一种基于悬浮芯片系统针对灰葡萄孢抗药相关位点的多重检测方法
专利汇可以提供一种基于悬浮芯片系统针对灰葡萄孢抗药相关位点的多重检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种基于悬浮芯片系统针对 灰葡萄孢 抗药相关位点的 多重检测 方法涉及分子 生物 学领域，具体涉及一种采用悬浮芯片系统，结合ASPE PCR方法针对与4种 杀菌剂 抗药性相关的灰霉抗药位点多重检测技术。本 发明 公开了一种基于悬浮芯片系统的针对灰葡萄孢抗药突变位点的多重检测方法。它是依次通过多重PCR、EXO/SAP处理PCR产物、多重ASPR PCR、带有生物素标记的ASPR PCR产物与 磁珠 杂交、Bio‑Plex 200系统检测五个步骤，来实现同时检测与四类杀菌剂抗药型相关基因型的目的。本发明具有高通量、灵敏度高、特异性好、重复性好、所需样本量少等优点。，下面是一种基于悬浮芯片系统针对灰葡萄孢抗药相关位点的多重检测方法专利的具体信息内容。
1.一种基于悬浮芯片系统针对灰葡萄孢抗药相关位点的多重检测方法，其特征在于共分五步：第一步，四重聚合酶链式反应:以灰葡萄孢菌基因组DNA为模板，采用四对引物，在同一反应体系中同时扩增包含抗药突变位点在内的BenA、SdhB、BcOS1、erg27四个基因片段；SEQ ID NO:1GTCGTCCCATCGCCAAAGGT，SEQ ID NO:2ACGGTGACAGCACGGAAAGA用于扩增BenA基因片断；SEQ ID NO:3ACACCGACCCAGCACCAGA，SEQ ID NO:4TTAGCAATAACCGCCCAAA用于扩增SdhB基因片断；SEQ ID NO:5AGGTCACCCGCGTAGCAAGA，SEQ ID NO:
6TGCTTGATTTCACCCTTACA用于扩增BcOS1基因片断；SEQ ID NO:7GCGTGGAGAACTCTAAATCGG，SEQ ID NO:8AGTGTAAGGCTTGATGGTATGC用于扩增erg27基因片断。
第二步，ExoSAP-IT处理四重PCR产物，以去除多余的引物及脱氧核苷酸(dNTP)；
第三步，多重等位基因特异性扩增反应。
该步反应以第二步中的反应产物为模板，加入dATP、dGTP、dTTP和生物素标记的dCTP，反应体系中共包括8条特异性TAG-ASPE检测引物，每条引物对应一种基因型，最终该步反应的 产物会带有生物素标记；多重ASPE反应引物序列为：SEQ ID NO:
9CATCTTCATATCAATTCTCTTATTTTGGTTGAGAACTCTGACGA，SEQ ID NO:
10ACAATATACATCACTTAAACTTTCTTGGTTGAGAACTCTGACGC，SEQ ID NO:
11AACTTTCTCTCTCTATTCTTATTTGAGCAGTTGAGAATAGTGTG，SEQ ID NO:
12AATTTCTTCTCTTTCTTTCACAATGAGCAGTTGAGAATAGTGTA，SEQ ID NO:
13ATACTTTACAAACAAATAACACACTGCCCTGGACGCCTTCGA，SEQ ID NO:
14TCATCACTTTCTTTACTTTACATTTGCCCTGGACGCCTTCGC，SEQ ID NO:
15TTCAATTCAAATCAAACACATCATCCATCCATCTTACAAGGTAGA，SEQ ID NO:
16ATCTCAATTACAATAACACACAAACATCCATCTTACAAGGTAGG；
第四步，将8种偶联有anti-TAG序列的荧光编码微球混合，不同荧光编码微球上偶联的anti-TAG序列特异的与ASPE反应产物的TAG序列杂交，反应体系中加入的链酶亲和素-藻红蛋白，识别微球捕获的PCR产物上的生物素标记；
第五步，区分不同颜色的微球并且检测复合物发出的荧光，从而确定目标物的基因型，以此达到高通量的检测目的。检测结果以平均荧光强度展示。检测的八种与灰葡萄孢抗药性相关的基因型分别为：BenA-E198(GAG)、BenA-198A(GCG)、SdhB-H272(CAC)、SdhB-272Y(TAC)、BcOS1-I365(ATC)、BcOS1-365S(AGC)、erg27-F412(TTC)、erg27-412S(TCC)。
2.根据权利要求1所述的方法，第一步中所需的SEQ ID NO:1-8八条引物浓度分别为
0.05μM、0.05μM、0.4μM、0.4μM、0.2μM、0.2μM、0.2μM、0.2μM。
3.根据权利要求1所述的方法，第一步中的反应体系如下：
PCR反应程序：94℃ 5min；94℃ 30sec，54℃ 30sec，72℃ 25sec共35个循环；72℃
10min；4℃保存。
4.根据权利要求1所述的方法，第三步中
2×ASPE PCR mix配制体系
ASPE PCR反应体系
PCR反应程序：96℃ 2min；94℃ 30sec，54℃ 1min，72℃ 2min共40个循环；4℃保存。
5.根据权利要求1所述的方法，第四步所述杂交的条件为96℃ 90s,37℃1hour。
一种基于悬浮芯片系统针对灰葡萄孢抗药相关位点的多重检
测方法
技术领域
背景技术
发明内容：
30sec，54℃30sec，72℃25sec共35个循环；72℃10min；4℃保存。第二步，ExoSAP-IT处理四重PCR产物，以去除多余的引物及脱氧核苷酸(dNTP)。反应体系及程序如下：将第一步7.5μl多重PCR产物与3μl ExoSAP-IT混合，37℃反应30min，80℃反应15min，4℃保存；第三步，多重等位基因特异性扩增(ASPE)反应。该步反应以第二步中的反应产物为模板，加入dATP、dGTP、dTTP和生物素标记的dCTP，反应体系中共包括8条特异性TAG-ASPE检测引物SEQ ID NO:9-16，最终该步反应的产物会带有生物素标记；第四步，将8种偶联有anti-TAG序列的荧光编码微球混合，不同荧光编码微球上偶联的anti-TAG序列特异的与ASPE反应产物的TAG序列杂交，反应体系中加入的链酶亲和素-藻红蛋白(SAPE)，能够识别微球捕获的PCR产物上的生物素标记；第五步，BIO-RAD公司的Bio-Plex 200系统区分不同颜色的微球并且检测复合物发出的荧光，从而确定目标物的基因型，以此达到高通量的检测目的。检测结果以平均荧光强度(MFI)展示。
附图说明
具体实施方式
表2 2×ASPE PCR mix(2倍的ASPE PCR预混液)配制体系
ASPE PCR反应体系如下表3所示。
表3ASPE PCR反应体系
2.按照每种微球2500个/反应混合；
3.用2×Tm杂交buffer(2倍的Tm杂交缓冲液)(0.4M NaCl,0.2M Tris,0.16％Triton
X-100,pH 8.0)稀释/富集各种Magplex-TAG微球混合液100个/ul，涡旋混匀，超声20s；
4.各孔加入25ul混合微球；
5.向对应孔中加入5ul ASPE反应物，20ul ddH2O；
6.用MicroSeal A film覆盖防止蒸发，PCR仪中反应：96℃90s,37℃1hour；
7.将反应混合液加入预洗96孔滤板中；
8.用75ul 1×Tm杂交buffer(1倍的Tm杂交缓冲液)(0.2M NaCl,0.1M Tris,0.08％
Triton X-100,pH8.0)重悬微球，真空抽滤，去除1×Tm buffer；
9.重复8；
10.用包含2ug/ml SAPE的75ul 1×TM杂交buffer(含有0.1％BSA)重悬微球；
11.37℃15min；
12.Bio-Plex 200系统检测(室温50ul)，区分不同颜色的微球并且检测复合物发出的荧光，从而确定目标物的基因型，以此达到高通量的检测目的。检测结果以平均荧光强度(MFI)展示。
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