灰葡萄孢石竹变种用于制备金纳米粒子的用途
阅读：677发布：2020-05-12
专利汇可以提供灰葡萄孢石竹变种用于制备金纳米粒子的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 灰葡萄孢 石竹变种(Botrytis cinerea)菌株、其孢子、菌丝、菌丝体、菌核、胞内和/或胞外有机分子(如 蛋白质 、核酸、多糖、脂质和次级 代谢物 )用于 生物 合成金 纳米粒子 (AuNps)的用途。概括地，本发明涉及灰葡萄孢石竹变种菌株和/或由该生物产生的分子用于生物合成AuNps的用途，并且因此，应用领域是，使用 植物 病原体 真菌 灰葡萄孢石竹变种和/或它的单独地或组合地纯化的胞内或胞外蛋白质或该生物产生的任何其他胞内和/或胞外分子作为生物合成系统合成 纳米材料 ，尤其是AuNps。金属纳米粒子被用于各种应用，包括： 半导体 、 光致发光 、生物医学、医学诊断成像、催化剂(分散型及支持型)并且被用于针对某些类型的瘤形成(癌症)的 治疗 ，等等。，下面是灰葡萄孢石竹变种用于制备金纳米粒子的用途专利的具体信息内容。
1.生物合成金纳米粒子(AuNps)的方法，其中所述方法包括：
a)在20℃在黑暗中10天的在含有0.1-1％之间的麦芽提取物和0.1-1％酵母提取物的营养培养基中的灰葡萄孢石竹变种(Botrytis cinerea)真菌的菌丝体培养；和b)产生金纳米粒子(AuNps)，取获得自步骤a)的上清并将其与HAuCl4·3H2O在25-27℃之间的范围内的温度温育0.5至12小时之间的范围内的时间，并且通过低速离心或通过在静置至少1小时后的自发沉降回收所述纳米粒子。
2.权利要求1所述的方法，其中步骤b)包括自所述上清提取由灰葡萄孢石竹变种(B.cinerea)产生的分子，并且将含有这样的分子的悬浮液在25-27℃之间的范围内的温度保持0.5至12小时之间的范围内的时间，并且通过低速离心或通过在静置至少1小时后的自发沉降回收所述纳米粒子。
3.灰葡萄孢石竹变种菌株、其菌丝体、包括蛋白、核酸、多糖、脂和次级代谢物的胞内和胞外有机分子用于金纳米粒子(AuNps)的生物合成的用途。
灰葡萄孢石竹变种用于制备金纳米粒子的用途
发明领域
[0001] 本发明涉及灰葡萄孢石竹变种(Botrytis cinerea)菌株、其菌丝体、包括蛋白、核酸、多糖、脂和次级代谢物的胞内和/或胞外有机分子用于生物合成金纳米粒子(AuNps)的用途。概括地，本发明聚焦于将灰葡萄孢石竹变种(B.cinerea)菌株和/或由该生物产生的分子用于生物合成AuNps。因此，申请的领域集中于，使用植物病原体真菌灰葡萄孢石竹变种和/或它的单独地或组合地纯化的胞内或胞外蛋白质或由该生物产生的任何其他分子作为生物合成系统，合成纳米材料，尤其是AuNps。
[0003] 发明背景
[0004] 纳米粒子是尺寸为1至100纳米范围内的结构体，并且由于其光学、化学、光电化学和电学性质而尤其有吸引力(Wilson M.,Kannangara K.,Smith G,Simmons M.,Raguse B.Nanotechnology:Basic Science and Emerging Technologies(纳米技术：基础科学和新兴技术).Chapman and Hall/CRC 2002；Jain,P.K.,Huang,X.,El-Sayed,I.H.El-Sayed,M.A.2008.Noble metals on the nanoscale:optical and photothermal properties and some applications in imaging,sensing,biology and medicine(纳米级的贵金属：光学和光热性质以及在成像、感测、生物学和医学方面的一些应用).A of Chem Res.41:
1578-1586)。
1578-1586)。
[0005] 近年，合成具有不同组成和尺寸的纳米粒子是非常让人感兴趣的研究领域。目前，大规模制备AuNPs通过化学方法进行，所述化学方法需要使用还原剂以由可溶的金盐生产粒子。也存在物理方法，其需要在减压和高温下操作。在这两种情况中，伴随AuNPs生产，由于所述反应试剂和信号系统的操作条件而产生有毒的化学化合物；这带来了问题，所述问题涉及产生的纳米粒子的稳定性、聚集和所需尺寸的控制(Sau T.K.,Murphy C.J.2004.Room temperature,high-yield synthesis of multiple shapes of gold nanoparticles in aqueous solution(在水溶液中室温高产率合成多种形状的金纳米粒子).J Am Chem Soc 126:8648–8649)。
[0006] 已知此课题在世界范围内的相关性，必需要进行备选的和有效的不需要大量的能量的“对环境友好的”用于获得金属纳米粒子的方法。在这点上，生物系统是进行此种方法的良好候选。目前，关于此课题有多种出版物，具体地涉及包括细菌和真菌在内的某些生物产生这些结构体的能力(Brown S,Sarikaya M,Johnson EA.2000.Genetic analysis of crystal growth(晶体生长的遗传分析).J Mol Biol 299:725–735；Nair B,Pradeep T.2002.Coalescence of nanoclusters and formation of submicron crystallites assisted by Lactobacillus strains(乳酸杆菌菌株辅助的纳米簇的聚结和亚微米微晶的形成).Cryst Growth Des 2:293–298；-Husseiny MI.,Abd El-Aziz M,Badr Y,Mahmoud MA.2007.Biosynthesis of gold nanoparticles using Pseudomonas aeruginosa(使用铜绿假单胞菌生物合成金纳米粒子).Spectrochimica Acta Part A.67:1003–1006；Narayanan KB,Sakthivel N.2010.Biological synthesis of metal nanoparticles by microbes(通过微生物生物合成金属纳米粒子).Adv Colloid Interface Sci 156:1-13；
Thirumurugan G,Veni VS,Ramachandran S,Rao JV,Dhanaraju MD.2011.Superior wound healing effect of topically delivered silver nanoparticle formulation using eco-friendly potato plant pathogenic fungus:synthesis and characterization(使用对环境友好的马铃薯植物病原真菌的局部递送的银纳米粒子制剂的出色的伤口愈合效果：合成和表征).J Biomed Nanotechnol.7:659-66；Mourato A,Gadanho M,Lino AR,Tenreiro R.2011.Biosynthesis of crystalline silver and gold nanoparticles by extremophilic yeasts(通过极端酵母生物合成晶态银和金纳米粒子).Bioinorg Chem Appl.2011:546074；Balagurunathan R,Radhakrishnan M,Rajendran RB,Velmurugan D.2011.Biosynthesis of gold nanoparticles by actinomycete Streptomyces viridogens strain HM10(通过放线菌产绿链霉菌菌株HM10生物合成金纳米粒子).Indian J Biochem Biophys 48:331-335。
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[0007] 肽、细菌、真菌和植物催化金属纳米粒的胞外合成的可能机制目前已被修改(Durán N,Marcato PD,Durán M,Yadav A,Gade A,Rai M.2011.Appl Microbiol Biotechnol 90:1609-1624)。灰葡萄孢石竹变种是植物病原体真菌，其感染大量的具有极高经济重要性的植物物种，包括果树、观赏植物和蔬菜。此真菌产生被称为灰霉病(grey mold)的疾病，其在草莓、覆盆子、苹果、梨、栗子、猕猴桃和葡萄等中在收割前和收割后产生严重的问题。在葡萄藤中，该真菌产生果腐病(bunch rot)，(van Kan J.A.2006.Licensed to kill:the lifestyle of a necrotrophic plant pathogen(授权杀戮：腐生性植物病原体的生活方式).Trends Plant Sci.11,247-253；Elad,Y.,Williamson,B.,Tudzynski,P.和Delen,N.编辑2007.Botrytis:Biology,Pathology and Control(葡萄孢：生物学、病理学和防治).The Netherlands:Kluwer Academic Publishers)。
[0008] 传统上，研究灰葡萄孢石竹变种的目的在于产生策略以允许对其进行控制，并且因此，降低与由该真菌产生的感染相关的经济损失。直至今日，在纳米技术领域还没有研究将灰葡萄孢石竹变种的培养物、繁殖体或分子用于合成金属纳米粒子的方法。我们的结果显示，液体培养基中的灰葡萄孢石竹变种能够催化在室温自HAuCl4的溶液的金纳米粒子的合成。纳米粒子的形成通过反应溶液的颜色从浅黄色到微红色到紫色的变化得到验证。此外，含有纳米粒子的溶液在540nm处呈现吸收的最大值，这是此类结构存在的特性。
[0009] 关于知识产权，涉及金属纳米粒子的合成的专利主要由化学方法用于合成这些结构体的用途组成，它们中的一些允许制备具有特定尺寸和形态的粒子。这就是专利USNo.6.929.675中的情况，其中描述了用于制备铜、银和金纳米粒子的化学体系。具体地关于AuNps，还可以找到一些公开，如专利US 20070125196，其中描述了使用含有丙烯酸钠的水介质合成尺寸在30至90nm范围内的AuNPs，并且还可以找到公开US 20060021468，其中描述了用于控制产生的粒子的均匀性的化学方法。
[0010] 最后，应当注意的是，虽然有涉及使用生物系统合成AuNps的专利，但是目前没有专利描述将灰葡萄孢石竹变种或由所述真菌产生的分子用于此用途。关于这点，具有最大相似性的专利是由University of Illinois的研究者在2010年公开的专利(公开USNo.20100055199)，其中描述了真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)用于合成AgNps的用途。
[0011] 发明概述
[0012] 本发明涉及由丝状子囊菌(filamentous ascomycete)灰葡萄孢石竹变种和/或由该真菌菌丝体分泌的分子介导的AuNps的合成。因为以上，该方法可以以分离的方式直接使用所述真菌或其分子来进行。
[0014] 图1.通过灰葡萄孢石竹变种的胞外AuNps合成。将灰葡萄孢石竹变种培养物上清与HAuCl4在ELISA微平板的不同的孔中温育。(a)没有接种的培养基，(b)获得自灰葡萄孢石竹变种的培养物的培养基，(1、5和10)获得自在分别存在HAuCl4 1、5和10mM的情况下的灰葡萄孢石竹变种的培养物的培养基。
[0015] 图2.由灰葡萄孢石竹变种培养物上清产生的AuNps的吸收光谱。吸收的最大值约在550nm处观察到。
[0016] 图3.由灰葡萄孢石竹变种产生的金粒子的EDS谱。观察到对应于作为纳米粒子成分的金元素的存在的信号。
[0018] 本发明优选实施方案的描述
[0019] 具体被设计成自丝状真菌制备金纳米粒子的方法。该方法包括以下步骤：
[0020] 1.-真菌菌丝体的生长：将真菌菌丝体培养在含有50mL的营养培养基的250mL Erlenmeyer烧瓶中，所述营养培养基含有0.1-1％之间的麦芽提取物和0.1-1％的酵母提取物。将所述真菌在20℃在黑暗中培养，并且为了这样做，将烧瓶保持在暗室中10天。
[0021] 2.-金属纳米粒子的产生：将约100mL的获得自所述真菌的生长的上清液收集在500mL Erlenmeyer烧瓶中，并且将其与HAuCl4·3H2O(终浓度0.5-10mM)一起温育。为了这样做，向所述上清中添加0.5-10mL的HAuCl4·3H2O 100mM的溶液，并且将该500mL Erlenmeyer烧瓶在25-27℃之间的范围内的温度温育0.5至12小时的时间。通过低速离心(6,000-8,
000rpm)或通过自发沉降(使试管静置至少1小时)回收粒子。
000rpm)或通过自发沉降(使试管静置至少1小时)回收粒子。
[0022] 所述材料通过以下各项表征：i)吸收光谱，其中在约550nm处观察到最大值。ii)由灰葡萄孢石竹变种产生的金粒子的透射电子显微镜法。观察到具有极大多样性的尺寸(10-300nm)以及形态(球形的、六角形的、三角形的和多面的)的粒子。
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