发明领域
[0001] 本发明涉及一种
微生物及用途，更具体地说涉及一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）DJ-6菌株、用途及其制剂的制备方法，属于生物
农药技术领域。
背景技术
[0002] 由
植物病原
真菌围小丛壳菌（Glomerella cingulata）侵染引发的葡萄
炭疽病、囊孢壳菌（Physalospora baccae）侵染引发的葡萄房枯病、链格孢菌（Alternaria viticola）引发的葡萄穗轴褐腐（枯）病、Coniothyrium dlodiella侵染引发的葡萄白腐病、单轴霉属（Plasmopara viticola）侵染引发的葡萄霜霉病、
灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）侵染引发的葡萄灰霉病和痂囊腔菌（Elsinae ampelina) 侵染引发的葡萄黑痘病是我国葡萄上发生的主要病害。
[0003] 葡萄病害当前主要通过
化学防治来防控，常用以下化学药剂防治：甲基硫菌灵(thiophanate-methyl)、波 尔多液（bordeaux mixture）、五氯酚钠（sodium pentachlorophenol）、乙 酸
铜（cupric acetate）、嘧 菌 酯（azoxystrobin）、醚 菌 酯(kresoxim-methyl)、嘧霉胺(pyrimethanil)、苯醚甲环唑(difenoconazole)、烯肟菌酯(enestroburin)、氟吗啉（flumorph）、啶酰菌胺（boscalid）、甲霜灵（metalaxyl）、霜霉威（propamocarb）、多菌灵(carbendazim)、咪鲜胺（prochloraz）、吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）和烯酰吗啉（dimethomorph）等。长期以来，由于多频次、多剂量施用化学药剂，造成葡萄病原菌对常用化学药剂都产生了不同程度的抗（耐）药性，生产上屡屡出现防治失败的事例。
[0004] 目前成功用于防治葡萄病害的
生物农药专用制剂还没有。文献已报道
生物防治控制葡萄病害的生防菌属（种）主要有（1）木霉菌属真菌（Trichoderma spp.）中的绿色木霉（Trichoderma viride）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）；（2）芽孢杆菌属细菌（Bacillus spp.）中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)、多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）和解
淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）；（3）单格孢菌( Ulocladium atrum)；（4）链霉菌属细菌（Streptomycesspp.）中的灰绿链霉菌( Streptomyces griseovirides)、吸
水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）、金色链霉菌（Streptomyces aureochromogenes）和链霉菌（Streptomyces kitasazwaensis）；（5）假单胞菌属细菌（Pseudomonas spp.）中的洋葱假单胞菌( Pseudomonas cepacia)、
荧光假单胞细菌（Pseudomonas fluorescens）和恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）；（6）
酵母菌中的季也蒙毕赤氏酵母（Pichia guilliermondii）和罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）等。
[0005] 本发明提供的可同时兼治葡萄多种病害的颉颃细菌枯草芽孢杆菌DJ-6菌株，在
现有技术中没有提及和公开。
发明内容
[0006] 本发明解决现有技术存在的不足，提供一株分离自黄杜鹃花的内生芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）DJ-6菌株，该菌株可用于防治葡萄炭疽病、葡萄房枯病、葡萄穗轴褐腐病、葡萄灰霉病、葡萄黑痘病和葡萄白腐病。同时本发明还提供用该枯草芽孢杆菌DJ-6菌株加工成悬浮剂的制备方法。
[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0008] 本发明的枯草芽孢杆菌（拉丁文学名为Bacillus subtilis）DJ-6菌株，已于2012年7月2日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，保藏号为：CGMCC No. 6314。本发明的菌种具有如下特征：
[0009] （1）DJ-6菌株的细胞形态及生理生化特征（见表1）
[0010] 表1、DJ-6菌株细胞形态及理化特征
[0011]
[0012] （2）本发明的枯草芽孢杆菌DJ-6菌株的16S rRNA基因序列为：
[0013] TATCATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCYYGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCA；
[0014] （3）本发明的枯草芽孢杆菌DJ-6菌株的gyrB基因序列为：
[0015] GCTTGATGTGACGGTTCACCGTGACGGTAAAATTCACCGCCAAACCTATAAACGCGGAGTTCCGGTTACAGACCTTGAAATCATTGGCGAAACGGATCATACAGGAACGACGACACATTTTGTCCCGGACCCTGAAATTTTCTCAGAAACAACCGAGTATGATTACGATCTGCTTGCCAACCGCGTGCGTGAATTAGCCTTTTTAACAAAGGGCGTAAACATCACGATTGAAGATAAACGTGAAGGACAAGAGCGCAAAAATGAATACCATTACGAAGGCGGAATTAAAAGTTATGTAGAGTATTTAAACCGCTCTAAAGAGGTTGTCCATGAAGAGCCGATTTACATTGAAGGCGAAAAGGACGGCATTACGGTTGAAGTGGCTTTGCAATACAATGACAGCTACACAAGCAACATTTACTCGTTTACAAACAACATTAACACGTACGAAGGCGGTACCCATGAAGCTGGCTTCAAAACGGGCCTGACTCGTGTTATCAACGATTACGCCAGAAAAAAAGGGCTTATTAAAGAAAATGATCCAAACCTAAGCGGAGATGACGTAAGGGAAGGGCTGACAGCGATTATTTCAATCAAACACCCTGATCCGCAGTTTGAGGGCCAAACGAAAACAAAGCTGGGCAACTCAGAAGCACGGACGATCACCGATACGTTATTTTCTACGGCGATGGAAACATTTATGCTGGAAAATCCAGATGCAGCC。
[0016] 用本发明的防治葡萄病害的菌株DJ-6制备的生防菌剂，其制备方法包括以下步骤：
[0017] （A）菌液的获得
[0018] 用无菌芽签挑取事先在PDA固体培养基上划线培养好的DJ-6菌株单菌落斑，接种于装有5 mL PDA液体培养液的容积为20 mL的三
角瓶中，于30 ℃、200 rpm条件下振荡培养16 h，过夜，将上步所得培养液5 mL全部接种于装有400 mL PDA培养液的容积为1000 mL的三角瓶中，200 rpm、30℃条件下振荡培养16 h；把所得的400mL培养液接种于装有20 L培养液的容积为30L的
发酵罐（镇江东方GUS-30），20L发酵培养液中固容物含量为：
豆粕100 g、
马铃薯淀粉200 g、
蔗糖25 g、酵母粉25 g、CaCO3 20 g、MnSO4 1.0 g，设置发酵条件为：溶
氧100%，搅拌速度为350 rpm，发酵
温度30 ℃，发酵时间36 h，pH 7.0-7.2；
[0019] （B）菌剂加工工艺
[0020] 将发酵好的发酵液按如下方法加工成悬浮剂：
[0021] （1）将发酵液离心（8000 rpm）后用20%丙三醇溶液（V/V）（溶液用无菌水配制）重新悬浮，测定悬浮液的活芽孢含量，根据测定结果用20%丙三醇溶液（V/V）调节悬浮液的活10
芽孢数，终含量调节成芽孢含量为1.0×10 cfu/mL（即每毫升含100亿个活芽孢）；（2）在上述调节好的悬浮液中按5 g/L（W/V）的用量加入黄原胶，并搅拌均匀，得成品悬浮剂的浓度为100亿活芽孢/mL。
[0022] 本发明的有益效果是：
[0023] （1）本发明提供一株新的生防芽孢杆菌——枯草芽孢杆菌DJ-6菌株，由该菌株发酵而制得的悬浮剂，能有效防治葡萄炭疽病、葡萄房枯病、葡萄穗轴褐腐病、葡萄灰霉病、葡萄黑痘病和葡萄白腐病；
[0024] （2）菌剂贮藏性质稳定，防治效果好，大规模生产的发酵工艺简单、生产成本低廉。
具体实施方式
[0026] 本发明的枯草芽孢杆菌（拉丁文学名为Bacillus subtilis）DJ-6菌株，已于2012年7月2日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC No.6314。本发明的菌株的细胞形态及生理生化特征见表1。
[0027] 本实施例的枯草芽孢杆菌DJ-6菌株的16S rRNA基因序列为：
[0028] TATCATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCYYGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCA。
[0029] 本实施例的枯草芽孢杆菌DJ-6菌株的gyrB基因序列为：
[0030] GCTTGATGTGACGGTTCACCGTGACGGTAAAATTCACCGCCAAACCTATAAACGCGGAGTTCCGGTTACAGACCTTGAAATCATTGGCGAAACGGATCATACAGGAACGACGACACATTTTGTCCCGGACCCTGAAATTTTCTCAGAAACAACCGAGTATGATTACGATCTGCTTGCCAACCGCGTGCGTGAATTAGCCTTTTTAACAAAGGGCGTAAACATCACGATTGAAGATAAACGTGAAGGACAAGAGCGCAAAAATGAATACCATTACGAAGGCGGAATTAAAAGTTATGTAGAGTATTTAAACCGCTCTAAAGAGGTTGTCCATGAAGAGCCGATTTACATTGAAGGCGAAAAGGACGGCATTACGGTTGAAGTGGCTTTGCAATACAATGACAGCTACACAAGCAACATTTACTCGTTTACAAACAACATTAACACGTACGAAGGCGGTACCCATGAAGCTGGCTTCAAAACGGGCCTGACTCGTGTTATCAACGATTACGCCAGAAAAAAAGGGCTTATTAAAGAAAATGATCCAAACCTAAGCGGAGATGACGTAAGGGAAGGGCTGACAGCGATTATTTCAATCAAACACCCTGATCCGCAGTTTGAGGGCCAAACGAAAACAAAGCTGGGCAACTCAGAAGCACGGACGATCACCGATACGTTATTTTCTACGGCGATGGAAACATTTATGCTGGAAAATCCAGATGCAGCC。
[0031] 用本发明的防治葡萄病害的DJ-6菌株制备的生防菌剂，其制备方法包括以下步骤：
[0032] （A）菌液的获得
[0033] 用无菌芽签挑取事先在PDA固体培养基上划线培养好的DJ-6菌株单菌落斑，接种于装有5 mL PDA液体培养液的容积为20 mL的三角瓶中，于30 ℃、200 rpm条件下振荡培养16 h，过夜，将上步所得培养液5 mL全部接种于装有400 mL PDA培养液的容积为1000 mL的三角瓶中，200 rpm、30℃条件下振荡培养16 h；把所得的400mL培养液接种于装有20 L培养液的容积为30L的
发酵罐（镇江东方GUS-30），20L发酵培养液中固容物含量为：豆粕100 g、马铃薯淀粉200 g、蔗糖25 g、酵母粉25 g、CaCO3 20 g、MnSO4 1.0 g，设置发酵条件为：溶氧100%，搅拌速度为350 rpm，发酵温度30 ℃，发酵时间36 h，pH 7.0-7.2。
[0034] （B）菌剂加工工艺
[0035] 将发酵好的发酵液按如下方法加工成悬浮剂：
[0036] （1）将发酵液离心（8000 rpm）后用20%丙三醇溶液（V/V）（溶液用无菌水配制）重新悬浮，测定悬浮液的活芽孢含量，根据测定结果用20%丙三醇溶液（V/V）调节悬浮液的活10
芽孢数，终含量调节成芽孢含量为1.0×10 cfu/mL（即每毫升含100亿个活芽孢）；（2）在上述调节好的悬浮液中按5 g/L（W/V）的用量加入黄原胶，并搅拌均匀，得成品悬浮剂的浓度为100亿活芽孢/mL。
[0037] 实施效果
[0038] DJ-6悬浮剂对葡萄病害的田间防治试验
[0039] 试验处理方法：在江苏省万山红遍农业科技示范园（江苏省句容市后白镇）, 葡萄品种为巨峰, 试验园面积约8.6亩。采用水平棚架式栽植, 树龄6年生。试验时间2011年6～9月。药剂处理为枯草芽孢杆菌DJ-6悬浮剂（100亿活芽孢/mL）1000倍液，对照药剂50%多菌灵
可湿性粉剂1000倍液，空白对照为不防治, 每小区6棵树，喷雾用水量为3 kg/棵，实验4重复，小区随机区组排列。试验于2011年6月15日第1次喷药, 每隔10天（遇到下雨天时调整喷药日期）共防治5次，最后1次防治日期为8月8日。于最后1次施药后14天( 8月22日) 调查防效。调查时在每个小区中间随机选4株葡萄，在上、中、下、左、右5个方位分别取1个果穗，共20个果穗, 记载每个果穗轴、果粒和果柄中各种病害的发病率, 计算出病指和防治效果。
[0040] 结果与分析：第5次喷药后14天, 枯草芽孢杆菌DJ-6悬浮剂（100亿活芽孢/mL）1000倍液对葡萄炭疽病，葡萄房枯病，葡萄穗轴褐腐，葡萄灰霉病，葡萄黑痘病和白腐病的防治效果分别为89.40%、91.19%、90.51%、94.16%、84.99%和94.63%（表2），而对照药剂50%多菌灵可湿性粉剂1000倍液对葡萄炭疽病，葡萄房枯病，葡萄穗轴褐腐，葡萄灰霉病，葡萄黑痘病和白腐病的防治效果分别为76.93%、73.37%、77.30%、82.13%、63.28%和64.43%（表
2）。
[0041] 以上结果表明，枯草芽孢杆菌DJ-6悬浮剂的田间防治效果显著高于对照药剂，且兼治作用显著。试验中所有处理均未发生
药害现象，表明制剂对施用作物安全。
[0042] 表2 NF0919菌株发酵液的提取物对葡萄病害的田间防治试验结果
