斑进行染色。空斑数目减少80％的最高稀释度即为空斑减少中和试验80(PRNT80)。
[1346] 8.细胞因子和趋化因子的定量
[1347] 在4天温育之后，取培养物上清液，冷冻于-20℃以备分析之用。根据厂商说明利用商购抗体和标准品(EBiosciene)通过ELISA和/或FACS(EBioscience)来测量上清液中的细胞因子和趋化因子水平。
[1348] 9.小鼠病毒保护试验
[1349] 利用小鼠激发模型来确定含和不含佐剂的ZEBOVGP和SEBOVGP抗原提呈微粒制剂的功效。如上文第1节材料和方法部分所述，利用1、5和10μg的剂量，对B10.BR小鼠(MHE K 5H-2)，The Jackson Laboratory，ME) 进行免疫接种。在免疫接种之后，小鼠用1000xLD50的ZEBOV小鼠适应株进行腹膜内注射(IP)激发。在激发后12-16天监测发病率和死亡率。
[1350] 含和不含佐剂的ZEBOVGP和SEBOVGP抗原提呈微粒制剂的功效借助于在IP注射1000xLD50后30分钟给药所述疫苗制剂来确定。在激发后12-16天监测发病率和死亡率。
[1351] 10.血清抗体定量
[1352] 利用固定化了的用于捕获抗体的抗原展示微粒通过ELISA来测量血清抗体。
[1353] 11.统计学分析
[1354] 细胞因子、趋化因子和抗体反应的分析通过Kruskal-Wallis单因素方差分析(ANOVA)来进行。
[1355] 结果
[1356] 对 所 有 在 pMCS69 存 在 下 携 带 pET14B-ZEBOVGP-C-SEBOVGP 或pET14B-SEBOVGP-C-ZEBOVGP和pHAS质粒的细胞进行GC-MS分析，确认了聚羟基丁酸聚酯的存在。还进一步利用尼罗红染色通过荧光显微镜检来确认胞内聚酯包涵体的存在。所有在pMCS69存在下携带质粒pET 14B-ZEBOVGP-C-SEBOVGP或pET 14B-SEBOVGP-C-ZEBOVGP和
pHAS(野生型对照)的细胞中存在聚羟基丁酸，表明PhaC聚酯合酶域作为单一或三联融合蛋白存在时保留了聚合物合酶活性。
pHAS(野生型对照)的细胞中存在聚羟基丁酸，表明PhaC聚酯合酶域作为单一或三联融合蛋白存在时保留了聚合物合酶活性。
[1357] 微粒展示了高水平的蛋白，这是通过表观分子量与由相应融合蛋白序列推断的分子量直接相对应的突出的蛋白电泳带确定的。这些蛋白的身份利用MALDI-TOF-MS通过胰蛋白酶酶解肽的指纹分析得以确认。ELISA结果表明这些不同抗原展示微粒以剂量依赖性的方式与相应的抗抗原抗体结合，而野生型微粒表现出明显更低的抗体结合。流式细胞术分析结果优选地表明＞98％的抗原微粒结合抗抗原抗体。结果显示，在重组大肠杆菌中表达编码不同抗原-PhaC融合蛋白的相应杂合基因，能够生产表面展示所述融合蛋白的聚酯微粒。
[1358] 优选地，在免疫接种之后未在任何一只动物中观察到明显的毒性，在实验开展期间小鼠体重并无显著的组间差异，且所有组的小鼠都增重了。免疫接种聚酯微粒的小鼠会在接种部位形成小肿块(直径2.5mm)，但不会观察到脓疮或化脓，且所有小鼠典型地在整个试验期间是健康的，行为正常，皮毛品质良好。
[1359] 5-100μg剂量的抗原微粒对于在小鼠中生成显著的抗体反应而言是最佳的。此剂量与单独的5-100μg剂量的野生型微粒相比，诱导显著更高的抗体滴度。另一实验包括未免疫接种的对照小鼠，对含或不含佐剂的微珠制剂进行了比较，与未接种疫苗的小鼠相比，给予抗原微粒的两个疫苗接种组均诱导了显著更高的抗原特异性血清抗体反应。在免疫接种佐以Emulsigen的抗原微粒的小鼠中典型地会观察到最高的抗体反应。IgG1同种型的抗体反应比IgG2的反应更强。
[1360] 与仅免疫接种了野生型微粒或PBS的小鼠相比，免疫接种了5-100μg抗原微粒的小鼠中细胞介导的抗原应答显著增强。仅免疫接种野生型微粒的小鼠与PBS免疫接种的对照小鼠相比，在细胞介导的应答方面无明显差异。10-50μg野生型微粒免疫接种2次的小鼠中针对抗原的趋化因子和细胞因子反应与PBS免疫接种的对照小鼠相比一般不会出现明显差异。相反，在抗原微粒免疫接种2次的小鼠中，以及以抗原微粒和Emulsigen免疫接种2次的小鼠中，观察到针对各抗原的趋化因子和细胞因子反应显著更高。如所预期的那样，在以抗原微粒和Emulsigen免疫接种2次的小鼠中观察到的针对各抗原的趋化因子和细胞因子反应比所有其他疫苗接种组显著更高。所述展示ZEBOVGP和SEBOVGP蛋白抗原的工程化聚酯微粒能够产生抗原特异性的细胞介导的应答，并显著增加IgG1和IgG2抗体的产生。
[1361] 在空斑减少中和试验中，免疫接种野生型微粒的小鼠血清与PBS免疫接种的对照小鼠一般无明显差别。在空斑减少中和试验中，与仅免疫接种野生型微粒的小鼠血清相比，免疫接种了ZEBOVGP和SEBOVGP提呈微粒制剂的小鼠的血清中和滴度显著更高。在空斑减少中和试验中，就同源和异源病毒而言，免疫接种了含ZEBOVGP和SEBOVGP微粒制剂的小鼠的血清中和滴度相似。
[1362] 免疫接种了PBS或野生型微粒的小鼠在病毒激发之后预期会死亡，两组之间没有任何明显差异，不论免疫接种时间和顺序如何皆是如此。而免疫接种了含和不含佐剂的ZEBOVGP和SEBOVGP提呈微粒的小鼠预期会受到保护，其中含佐剂制剂的保护作用更佳。而且，免疫接种了含和不含佐剂的ZEBOVGP和SEBOVGP提呈微粒的小鼠预期会受到保护。
[1363] 所述展示ZEBOV-GP和SEBOV-GP抗原的工程化聚酯微粒能够产生抗原特异性的细胞介导的应答，并显著增加IgG1和IgG2抗体的产生。没有诸如体重减轻的不良副作用，且注射部位没有脓疮和化脓，这都表明所述聚酯微粒耐受良好、安全无毒。
[1364] 实施例12-西尼罗病毒聚合物微粒疫苗的免疫原性
[1365] 本实施例描述了为在转化的宿主(此处为大肠杆菌)中生产聚合物微粒所用质粒的构建以及所述聚合物微粒免疫原性的分析，所述聚合物微粒展示来自西尼罗病毒(WNV)的黄病毒被膜抗原(E)——在WNV病毒体表面表达的一种无毒蛋白(WNVE)。该抗原据认为是疫苗开发的一线候选抗原。虽有几种疫苗制剂目前正在审核之中，但是尚无批准的WNV疫苗。如本实施例中所生产的具有该抗原的聚合物微粒可用作为抗WNV的预防性和治疗性疫苗。
[1366] 材料和方法
[1367] 所 有 动 物 实 验 都 得 到 了 AgResearch Grasslands Animal EthicsCommittee(Palmerston North，New Zealand)的批准。
[1368] 1.质粒构建
[1369] 本实施例中使用的所有质粒和寡核苷酸列于表12。
[1370] 介导3-羟基丁酰-辅酶A合成的酶由质粒pMCS69编码。
[1371] 为生产展示WNVE抗原的聚合物微粒，对编码被膜抗原(E)的基因进行了密码子优化、协调，由GenScript公司合成，以亚克隆到pET-14b PhaC-接头-GFP的XhoI-BamHI位点，与聚合物微珠形成酶PhaC进行C-末端融合。E编码基因插入在XhoI-BamHI位点。该基因插入片段与原始质粒中替换了的GFP编码区阅读框相同，得到了pET14B-C-WNVE质粒。
[1372] PhaC-WNVE融合蛋白的构建体如SEQ ID No.53所示，其衍生氨基酸序列如SEQ ID No.54所示。
[1373] 表12：质粒和寡核苷酸
[1374]
[1375] 2.WNVE展示微粒的生产
[1376] 将pET14B-C-WNVE和pHAS质粒引入拥有pMCS69质粒的大肠杆菌BL21Star(DE3)细胞中。如实施例1所述在适合于生产生物聚酯微粒的条件下培养转化株。
[1377] 3.气相色谱质谱(GC-MS)
[1378] 拥有不同质粒的细菌细胞的聚酯含量与其体内的PhaC合酶活性相对应。通过气相色谱质谱(GC-MS)分析评估所积累的聚酯量来确定phaC合酶活性，特别是来评估
PhaC-WNVE抗原融合蛋白是否仍然催化聚酯合成及介导胞内颗粒形成。在通过酸催化的甲醇解作用将聚酯转化为3-羟基甲酯之后通过GC-MS来定量确定聚酯含量。
PhaC-WNVE抗原融合蛋白是否仍然催化聚酯合成及介导胞内颗粒形成。在通过酸催化的甲醇解作用将聚酯转化为3-羟基甲酯之后通过GC-MS来定量确定聚酯含量。
[1379] 4.聚酯微粒的分离
[1380] 如实施例3所述分离聚酯颗粒。
[1381] 5.蛋白浓度测定
[1382] 如实施例3所述利用Bio-Rad蛋白测定法来测定微粒上所附蛋白的浓度。
[1383] 6.ELISA
[1384] 西尼罗病毒聚合物微粒的免疫反应性如实施例3所述通过酶联免疫吸附试验(ELISA)来确定。Maxisorb板(Nunc)用纯化了的、在碳酸盐-重碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)(Sigma-Aldrich)中稀释了的PhaC-WNVE微粒或野生型微粒4℃过夜包被。利用该缓冲液进行系列稀释，蛋白浓度范围1mg/ml到0.015mg/ml。洗板并在25℃封闭2小时。
[1385] 板随之以PBS-Tween 20清洗，与针对不同抗原所产生的小鼠抗体一起孵育，清洗，然后再与用含1％(w/v)BSA的PBS稀释了的马抗小鼠IgG∶辣根过氧化物酶缀
合物(Sigma-Aldrich)在室温一起孵育1小时。再次清洗后，加邻苯二胺(OPD)底物
(Sigma-Aldrich)，板在室温孵育30分钟。
合物(Sigma-Aldrich)在室温一起孵育1小时。再次清洗后，加邻苯二胺(OPD)底物
(Sigma-Aldrich)，板在室温孵育30分钟。
[1386] 用0.5M H2SO4终止反应，并记录495nm的光吸收值。
[1387] 7.小鼠免疫接种
[1388] 对6-8周龄的C57BL/6雌鼠(Malaghan Institute，Wellington，NZ)以2周的间隔进行3次肌内免疫接种。3个处理组设置如下：
[1389] a)个体免疫接种野生型微粒(即，由携带pHAS和pMCS69的细菌细胞制备的微粒)；
[1390] b)个体仅免疫接种抗原微粒(即，由携带编码不同抗原-PhaC融合蛋白的质粒和pMCS69的细菌细胞制备的微粒)；
[1391] c)个体免疫接种与20％EmulsigenTM佐剂(MVP Laboratories)混合的不同抗原微粒。
[1392] 各实验设置均纳入了未接种疫苗的对照动物。
[1393] 8.免疫测定
[1394] 小鼠在末次免疫接种后3周麻醉，采血，离心，收集血清，冷冻于-20℃以备分析之用。
[1395] 然后对小鼠实施安乐死，取出脾脏，通过80目网筛制备单细胞悬液。如实施例4所述来处理脾红细胞(RBC)。
[1396] 9.空斑减少中和试验
[1397] 通过空斑减少中和试验来研究免疫接种小鼠血清中西尼罗病毒中和抗体的存在。系列稀释的血清进行热灭活，与100个空斑形成单位的同源和异源血清型病毒混合，然后在37℃孵育1小时。所述血清-病毒混合物与Vero单层细胞一起孵育1小时，然后铺上一层含琼脂糖的培养基。在试验第5天对病毒空斑进行染色。空斑数目减少80％的最高稀释度即为空斑减少中和试验80(PRNT80)。
[1398] 10.细胞因子和趋化因子的定量
[1399] 在4天温育之后，取培养物上清液，冷冻于-20℃以备分析之用。根据厂商说明利用商购抗体和标准品(EBiosciene)通过ELISA和/或FACS(EBioscience)来测量上清液中的细胞因子和趋化因子水平。
[1400] 11.小鼠病毒保护试验
[1401] 利用小鼠激发模型来确定含和不含佐剂的西尼罗病毒抗原提呈微粒制剂的功效。如上文第1节材料和方法部分所述，利用1、5和10μg的剂量，对13天的断奶小鼠进行免疫接种。在免疫接种之后，小鼠用100LD50的西尼罗病毒小鼠适应株进行脑内注射(IC)激发。在激发后21天监测发病率和死亡率。
[1402] 12.血清抗体定量
[1403] 利用固定化了的用于捕获抗体的抗原展示微粒通过ELISA来测量血清抗体。
[1404] 13.统计学分析
[1405] 细胞因子、趋化因子和抗体反应的分析通过Kruskal-Wallis单因素方差分析(ANOVA)来进行。
[1406] 结果
[1407] 对所有在pMCS69存在下携带pET14B-C-WNVE和pHAS质粒的细胞进行GC-MS分析来确认聚羟基丁酸聚酯的存在。还进一步利用尼罗红染色通过荧光显微镜检来确认胞内聚酯包涵体的存在。
[1408] 所有在pMCS69存在下携带质粒pET14B-C-WNVE和pHAS(野生型对照)的细胞中存在聚羟基丁酸，表明PhaC聚酯合酶域作为单一或三联融合蛋白存在时保留了聚合物合酶活性。
[1409] 微粒展示了高水平的蛋白，这是通过表观分子量与由相应融合蛋白序列推断的分子量直接相对应的突出的蛋白电泳带确定的。这些蛋白的身份利用MALDI-TOF-MS通过胰蛋白酶酶解肽的指纹分析得以确认。ELISA结果表明这些不同抗原展示微粒以剂量依赖性的方式与相应的抗抗原抗体结合，而野生型微粒表现出明显更低的抗体结合。流式细胞术分析结果优选地表明＞97％的抗原微粒结合抗抗原抗体。
[1410] 在重组大肠杆菌中表达编码所述PhaC-抗原融合蛋白的相应杂合基因，能够生产表面展示所述融合蛋白的聚酯微粒。
[1411] 优选地，在免疫接种之后未在任何一只动物中观察到明显的毒性，在实验开展期间小鼠体重并无显著的组间差异，且所有组的小鼠都增重了(数据未显示)。免疫接种聚酯微粒的小鼠会在接种部位形成小肿块(直径2.5mm)，但一般没有脓疮或化脓，且所有小鼠典型地在整个试验期间是健康的，行为正常，皮毛品质良好。5-100μg剂量的抗原微粒在小鼠中生成显著的抗体反应。此剂量与单独的5-100μg剂量的野生型微粒相比，诱导显著更高的抗体滴度。也可以测试和应用其他剂量。另一实验包括未免疫接种的小鼠(对照组)、免疫接种了对照野生型微粒(微珠对照组)的小鼠、以及与和不与佐剂一起配制的WNVE提呈微粒(测试组)的小鼠。评价结果是，与未接种疫苗的小鼠或者野生型微珠免疫接种的小鼠相比，给予抗原提呈微粒的两组小鼠均诱导了显著更高的抗原特异性血清抗体反应。在免疫接种佐以Emulsigen的抗原微粒的小鼠中可观察到最高的抗体反应。IgG1同种型的抗体反应比IgG2的反应更强。
[1412] 与仅免疫接种了野生型微粒或PBS的小鼠相比，免疫接种了5-100μg抗原微粒的小鼠中细胞介导的抗原应答也显著增强。仅免疫接种野生型微粒的小鼠与PBS免疫接种的对照小鼠相比，在细胞介导的应答方面无明显差异。
[1413] 在空斑减少中和试验中，免疫接种野生型微粒的小鼠血清与PBS免疫接种的对照小鼠一般无明显差别。在空斑减少中和试验中，与仅免疫接种野生型微粒的小鼠血清相比，免疫接种了WNVE提呈微粒制剂的小鼠的血清中和滴度显著更高。优选地，就同源和异源西尼罗病毒而言，免疫接种了含WNVE微粒制剂的小鼠的血清中和滴度相似。
[1414] 5-100μg野生型微粒免疫接种2次的小鼠中针对抗原的趋化因子和细胞因子反应与PBS免疫接种的对照小鼠相比一般不会出现明显差异。相反，在抗原微粒免疫接种2次的小鼠中，以及以抗原微粒和Emulsigen免疫接种2次的小鼠中，观察到针对各抗原的趋化因子和细胞因子反应显著更高。如所预期的那样，在以抗原微粒和Emulsigen免疫接种2次的小鼠中观察到的针对各抗原的趋化因子和细胞因子反应比所有其他疫苗接种组显著更高。所述展示WNVE抗原的工程化聚酯微粒能够产生抗原特异性的细胞介导的应答，并显著增加IgG1和IgG2抗体的产生。
[1415] 免疫接种了PBS或野生型微粒的小鼠在病毒激发之后预期会死亡，两组之间没有任何明显差异。而免疫接种了含和不含佐剂的WNVE提呈微粒的小鼠预期会受到保护，其中含佐剂制剂的保护作用更佳。
[1416] 所述展示WNVE的工程化聚酯微粒能够产生抗原特异性的细胞介导的应答，并显著增加IgG1和IgG2抗体的产生。除了产生体液和细胞介导的免疫应答之外，没有诸如体重减轻的不良副作用，且注射部位没有脓疮和化脓，这都表明所述聚酯微粒耐受良好、安全无毒。
[1417] 实施例13-小鼠体内的免疫学研究
[1418] 本实施例描述了Ag85A-ESAT-6聚合物微粒对哺乳动物模型生物的免疫接种。
[1419] 材料和方法
[1420] 所 有 动 物 实 验 都 得 到 了 AgResearch Grasslands Animal EthicsCommittee(Palmerston North，New Zealand)的批准。
[1421] 1.质粒构建和在大肠杆菌及乳酸乳球菌中生产聚合物微粒
[1422] 如实施例1和2所述，构建了质粒，用来在乳酸乳球菌和大肠杆菌中生产展示结核抗原Ag-85A和ESAT-6的聚合物微粒。
[1423] 通过破碎细菌，对全细胞裂解物于4℃以6000g离心15分钟使聚合物微粒沉降来分离聚酯颗粒。借助甘油梯度超速离心来纯化微粒。根据厂商说明(Bio-Rad)利用Bio-RadTM蛋白测定法来测定蛋白浓度。利用Gel Doc XR来检测相对于聚合物微粒上所附总蛋白量而言的Ag85A-ESAT-6:PhaC融合蛋白的量，并利用Quantity One软件(4.6.2版，Bio-Rad Laboratories)来进行分析。Tb抗原约占聚合物微粒总蛋白的20％。目的蛋白的身份利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)得到了确认。
[1424] 2.ELISA
[1425] 聚合物微粒的活性如实施例3所述通过酶联免疫吸附试验(ELISA)来确定。在VERSAax酶标仪上记录490nm的光吸收值。
[1426] 3.小鼠免疫接种
[1427] 用如实施例1、2和3构建和分离的结核菌聚合物微粒疫苗对6-8周龄的C57BL/6雌鼠(Malaghan Institute，Wellington，NZ)以2周的间隔进行3次皮下免疫接种。3个处理组设置如下：
[1428] a)个体免疫接种野生型聚合物微粒(即，由携带pHAS和pMCS69的细菌细胞制备的聚合物微粒)；
[1429] b)个体仅免疫接种Ag85A-ESAT-6聚合物微粒(即，由携带pHAS-Ag85A-ESAT-6和pMCS69的细菌细胞制备的聚合物微粒)；
[1430] c)个体免疫接 种与20％EmulsigenTM佐剂(MVP Laboratories)混合 的Ag85A-ESAT-6聚合物微粒。
[1431] 各实验设置均纳入了未接种疫苗的对照动物。
[1432] 4.免疫测定
[1433] 小鼠在末次免疫接种后3周麻醉，采血，离心，收集血清，冷冻于-20℃以备分析之用。
[1434] 然后对小鼠实施安乐死，取出脾脏，通过80目网筛制备单细胞悬液。脾红细胞(RBC)利用含17mM TRIS-HCl和140mM NH4Cl的溶液裂解。清洗之后，RBC在补加有2mM谷-5氨酸(Invitrogen)、100U/mL青霉素(Invitrogen)、100μg/mL链霉素(Invitrogen)、5x10 M 2-巯基乙醇(Sigma)和5％(w/w)胎牛血清(Invitrogen)的达尔伯克改良伊格尔培养
基(Dulbecco’s Modified Eagle media，DMEM)中培养。
基(Dulbecco’s Modified Eagle media，DMEM)中培养。
[1435] 细胞要么仅在培养基中、要么在含有Ag85A、ESAT-6任一抗原或两抗原组合的培养基中于37℃在10％CO2中温育。
[1436] 5.IFN-γ定量
[1437] 在4天温育之后，取培养物上清液，冷冻于-20℃以备分析之用。根据厂商说明利用商购抗体和标准品(BD Pharmingen)通过ELISA(BD Biosciences)来测量上清液中的IFN-γ水平。
[1438] 6.血清抗体定量
[1439] 根据厂商建议利用单克隆抗ESAT-6或抗Ag85A抗体(Abcam)通过ELISA来测量血清抗体。
[1440] 7.统计学分析
[1441] IFN-γ反应和抗体反应的分析通过Kruskal-Wallis单因素方差分析(ANOVA)来进行。
[1442] 结果
[1443] 在免疫接种之后未在任何一只动物中观察到明显的毒性，在实验开展期间小鼠体重并无显著的组间差异，且所有组的小鼠都增重了(数据未显示)。免疫接种聚酯微粒的小鼠在接种部位形成小肿块(直径2.5mm)，但未观察到脓疮或化脓。所有小鼠在整个试验期间是健康的，行为正常，皮毛品质良好(数据未显示)。
[1444] 30μg剂量的Ag85A-ESAT-6聚合物微粒对于在小鼠中生成显著的抗体反应而言是最佳的(见图5)。此剂量与单独的30μg剂量的重组Ag85A-ESAT-6蛋白(P＜0.01)相比，诱导显著更高的抗体滴度。另一实验包括未免疫接种的对照小鼠，对含或不含佐剂的微珠制剂进行了比较，与未接种疫苗的小鼠(P＜0.01，见图6)相比，给予Ag85A-ESAT-6聚合物微粒的两个疫苗接种组中抗原特异性血清抗体反应均显著更高。在免疫接种佐以Emulsigen的Ag85A-ESAT-6聚合物微粒的小鼠中观察到了最高的抗体反应。两组实验中IgG1同种型的抗体反应均比IgG2的反应更强。
[1445] 如图7所示，与仅免疫接种了重组ESAT-6-Ag85A(P＜0.01)或PBS(p＜0.01)的小鼠相比，免疫接种了10μg或30μgAg85A-ESAT-6聚合物微粒的小鼠中细胞介导的针对ESAT-6和Ag85A的应答显著增强。仅免疫接种抗原的小鼠与PBS免疫接种的对照小鼠相
比，在细胞介导的应答方面无明显差异。
比，在细胞介导的应答方面无明显差异。
[1446] 如图8所示，在30μg野生型微粒(无Tb抗原)免疫接种3次的小鼠中，针对ESAT-6或Ag85A抗原的IFN-γ反应与PBS免疫接种的对照小鼠相比并没有明显差异。相
反，在Ag85A-ESAT-6聚合物微粒免疫接种3次的小鼠(p＜0.01)中，以及以Ag85A-ESAT-6聚合物微粒和Emulsigen免疫接种3次的小鼠(p＜0.01)中，观察到针对各抗原的IFN-γ反应显著更高。事实上，在以Ag85A-ESAT-6聚合物微粒和Emulsigen免疫接种3次的小鼠中观察到的针对各抗原的IFN-γ反应比所有其他疫苗接种组显著更高(p＜0.01，**)。
反，在Ag85A-ESAT-6聚合物微粒免疫接种3次的小鼠(p＜0.01)中，以及以Ag85A-ESAT-6聚合物微粒和Emulsigen免疫接种3次的小鼠(p＜0.01)中，观察到针对各抗原的IFN-γ反应显著更高。事实上，在以Ag85A-ESAT-6聚合物微粒和Emulsigen免疫接种3次的小鼠中观察到的针对各抗原的IFN-γ反应比所有其他疫苗接种组显著更高(p＜0.01，**)。
[1447] 讨论
[1448] 所述展示Ag85A-ESAT-6抗原的工程化聚酯聚合物微粒能够产生抗原特异性的细胞介导的应答，并显著增加IgG1和IgG2抗体的产生。值得注意的是，免疫接种单独的抗原(即，不含本发明聚合物微粒的抗原)在引发细胞介导的应答方面是无效的。
[1449] 这些结果也证明了该疫苗递送系统引发互补层面免疫应答的多功能性和潜能，从而既引发体液免疫应答又引发细胞介导的免疫应答。
[1450] 没有诸如体重减轻的不良副作用，且注射部位没有脓疮和化脓，这都证明所述聚酯聚合物微粒耐受良好、安全无毒。
[1451] 实施例14-对免疫接种过的小鼠进行体内病原激发
[1452] 本实施例描述了哺乳动物模型免疫接种Ag85A-ESAT-6聚合物微粒生物对于接触牛分枝杆菌病原激发的功效。
[1453] 材料和方法
[1454] 所 有 动 物 实 验 都 得 到 了 AgResearch Grasslands Animal EthicsCommittee(Palmerston North，New Zealand)的批准。
[1455] 1.质粒构建和聚酯聚合物微粒的分离
[1456] 如实施例1和2所述，构建了质粒，用来在乳酸乳球菌和大肠杆菌中生产展示结核菌抗原Ag-85A和ESAT-6的聚合物微粒。
[1457] 通过破碎细菌，对全细胞裂解物于4℃以6000g离心15分钟使聚合物微粒沉降来分离聚酯颗粒。借助甘油梯度超速离心来纯化微粒。根据厂商说明(Bio-Rad)利用Bio-RadTM蛋白测定法来测定蛋白浓度。利用Gel Doc XR来检测相对于聚合物微粒上所附总蛋白量而言的Ag85A-ESAT-6:PhaC融合蛋白的量，并利用Quantity One软件(4.6.2版，Bio-Rad Laboratories)来进行分析。Tb抗原约占聚合物微粒总蛋白的20％。目的蛋白的身份利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)得到了确认。
[1458] 2.ELISA
[1459] 聚合物微粒的活性如实施例3所述通过酶联免疫吸附试验(ELISA)来确定。在VERSAax酶标仪上记录490nm的光吸收值。
[1460] 3.小鼠免疫接种
[1461] 对6-8周龄的C57BL/6雌鼠(Malaghan Institute，Wellington，NZ)隔周进行3次皮下免疫接种。7个处理组(每组n＝6)设置如下：
[1462] a)个体免疫接种PBS和EmulsigenTM佐剂(MVP Laboratories)。
[1463] b)个体免疫接 种与20％EmulsigenTM佐剂(MVP Laboratories)混合 的Ag85A-ESAT-6聚合物微粒(大肠杆菌宿主)。
[1464] c)个体免疫接种与20％EmulsigenTM佐剂(MVP Laboratories)混合的野生型聚合物微粒(大肠杆菌宿主)。
[1465] d)个体免疫接 种与20％EmulsigenTM佐剂(MVP Laboratories)混合 的Ag85A-ESAT-6聚合物微粒(乳酸乳球菌宿主)。
[1466] e)个体免疫接种与20％EmulsigenTM佐剂(MVP Laboratories)混合的野生型聚合物微粒(乳酸乳球菌宿主)。
[1467] f)个体免疫接种与20％EmulsigenTM佐剂(MVP Laboratories)混合的重组Ag85A-ESAT-6抗原。
[1468] g)个体免疫接种106CFU剂量的BCG。
[1469] 各实验设置均纳入了未接种疫苗的对照动物。
[1470] 4.病原激发
[1471] 在第一次疫苗接种15周后，用牛分枝杆菌对所有的小鼠进行激发。牛分枝杆菌由低传代株菌种在Tween白蛋白培养液(Tween 80、Dubos培养液基础和油酸-白蛋白-右旋糖，Difco)中培养至对数早中期。小份培养物-70℃冷冻备用。
[1472] 为以低剂量气溶胶暴露形式感染小鼠，利用经校准递向每只小鼠肺部送约50个细菌的Madison气溶胶发生室装置来给药稀释了的牛分枝杆菌贮液。
[1473] 5.免疫测定
[1474] 小鼠在病原激发后5周按每克体重应用87μg氯胺酮(Parnell Laboratories，Australia)和2.6μg盐酸甲苯噻嗪(Bayer， Germany)进行腹膜内注射麻醉。采血，离心，收集血清，冷冻于-20℃以备分析之用。
[1475] 然后对小鼠实施安乐死，取出脾和肺。从肺上取下肺叶尖，保藏在10％缓冲的福尔马林中，进行后续的组织学处理。切片以Ziehl-Neelson溶液以及苏木精-曙红染料进行染色。
[1476] 脾和余下的肺标本利用Seward 80(Seward，UK)在加0.5％Tween80的3mL PBS进行机械匀浆处理，并以10倍的系列稀释涂布到补加了10％油酸-白蛋白-右旋糖-过氧化氢酶富集培养基(BD)的选择性Middlebrook7H11琼脂板上。培养板于37℃
在潮湿空气中温育3周，之后计数。
在潮湿空气中温育3周，之后计数。
[1477] 6.血清抗体定量
[1478] 按照厂商建议利用抗ESAT-6单克隆抗体(Abcam)通过ELISA来测量血清抗体。简而言之，Microlon高结合板(Greiner)用5μg/mL recAg85A-ESAT-6过夜包被，用1％BSA封闭，并用PBST清洗。添加5倍稀释的血清(1∶50到1∶6250)并孵育。清洗之后，添加抗小鼠IgG1:HRP或IgG2c:HRP(ICL，USA)并孵育微孔板。洗板，加TMB作为底物，之后在VERSAmax酶标仪上进行450nm的读出。
[1479] 对抗ESAT6单克隆抗体进行了滴定并纳入作为IgG1板的阳性对照。
[1480] 7.统计学分析
[1481] 关于牛分枝杆菌激发后的细菌计数和抗体反应的分析通过Fisher单因素方差分析(ANOVA)来进行，显著性水平P＜0.05。
[1482] 结果
[1483] 乳酸乳球菌中生产的Ag85A-ESAT-6聚合物微粒的反应性表现出对ESAT-6抗体的剂量依赖性反应，而野生型聚合物微粒未观察到抗体结合(图9)。
[1484] 在肺培养方面，与PBS免疫接种的阴性对照组相比(图10，*＝p＜0.05)，用Ag85A-ESAT-6聚合物微粒进行疫苗接种提供的感染抗性显著提高了。这种抗性提高是通过在大肠杆菌或乳酸乳球菌宿主中合成的微粒所带来的。而且，用在大肠杆菌宿主中合成的Ag85A-ESAT-6聚合物微粒进行疫苗接种提供了比单独的抗原显著更佳的保护作用。事实上，Ag85A-ESAT-6聚合物微粒表现出与黄金标准BCG疫苗相当的保护作用(图10)。
[1485] 重要的是，与PBS免疫接种的对照组相比，用单独的重组Ag85A-ESAT-6抗原(即，不含本发明聚合物微粒的抗原)进行疫苗接种并不能使感染抗性提高。
[1486] 在脾培养方面，与PBS免疫接种的阴性对照组相比(图11，*＝p＜0.05)，用Ag85A-ESAT-6聚合物微粒进行疫苗接种提供的感染抗性显著提高了。而且，用在大肠杆菌宿主中合成的Ag85A-ESAT-6聚合物微粒进行疫苗接种提供了比单独的抗原显著更佳
的保护作用。而用野生型聚合物微粒(即，无Tb抗原的聚合物微粒)、或用单独的重组
Ag85A-ESAT-6抗原进行免疫接种都不能带来保护反应。
的保护作用。而用野生型聚合物微粒(即，无Tb抗原的聚合物微粒)、或用单独的重组
Ag85A-ESAT-6抗原进行免疫接种都不能带来保护反应。
[1487] 图12和13表明，在用Ag85A-ESAT-6聚合物微粒进行疫苗接种的小鼠中，除了特异性的细胞介导的应答之外，还引发了体液应答。与BCG疫苗相比，在大肠杆菌中生产的Ag85A-ESAT-6聚合物微粒的IgG2c抗体反应更大。
[1488] 讨论
[1489] 用在大肠杆菌和乳酸乳球菌中生产的展示Ag85A-ESAT-6抗原融合蛋白的聚合物微粒进行免疫接种，均能够对以牛分枝杆菌激发的动物提供免疫保护作用。这种保护作用使得如此进行疫苗接种的动物的感染载量降低。
[1490] 用展示Ag85A-ESAT-6抗原融合蛋白的聚合物微粒进行免疫接种，所带来的肺部抗Tb感染的保护水平与BCG疫苗相当。这说明本发明的聚合物微粒可引发针对Tb感染[包括初次感染和定殖]的保护性免疫反应。
[1491] 与对照哺乳动物相比，在免疫接种了展示Ag85A-ESAT-6抗原融合蛋白的聚合物微粒的哺乳动物脾中观察到感染减轻，还表明用本发明的聚合物微粒进行免疫接种提供了抗Tb浸润和疾病发展的保护作用。
[1492] 同样，没有不良副作用证明了本发明的聚酯微粒耐受良好、安全无毒。
[1493] 工业应用
[1494] 本文描述的本发明的方方面面(包括方法、聚合物微粒和融合蛋白)，在疾病的治疗和预防、诊断、蛋白生成、生物催化剂固定和递药方面具有实用性。
[1495] 本领域技术人员将会理解，提供上述说明仅为阐释目的，而本发明并不局限于此。
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[1539] Van den Berg，G.et al.“Kluyveromyces as a host for heterologous gene expression：expression and secretion of prochymosin”Bio/Technology(1990)8：135-139
[1540] Yelton，M.M.et al.“Transformation of Aspergillus nidulans by using a trpC plasmid”Proceedings of the National Academy of Science USA(1984)81：1470-1474
[1541] ***
[1542] 本文引用或述及的所有专利、出版物、科研论文、网页及其他文件和材料显示着本发明所属技术领域技术人员的水平，故将每一篇这些引用的文件和材料并入本文作为参考，就如同单独地全文并入作为参考或者说全文在此阐述一样。申请人保留将出自任一这些专利、出版物、科研论文、网页、电子版信息及其他引用材料或文件的任何所有材料和信息有形地并入本说明书的权利。
[1543] 本专利的书面说明部分包括所有的权利要求。而且，所有的权利要求，包括所有的原始权利要求以及出自任何所有优先权文件的所有权利要求，在此全文并入到本说明书的书面说明部分，且申请人保留将任何所有这些权利要求有形地并入到本申请书面说明部分或任何其他部分的权利。因此，举例来说，在任何情况下都不可以基于某项权利要求的精确措辞未在本专利书面说明部分逐字逐句地列出的断言而所谓地解释成本专利未提供该项权利要求的书面说明。
[1544] 本说明书中公开的所有技术特征可以以任何方式组合。因此，除非明确另行指出，所公开的每个技术特征仅为广义上系列等同或相似技术特征的举例而已。
[1545] 应当理解，虽然已结合其详细说明对本发明进行了描述，但是前述说明旨在进行举例说明而非限制本发明的范围，后者是由所附权利要求书的范围界定的。因此，据此应当意识到，尽管出于举例说明目的已在此处对本发明具体的非限制性实施方案进行了说明，但是可以进行多种改动而不会偏离本发明的精神和范围。其他方面、优点和改动落在所附权利要求书的范围内，且除所附权利要求书之外，本发明不受其他限制。
[1546] 本文所述的具体方法和组合物为优选非限制性实施方案的代表，是举例性的，并非旨在限制本发明的范围。本领域技术人员在考虑本说明书之后会想到其他目标、方面和实施方案，这些都包含在权利要求书范围所界定的本发明精神内。对本领域技术人员而言显而易见的是，可以对本文公开的发明进行多种替换和改动而不会偏离本发明的范围和精神。本文例举性描述的发明可适合在不存在本文没有特别揭示为必要的要素或限制的情况下实施。因此，举例来说，在本文的每一种情况下，在本发明的非限制性实施方案或实施例中，术语“包含”、“包括”、“含有”等，应理解成开放式的而没有限制。本文例举性描述的方法和过程可适合以不同顺序的步骤实施，而不必限于本文或权利要求书中所示的步骤顺序。
[1547] 所采用的术语和短语用作为说明用语而无限制之意，使用这些术语和短语并非意在排除所示所述技术特征或其部分的任何等同物，而是认可在所要求保护的本发明范围之内多种改动是可行的。因此，应理解尽管本发明已通过多种非限制性实施方案和/或优选非限制性实施方案及任选技术特征进行了具体公开，但是本领域技术人员可以付诸实施的对于本文所披露概念的任何所有改动和变动，均视为落入所附权利要求书所限定的本发明范围之内。
[1548] 本文已就本发明进行了宽泛和广义性的说明。落在广义公开范围内的每个更窄的范畴及亚类也都构成本发明的部分。这包括本发明中前提或者负面限制是从大类中刨除一些个主题的那些广义说明，这与所排除的素材是否在本文具体叙述过无关。
[1549] 还应理解，如本文和所附权利要求书中所使用的那样，单数形式的“一”、“一个”和“该”包括复数形式，除非上下文另有明确说明；术语“X和/或Y”表示“X”或“Y”或者“X”和“Y”兼而有之，而跟在名词之后的字母“s”既表示该名词的复数形式，又表示其单数形式。另外，在本发明的技术特征或方面以马库什组进行说明的情况下，意在表示，且本领域技术人员能够认可，本发明涵盖而且也因此就该马库什组的任一个体成员及任一亚组成员进行了说明，故申请人保留对申请或权利要求进行修改从而具体述及该马库什组的任一个体成员及任一亚组成员的权利。
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