一种灰葡萄孢特异性PCR检测方法
阅读：933发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种灰葡萄孢特异性PCR检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 灰葡萄孢 特异性PCR检测方法，包括如下步骤：根据RAPD标记获得灰葡萄孢菌特异性 片段 ，设计扩增引物对序列B1SE11f和B1SE11r；提取样品DNA，PCR法扩增；凝胶 电泳 检测扩增产物，判断样品是否含灰葡萄孢菌；所述判断具体为：若电泳结果在327bp出现单一扩增条带，则说明样品中含有灰葡萄孢菌。本方法可检测到0.4纳克灰葡萄孢菌DNA，可特异性区分葡萄孢属其它种 真菌 以及其近缘属真菌，且能直接应用于田间检测。采用本发明检测灰葡萄孢菌，检测时间短，成本低，检测结果特异，结果判定简单。，下面是一种灰葡萄孢特异性PCR检测方法专利的具体信息内容。
1.一种灰葡萄孢特异性PCR检测方法，其步骤为：
1）CTAB法提取样品真菌菌丝基因组DNA；
2）PCR法扩增，PCR反应体系具体为：样品基因组DNA 1µL；10×PCR buffer 2.5µL；
2.5mM dNTP Mixture 0.5µL；5U/µL rTaq酶0.25µL；一对20µM引物分别0.5µL；ddH2O
19.75µL；总体系25µL；PCR反应程序具体为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火
30s，72℃延伸1min，27个循环；72℃延伸10min；降温至16℃维持5min；
所述引物对为：
B1SE11f：5’–CAGGAAACACTTTTGGGGATA–3’；
B1SE11r：5’–GAGGGACAAGAAAATCGACTAA–3’ ；
3）凝胶电泳检测扩增产物，EB染色观察，在327bp处存在单一扩增条带表明样品中含灰葡萄孢。
一种灰葡萄孢特异性PCR检测方法
技术领域
背景技术
[0002] 灰葡萄孢（Botrytis cinerea）按照最新的分类系统，其无性态属于半知菌类，丝孢纲，丝孢目，暗丛梗孢科，葡萄孢属。有性态属于子囊菌门，盘菌纲，柔膜菌目，核盘菌科，葡萄孢盘菌属。
[0003] 灰葡萄孢是一种兼性寄生菌，在植物生长的任何阶段均可侵染植物的地上部位，产生大量的分生孢子，可随风、水以及农事操作等传播从而进行再侵染，其腐生性强，引起的病害灰霉病是一类顽固性病害。在已报道的葡萄孢属真菌中，灰葡萄孢寄主范围最广，可以侵染蔬菜（如番茄、黄瓜、茄子、辣椒、豆类等）、大田作物（如油菜、小麦等）、水果（桃、梨、葡萄、草莓、苹果等）和花卉（如月季、康乃馨、百合花、郁金香等）。此病原菌喜低温高湿，其发病适温一般为20~25℃，因其发病适宜温度与绝大多数保护地蔬果生长的适宜温度相近，作物一旦被侵染，会突然暴发灰霉病并蔓延，由于病原量大难防治，从而造成严重的经济损失。
[0004] 葡萄孢属真菌主要包括：Botrytis cinerea（灰葡萄孢）、B.fabiopsis（拟蚕豆葡萄孢）、B.fabae（蚕豆葡萄孢）、B.sinoviticola（中国葡萄生葡萄孢）、B.elliptica（椭圆葡萄孢）、B.squamosa（葱鳞葡萄孢）、B.porri（大蒜盲种葡萄孢）、B.sinoallii（中国葱葡萄孢）、B.aclada（葱腐葡萄孢）、B.byssoidea（葱细丝葡萄孢），其近缘属真菌主要包括：Amphobotrys ricini、Verrucobotrys gernii、Streptobotrys caulophylli，它们在寄主上引起的症状相似，在田间无法区分病原种类。而通过分离培养，以及从形态学角度进行病菌鉴定所需时间较长，从而延误病害防治。因此迫切需要一种简单、快速、特异性强、灵敏性高的病原检测方法。
[0005] 本发明依据真菌基因组DNA的多样性，参考已经完善的RAPD（随机扩增多态性DNA片段）方法，扩增灰葡萄孢、葡萄孢属其它种真菌及其近缘属真菌，获得灰葡萄孢特异性DNA片段并测序，依据所得序列设计灰葡萄孢特异性引物，并提出一种更方便、省时灰葡萄孢特异性PCR检测技术。本发明大多数菌株参考文献（张静.湖北省灰霉病病菌区系和灰葡萄孢多样性研究.华中农业大学，博士学位论文，2010）中已经鉴定的真菌。所有试验菌株来源于华中农业大学农业微生物国家重点实验室植物病原真菌李国庆课题组。同时，本发明依据通用引物对ITS1、ITS4扩增真核生物ITS1-5.8S-ITS2（真核生物核糖体内转录间隔区）部分区域来验证本发明中所有样品是否含真核生物DNA，证实本发明中实验的可靠性。
[0006] 虽然已经有学者通过设计特异性PCR引物的方法检测灰葡萄孢，但是所需PCR反应时间长，并且只提供了特异性PCR引物扩增黄瓜霜霉病菌、黄瓜白粉病菌、辣椒疫霉病菌三种真菌的检测结果，其中，黄瓜霜霉病菌、辣椒疫霉病菌属于鞭毛菌门真菌，而黄瓜白粉病菌属于子囊菌门核菌纲真菌，这三种真菌与葡萄孢属相隔甚远容易区分。并未对葡萄孢属其它种及近缘属其它真菌进行特异性检测，且其特异性PCR引物灵敏性也仅限于微克级别。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于提供了一种灰葡萄孢新的特异性PCR检测方法。采用本发明的检测方法检测灰葡萄孢，时间短，成本低，结果特异，结果判定简单，灵敏性高。
[0009] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0010] 本发明提供了一种灰葡萄孢新的特异性PCR检测方法，包括如下步骤：
[0011] 步骤一，通过查找文献及参考上海生工生物工程股份有限公司提供的RAPD引物，选择23个随机引物（见表1），扩增灰葡萄孢及其近缘种（见表3）基因组DNA，根据扩增结果凝胶电泳图比较所有菌株多态性条带，扩增灰葡萄孢所得特异性条带最清晰、最稳定即为所需RAPD引物，最后选定RAPD引物OPE-11，回收灰葡萄孢特异性片段，测得其序列如SEQ ID NO:1所示，设计扩增引物对：B1SE11f（SEQ ID NO:2）和B1SE11r（SEQ ID NO:3）。
[0012] 步骤二，提取样品DNA，PCR法扩增。PCR反应体系具体为：样品基因组DNA1μL（通常为40ng）；10×PCR buffer2.5μL；2.5mM dNTP Mixture（TAKARA BiotechnologyCo.，大连）0.5μL；5U/μL rTaq酶（TAKARA Biotechnology Co.，大连）0.25μL；一对20μM引物分别0.5μL；ddH2O19.75μL。总体系25μL。PCR反应程序具体为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，27个循环；72℃延伸10min；降温至16℃维持5min。
[0013] 步骤三，凝胶电泳检测扩增产物，判断样品是否含有灰葡萄孢。所述判断具体为，琼脂糖凝胶电泳扩增产物，EB染色，紫外灯照射观察，若在327bp处存在单一扩增条带，则说明样品中含灰葡萄孢。
[0014] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
[0015] 本发明通过RAPD方法，选取大量可靠的引物扩增大量的菌株，获得了可靠的灰葡萄孢特异性片段。同时，本发明提供的反应体系，相对于以往的PCR体系减少了反应物量，但得到了很好的扩增结果，从而降低了检测成本。通常PCR反应程序需要35个以上甚至40多个循环，而本发明的程序只需要27个循环就能得到预期的结果，减少了反应时间，也延长了PCR仪的使用寿命，更证明本发明中特异性引物的灵敏度高。因此，采用本发明检测灰葡萄孢，检测时间短，检测成本低，避免了采用传统鉴定方法操作繁琐，耗时长等缺点。同时，本发明检测具有单一特异性，灵敏性高，结果判定简单。
[0016] 特异性好：用本发明的引物和方法检测23株源于不同寄主和不同地区的灰葡萄孢，结果均为阳性。而检测15株近缘种真菌结果均为阴性。说明本发明的引物和方法有很好的特异性。
[0017] 灵敏度高：本发明的引物和方法可检测到0.4纳克灰葡萄孢基因组DNA，同时，当灰葡萄孢基因组DNA与健康寄主植物基因组DNA混合扩增时，健康寄主植物基因组DNA浓度为灰葡萄孢基因组DNA1000倍也不影响检测结果。说明本发明的引物和方法有很好的灵敏性。附图说明
[0018] 图1为一种检测23株源于不同寄主和不同地区的灰葡萄孢凝胶电泳结果图。
[0019] 泳道M：DNA marker DL2000；泳道1~23：23株源于不同寄主和不同地区的灰葡萄孢扩增结果（代号同表2）；泳道CK：以ddH2O为模板空白对照。
[0020] 图2为一种通过检测15株近缘种真菌评价方法的特异性凝胶电泳结果图。
[0021] 本图分为两部分，第一部分为特异性引物对B1SE11f、B1SE11r扩增对照样品和待测样品结果；第二部分为ITS1、ITS4引物对扩增结果，验证第一部分试验可靠性。
[0022] 泳道M：DNA marker DL2000；泳道1：灰葡萄孢扩增结果；泳道2~16：15株近缘种真菌扩增结果（代号同表3）；泳道CK：以ddH2O为模板空白对照。
[0023] 图3为一种通过检测不同浓度灰葡萄孢DNA评价方法的灵敏性凝胶电泳结果图。
[0024] 泳道M：DNA marker DL2000；第2~6泳道：灰葡萄孢基因组DNA量依次为20ng、+ ﹣4ng、0.8ng、0.4ng、0.04ng扩增结果；泳道C ：40ng灰葡萄孢基因组DNA扩增结果；泳道C ：
以ddH2O为模板空白对照。
以ddH2O为模板空白对照。
[0025] 图4为一种中检测40ng灰葡萄孢DNA与不同浓度健康寄主植物DNA混合扩增凝胶电泳结果图。
[0026] 泳道M：DNA marker DL2000；第2~4泳道：40ng灰葡萄孢DNA依次与40ng、400ng、4μg、40μg健康寄主植物DNA混合扩增结果；泳道C：40ng灰葡萄孢基因组DNA量扩增结果；泳道CK：以ddH2O为模板空白对照。
[0027] 图5为一种田间检测凝胶电泳结果图评价方法的实用性。
[0028] 本图分为两部分，第一部分为特异性引物对B1SE11f、B1SE11r扩增对照样品和田间样品结果；第二部分为ITS1、ITS4引物对结果，验证第一部分试验可靠性。
[0029] 泳道M：DNA marker DL2000；泳道C：40ng灰葡萄孢DNA扩增结果；泳道1～10：田间10份样品DNA扩增结果；泳道CK：以ddH2O为模板空白对照。
具体实施方式
[0030] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如提取真菌菌丝基因组DNA的CTAB法按照文献 EM,Bahnweg G,Sandermann H,Geige HH.1992.A simple and efficient protocol for isolation of high molecular weight DNA from filamentous fungi,fruit bodie,and infected plant tissues.Nucleic Acids Res.20:6115-6116.）所述操作，或者按照制造厂商所建议的条件。
[0031] 实施例1：
[0032] 本发明设计一种灰葡萄孢特异性PCR检测方法，包括如下步骤：
[0033] 步骤一，设计特异性扩增灰葡萄孢的引物对
[0034] 通过查找文献及参考上海生工生物工程股份有限公司提供的RAPD（随机扩增多态性DNA片段）引物，选择23个随机引物（见表1，序列由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成），以灰葡萄孢及其近缘种（见表3）基因组DNA为模板扩增。
[0035] 50μLRAPD反应体系：样品基因组DNA1μL（即40ng）；10×PCRbuffer5μL；25mM MgCl22μL；2.5mM dNTP Mixture(TAKARA Biotechnology Co.，大连)1.6μL；5U/μL rTaq酶（TAKARA Biotechnology Co.，大连）0.5μL；20μM RAPD随机引物3μL；ddH2O36.9μL。RAPD反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，36℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；
72℃延伸10min；降温至16℃维持5min。
72℃延伸10min；降温至16℃维持5min。
[0036] 每个引物扩增所有菌株所得50μL产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，紫外灯照射观察，比较所有菌株多态性条带，扩增灰葡萄孢所得特异性条带最清晰、最稳定的引物即为所需RAPD引物，最后选定RAPD引物OPE-11。按照AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit（Axygen Scientific,Inc.Union City,USA）说明方法回收灰葡萄孢特异性片段，然后将PCR产物连接到pMD18-T载体（TAKARA Biotechnology Co.，大连）上，转入大肠杆菌（Escherichia coli DH5α）细胞，挑取抗性平板（LA+Amp）上阳性克隆并检测插入片段的大小，最后挑选三个阳性样品送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序（如SEQ ID NO:1所示），同时，将序列与GenBank中灰葡萄孢全基因组序列比对，证实此序列为灰葡萄孢部分DNA序列。所得序列输入PrimerPremier5.0软件设计扩增引物对，所述引物对序列如下（引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成）：
[0037] B1SE11f：5’-CAGGAAACACTTTTGGGGATA–3’（SEQ ID NO:2）
[0038] B1SE11r：5’-GAGGGACAAGAAAATCGACTAA–3’（SEQ ID NO:3）
[0039] 表1RAPD引物编号及序列
[0040]
[0041]
[0042] 步骤二，DNA模板制备
[0043] 从23种发病寄主上分离获得灰葡萄孢（见表2）。将植株发病部位（肉眼可见分生孢子梗及分生孢子）剪下，放入灭菌的1.5mL离心管中，加入无菌水震荡30s，即获得分生孢子的悬浮液。取带菌悬浮液100μL，使用无菌涂布棒涂布在PDA平板上，20℃下培养2天，挑取10个单菌落分别转接到新鲜的PDA平板上继续培养，一个菌落一个平板。再将这些培养物放置在20℃下恒温培养15天，根据菌落特征和分生孢子形态鉴定其属性(鉴定方法参考张静.湖北省灰霉病病菌区系和灰葡萄孢多样性研究.华中农业大学，博士学位论文，2010)，确定其都为灰葡萄孢。将不同地区不同植物来源的代表菌株转移到PDA试管斜面（18×2cm）上，并置于20℃下培养12天后，保存在4℃冰箱中。从斜面中取出少量菌丝块，在PDA平板上活化2天后，转移菌饼到铺有灭菌玻璃纸的PDA平板上，3天后收集菌丝，利用CTAB法提取每个菌株菌丝DNA，ddH2O溶解、稀释，紫外分光光度计检测浓度至40ng/μL，放置-20℃备用。
[0044] 表2不同寄主上获得的灰葡萄孢电泳样品编号、菌株编号、寄主名称、采集地点及时间
[0045]
[0046]
[0047] 步骤三，灰葡萄孢特异性PCR检测方法的建立
[0048] PCR检测25μL反应体系具体为：样品基因组DNA1μL（即40ng）；10×PCR buffer2.5μL；2.5mM dNTP Mixture（TAKARA Biotechnology Co.，大 连）0.5μL；5U/μL rTaq酶（TAKARA Biotechnology Co.，大连）0.25μL；一对20μM引物分别0.5μL；ddH2O19.75μL。PCR反应程序具体为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，27个循环；72℃延伸10min；降温至16℃维持5min。
[0049] 步骤四，结果判定
[0050] 所述判断具体为：取PCR扩增产物10μL，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，紫外灯照射观察，若在327bp处存在单一扩增条带，则说明样品中含灰葡萄孢。
[0051] 结果，分别取23个样品PCR扩增产物10μL，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，紫外灯照射观察，如图1所示，均在327bp处存在单一扩增条带，对照未检测到任何明显条带，说明所建立的PCR方法能成功检测出23个不同寄主上的灰葡萄孢菌株。
[0052] 实施例2：
[0053] 灰葡萄孢PCR检测方法特异性评价实验
[0054] 步骤一，DNA模板制备
[0055] 按照实施例1步骤二，分别提取葡萄孢属其它真菌及其近缘属真菌共16株（见表3）基因组DNA。
[0056] 本发明所用菌株及鉴定方法参考文献（张静.湖北省灰霉病病菌区系和灰葡萄孢多样性研究.华中农业大学，博士学位论文，2010）中已经鉴定的真菌。所有实验菌株来源于华中农业大学农业微生物国家重点实验室植物病原真菌李国庆课题组。同时，本发明依据通用引物对ITS1、ITS4扩增真核生物ITS1-5.8S-ITS2（真核生物核糖体内转录间隔区）部分区域来验证本发明中所有样品是否含真核生物DNA，证实本发明中实验的可靠性。
[0057] 表3葡萄孢属真菌及其近缘属真菌电泳样品编号、菌株编号、采集地点及时间[0058]
[0059]
[0060] 步骤二，灰葡萄孢PCR检测方法特异性评价试验
[0061] 按照实施例1步骤三中PCR反应体系，取步骤一中制备的每个菌株DNA1μL（即40ng）作为扩增模板，空白对照以1μL ddH2O作为模板。再按照实施例1步骤三中PCR反应程序扩增。同时，依据通用引物对ITS1、ITS4扩增真核生物ITS1-5.8S-ITS2（真核生物核糖体内转录间隔区）部分区域来验证本发明中所有样品是否含真核生物DNA，从而验证本实验的可靠性。其25μLPCR反应体系具体为：待测样品基因组DNA1μL（即40ng）；10×PCR buffer2.5μL；2.5mM dNTP Mixture0.5μL；5U/μL rTaq酶（TAKARA Biotechnology Co.，大连）0.25μL；一对20μM引物分别0.5μL；ddH2O19.75μL。PCR反应程序具体为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，34个循环；72℃延伸10min；降温至16℃维持5min。
[0062] 步骤三，结果判定
[0063] 取PCR扩增产物10μL，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，紫外灯照射观察，特异性引物对B1SE11f、B1SE11r扩增产物若在327bp处存在单一扩增条带，则说明样品中含灰葡萄孢。同时，引物对ITS1、ITS4扩增结果若在539bp左右处存在单一扩增条带，则说明样品中含葡萄孢属真菌及其近缘属真菌DNA模板。
[0064] 结果：如图2所示，仅有泳道1样品灰葡萄孢（Botrytis cinerea）在327bp处存在单一扩增条带，另外泳道2~16样品15株葡萄孢属真菌及其近缘属真菌和对照均未检测到任何明显条带，而ITS1、ITS4引物对扩增结果证实待测所有样品均含有真菌DNA模板。以上结果说明引物对具有很好的特异性，建立的PCR检测方法可以特异性检测灰葡萄孢。
[0065] 实施例3：
[0066] 扩增不同浓度灰葡萄孢DNA评价灰葡萄孢PCR检测方法灵敏度实验
[0067] 步骤一，DNA模板制备
[0068] 按照实施例1步骤二，提取灰葡萄孢DNA，ddH2O溶解、稀释，紫外分光光度计检测浓度依次至40ng/μL、20ng/μL、4ng/μL、0.8ng/μL、0.4ng/μL、0.04ng/μL。
[0069] 步骤二，灰葡萄孢PCR检测方法灵敏度评价试验
[0070] 每个浓度样品分别取1μL加入PCR反应体系，按照实施例1步骤三中方法对待测DNA模板进行PCR扩增检测。
[0071] 步骤三，结果判定
[0072] 取PCR扩增产物10μL，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，紫外灯照射观察，若在327bp处存在单一扩增条带，则说明样品中含灰葡萄孢。
[0073] 结果：如图3所示，第2~5泳道均在327bp处存在依次减弱的单一扩增条带，样品DNA含量依次为20ng、4ng、0.8ng、0.4ng。第6泳道未见明显条带，样品DNA含量为0.04ng。第7泳道为40ngDNA扩增结果，作为阳性对照。第8泳道为ddH2O扩增结果，作为阴性对照。
因此判定PCR灵敏度为0.4ng，具有较高的灵敏性。
因此判定PCR灵敏度为0.4ng，具有较高的灵敏性。
[0074] 实施例4：
[0075] 不同浓度寄主DNA与灰葡萄孢DNA混合扩增评价灰葡萄孢PCR检测方法灵敏度实验
[0076] 步骤一，DNA模板制备
[0077] 按照实施例1步骤二，提取灰葡萄孢DNA，ddH2O溶解、稀释，紫外分光光度计检测浓度至40ng/μL。按照植物基因组DNA试剂盒（TIANGEN BIOTECH，北京）所述方法提取健康蚕豆叶片基因组DNA，ddH2O溶解、稀释，紫外分光光度计检测浓度依次至40ng/μL、400ng/μL、4μg/μL、40μg/μL。
[0078] 步骤二，灰葡萄孢PCR检测方法灵敏度评价试验
[0079] 每个浓度植物组织DNA分别取1μL与1μL灰葡萄孢DNA混合，加入PCR反应体系，按照实施例1步骤三中方法对待测DNA模板进行PCR扩增检测。
[0080] 步骤三，结果判定
[0081] 取PCR扩增产物10μL，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，紫外灯照射观察，若在327bp处存在单一扩增条带，则说明样品中含灰葡萄孢。
[0082] 结果：如图4所示，第2~4泳道均在327bp处存在清晰的单一扩增条带。第5泳道为40ng灰葡萄孢DNA扩增结果，作为阳性对照。第6泳道为ddH2O扩增结果，作为阴性对照。因此，判定寄主植物组织DNA对PCR检测无影响，PCR检测具有较高的灵敏性。
[0083] 实施例5灰葡萄孢PCR检测田间实验
[0084] 步骤一，DNA模板制备
[0085] 按照实施例1步骤二，任意选取田间显现病斑蚕豆叶片0.2g，提取DNA，100μL ddH2O溶解。
[0086] 步骤二，灰葡萄孢PCR检测方法田间样品试验
[0087] 分别取每份样品DNA1μL加入PCR反应体系，按照实施例1步骤三中方法对待测DNA模板进行PCR扩增检测。同时，按照实施例2步骤二中方法用引物对ITS1、ITS4扩增所有待测样品，用于检测样品是否含真核生物DNA。
[0088] 步骤三，结果判定
[0089] 取PCR扩增产物10μL，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，紫外灯照射观察，特异性引物对B1SE11f、B1SE11r扩增产物若在327bp处存在单一扩增条带，则说明样品中含灰葡萄孢。同时，引物对ITS1、ITS4扩增结果若在500~750bp之间存在扩增条带，则说明样品中含真核生物DNA模板。
[0090] 结果：图5为田间10份样品基因组DNA扩增结果，1、4、5、6、9号样品均在327bp处存在明暗不一的单一扩增条带，按照实施例1步骤一中方法回收这些条带，并测序，将序列与所得灰葡萄孢特异性序列比对100%同源。同时，将ITS1、ITS4引物对扩增条带分别回收、测序（序列由北京奥科鼎盛生物科技有限公司测得），所得序列与GenBank中序列比对，证实所有待测样品中扩增得到强亮度条带均为寄主植物DNA，而相对较弱的条带为灰葡萄孢或者其它真菌的DNA。本实施例证明，灰葡萄孢特异性PCR检测方法具有非常高的可靠性。
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