【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規のDNA合成阻害作用を有する化合物PF1195およびその製造法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】DNA複製は、DNA自身が鋳型となって、すでにある２本鎖DNA（親DNA）と全く同じ２個の２本鎖DN
A（娘DNA）ができることであり、複製起点からの開始、
DNA鎖の伸長、終結の３段階からなる。 DNA合成酵素(DNA
polymerase)は、DNAの5'側から3'側に向かってDNA鎖を伸ばしていく酵素である。 抗腫瘍剤の多くは、腫瘍細胞と正常細胞の増殖力の差を目安に攻撃する薬剤が多く、
種々のDNA合成阻害物質が臨床で用いられている。 例えば、代謝拮抗物質として５−フルオロウラシルなどが治療に用いられており、抗腫瘍抗生物質としては微生物培養液より単離されたマイトマイシン(J. Antibiot., vo
l.9A, p141, 1956)、ダウノマイシン(Nature, vol.201,
p706, 1964)、ブレオマイシン(J.Antibiot.,vol.19A,
p200, 1966)、アドリアマイシン(Biotech. Bioengin.,
vol.11, p1101, 1969)等が臨床において抗腫瘍剤として使用されている。 一方、真核生物の染色体末端（テロメア）には直鎖DNAの末端（テロメアDNA）が位置している。 テロメアDNAは、短い塩基配列の単位が多数繰り返す特殊な構造になっている。 テロメアDNAの長さは生物種によって大きな違いがあるがヒトを含めた哺乳類では、(5'TTAGGG3')が数百から数千回繰り返され、ヒト体細胞ではおよそ10kb程度の長さを持っている。 そして、
DNAの複製の度に新生鎖の5'最末端のＲＮＡプライマーはDNAに置換されないため、娘鎖の5'末端は親鎖に比べて必ず短縮される。 これが体細胞の分裂寿命を決めると考えられている。 また、テロメラーゼ(telomerase)はテロメアDNAを延長する酵素である。 5'→3'のテロメアDNA
配列に対する鋳型ＲＮＡを含んだ酵素で、６塩基を単位として5'→3'方向にDNA鎖１本を延長する一種の逆転写酵素である。 テロメラーゼをもつ細胞はテロメアDNA短縮を補うことができ、無限の分裂寿命を持つ。 テロメラーゼは、正常体細胞にはほとんど活性がなく、癌組織などの不死化細胞には活性があることから、テロメラーゼを阻害することによる癌などの悪性腫瘍の治療への応用が期待されている。 このことからテロメラーゼの阻害剤の探索研究が進められており、これまでにpeptide nucl
eic acids (PNAs) (Nature Biotechnology, vol.14, 61
5-619, 1996) やG-quadruplexな構造を有する化合物
(J.Med.Chem., vol.40, 2113-2116, 1997)などが報告されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら癌などの悪性腫瘍には多様性があり、これまで開発されてきた抗腫瘍剤はある種の腫瘍には有効であるが、別の腫瘍には無効である場合も多く、また完全な治療効果を有する薬剤がないのが実状である。 また、薬剤耐性腫瘍の出現のため，多くの薬剤を組み合わせて使用しているのが現状であり、従来の化合物とは異なる新規な構造の化合物の発見が求められている。 本発明者らは以上の点に着目し、DNA合成酵素やテロメラーゼ等を阻害する新規なDNA
合成阻害物質を提供するとともに、その製造法を確立することによって新しい抗腫瘍物質を創出しようとするものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】新規なDNA合成阻害物質を見出すため、本発明者らは幅広く微生物を分離・培養して、タラロマイセス ( Talaromyces ）属に属する一菌株がその培養液中にDNA合成酵素およびテロメラーゼに対する阻害作用を有する物質を生産・蓄積していることを見いだし、その培養液中よりDNA合成酵素阻害およびテロメラーゼ阻害作用を有する新規な化合物PF1195を単離し、それらの物理化学的性状を明らかにすることにより本発明を完成した。 したがって第１の本発明の要旨とするところは以下に示す物理化学的性状を有する新規化合物PF1195にある。

【０００５】本発明で提供される化合物PF1195の物理化学的性状は以下の通りである。 （１）色および形状：黄色粉末 （２）融点：明確な融点を示さず１９０℃付近で分解 （３）質量分析：FAB-MS (m/z) 825 [M+H] ⁺ HRFAB-MS (m/z) 計算値825.1668 (C ₄₂ H ₃₂ O ₁₈ ) 実測値825.1661 [M+H] ⁺ （４）比旋光度： [α] _D -371°( c 0.5, MeOH) （５）メタノール溶液中での紫外部吸収スペクトル：λ
nm （ε） 218 (50500), 269 (29600), 325 (3500
0) （６）臭化カリウム錠で測定した赤外吸収スペクトル ν cm ^-1 3400, 1720, 1624, 1595, 1543, 1450 （７）重ジメチルスルフォキサイド中で測定した¹ H NMR
スペクトル δ _H ; 10.29 (2H), 10.27 (2H), 8.36 (1H), 8.29 (1
H), 6.43 (1H), 6.23 (2H), 6.13 (2H), 5.56 (1H), 5.
53 (1H), 4.22 (1H), 3.63 (1H), 3.44 (1H), 3.11 (1
H), 2.75 (1H), 2.46 (3H), 2.44 (3H), 1.58 (3H), 1.
54 (3H) （８）重ジメチルスルフォキサイド中で測定した¹³ C NM
Rスペクトル δ _C ; 192.33, 192.25, 191.37, 191.23, 173.02, 172.
34, 168.05, 167.91,163.03, 162.70, 162.44, 162.32,
158.08, 157.76, 155.37, 154.04, 142.57,142.40, 14
2.34, 141.19, 114.74, 114.33, 111.23, 111.10, 110.
37, 110.31,107.04, 104.72, 104.45, 103.93, 100.62,
100.57, 85.16, 84.66, 42.82, 38.08, 37.03, 25.62,
22.77, 22.60, 22.04, 21.98 溶解性：ジメチルスルフォキサイド、メタノールに可溶 上記の物理化学的性状と2次元NMRスペクトルの詳細な解析から化合物PF1195の構造を式（I）に示すように決定した。

【０００６】

【化２】

【０００７】上記化合物の塩としては塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩等の無機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。 また、本発明には上記化合物、またはその塩の水和物、溶媒和物も使用できる。 本発明のDNA合成阻害剤は、経口投与または非経口投与（筋肉内、皮下、静脈内、座薬等）のいずれでも投与できる。

【０００８】第２の本発明の要旨とするところは、タラロマイセス属に属する化合物PF1195生産菌を培養し、その培養物から化合物PF1195を採取することを特徴とする、化合物PF1195の製造法にある。 本発明に使用される新規化合物PF1195生産菌の一例としては、土壌から分離されたタラロマイセス属に属するPF1195株がある。

【０００９】PF1195株の菌学的性状は次のとおりである。 （１）生育状態 ツアペック酵母エキス寒天培地、麦芽エキス寒天培地上で良く生育し、２５℃、７日間の培養でコロニーの直径は30 〜 40mmに達する。 淡黄色〜黄色、羊毛状、平坦、
緩やかな菌糸層からなる。 子のう果を多数気生菌糸中および表面に形成する。 分生子構造はわずかでコロニーの色調に影響しない。 裏面は橙色〜茶色となる。 ３７℃の培養では、どの培地でも２５℃の培養と同様に生育が良い。

【００１０】（２）形態的特徴 子のう果は、球形〜亜球形、大きさ200 〜 500 μm、黄色、子のう果壁は菌糸層よりなり、成熟には２週間を要する。 子のう果原基は棍棒状の造のう器に細い造精器が巻き付き発達する。 子のうは、亜球形〜卵形、8 〜 10
μm、８胞子性、連鎖状に生じ、成熟すると膜は消失する。 子のう胞子は、楕円形、3.5 〜 4.5x 2.0 〜 3.0
μm、表面に刺状突起を有する。 分生子柄は100 〜 250
X 2 〜 2.5 μm、滑面である。 ペニシリは複輪生、メトレは10 〜 15 x 2 〜 2.5 μm、2〜 4本輪生、フィアライドはペン先型、7 〜 12 x 2 〜 2.5 μm、3 〜 6本輪生する。 分生子は楕円形、2 〜 3 x 1.5 〜 2 μm、滑面である。

【００１１】以上の菌学的性状より本菌株を、不整子のう菌綱に属するTalaromyces flavusと同定し、 Talaromy
ces flavus PF1195と呼称することにした。 同定のためにAmelia C. Stolk、Robert A. Samson著、"The genus
Talaromyces - Studies on Talaromyces and related g
enera II (Studies in Mycology, No.2)" (1972年、Cen
traalbureau voor Schimmelcultures発行)を用いた。 なお、本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦ
ＥＲＭ Ｐ−１６５１８として寄託されている。

【００１２】PF1195株は他のカビに見られるようにその性状が変化し易い。 例えば、PF1195株に由来する突然変異株（自然発生または誘発性）、形質接合体または遺伝子組換え体であっても、化合物PF1195を生産するものはすべて本発明に使用できる。

【００１３】本発明の方法では、タラロマイセス属に属する化合物PF1195生産菌を通常の微生物が利用し得る栄養物を含有する培地で培養する。 栄養源としては、従来カビの培養に利用されている公知のものが使用できる。
例えば、炭素源としては、グルコース、シュクロース、
水飴、デキストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動植物油等を使用し得る。 また、窒素源としては、大豆粉、
小麦胚芽、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等を使用し得る。 その他必要に応じてナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸及びその他のイオンを生成することができる無機塩類を添加することは有効である。
また、菌の発育を助け、化合物PF1195の生産を促進するような有機及び無機物を適当に添加することができる。

【００１４】培養法としては、好気的条件での培養法、
特に静置培養法が最も適している。 培養に適当な温度は
25〜30℃であるが、多くの場合26℃付近で培養する。 化合物PF1195の生産は培地や培養条件によって異なるが、
静置培養、振とう培養、タンク培養のいずれにおいても、通常2〜14日間でその蓄積が最高に達する。 培養液中の化合物PF1195の蓄積が最高になった時に培養を停止し、培養液から目的物質を単離精製する。

【００１５】かく生産される化合物PF1195は、前記する物理化学的性状を有するので、その性状に従って培養物から精製することが可能である。 例えば、有機溶媒を用いて培養物より化合物PF1195を抽出した後、吸着剤を用いた吸脱着法、ゲル濾過剤を用いた分子分配法、適当な溶剤からの再結晶法等を用いて精製することが可能である。 例えば、有効成分を含む培養物を酢酸エチルにより抽出する。 抽出液を減圧濃縮し、この抽出物を少量のメタノールに溶解し、シリカゲルと混合した後、良く乾燥させ、クロロホルムで平衡化したシリカゲルカラムに乗せ、クロロホルム／メタノールの溶媒系でクロマトグラフィ−を行う。 化合物PF1195を含む溶出液を減圧濃縮し、これを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製することにより化合物PF1195を得ることができる。

【００１６】以下に本発明の実施例を示すが、これは単なる一例であって本発明を限定するものではない。 ここに例示しなかった多くの変法あるいは修飾手段を用い得ることは勿論のことである。

【００１７】

【実施例】実施例 化合物PF1195の製造法 種培地として、でんぷん 2.0%、ブドウ糖 1.0%、ペプトン 0.5%、小麦胚芽0.6%、酵母エキス 0.3%、大豆粕0.2
%、炭酸カルシウム0.2%の組成からなる培地（殺菌前 pH
7.0）を用いた。 また、生産培地として、十分水を吸収させた米に大豆粕 2.5%を添加した固形培地を用いた。
前記の種培地 20mlを分注した100ml容三角フラスコを12
0℃、１５分間殺菌し、これにPF1195株の斜面寒天培養の１白金耳を植菌し、２５℃、２日間振とう培養した。
ついで、生産培地100gを分注した500ml容三角フラスコを120℃、１５分間殺菌し、これに上記種培地4mlを植菌し、よく攪拌後、２８℃、１４日間静置培養した。 このようにして得られた培養物1kgを67%アセトン水2.5Lで１
時間攪拌抽出し、抽出液2Lをえた。

【００１８】得られたアセトン抽出液を濃縮し、アセトンを留去した残りの水溶液に６N塩酸を加え、pHを3.2に調整した。 得られた水溶液を１Lの酢酸エチルで抽出した。 得られた酢酸エチルを硫酸ナトリウム上で脱水後、
濃縮乾固したところ3.7gの褐色粉末を得た。 得られた褐色粉末２gを５０mlのメタノールに溶解し、２０gのシリカゲル（ワコーゲルC-300）を加え混合した後に、メタノールを減圧留去した。 得られたシリカゲルと混合した粗粉末をシリカゲルカラム（ワコーゲルC-300、４０g
直径65mm高さ40mm）の上に乗せ、クロロホルムとメタノールの混合溶液を展開溶媒とするクロマトグラフィーを実施した。 クロロホルム５００mlとメタノール２５mlの混合溶液で溶出した画分を濃縮乾固すると化合物PF1195
を含む５８３mgの赤褐色粉末を得た。

【００１９】上記粗粉末を4回に分けて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分取し、濃縮乾固することにより、化合物PF1195の黄色粉末を合計２０９ｍｇ得た。 用いたHPLCは以下の通りである。 カラム：CAPCELL
PAC C18（資生堂、内径20mm、長さ250mm）、展開溶媒：
アセトニトリルと0.1%のトリフルオロ酢酸水溶液の等量混合液、流速：１０ml／分、検出：紫外部吸収 ２５４
nm。 上記のHPLCで化合物PF1195は7.5分から13分の間に溶出される。 試験例１ DNA合成酵素阻害実験 下記の方法により、耐熱性DNAポリメラーゼであるTth D
NA Polymerase 阻害活性を測定した。

【００２０】18mM トリス緩衝液(pH 8.3)、1.5mM 塩化マグネシウム、54mM 塩化カリウム、0.0045% Tween20、
0.9mM EGTA、36μM デオキシアデノシン3リン酸（dATP,
宝酒造社製）、36μM デオキシシチジン3リン酸（dCTP,
宝酒造社製）、36μM デオキシグアノシン3リン酸（dGT
P,宝酒造社製）、1.4μM チミジン3リン酸（TTP,宝酒造社製）、132kBq/ml ³ H-TTP(4.4TBq/mmol)、0.07mg/ml
ウシ血清アルブミン(BSA)、鋳型となるDNA、そのDNA特異的な2種類のプライマー（そのうち1種類はビオチン化されたもの）0.14μg/ml、及び化合物PF1195からなる反応液（全量70μl)をDNAサーマルサイクラー装置にて94
℃30秒、53℃60秒、72℃90秒を1サイクルとして26サイクル行うことにより反応させた。 その反応液を7.5mg/ml
のシンチレーションプロキシミティアッセイ（SPA)用ビーズ溶液が20μlずつ分注された白色不透明96穴プレートに移し、さらに50μlの水を添加して5分間攪拌した。
室温にて一晩静置した後、96穴プレート用液体シンチレーションカウンターにて合成されたDNA中に取り込まれた³ H-TTPの放射活性を測定した。 化合物PF1195無添加で同様に処理後測定したコントロール値、化合物PF1195及び鋳型となるDNA無添加で同様に処理後測定したブランク値より以下の式にて阻害率を計算し、IC ₅₀値を算出した。 阻害率＝｛１−(測定値−ブランク値)÷(コントロール値−ブランク値)｝×100

【００２１】その結果、化合物PF1195は濃度依存的にTt
h DNA PolymeraseによるDNA合成を阻害し、IC ₅₀値は約3
μg/mlであった。

【００２２】試験例２ テロメラーゼ阻害実験 下記の方法により、テロメラーゼ阻害活性を測定した。

【００２３】アッセイ用緩衝液（200mM トリス緩衝液(p
H 8.3)、15mM 塩化マグネシウム、600mM 塩化カリウム、0.05 % Tween20、10 mM EGTA）5μl、0.5 mM デオキシアデノシン3リン酸（dATP,宝酒造社製）、デオキシシチジン3リン酸（dCTP,宝酒造社製）、デオキシグアノシン3リン酸（dGTP,宝酒造社製）、チミジン3リン酸(TT
P,宝酒造社製)各5μl、0.05μg/μlのプライマーA溶液（5'AATCCGTCGAGCAGAGTT3'）2μl、0.5 mg/mlのＴ４ ge
ne 32溶液1μl、1 mg/ml ウシ血清アルブミン(BSA)溶液
5μl及び化合物PF1195溶液5μlからなる反応溶液にテロメラーゼを産生しているヒト白血病細胞MT1細胞の抽出画分２μlを添加した後23℃で20分反応させ、ついで94
℃で2分間処理した。 次に0.05μg/μlの3'末端をビオチンにて標識されたプライマーA 溶液（5'AACTCTGCTCGAC
GGATT3'）を4μl添加し、94℃で5分間処理した後5 M塩化ナトリウム溶液を10μl 添加し、さらに37℃にて15分間反応させた。 反応後、ストレプトアビジンにてコートされたマグネットビーズ（５mg/ml）を8μl 添加し、室温にて15分間静置させた後、ビーズを磁石にて補足して上澄を廃棄した。 その後0.1Mの塩化ナトリウムを含むTE
緩衝液（10mM トリス緩衝液(pH 8.0)、1mM EDTA）にて同様に３回ビーズを洗浄し被検物質を除去した。 その後、50μl の滅菌水を加え、70℃で5分処理した後ビーズを磁石にて捕捉して上澄を採取した。 その上澄22μl
に前記のアッセイ用緩衝液５μl 、0.5ｍＭデオキシリボ核酸３リン酸（dNTP）溶液 ５μl、0.5 mg/ml のＴ４
gene 32溶液1μl 、1 mg/ml BSA溶液5μl、0.05μg/μ
lのプライマーA溶液及びプライマーB溶液 (5'CCCTTACCC
TTACCCTTACCCTAA3')を各2μl 、α- ³² P-dCTP(1μCi/μ
l) 4μl及び0.5 U/μl Taq DNA合成酵素4μlを添加し、
DNAサーマルサイクラー装置にて94℃30秒、50℃60秒、7
2℃90秒を1サイクルとして30サイクル行うことにより反応させた。 反応後反応液にクロロホルムを50μl添加し、攪拌後、遠心分離し、その上清40μlを94℃で5分間処理し、氷上で冷却した。 冷却後、ブロムフェノールブルー及びキシレンシアノールからなる染色液を５μl加え攪拌し、そのうちの５μlを10％ポリアクリルアミドゲル及びTBE緩衝液（トリスほう酸塩0.045M、EDTA 0.00
1M）を用いて20mAで1.5時間電気泳動を行った。 泳動後、ゲルを乾燥し、イメージングプレートに感光させ、
画像解析装置にて解析することによりテロメラーゼにより生産されたテロメアの量を定量した。 化合物PF1195無添加で同様に処理後測定したコントロール値、化合物PF
1195及び細胞抽出液無添加で同様に処理後測定したブランク値より以下の式にて阻害率を計算し、IC ₅₀値を算出した。 阻害率＝｛１−(測定値−ブランク値)÷(コントロール値−ブランク値)｝×100

【００２４】以上の方法にて測定をした結果、化合物PF
1195は50μＭでテロメラーゼ活性を90％以上阻害した。

【発明の効果】本発明による化合物PF1195はDNA合成阻害活性を有する。 現在臨床において使用されている抗腫瘍物質の多くはDNA合成阻害作用を有する事が報告されており，その阻害剤である化合物PF1195には抗腫瘍作用が期待される。 また既存活性物質と構造や活性を比較・
検討することによって、インビトロ・インビボ有効性に関する基礎研究を進めるための有効な試薬として用いることが可能である。 また、本発明による化合物PF1195はテロメラーゼ阻害活性も有している。 テロメラーゼは癌の悪性化に関与していると言われており、その阻害剤である化合物PF1195には癌などの悪性腫瘍に対する抗腫瘍作用ならびに癌の予防作用等が期待される。 また、インビトロ及びインビボ有効性に関する基礎研究を進めるための有効な試薬として用いることが可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. ⁶識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 佐々木 徹 神奈川県横浜市港北区師岡町760番地 明 治製菓株式会社薬品総合研究所創薬研究所 内 (72)発明者 矢口 貴志 神奈川県横浜市港北区師岡町760番地 明 治製菓株式会社薬品総合研究所創薬研究所 内 (72)発明者 田端 祐二 神奈川県横浜市港北区師岡町760番地 明 治製菓株式会社薬品総合研究所創薬研究所 内 (72)発明者 佐久間 貞俊 神奈川県小田原市成田540番地 明治乳業 株式会社細胞工学センター内 (72)発明者 池上 秀二 神奈川県小田原市成田540番地 明治乳業 株式会社細胞工学センター内