【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ラフィノース合成酵素遺伝子等に関する。

【０００２】

【従来の技術】ラフィノース類オリゴ糖は、一般式としてo-α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)no-α-D-グルコピラノシル-(1→2)-β-D-フルクトフラノシドで示されるショ糖の誘導体であり、n=1の場合にはラフィノース、n=2の場合にはスタキオース、n=3の場合にはベルバスコース、n=4の場合にはアジュコースと呼ばれている。 このようなラフィノース類オリゴ糖は、ショ糖を除けば、植物で最も含量の多いオリゴ糖であり、例えば、
トウヒ等のマツ科の裸子植物、ダイズ、インゲンマメ等のマメ科、ナタネ等のアブラナ科、甜菜等のアカザ科、
ワタ等のアオイ科、ポプラ等のヤナギ科等の被子植物などの高等植物のみならずクロレラにも含まれていることが明らかにされており、植物界にショ糖と同様に広く存在している。 ラフィノース類オリゴ糖は、多くの植物において、例えば、貯蔵器官や種子における貯蔵糖としての役割を果たし、また、ある種の植物では、例えば、組織間を糖が移動する現象における転流糖としての役割を果たしている。 また、ラフィノース類オリゴ糖は、食品中に適量存在すると腸内細菌フローラの状態を健全にする効果を示すことが知られている。 このため、ラフィノース類オリゴ糖は機能性食品素材として一部の食品に添加され、特定保健用食品分野において利用され始めている。 このような役割や有用性を有するラフィノース類オリゴ糖は、多くの植物においてショ糖を初発とするラフィノース類オリゴ糖合成系により生成される。 この生合成系は、通常、ショ糖分子中のD-グルコース残基の６位炭素原子に結合するヒドロキシル基にα(1→6)結合でガラクチノール由来のガラクトシル基が順次付加されてゆく反応により構成されている。 このラフィノース類オリゴ糖合成系の最初の段階においてショ糖分子中のD-グルコース残基の６位炭素原子に結合するヒドロキシル基にガラクチノール由来のD-ガラクトシル基をα(1→6)結合させることによりラフィノースを生成させる反応に関与する酵素がラフィノース合成酵素である。 該酵素は前記合成系における律速段階となっていることが示唆されており、該酵素がラフィノース類オリゴ糖の生合成の制御においてきわめて重要であることが明らかにされつつある。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ラフィノース合成酵素の植物における発現量や活性を制御することにより、植物中のラフィノース類オリゴ糖の含量を変化させることが可能となる。 ところが、ラフィノース合成酵素は、その存在自体はその活性を生化学的な手法により調べることにより多くの植物で確認されているものの、いまだに該酵素を単一の標品として単離・精製することに成功した事例は存在せず、そのアミノ酸配列も不明のままであり、まして該酵素の遺伝子の単離に着手する試みについての報告は全く見られない。

【０００４】

【課題を解決するための手段】このような状況下、本発明者らは鋭意検討した結果、ソラマメよりラフィノース合成酵素及びその遺伝子を単離することに成功し、本発明に至った。 すなわち、本発明は、 1)植物から得られる遺伝子であって、ショ糖分子中のD-
グルコース残基の6位炭素原子に結合するヒドロキシル基にD-ガラクトシル基をα(1→6)結合させることによりラフィノースを生成させる能力を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴とするラフィノース合成酵素遺伝子、 ２）植物が双子葉植物であることを特徴とする前項1記載のラフィノース合成酵素遺伝子、 ３）双子葉植物がマメ科植物であることを特徴とする前項２記載のラフィノース合成酵素遺伝子、 ４）マメ科植物がソラマメであることを特徴とする前項
3記載のラフィノース合成酵素遺伝子、 ５）以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質をコードする塩基配列を有することを特徴とするラフィノース合成酵素遺伝子、（ａ）配列番号1に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、（ｂ）配列番号1に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつショ糖分子中のD-グルコース残基の6位炭素原子に結合するヒドロキシル基にD-ガラクトシル基をα(1→6)結合させることによりラフィノースを生成させる能力を有する蛋白質、 ６）配列番号2に示される塩基配列を有することを特徴とするラフィノース合成酵素遺伝子、 ７）マメ科植物がダイズであることを特徴とする前項3
記載のラフィノース合成酵素遺伝子、 ８）以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質をコードする塩基配列を有することを特徴とするラフィノース合成酵素遺伝子、（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつショ糖分子中のD-グルコース残基の6位炭素原子に結合するヒドロキシル基にD-ガラクトシル基をα(1→6)結合させることによりラフィノースを生成させる能力を有する蛋白質、 ９）配列番号4に示される塩基配列を有することを特徴とするラフィノース合成酵素遺伝子、 １０）双子葉植物がシソ科植物であることを特徴とする前項2記載のラフィノース合成酵素遺伝子、 １１）シソ科植物がチョロギであることを特徴とする前項10記載のラフィノース合成酵素遺伝子、 １２）配列番号5に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴とするラフィノース合成酵素遺伝子、 １３）配列番号6に示される塩基配列を有することを特徴とするラフィノース合成酵素遺伝子、 １４）植物が単子葉植物であることを特徴とする前項1
記載のラフィノース合成酵素遺伝子、 １５）単子葉植物がイネ科植物であることを特徴とする前項14記載のラフィノース合成酵素遺伝子、 １６）イネ科植物がトウモロコシであることを特徴とする前項15記載のラフィノース合成酵素遺伝子、 １７）配列番号7に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴とするラフィノース合成酵素遺伝子、 １８）配列番号8に示される塩基配列を有することを特徴とするラフィノース合成酵素遺伝子、 １９）下記(a)または(b)のアミノ酸配列からなり、かつショ糖分子中のD-グルコース残基の6位炭素原子に結合するヒドロキシル基にD-ガラクトシル基をα(1→6)結合させることによりラフィノースを生成させる能力を有することを特徴とするラフィノース合成酵素蛋白質、(a)
配列番号1または３に示されるアミノ酸配列、(b)配列番号1または３に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾もしくは付加されたアミノ酸配列、 ２０）配列番号1または3に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とするラフィノース合成酵素蛋白質、 ２１）前項1，2、3，4，7，10，11，14，15または16記載のラフィノース合成酵素遺伝子の部分塩基配列を有することを特徴とする遺伝子断片、 ２２）前項5，6，8，9，12，13，17または18記載のラフィノース合成酵素遺伝子の部分塩基配列を有することを特徴とする遺伝子断片、 ２３）塩基数が15以上50以下であることを特徴とする前項21または22記載の遺伝子断片、 ２４）前項21，22または23記載の遺伝子断片が標識されてなるプローブを生物由来のゲノムＤＮＡ断片またはｃ
ＤＮＡ断片にハイブリダイズさせて前記プローブが特異的に結合したＤＮＡ断片を検出することを特徴とするラフィノース合成酵素遺伝子またはその部分塩基配列を有する遺伝子断片の検出方法、 ２５）前項21，22または23記載の遺伝子断片が標識されてなるプローブを植物由来のゲノムＤＮＡ断片またはｃ
ＤＮＡ断片にハイブリダイズさせて前記プローブが特異的に結合したＤＮＡ断片を検出することを特徴とするラフィノース合成酵素遺伝子またはその部分塩基配列を有する遺伝子断片の検出方法、 ２６）前項21，22または23記載の遺伝子断片の塩基配列を有するプライマーを生物由来のゲノムＤＮＡまたはｃ
ＤＮＡにアニールさせてPCR(Polymerase Chain Reactio
n)反応を行ないＤＮＡ断片を増幅することを特徴とするラフィノース合成酵素遺伝子またはその部分塩基配列を有する遺伝子断片の増幅方法、 ２７）前項21，22または23記載の遺伝子断片の塩基配列を有するプライマーを植物由来のゲノムＤＮＡまたはｃ
ＤＮＡにアニールさせてPCR(Polymerase Chain Reactio
n)反応を行ないＤＮＡ断片を増幅することを特徴とするラフィノース合成酵素遺伝子またはその部分塩基配列を有する遺伝子断片の増幅方法、 ２８）前項24，25，26または27記載の方法によりラフィノース合成酵素遺伝子またはその部分塩基配列を有する遺伝子断片を含むＤＮＡ断片を特定し、特定された前記ＤＮＡ断片を単離・精製する工程を含むことを特徴とするラフィノース合成酵素遺伝子の取得方法、 ２９）前項24，25，26または27記載の方法によりラフィノース合成酵素遺伝子またはその部分塩基配列を有する遺伝子断片を含むＤＮＡ断片を特定し、特定された前記ＤＮＡ断片を単離・精製する工程から取得されることを特徴とするラフィノース合成酵素遺伝子、 ３０）プロモーターと前項1，2，3，4，5，6，7，8，
9，10，11，12，13，14，15，16，17，18または29記載のラフィノース合成酵素遺伝子が連結されてなることを特徴とするキメラ遺伝子、 ３１）前項30記載のキメラ遺伝子が宿主細胞内に導入されてなることを特徴とする形質転換体、 ３２）前項1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，1
3，14，15，16，17，18，29または30記載の遺伝子を含有することを特徴とするプラスミド、 ３３）前項32記載のプラスミドが宿主細胞内に導入されてなることを特徴とする形質転換体、 ３４）宿主細胞が微生物であることを特徴とする前項３
３記載の形質転換体、 ３５）宿主細胞が植物細胞であることを特徴とする前項３３記載の形質転換体、 ３６）前項1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，1
3，14，15，16，17，18，29または30記載の遺伝子を宿主生物またはその細胞に導入し、宿主生物またはその細胞内のラフィノース類オリゴ糖量を変化させることを特徴とする代謝改変方法、 ３７）前項34記載の微生物を培養して得られる培養物からラフィノース合成酵素蛋白質を単離・精製することを特徴とするラフィノース合成酵素蛋白質の製造方法、 ３８）前項19または20記載のラフィノース合成酵素蛋白質に対して結合能力を有することを特徴とする抗ラフィノース合成酵素抗体、 ３９）前項38記載の抗ラフィノース合成酵素抗体を供試蛋白質に作用させ、前記抗体とラフィノース合成酵素蛋白質との抗原抗体反応によりラフィノース合成酵素蛋白質を検出することを特徴とするラフィノース合成酵素蛋白質の検出方法、を提供するものである。

【０００５】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明する。 なお、以下に記述された遺伝子工学的方法は、例えば、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd
edition」 (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess,ISBN 0-87969-309-6、「CurrentProtocols In Mole
cular Biology」 (1987), John Wiley & Sons,Inc.ISBN
0-471-50338-X、 Current Protocols In Protein Scie
nce (1995), John Wiley & Sons, Inc.ISBN0-471-11184
-8等に記載される通常の方法に準じて実施可能である。

【０００６】本発明でいうラフィノース合成酵素遺伝子（以下、本発明遺伝子と記す。）とは、ショ糖分子中の
D-グルコース残基の6位炭素原子に結合するヒドロキシル基にD-ガラクトシル基をα(1→6)結合させることによりラフィノースを生成させる能力を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子であり、
例えば、植物から調製することができる。 本発明遺伝子は、具体的には、例えば、ソラマメ、ダイズなどのマメ科植物やチョロギなどのシソ科植物等の双子葉植物、トウモロコシなどのイネ科植物等の単子葉植物から調製できる。 本発明遺伝子としては、具体的には、例えば、
「配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする塩基配列を有するラフィノース合成酵素遺伝子」、「配列番号１に示されるアミノ酸配列において1
もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつショ糖分子中のD-
グルコース残基の6位炭素原子に結合するヒドロキシル基にD-ガラクトシル基をα(1→6)結合させることによりラフィノースを生成させる能力を有する蛋白質をコードする塩基配列を有するラフィノース合成酵素遺伝子」、
「配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする塩基配列を有するラフィノース合成酵素遺伝子」、「配列番号３に示されるアミノ酸配列において1
もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつショ糖分子中のD-
グルコース残基の6位炭素原子に結合するヒドロキシル基にD-ガラクトシル基をα(1→6)結合させることによりラフィノースを生成させる能力を有する蛋白質をコードする塩基配列を有するラフィノース合成酵素遺伝子」、
「配列番号５に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するラフィノース合成酵素遺伝子」、「配列番号７に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するラフィノース合成酵素遺伝子」等があげられる。

【０００７】本発明遺伝子は、例えば、下記の方法により得ることができる。 例えば、ソラマメ(Vicia faba)、
ダイズ(Glycine max)等のマメ科植物の組織を液体窒素中で凍結させた後、乳鉢などにより物理的に磨砕することにより細かい粉末状の組織片とする。 該組織片から通常の方法によりRNAを抽出する。 該抽出操作には、市販のRNA抽出キットを利用することができる。 そして、得られたRNA抽出液からエタノール沈澱により全RNAを回収する。 次に、回収された全RNAから通常の方法によりポリAを有するRNAを分画する。 該分画操作には、市販のOl
igo dTカラムを利用することができる。 得られた画分
(ポリAを有するRNA)から通常の方法によりcDNAを合成する。 該合成操作には、市販のcDNA合成キットを利用することができる。 得られたソラマメ由来のcDNAを鋳型として、例えば、下記リスト１に示されるプライマー１から
3を用いてPCRを行ない、本発明遺伝子である「配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする塩基配列を有するラフィノース合成酵素遺伝子」のcDNA
断片を増幅し取得することができる。 この際に用いられるプライマーは、目的に応じて配列番号2で示される塩基配列を基にして設計し合成することができ、例えば、
「配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする塩基配列を有するラフィノース合成酵素遺伝子」のオープンリーディングフレーム領域を増幅するには、下記リスト２のプライマー1から4で示されるプライマーを設計し合成すればよい。 同様にして、得られたダイズ由来のcDNAを鋳型として、例えば、下記リスト１に示されるプライマー4から6を用いてPCRを行ない、本発明遺伝子である「配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする塩基配列を有するラフィノース合成酵素遺伝子」のcDNA断片を増幅し取得することができる。 この際に用いられるプライマーは、目的に応じて配列番号４で示される塩基配列を基にして設計し合成することができ、例えば、「配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする塩基配列を有するラフィノース合成酵素遺伝子」のオープンリーディングフレーム領域を増幅するには、下記リスト２のプライマー5から8で示されるプライマーを設計し合成すればよい。 増幅されたDNA断片は、「Molecular Cloning:A Lab
oratory Manual 2nd edition」 (1989),Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press、 「Current Protocols InMole
cular Biology」 (1987),John Wiley & Sons,Inc.ISBN0
-471-50338-X等に記載される通常の方法に準じてサブクローニングすることができる。 具体的には、例えばInvi
trogen社のTAクローニングキットやStratagene社のpBlu
escriptIIなどのプラスミドベクターを用いることでクローニングすることができる。 クローニングされたDNA
断片の塩基配列の確認は、F.Sanger,S.Nicklen,ARCou
lson著、Proceedings of National Academy of Science
USA． (1977),74,5463頁-5467頁等に記載されるダイデオキシターミネーティング法により行なうことができる。 例えば、市販のパーキンエルマー社のABI PRISM Dy
e Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kitなどを用いると良い。

【０００８】 （リスト１） プライマー1 AATTTTCAAG CATAGCCAAG TTAACCACCT 30mer プライマー2 GCTCACAAGA TAATGATGTT AGTC 24mer プライマー3 ATACAAGTGA GGAACTTGAC CA 22mer プライマー4 CCAAACCATA GCAAACCTAA GCAC 24mer プライマー5 ACAACAGAAA AATATGACTC TTATTACT 28mer プライマー6 AAAAGAGAGT CAAACATCAT AGTATC 26mer

【０００９】 （リスト２） プライマー1 ATGGCACCAC CAAGCATAAC CAAAACTGC 29mer プライマー2 ATGGCACCAC CAAGCATAAC CAAAACTGCA ACCCTCCAAG ACG 43mer プライマー3 TCAAAATAAA AACTGGACCA AAGAC 25mer プライマー4 TCAAAATAAA AACTGGACCA AAGACAATGT 30mer プライマー5 ATGGCTCCAA GCATAAGCAA AACTG 25mer プライマー6 ATGGCTCCAA GCATAAGCAA AACTGTGGAA CT 32mer プライマー7 TCAAAATAAA AACTCAACCA TTGAC 25mer プライマー8 TCAAAATAAA AACTCAACCA TTGACAATTT TGAAGCACT 39mer

【００１０】本発明遺伝子の部分塩基配列を有する遺伝子断片（以下、本発明遺伝子断片と記す。）としては、
例えば、植物由来の遺伝子断片であり、ショ糖分子中の
D-グルコース残基の6位炭素原子に結合するヒドロキシル基にD-ガラクトシル基をα(1→6)結合させることによりラフィノースを生成させる能力を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の部分配列を有する遺伝子断片があげられる。 具体的には、例えば、配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の部分塩基配列を有する遺伝子断片や配列番号2に示される塩基配列を有する遺伝子の部分塩基配列を有する遺伝子断片、より具体的には、例えば、下記リスト3に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列またはその部分塩基配列を有する遺伝子断片等をあげることができる。 これら遺伝子断片は、ハイブリダイゼーション法におけるプローブやPCR（Polymerase Chai
n Reaction）法におけるプライマーとして有用である。
PCR法におけるプライマーとしては、一般的に、アニーリングの特異性が確保される点からは塩基数が多い方がよく、一方、塩基数が多くなるに従って、プライマー自身が高次構造を取り易くアニーリング効率が悪くなる恐れがあり、また、合成後の精製時に煩雑な操作が必要となることを考慮すると、塩基数は多すぎない方がよく、
通常、塩基数が15以上50以下の１本鎖ＤＮＡからなる遺伝子断片が好ましい。

【００１１】 （リスト３） #1 Gly Ile Lys Phe Met Ser Ile Phe Arg Phe Lys Val Trp Trp Thr Thr His Trp Val Gly #2 Ile Ile Asp Lys Phe Gly Trp Cys Thr Trp Asp Ala Phe Tyr #3 Gly Gly Cys Pro Pro Gly Phe Val Ile Ile Asp Asp Gly Trp Gln #4 Thr Ser Ala Gly Glu Gln Met Pro Cys Arg Leu Val Lys Tyr Glu Glu Asn #5 Val Tyr Val Trp His Ala Leu Cys Gly Tyr Trp Gly Gly Val Arg Pro #6 Thr Met Glu Asp Leu Ala Val Asp Lys Ile Val Glu Asn Gly Val Gly Leu Val Pro Pro #7 Gly Leu His Ser His Leu Glu Ser Ala Gly Ile Asp Gly Val Lys Val Asp Val Ile His Leu Leu Glu #8 Gly Gly Arg Val Glu Leu Ala Arg Ala Tyr Tyr Lys Ala Leu #9 Val Lys Lys His Phe Lys Gly Asn Gly Val Ile Ala #10 Glu His Cys Asn Asp Phe Phe Leu Leu Gly Thr Glu Ala Ile Ser Leu Gly Arg Val Gly Asp Asp Phe Trp Cys Ser Asp Pro Ser Gly Asp Pro Asn Gly Thr Tyr Trp Leu Gln Gly Cys His Met Val His Cys #11 Ala Tyr Asn Ser Leu Trp Met Gly Asn Phe Ile Gln Pro Asp Trp Asp Met Phe Gln Ser Thr His Pro Cys Ala Glu Phe His Ala Ala Ser Arg Ala Ile Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Val Ser Asp #12 Leu Pro Asp Gly Ser Ile Leu Arg Cys #13 Ala Leu Pro Thr Arg Asp Cys Leu Phe Glu Asp Pro Leu His Asn Gly Lys Thr Met Leu Lys Ile Trp Asn #14 Gly Val Leu Gly Leu Phe Asn Cys Gln Gly Gly Gly Trp #15 Phe Ala Pro Ile Gly Leu Val Asn Met

【００１２】本発明遺伝子断片を標識しこれをハイブリダイゼーション法におけるプローブとして利用して生物由来のＤＮＡにハイブリダイズさせ、前述のプローブが特異的に結合したＤＮＡ断片を検出することができる。
このようにして、生物由来の遺伝子ライブラリーから、
ショ糖分子中のD-グルコース残基の6位炭素原子に結合するヒドロキシル基にD-ガラクトシル基をα(1→6)結合させることによりラフィノースを生成させる能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するラフィノース合成酵素遺伝子またはその部分塩基配列を有する遺伝子断片を検出すること（以下、本発明検出方法と記す。）が可能である。 生物由来のＤＮＡとしては、
例えば、目的の植物のcDNAライブラリーやgenomicDNAライブラリー等を使用することができる。 該遺伝子ライブラリーは、市販の遺伝子ライブラリーをそのまま用いることもできるし、また「Molecular Cloning:A Laborato
ry Manual 2nd edition」(1989),Cold Spring Harbor L
aboratoryPressや「Current Protocols In Molecular B
iology」(1987),John Wiley & Sons,Inc.ISBN0-471-503
38-X等に記載される通常のライブラリー作製法等に従って作製されたライブラリーを用いることもできる。 ここで利用されるハイブリダイゼーション法としては、ライブラリーの作製に用いられたベクターの種類に応じてプラークハイブリダイゼーションやコロニーハイブリダイゼーションをあげることができる。 具体的には、使用されるライブラリーがファージベクターで構築された場合には、まず適当な宿主微生物とファージを感染可能な条件下で混合した後さらに軟寒天培地と混合し、寒天培地上にまく。 その後適当な大きさのプラークが現れるまで
37℃で培養を行う。 また、使用されるライブラリーがプラスミドベクターで構築された場合には、まず適当な宿主微生物に形質転換し、形質転換体を得る。 得られた形質転換体を適当に希釈して寒天培地にまき、適当な大きさのコロニーが現れるまで37℃で培養を行う。 いずれのライブラリーの場合も培養後メンブレンフィルターを寒天培地の表面にのせ、ファージや形質転換体をメンブレンに転写する。 このメンブレンをアルカリによる変性処理後、中和し、例えば、ナイロンメンブレンの場合には紫外線を照射し、DNAをメンブレンに固定する。 次にこのメンブレンと通常の方法により標識された本発明遺伝子断片をプローブとして用いてハイブリダイゼーション法を行う。 この方法については、例えば、DM Glover編「DNA cloning,a practical approach.」 IRL PRESS
（1985） ISBN 0-947946-18-7を参考にするとよい。 ハイブリダイゼーションを行う際の試薬及び温度条件は多種存在するが、例えば、プレハイブリダイゼーションは
6×SSC(0.9M NaCl,0.09Mクエン酸)、0.1〜1%SDS、100μ
g/ml変性サケ精巣DNAを加えて65℃で1時間インキュベートして行い、ラベル化された本発明遺伝子断片をプローブとして次に加え、混合する。 42〜68℃で4〜16時間ハイブリダイゼーションを行い、次に2×SSC、0.1〜1%SDS
で洗浄し、さらに0.2×SSC、0〜0.1%SDSですすいだ後メンブレンを乾かす。 このメンブレンを、例えば、オートラジオグラフィーなどにより解析することでメンブレン上のプローブの位置を検出することにより、用いたプローブと相同性のある塩基配列を有するDNAのメンブレン上の位置を検出する。 このようにして本発明遺伝子または本発明遺伝子断片を検出することができる。 尚、検出された本発明遺伝子または本発明遺伝子断片のDNAのメンブレン上の位置に相当するクローンをもとの寒天培地上で特定しこれを釣菌することにより、当該DNAを有するクローンを単離することができ、さらに、同様の検出操作を繰り返すことで当該DNAを有するクローンを純化することができる。 また、市販のGibcoBRL社のGENE TRA
PPER cDNA Positive Selection Systemキットの様な検出の方法も用いることができる。 この方法では、まず一本鎖化したDNAライブラリーとビオチン化した本発明遺伝子断片（プローブ）とをハイブリダイズさせた後、これにストレプトアビジン結合マグネットビーズを加え混合し、この混合物からストレプトアビジン結合マグネットビーズを磁石で回収することで、本発明遺伝子断片、
ビオチンおよびストレプトアビジンを介して該ビーズに結合した１本鎖DNA、すなわち、用いたプローブと相同性のある塩基配列を有する１本鎖DNAを回収し検出する。 このようにして本発明遺伝子または本発明遺伝子断片を検出することができる。 尚、回収された１本鎖DNA
は適当なオリゴヌクレオチドをプライマーとして適当な
DNAポリメラーゼを反応させることにより２本鎖化することができる。

【００１３】本発明検出方法を植物の解析に利用してもよい。 具体的には、植物ゲノムDNAを、例えば、渡辺格監修、杉浦昌弘編集:「クローニングとシークエンス(植物バイオテクノロジー実験マニュアル)」、農村文化社、東京(1989)などに記載された通常の方法に従って調製し、適当な少なくとも数種類の制限酵素で切断し、電気泳動した後、泳動されたＤＮＡを通常の方法に従ってフィルターにブロッティングする。 このフィルターに本発明遺伝子断片から通常の方法で調製されたプローブを用いてハイブリダイゼーションを行ない、プローブがハイブリダイズするDNA断片を検出する。 検出されたDNA断片の長さを特定植物種の異なる品種について比較し、長さの違いから品種間のラフィノース類オリゴ糖発現に伴う表現形質の差を解析することができる。 また、上記の方法により検出されたDNA断片の長さを遺伝子組換え植物と同種の非組換え植物とで比較したときに、遺伝子組換え植物において非組換え植物よりもハイブリダイズするバンドが数多くまたは濃く検出された場合、該植物が遺伝子組換え植物であると判別することができる。 この方法は、例えば、島本功、佐々木卓治監修:「植物のPCR
実験プロトコール」、秀潤社、東京(1995)、ISBN4-8796
2-144-7、90-94頁に記載されるRFLP(Restriction Fragm
ent Length Polymorphism)法に準じて行なうことができる。

【００１４】本発明遺伝子断片の塩基配列を有するプライマーを用いるPCR法により、生物由来のＤＮＡから、
ショ糖分子中のD-グルコース残基の6位炭素原子に結合するヒドロキシル基にD-ガラクトシル基をα(1→6)結合させることによりラフィノースを生成させる能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するラフィノース合成酵素遺伝子またはその部分塩基配列を有する遺伝子断片を増幅すること（以下、本発明増幅方法と記す。）が可能である。

【００１５】具体的には、例えば、3'-末端側に本発明遺伝子断片の塩基配列を15塩基以上50塩基以下有するオリゴヌクレオチドを通常の合成方法により化学合成する。 コドン表(図1)に基づき、１つのアミノ酸をコードしうるコドンのバリエーションに応じてプライマーの特定の位置の残基を数種類の塩基の混合物とするミックスプライマーを合成することもできる。 また、例えば、複数種の塩基と対合できるイノシンなどの塩基を数種類の塩基の混合物の代わりに用いることもできる。 具体的には、例えば、リスト4に示される塩基配列を有するプライマーを用いることができる。 尚、ここで、２本鎖ＤＮ
Ａからなる本発明遺伝子のコーディング鎖と同じ塩基配列を持つオリゴヌクレオチドをセンスプライマー、該コーディング鎖と相補鎖をなす塩基配列を持つオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーと呼ぶ。 増幅しようとするラフィノース合成酵素遺伝子またはその部分塩基配列を有する遺伝子断片のコーディング鎖の５'上流側の塩基配列を有するセンスプライマーと３'下流側の塩基配列と相補的な配列を有するアンチセンスプライマーを組み合わせて用いて、例えば、遺伝子ライブラリー、
ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型としてPCR反応を行いＤＮＡ断片を増幅する。 ここで用いられる遺伝子ライブラリーとしては、例えば、目的の植物のcDNAライブラリーやgenomicDNAライブラリー等をあげることができる。 植物遺伝子ライブラリーは、市販の植物由来のライブラリーをそのまま用いることもできるし、また 「Mol
ecular Cloning:ALaboratory Manual 2nd edition」 (1
989),Cold Spring Harbor Laboratory Pressや「Curren
t Protocols In Molecular Biology」 (1987),John Wil
ey & Sons,Inc.ISBN0-471-50338-X等に記載される通常のライブラリー作製法に従って作製されたライブラリーも用いることができる。 また、本発明増幅法において用いられるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡとしては、例えば、目的の植物から調製されたcDNAやgenomicDNAをあげることができる。 DNA断片の増幅は通常の電気泳動の方法により確認することができる。 さらに、増幅されたDN
A断片について通常の方法により制限酵素地図を明らかにするかまたは塩基配列を決定することにより、本発明遺伝子または本発明遺伝子断片を特定することができる。 具体的には、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列に基づいて設計されたプライマーを用いシソ科植物であるチョロギ由来のｃＤＮＡを鋳型として本発明増幅法を行うことにより、配列番号６に示される塩基配列を有するラフィノース合成酵素遺伝子断片を増幅することができる。 また、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列に基づいて設計されたプライマーを用いイネ科植物であるトウモロコシ由来のｃＤＮＡを鋳型として本発明増幅法を行うことにより、配列番号８に示される塩基配列を有するラフィノース合成酵素遺伝子断片を増幅することができる。

【００１６】（リスト４） 1-F 32mer TTIAAIGTITGGTGGACIACICAITGGGTIGG 2-F 41mer ATIATIGAIAAITTIGGITGGTGIACITGGGAIGCITTITA 2-RV 41mer TAIAAIGCITCCCAIGTICACCAICCIAAITTITCIATIAT 3-F 44mer GGIGGITGICCICCIGGITTIGTIATIATIGAIGAIGGITGGCA 3-RV 44mer TGCCAICCITCITCIATIATIACIAAICCIGGIGGICAICCICC 4-F 32mer AAIAAICAITTIAAIGGIAAIGGIGTIATIGC 4-RV 32mer GCIATIACICCITTICCITTIAAITGITTITT 5-F 38mer TGGATGGGIAAITTIATICAICCIGAITGGGAIATGTT 5-RV 38mer AACATITCCCAITCIGGITGIATIAAITTICCCATCCA 6-RV 27mer CATITTIACIA(AG)ICCIATIGGIGCIAA

【００１７】本発明増幅方法を植物遺伝子の解析に利用してもよい。 具体的には、例えば、特定植物種の異なる品種から調製した植物ゲノムDNAを鋳型として、本発明増幅方法を行ない、ＤＮＡ断片を増幅させる。 増幅されたＤＮＡ断片をホルムアルデヒド溶液と混合し、85℃で
5分間加熱変性処理を行った後、氷上で急冷する。 このサンプルをグリセロール濃度を0%または10%含む、例えば6%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動に供する。 この電気泳動には市販のSSCP(Single Strand Conformation
Polymorphism)用の電気泳動装置を用いることができ、
例えば5℃、25℃、37℃等にゲルの温度を一定に保って電気泳動を行なう。 電気泳動したゲルから、例えば、市販の試薬による銀染色法等の方法によりDNA断片を検出する。 検出されたDNA断片の電気泳動における挙動の品種間の差からラフィノース合成酵素遺伝子内の変異を検出し、該変異に基づいて生じる、ラフィノース類オリゴ糖発現に伴う表現形質における品種間の差を解析する。
この方法は、例えば、島本功、佐々木卓治監修:「植物のPCR実験プロトコール」、秀潤社、東京(1995)、ISBN4
-87962-144-7、141-146頁に記載されるSSCP法に準じて行うことができる。

【００１８】本発明検出方法または本発明増幅方法によりラフィノース合成酵素遺伝子またはその部分塩基配列を有する遺伝子断片を特定し、特定された前記遺伝子またはその遺伝子断片を単離・精製することにより本発明遺伝子を取得すること（以下、本発明遺伝子取得方法と記す。）もできる。 例えば、上述のように本発明検出方法により、生物由来の遺伝子ライブラリーのＤＮＡにハイブリダイズした本発明遺伝子断片からなるプローブを検出して、用いたプローブと相同性のある塩基配列を有するＤＮＡを特定し、当該ＤＮＡを保有するクローンを純化し、該クローンからプラスミドまたはファージＤＮ
Ａを単離・精製することにより、本発明遺伝子または本発明遺伝子断片を取得することができる。 このようにして得られたＤＮＡがラフィノース合成酵素遺伝子の部分塩基配列を有する遺伝子断片である場合は、該ＤＮＡをプローブとして本発明遺伝子検出方法により遺伝子ライブラリーをさらにスクリーニングすることにより、完全長の本発明遺伝子を取得することができる。 また、例えば、上述のように本発明増幅方法により、本発明遺伝子断片の塩基配列を有するプライマーを用いるPCR反応を行い、生物由来のＤＮＡからＤＮＡ断片を増幅し、増幅されたＤＮＡ断片について制限酵素地図を明らかにするかまたは塩基配列を決定することにより、本発明遺伝子または本発明遺伝子断片を特定することができる。 得られた遺伝子断片の塩基配列に基づいて、5'上流領域の配列の解析にはアンチセンスプライマーを、3'下流領域の配列の解析にはセンスプライマーを合成する。 これらのプライマーを用いて、例えば、Clontech社のMarath
on Kit等の市販のキットを用いてRACE法を行うことにより、完全長の本発明遺伝子の塩基配列を明らかにすることができる。 このようにして明らかにした塩基配列の両末端の配列に基づいて新たにプライマーを合成し、再度
PCRを行うことにより完全長の本発明遺伝子を取得することができる。 本発明遺伝子取得方法により、種々の生物から本発明遺伝子であるラフィノース合成酵素遺伝子を取得することができる。 例えば、400アミノ酸残基以上の長さに相当する領域において、配列番号１に示されるアミノ酸配列と約50％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつショ糖分子中のD-グルコース残基の
6位炭素原子に結合するヒドロキシル基にD-ガラクトシル基をα(1→6)結合させることによりラフィノースを生成させる能力を有するラフィノース合成酵素をコードする遺伝子を取得することができる。 具体的には例えば、
配列番号１で示されるアミノ酸配列に基づいて設計したプライマーを使用しダイズｃＤＮＡを鋳型とする本発明増幅方法によりラフィノース合成酵素遺伝子の部分塩基配列を有する遺伝子断片を含むＤＮＡ断片を増幅して特定し、特定された前記ＤＮＡ断片を単離・精製し、さらに上述の操作により該ＤＮＡ断片を含む完全長遺伝子を取得することにより、配列番号４に示される塩基配列を有するラフィノース合成酵素遺伝子を取得することができる。

【００１９】本発明遺伝子とプロモーターが連結されてなるキメラ遺伝子（以下、本発明キメラ遺伝子と記す。）を構築することができる。 用いられるプロモーターは、形質転換される宿主生物内で転写活性を示すものであれば特に制限はない。 例えば、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター、大腸菌のトリプトファンオペロンのプロモーター、tacプロモーター等の大腸菌内で機能可能な合成プロモーター、酵母のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ADH）プロモーター、アデノウイルス・メジャーレート（Ad.ML）プロモーター、SV40の初期プロモーター、バキュロウイルスプロモーターなどをあげられる。 また、宿主生物が植物またはその細胞の場合には、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子(NOS)プロモーター、オクトピン合成酵素遺伝子(OCS)プロモーターなどのT-DNA由来の構成型プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)由来の19S及び35Sプロモーターなどの植物ウイルス由来のプロモーター、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)遺伝子プロモーター、カルコンシンターゼ(CHS)遺伝子のプロモーター、Pathoge
nesis-related protein(PR)遺伝子のプロモーターなどの誘導プロモーターなどをあげることができる。 さらに、特定の植物組織で特異的に発現するようなプロモーター、例えば、ダイズ由来種子貯蔵蛋白質グリシニン遺伝子のプロモーターを持つベクターpSUM-GY1（特開平06
-189777）なども使用することができ、このようなプロモーターを有するように構築されたキメラ遺伝子を用いれば、植物内での特定の組織においてラフィノース類オリゴ糖の含量を増加または減少させることが可能になる。

【００２０】次に、本発明キメラ遺伝子を通常の遺伝子工学的方法に準じて宿主細胞内に導入することにより形質転換体が得られる。 尚、宿主細胞内に導入するための形質転換方法に応じて必要であれば本発明キメラ遺伝子をプラスミドに挿入してから使用するとよい。 さらに、
本発明キメラ遺伝子にターミネーターを含有させてもよい。 この場合、ラフィノース合成酵素遺伝子の下流にターミネーターを有するようにキメラ遺伝子を構築すると一般的によい。 用いられるターミネーターは、形質転換される宿主細胞内で転写終結活性を示すものであれば特に制限はなく、例えば宿主細胞が植物細胞の場合には、
例えば、ノパリン合成酵素遺伝子(NOS)ターミネーターなどのT-DNA由来の構成型ターミネーター、ニンニクウイルスGV1、GV2のターミネーターなどの植物由来のターミネーターなどをあげることができる。

【００２１】本発明遺伝子を利用するには、通常の遺伝子工学的方法によりプラスミドの形にして使用することができる。 構築されたプラスミドは、例えば、宿主生物が微生物の場合には、「Molecular Cloning:A Laborato
ry Manual 2nd edition」 (1989),Cold Spring Harbor
Laboratory Pressや「Current Protocols In Molecular
Biology」 (1987),John Wiley & Sons,Inc.ISBN0-471-
50338-X等に記載される通常の手段により微生物に導入され、これにより形質転換された微生物は抗生物質耐性や栄養要求性等のマーカーにより選抜される。 又、例えば、宿主生物が植物の場合には、構築されたプラスミドは、アグロバクテリウム感染方法(特公平2-58917および特開昭60-70080)、プロトプラストへのエレクトロポレーション方法(特開昭60-251887および特開平5-68575)、
またはパーティクルガン方法(特開平5-508316および特開昭63-258525)などの通常の手段により植物細胞に導入され、プラスミドの導入により形質転換された植物細胞はカナマイシンまたはハイグロマイシン等の抗生物質により選抜される。 このようにして形質転換された植物細胞から、例えば内宮著、「植物遺伝子操作マニュアル
(トランスジェニック植物の作り方)」1990年、講談社サイエンティフィック(ISBN4-06-153513-7)、27-55頁に記載される通常の植物細胞培養方法により形質転換植物を再生することにより形質転換体植物が得られる。 さらに、得られた形質転換体植物から種子を得ることにより該形質転換体植物の増殖を行うこともできる。 また、得られた形質転換体植物と非形質転換体植物とを交雑することで形質転換体の形質をもつ子孫植物を作成することもできる。

【００２２】本発明遺伝子を宿主生物またはその細胞に導入し、宿主生物またはその細胞内の宿主生物またはその細胞内の代謝を改変することによりラフィノース類オリゴ糖量を変化させることができる。 このような方法としては、例えば、本発明遺伝子が本来転写・翻訳され蛋白質として発現するときの方向に該遺伝子がプロモーターと連結されてなる本発明キメラ遺伝子を構築し、これを通常の遺伝子工学的方法に準じて宿主生物またはその細胞内に導入することで宿主生物またはその細胞内のラフィノース類オリゴ糖量を増加させるように代謝を改変させる方法があげられる。 また、本発明遺伝子が本来転写・翻訳され、蛋白質として発現するときの方向とは反転した方向に該遺伝子がプロモーターと連結されてなる本発明キメラ遺伝子を構築し、これを通常の遺伝子工学的方法に準じて宿主生物またはその細胞内に導入することで宿主生物またはその細胞内のラフィノース類オリゴ糖量を減少させるように代謝を改変させる方法もあげられる。

【００２３】本発明でいうラフィノース合成酵素蛋白質（以下、本発明蛋白質と記す。）とは、本発明遺伝子にコードされる蛋白質であり、例えば、配列番号1または３に示されるアミノ酸配列、または、配列番号1または３に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつショ糖分子中のD-グルコース残基の
6位炭素原子に結合するヒドロキシル基にD-ガラクトシル基をα(1→6)結合させることによりラフィノースを生成させる能力を有する酵素蛋白質をいう。 具体的には、
例えば、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する酵素蛋白質（アミノ酸799個、分子量89kDa）、配列番号３
に示されるアミノ酸配列を有する酵素蛋白質（アミノ酸
781個、分子量87kDa）をあげることができる。

【００２４】本発明蛋白質は、例えば、ソラマメ（Vici
a faba）等のマメ科植物から、（NH ₄ ） ₂ SO ₄沈殿、イオン交換カラム、疎水性カラム、ハイドロキシアパタイトカラム、ゲルろ過カラムなどの通常の生化学的方法により調製することができ、また、本発明プラスミドで形質転換されてなる宿主生物またはその細胞から調製することもできる。 具体的には、例えば、ファルマシア社のGS
T Gene Fusion Vectorsキットを用いて本発明遺伝子をキットに付属の発現ベクタープラスミドに挿入し、得られたベクタープラスミドを通常の遺伝子工学的方法に準じて、大腸菌等の微生物に導入し、得られた形質転換体を、例えば、IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)を添加した培地にて培養することにより培養物中に本発明蛋白質を融合蛋白質として発現誘導させることができる。 発現誘導させた融合蛋白質は、通常の菌体破壊処理、カラム操作、SDS-PAGE電気泳動等の方法によって単離・精製することができる。 そして、得られた融合蛋白質をトロンビンまたは血液凝固因子Xa等のプロテアーゼで切断処理することにより本発明蛋白質が得られる。 好ましくは、例えば「Current Protocols In Protein Sci
ence」(1995), John Wiley & Sons,Inc. ISBN0-471-111
84-8に記載される方法に準じて行なうと良い。 尚、本発明蛋白質の活性は、例えば、L． Lehle and W． Tanne
r，Eur． J． Biochem． ，38，103頁-110頁（1973）に記載される方法により測定できる。

【００２５】このようにして、調製された本発明蛋白質を抗原として用いて通常の免疫学的方法によりラフィノース合成酵素蛋白質に対して結合能力を有する抗ラフィノース合成酵素抗体（以下、本発明抗体と記す。）を作製することができる。 具体的には、例えば、Ed Harlow
and David Lane, 「Antibodies:A Laboratory Manual」
(1988), Cold Spring Harbor Laboratory Press ISBN
No.0-87969-314-2に記載される方法に準じて本発明抗体を作製することができる。 本発明抗体を供試蛋白質に作用させ、前記抗体が特異的に結合した蛋白質を検出することにより本発明蛋白質を検出することができる。 このような検出方法は、具体的には、例えば、ウエスタンブロット法、ELISA法等のEd Harlow and David Lane, 「A
ntibodies:A Laboratory Manual」 (1988), Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press記載の免疫学的手法に準じて行うことができる。

【００２６】ウエスタンブロット法は、例えば、以下のようにして行う。 まず、対象となる植物から、例えば、
Methods in Enzymology, volume182, 「Guide to Prote
in Purification」174頁〜193頁 ISBN 0-12-182083-1に記載される方法に準じて蛋白質を抽出する。 尚、用いられる植物組織に応じて適宜抽出液の組成を変えることができる。 抽出された蛋白質は、通常のSDS-PAGEの方法に従って電気泳動する。 電気泳動されたゲルの中の蛋白質は、通常の電気的な方法によるウエスタンブロットによりメンブレンに転写させる。 具体的には例えば、ゲルをトランスファーバッファー(25mM Tris, 192mM グリシン,20%メタノール)に10分間浸し、その後市販のセミドライ型のトランスファー装置にゲルの大きさに切ったPV
DF膜と合わせてセットする。 1cm ²当り0.8〜2mAの定電流条件で45分間から1時間ブロッティングを行う。 メンブレンに転写された蛋白質は一次抗体およびアルカリ性フォスファターゼやホースラディッシュパーオキシダーゼを結合させた二次抗体またはProteinAなどを用いたウエスタンブロット検出用のキットを用いて免疫学的検出を行うことができる。 この際、本発明抗体を一次抗体として使用することでメンブレン上の本発明蛋白質を検出することができる。

【００２７】また、ELISA法は、原理的には、樹脂製の9
6ウェルのELISAプレートの表面に蛋白質が結合する性質を利用して、最終的にELISAプレートの表面に結合している抗原を免疫学的に検出する。 例えば、まず、ELISA
プレートに供試蛋白質を溶液として加え、該蛋白質を結合させた後、5%牛血清アルブミンなどの蛋白質を含んだ
PBSを加え、ブロッキングする。 その後ウェルをPBSで洗浄し、本発明抗体を含む溶液を加え、反応させる。 次に、ウェルの洗浄を行い、さらにアルカリ性フォスファターゼやホースラディッシュパーオキシダーゼを結合させた二次抗体を含む溶液を加えて反応させた後、洗浄する。 最後に検出するための基質溶液をウェルに加えてEL
ISAリーダーで基質の発色を検出する。 また、別の方法としては、本発明抗体をELISAプレートに加えて結合させた後、例えば、5%牛血清アルブミンなどの蛋白質を含んだPBSを加え、ブロッキングする。 次に供試蛋白質を溶液として加え、該供試蛋白質に含まれる抗原を上記プレートに結合させた本発明抗体と結合させた後、ウェルを洗浄し、該ウェルにさらに本発明抗体を加える。 この際に使用する本発明抗体は最初に用いた本発明抗体とは異なる動物種から調製されたものであることが望ましい。 次にアルカリ性フォスファターゼやホースラディッシュパーオキシダーゼを結合させた二次抗体を含む溶液をウェルに加えて反応させた後、洗浄する。 この際に使用する二次抗体は後から加えた本発明抗体と結合する性質のものでなければならない。 最後に検出するための基質溶液を加えてELISAリーダーで基質の発色を検出する。

【００２８】

【実施例】以下に実施例をあげて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例にのみ限定されるものではない。

【００２９】実施例1 (ガラクチノールの精製) 甜菜廃糖蜜約250mlをメタノールで5倍に希釈した。 該希釈液を室温で21，400g、15分間遠心分離し、不溶物を除去した。 得られた上澄みを2lの三角フラスコに移し、これに1/2量のイソプロパノールを撹拌しながら少量ずつ添加した。 沈澱が器壁に付着するまでしばらく室温で放置した。 次にデカンテーションで上澄みを廃棄した。 沈澱に500mlのエタノールを加え、これをロータリーシェーカーで撹拌して洗浄した。 この洗浄をさらに数回繰り返した。 洗浄された沈澱を器壁よりかきとり、これを濾紙上で風乾した。 風乾された沈殿（乾燥粉末）は約40%
(w/v)になるように精製水で溶解された。 この溶液にBio
Rad社のAG501-X8(D)を加え、撹拌した。 溶液の色がほぼ観察されなくなるまで、この操作を繰り返した。 得られた溶液をMillipore社のSep-Pak QMAカラムで処理をした。 さらにMillipore社のSep-Pak CMカラム、Millipore
社のSep-Pak C18カラム、Millipore社のSep-Pak Silica
カラムで前処理した。 得られた溶液5mlをWako-gel LP40
C18(和光純薬:2.6cm×85cm)カラムにかけ、精製水で溶出した。 溶出液の糖度は携帯用砂糖屈折計で測定され、
糖の組成はMillipore社のSugar-Pak Na(7.8mm×300mm)
カラムを用いたHPLCにより分析された。 糖の検出はWate
rs社の410 Defferential Refractometerで行なった。 ガラクチノールを含む溶出液を凍結乾燥し、得られた凍結乾燥粉末を精製水5mlに溶解し、これをTOYOPEARL HW40
(S)(東ソー:2.6cm×90cm)にかけ、精製水で溶出した。
溶出液は前記と同様に分析され、精製ガラクチノールが得られた。 得られたガラクチノールを80mM phosphate b
uffer(pH6.5)、2mg/ml ガラクチノール、8.3U α-galac
tosidase(ベーリンガー・マンハイム社: E.coli overpr
oducer 662038)となる反応液中で25℃、40分間保温し、
該反応液についてクロロホルム抽出を行なった後、水層をHPLCで分析した。 得られたガラクチノールはガラクトースとmyo-イノシトールに加水分解されることが確認された。

【００３０】実施例2 （ラフィノース合成酵素の活性測定） ラフィノース合成酵素活性は、L.Lehle and W.Tanner,E
ur.J.Biochem.,38,103頁-110頁(1973)に準じて、以下の条件で測定された。 活性の測定に供する試料2μlを終濃度で100mM Tris-HCl(pH7.4)、5mM DTT(Dithiothreito
l)、0.01% BSA、200μM sucrose、5mM ガラクチノール、740KBq/ml(31.7μM)[ ¹⁴ C]sucroseとなる反応液18μ
lに加え、37℃で3時間から20時間保温した。 反応後、反応液に30μlのエタノールを加えて撹拌し、15,000rpmで
5分間遠心分離した。 上澄み5μlをHPTLCセルロース薄層クロマト(Merck社HPTLC platescellulose 10×20cm)にスポットし、n-ブタノール:ピリジン:水:酢酸=60:40:3
0:3で展開した。 展開されたプレートを乾燥した後、イメージングアナライザー(富士写真フイルム社FUJIXバイオ・イメージングアナライザーBAS-2000II)で分析し、
生成した[ ¹⁴ C]ラフィノースを定量した。

【００３１】実施例3 （ラフィノース合成酵素の精製） 以下のようにしてソラマメよりラフィノース合成酵素の精製を行なった。 それぞれの精製蛋白質液について、該蛋白質液中に存在する蛋白質をSDS-PAGE(第一化学薬品製)により分析し、又、その酵素活性を実施例2記載の方法に従って測定した。 -80℃で保存したソラマメ(仁徳一寸)未熟種子300gを解凍後、皮をむき、600mlの100mM Tr
is-HCl(pH7.4)、5mM DTT(Dithiothreitol)、1mM EDTA、
1mM PMSF(Phenylmethylsulfonyl fluoride)、1mM Benza
mideに入れ、氷上で乳鉢ですりつぶした。 該破砕物を2
1,400xg、4℃で50分間遠心分離し、得られた上澄みに20
分の1の体積の10%polyethylene imine(pH8.0)を加え、4
℃で15分間撹拌した。 そして該混合物を15,700xg、4℃
で20分間遠心分離し、得られた上澄みに196g/lの(NH ₄ ) ₂
SO ₄を撹拌しながら添加した。 氷中、30分間撹拌した後、15,700xg、4℃で20分間遠心分離した。 得られた上澄みにさらに142g/lの(NH ₄ ) ₂ SO ₄を撹拌しながら添加した。 氷中、30分間撹拌した後、15,700xg、4℃で20分間遠心分離した。 得られた沈澱を50mlの100mM Tris-HCl(p
H7.4)、5mM DTT(Dithiothreitol)で溶解し、20mM Tris-
HCl(pH7.4)、1mM DTT(Dithiothreitol)、1mM EDTAで4℃
で一晩透析した。 透析後、懸濁液を70,000xg、4℃で60
分間遠心分離した。 得られた上澄みに1mMBenzamidine・
HCl、5mM ε-Amino-n-caproic acid、1μg/ml antipai
n、1μg/ml leupeptin、10mM EGTAを添加した。 さらに4
0分の1の体積の2M KClを少量ずつ添加した後、これを0.
05M KCl、20mM Tris-HCl(pH7.4)、1mM DTT(Dithiothrei
tol)、1mM EDTAで平衡化したDEAE-Sephacelカラム(Phar
macia社:2.5×21.5cm)にかけ、一旦担体に捕獲された蛋白質を0.05から0.5MのKClグラジェントで溶出した。 ここまでの精製を3回行ない、ラフィノース合成酵素活性を有する画分をまとめてから以下の精製を行なった。 ラフィノース合成活性を有する溶出画分に4分の1の体積の飽和(NH ₄ ) ₂ SO ₄を少量ずつ添加した。 この溶液を20%飽和
(NH ₄ ) ₂ SO ₄ 、20mM Tris-HCl(pH7.4)、1mM DTT(Dithiothr
eitol)、1mM EDTAで平衡化したPhenyl-Sepharoseカラム
(Pharmacia社:2.5×10.2cm)にかけ、20％から0%の(NH ₄ )
₂ SO ₄グラジェントで溶出した。 得られた活性画分に2倍量の0.01M pottassium phosphate buffer(pH7.5)を加え、希釈した。 この希釈溶液をあらかじめ0.01Mのpotta
ssium phosphate buffer(pH7.5)、2mM DTT(Dithiothrei
tol)で平衡化したEcono-Pac 10DG(BioRad社:5ml)にかけ、0.01Mから0.5Mのpottassium phosphate buffer(pH
7.5)、2mM DTT(Dithiothreitol)のグラジェントで溶出した。 この時点で得られた活性画分は、比活性6500倍以上にまで精製されていた。 さらに得られたラフィノース合成酵素活性を有する精製蛋白質溶液の一部を0.2M KC
l、20mM Tris-HCl(pH7.4)、1mM DTT(Dithiothreitol)、
1mM EDTAで平衡化したSuperdex200カラム(Pharmacia社:
1.6×60cm)にかけた。 分取された精製蛋白質をSDS-PAGE
にかけ、また、ラフィノース合成酵素活性を測定した。
ラフィノース合成酵素活性を有する蛋白質のバンドをSD
S-PAGE上で分子量約90kDaと特定した。

【００３２】実施例4 （ラフィノース合成酵素の部分アミノ酸配列の解析） 実施例3においてEcono-Pac 10DG(BioRad社:5ml)により精製された精製蛋白質溶液約1mlに9分の1の体積の100%T
CAを加え、氷上で30分間放置した。 10，000ｘｇ，15分間遠心分離した後、得られた沈澱を500μlの-20℃に冷やしたアセトンで懸濁し、遠心分離して沈澱を回収した。 回収された沈殿を前記と同様な方法でアセトン洗浄を行った後、沈澱を回収し、乾燥した。 乾燥された沈澱について、該沈殿を200μlのSDS-サンプルバッファーに溶解してから、SDS-PAGEを行なった。 電気泳動したゲルをCBB染色し、ラフィノース合成酵素蛋白質のバンドを切り出した。 切り出したゲルに1mlの50%アセトニトリル、0.2M ammonium carbonate(pH8.9)を加え、室温で20
分間撹拌しながら洗浄した。 さらにもう一度同様な方法でゲルを洗浄し、該ゲルを体積が減少する程度まで減圧下乾燥した。 次にこのゲルに対して、1mlの0.02% Tween
-20、0.2M ammonium carbonate(pH8.9)を加え、室温で1
5分間撹拌した。 溶液を除いた後、新たに400μlの8M ur
ea、0.4M NH ₄ HCO ₃を加えた。 さらに40μlの45mMのDTT(D
ithiothreitol)を添加し、50℃で20分間放置した。 十分に室温まで戻した後、4μlの1M iodoacotic acidを加え、暗所中、室温で20分間撹拌した。 溶液を除き1mlの精製水を加え、室温で5分間撹拌して洗浄した。 さらに2
回洗浄を行った後、1mlの50%アセトニトリル、0.2M amm
onium carbonate(pH8.9)を加え、室温で15分間撹拌した。 同様の処理をさらにもう一度行った後、溶液を除去し、ゲルを体積が減少する程度まで減圧下乾燥した。 次にこのゲルに対してAchromobacter ProteaseIの溶液(TA
KARA社:Residue-specific Protease kit)を100μl加えた。 該ゲルが溶液の表面から出ない程度に0.02% Tween-
20、0.2M ammonium carbonate(pH8.9)を加え、37℃で42
時間放置した。 500μlの0.09% TFA、70%アセトニトリルを加え、室温で30分間撹拌した。 得られた混合物が入れられたサンプルチューブごと超音波洗浄器の中に浮かし、超音波処理（BRANSON:出力60W）を5分間行なった。
得られた処理物を遠心分離し、得られた抽出液を別のシリコンコートしたサンプルチューブに回収した。 一方、
沈殿には再度500μlの0.09% TFA、70%アセトニトリルを添加し、上記と同様な方法により再抽出を行った。 得られた抽出液を合わせて、200〜300μl溶液が残る程度にまで減圧下で濃縮した。 該濃縮物に25μlの8M 尿素、0.
4M NH ₄ HCO ₃を加えてから、100μl以下溶液が残る程度にまで減圧下で濃縮した。 該濃縮物を精製水で約100μlにし、これをウルトラフリーC3 GV(Millipore社)で濾過した。 得られた濾液をAquapore BU-300 C-4(2.1×300mm)
カラムで0.1%TFA/2.1%〜68.6%のアセトニトリルグラジェントで溶出し、215nmの吸収でモニターしながらピークを分取した。 分取したサンプルを減圧下で完全に乾固した後、ABI社プロテインシークエンサー473Aで分析することによりラフィノース合成酵素の部分アミノ酸配列の解析を行った。

【００３３】実施例5 （cDNAの作成） ソラマメ(仁徳一寸)の未熟種子約2gを液体窒素で凍結し、乳鉢で粉砕した。 Isogen(ニッポンジーン社)を20ml
加え、さらに良くすりつぶした。 該破砕物を遠心管に移し、4mlのクロロホルムを加え、ボルテックスで撹拌した後、これを4℃で6，500ｘｇ10分間遠心分離し、水層を回収した。 回収された水層に10mlのイソプロパノールを加えて撹拌した後、4℃で6，500ｘｇ 10分間遠心分離した。 得られた沈殿を10mlの70%エタノールで洗浄した後、これを1mlのElution buffer（10mMTris-HCl/pH7．
5，１mM EDTA，0．1%SDS）で溶解した。 該溶解物を60
℃で10分間おいた後、10，000ｘｇで1分間遠心分離し、
不溶物を除去した。 得られた上澄み液に等量のOligotex
-dT30（TAKARA社）を加え、撹拌し、65℃で5分間放置した。 さらに氷上に移して3分間放置した後、5M NaClを20
0μl加え、混合し、37℃で10分間放置した。 次にこれを
4℃、10，000ｘｇで3分間遠心分離し、沈澱を回収した。 回収された沈殿を1mlのTEバッファーで懸濁し、65
℃で5分間放置した。 この懸濁液を氷上に移して3分間放置した後、4℃、10，000ｘｇで3分間遠心分離して沈澱を除去した。 得られた上澄み液に100μlの3M酢酸ナトリウムと2mlのエタノールを加えてRNAをエタノール沈澱し、これを回収した。 回収されたRNAを70%エタノールで
2回洗浄し、これを20μlの滅菌水に溶解し、cDNA合成に用いた。 得られたRNAは260nmの吸光度を測定し、定量した。 cDNA合成には、Amersham社のFirst strand synthes
is for RT-PCRのキットとTakara社のcDNA Synthesis Ki
tを用い、すべての操作はプロトコールに従った。

【００３４】実施例6 （cDNAからのラフィノース合成酵素遺伝子の塩基配列の解析） 実施例4により得られたアミノ酸配列に基づき、下記リスト5で示される塩基配列の混合合成DNAプライマーを合成した。 該プライマーとClontech社のAdvantageKlenTaq
cDNA Kitを用い、パーキンエルマー社のGene Amp PCR
Systems 2400とDNA Thermal Cycler Model 480を使用してPCR反応を行った。 PCR反応は、94℃1分間、50℃3分間、72℃3分間の反応を１サイクルとして、40回繰り返した。 その結果、下記リスト5で示される塩基配列を有するプライマー8.2と13.3RV、13.4と10.3RV、そして7.4
と10.3RVの組み合わせでそれぞれ1.2kb、0.5kb、1.2kb
のバンドの増幅が見られた。 増幅されたDNA断片をTAクローニングキット(Invitrogen社)でクローニングし、パーキンエルマー社のABI PRISM Dye Terminater Cycle S
equencing Ready Reaction Kitを用いてシークエンス反応を行ない、ABI社373S DNA シークエンサーで塩基配列の解析を行った。 その結果、それぞれのDNA断片は、配列番号2で示される塩基配列における813番目から1915番目まで、1936番目から2413番目まで、1226番目から2413
番目までの塩基配列を有することが明らかにされた。 この塩基配列をもとにリスト6に示される塩基配列の合成D
NAプライマーを作成し、Clontech社のMarathon cDNA Am
plification Kitを用いてcDNAの両端の塩基配列を解析した。 その結果、最終的に配列番号2で示される塩基配列が明らかにされた。

【００３５】 （リスト５） #8.2 26mer AA(AG) AC(ATGC) GC(ATGC) CC(ATGC) AG(TC) AT(TCA) AT(TCA) GAC AA #13.4 20mer AA(AG) AT(TCA) TGG AA(TC) CT(ATGC) AAC AA #7.4 24mer AA(AG) GC(ATGC) AG(AG) GT(ATGC) GT(ATGC) GT(ATGC) CC(ATGC) AAG #13.3RV 21mer (TC)TT (AG)TT (ATGC)AG (AG)TT CCA (AGT)AT TTT #10.3RV 21mer (TC)TT (AG)TC (TC)TC (AG)TA (ATGC)AG (AG)AA TTT

【００３６】（リスト６） RS-2RV 30mer GGCTGAGGTTCGGTTCATTCCTGAATCATC RS-7 30mer CCAAATGGTACATATTGGCTCCAAGGTTGT RS-8 30mer AAGAGTGTATCTGAATTTTCACGCGCGGTG RS-9 30mer TGGTGCAATGGGAAAACTCCAATGAGCACC RS-10 30mer ATGAAGTGTTCTGATAGATTGAAAGTTTCG RS-11 30mer CAGTCTCTGGAGTTTGATGATAATGCAAGT

【００３７】実施例7 （ソラマメcDNAからのラフィノース合成酵素遺伝子のクローニング） 配列番号1で示されるアミノ酸配列に基づき設計されたプライマー、すなわち下記リスト7に示される塩基配列を有するプライマーを合成した。 本プライマーを用い実施例5により得られたcDNAを鋳型として、実施例６に記載の条件にてPCR反応を行い、オープンリーディングフレーム領域のDNA断片を増幅した。 増幅されたDNA断片は用いたプライマーに認識配列が含まれる制限酵素、BamH
IとXbaIで切断した後、あらかじめBamHIとXbaIで切断したプラスミドpBluescriptII KS−(Stratagene社)にLiga
tion Kit(TAKARA社)を用いてクローニングした。 クローニングしたDNA断片の塩基配列の確認はパーキンエルマー社のABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Re
ady Reaction Kitを用いて行った。 ここで取得されたクローンの塩基配列は配列番号2の1591番目の位置の塩基がTからCに変化していたが、これはアミノ酸の変化を伴わないnonsense変異であることから、このクローンをpB
luescriptKS−RSと名づけ、以後の実験に用いた。

【００３８】（リスト７） RS-N 41mer CGCGGATCCACCATGGCACCACCAAGCATAACCAAAACTGC RS-C 37mer TGCTCTAGATTATCAAAATAAAAACTGGACCAAAGAC

【００３９】実施例8 （ソラマメラフィノース合成酵素遺伝子の大腸菌での発現） 実施例7で得られたソラマメラフィノース合成酵素遺伝子を持つプラスミドpBluescriptKS−RSをBamHIとNotIで切断し、同様にBamHIとNotIで切断したプラスミドpGEX
−4T3(Pharmacia社)にクローニングし、プラスミドpGEX
−RSを得た。 また、pBluescriptKS−RSをNcoIとXbaIで切断し、同様にNcoIとXbaIで切断したプラスミドpTrc99
A(Pharmacia社)にクローニングし、プラスミドpTrc−RS
を得た。 これらのプラスミドを大腸菌HB101株に導入し、得られた形質転換株でラフィノース合成酵素の発現を確認した。 得られた形質転換株の終夜培養液1mlを100
mlのLB培地に植菌し、37℃で約3時間培養した後、終濃度1mMのIPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)を添加し、さらに5時間培養した。 培養液は21,400ｘｇで10分間遠心分離し、菌体を回収した。 菌体は-80℃で保存した。 凍結した菌体に菌体重量の10倍量の100mM Tris-HCl
(pH7.4)、1mM EDTA、5mM DTT(Dithiothreitol)、1mM PM
SF(Phenylmethylsulfonyl fluoride)、1mM benzamideを加え、解凍し、菌体を懸濁した。 この懸濁液を超音波破砕機(Branson社)で処理し、菌体を破砕した。 得られた破砕液を16,000ｘｇで10分間遠心分離し、可溶性蛋白質溶液を回収した。 得られた蛋白質溶液4μlを用いて実施例２に記載の方法に従ってラフィノース合成活性の検討を行った。 反応は37℃で64時間行った。 コントロールとしてベクターであるpGEX-4T3で形質転換した大腸菌を用いた。 その結果を表1に示す。 pGEX-RSとpTrc-RSにおいてラフィノースの合成が検出された。

【００４０】表1 HB101(pGEX4T-3)・・・0.56pmol・produced raffinose HB101(pGEX-RS)・・・10.50pmol・produced raffinose HB101(pTrc-RS)・・・11.10pmol・produced raffinose

【００４１】実施例9 （ダイズcDNAからのラフィノース合成酵素遺伝子のクローニング） 実施例5と同様の操作によりダイズ(Glycine max)Willia
ms82の未熟種子から得られたcDNAを鋳型として、配列番号1で示されるアミノ酸配列に基づき設計されたプライマー、すなわち下記リスト8に示される塩基配列を有するプライマーを用いてDNA断片を実施例６に記載の条件にてPCRによる増幅を行った。 本PCRにより増幅されたDN
A断片はTAクローニングキット(Invitrogen社)でクローニングし、パーキンエルマー社のABI PRISM Dye Termin
ater Cycle Sequencing Ready Reaction Kitを用いてシークエンス反応を行ない、ABI社373S DNA シークエンサーで解析を行った。 この配列に基づいて下記のリスト9
に示す配列を有するプライマーを合成した。 実施例5と同様の操作によりダイズWilliams82の葉から得られたmR
NAを用いてClontech社のMarathon KitによるcDNA合成を行い、得られたcDNAはリガーゼにより本キットに含まれるアダプターと結合した。 本操作は添付のプロトコールにしたがって実施した。 このようにして調製したアダプターが結合したcDNAを用いて、リスト9に示されるプライマーによるPCRを上記と同様に行った。 遺伝子の両末端領域の塩基配列の解析はClontech社のMarathon Kitのプロトコールに準じて行った。 その結果、配列番号4に示される配列が明らかとなった。

【００４２】（リスト８） 1-F primer 35mer CGATTIAAIGTITGGTGGACIACICAITGGGTIGG 2-RV primer 45mer GGCCTAIAAIGCITCCCAIGTICACCAICCIAAITTITCIATIAT 5-F primer 41mer CGATGGATGGGIAAITTIATICAICCIGAITGGGAIATGTT 6-RV primer 32mer GGCCACATITTIACIA(AG)ICCIATIGGIGCIAA

【００４３】（リスト９） SN-1 30mer CACGAACTGGGGCACGAGACACAGATGATG SC-3RV 30mer AAGCAAGTCACGGAGTGTGAATAGTCAGAG SC-5 30mer ACACGAGACTGTTTGTTTGAAGACCCCTTG SC-6 25mer TGGAATCTCAACAAATATACAGGTG SN-3RV 30mer GGGTCATGGCCAACGTGGACGTATAAGCAC SN-4RV 30mer GATGATCACTGGCGCGGTTTTCTCCTCGAG

【００４４】実施例10 （チョロギcDNAからのラフィノース合成酵素遺伝子の取得） 実施例5と同様の操作によりチョロギ(Stachys sieboldi
i)の葉から得られたcDNAを鋳型として、配列番号1で示されるアミノ酸配列に基づき設計されたプライマー、すなわち下記リスト10に示される塩基配列を有するプライマーを用いて、実施例６に記載の条件にてPCR反応を行いDNA断片を増幅した。 本PCRにより増幅されたDNA断片はTAクローニングキット(Invitrogen社)でクローニングし、パーキンエルマー社のABI PRISM Dye Terminater C
ycle Sequencing Ready ReactionKitを用いてシークエンス反応を行ない、ABI社373S DNA シークエンサーで塩基配列の解析を行った。 その結果、配列番号6に示される塩基配列が明らかとなった。 ここで得られた塩基配列に基づき、合成DNAプライマーを作製し、実施例12と同様にClontech社のMarathon Kitを用いて解析することにより本遺伝子の両末端領域の塩基配列を得る。

【００４５】（リスト１０） 1-F primer 35mer CGATTIAAIGTITGGTGGACIACICAITGGGTIGG 4-RV primer 37mer GGCCAGCIATIACICCITTICCITTIAAITGITTITT 2-F primer 44mer CGAATIATIGAIAAITTIGGITGGTGIACITGGGAIGCITTITA 6-RV primer 32mer GGCCACATITTIACIA(AG)ICCIATIGGIGCIAA

【００４６】実施例11 （トウモロコシcDNAからのラフィノース合成酵素遺伝子の取得） 実施例5と同様の操作によりトウモロコシ(Zea mays L.)
Pioneer3358の葉から得られたcDNAを鋳型として、配列番号1で示されるアミノ酸配列に基づき設計されたプライマー、すなわち下記リスト11に示される塩基配列を有するプライマーを用いて実施例６に記載の条件にてPCR
反応を行いDNA断片を増幅した。 本PCRにより増幅された
DNA断片はTAクローニングキット(Invitrogen社)でクローニングし、パーキンエルマー社のABI PRISM Dye Term
inater Cycle Sequencing ReadyReaction Kitを用いてシークエンス反応を行ない、ABI社373S DNA シークエンサーで塩基配列の解析を行った。 この配列に基づいて下記のリスト12に示す配列を有するプライマーを合成した。 実施例5と同様の操作によりトウモロコシ(Zea mays
L.)Pioneer3358の葉から得られたmRNAをリガーゼによりClontech社のMarathon Kitに含まれるアダプターと結合した。 本操作は添付のプロトコールにしたがって実施した。 このようにして調製したアダプターが結合したcD
NAを用いて、リスト12に示されるプライマーによるPCR
を上記と同様に行った。 その結果、配列番号8に示される塩基配列が明らかとなった。 ここで得られた塩基配列に基づき、合成DNAプライマーを作製し、実施例12と同様にClontech社のMarathon Kitを用いて解析することにより本遺伝子の5'末端領域の塩基配列を得る。

【００４７】（リスト１１） 5-F primer 41mer CGATGGATGGGIAAITTIATICAICCIGAITGGGAIATGTT 6-RV primer 32mer GGCCACATITTIACIA(AG)ICCIATIGGIGCIAA

【００４８】（リスト１２） M-10 primer 25mer GACGTCGAGTGGAAGAGCGGCAAGG M-11 primer 25mer CACCTACGAGCTCTTCGTCGTTGCC

【００４９】実施例12 （35S-ソラマメラフィノース合成酵素遺伝子キメラ遺伝子の植物での発現ベクターの構築） 実施例7で得られたソラマメラフィノース合成酵素遺伝子を持つプラスミドpBluescriptKS−RSを制限酵素BamHI
とSacIで切断し、あらかじめBamHIとSacIで切断したバイナリーベクターpBI121(Clontech社)にLigation Kit(T
AKARA社)を用いてクローニングした。 ここで得られたベクターをpBI121-RSと名づけた。 また、アンチセンス実験のため、あらかじめBamHIとSacIで切断したプラスミドpBI121(Clontech社)をリスト13に示したリンカーとLi
gation Kit(TAKARA社)を用いてライゲーションし、pBI1
21(-)を作製した。 このpBI121(-)を用いて上記pBI121と同様にしてpBI121(-)-RSを作製した。 また、pBI221を用いて同様のベクターを作製した。 実施例7で得られたプラスミドpBluescriptKS−RSを制限酵素BamHIとSacIで切断し、あらかじめBamHIとSacIで切断したベクターpBI22
1(Clontech社)にLigation Kit(TAKARA社)を用いてクローニングした。 ここで得られたベクターをpBI221-RSと名づけた。 また、アンチセンス実験のため、あらかじめ
BamHIとSacIで切断したプラスミドpBI221(Clontech社)
をリスト13に示したリンカーとLigation Kit(TAKARA社)
を用いてライゲーションし、pBI221(-)を作製した。 このpBI221(-)を用いて上記pBI221と同様にしてpBI221(-)
-RSを作製した。

【００５０】（リスト１３） BamSac-(+)linker 25mer GATCGAGCTCGTGTCGGATCCAGCT BamSac-(-)linker 17mer GGATCCGACACGAGCTC

【００５１】実施例13 （ソラマメラフィノース合成酵素遺伝子によるカラシナの形質転換） 実施例12で作製したベクターpBI121-RSとpBI121(-)-RS
を用いてアグロバクテリウム感染方法によりカラシナ(B
rassica juncia)の形質転換を行った。 実施例12で作製した2種類のプラスミドpBI121-RSとpBI121(-)-RS各々によって、あらかじめ塩化カルシウム処理でcompetentな状態にしたAgrobacterium tumefaciens(C58C1株:リファンピシン耐性)を形質転換した。 形質転換体は導入されたプラスミドが有するカナマイシン耐性遺伝子(neomyci
n phosphotransferase:NPTII)により付与されるカナマイシンに対する耐性の形質を利用してリファンピシン50
μg/ml、カナマイシン25μg/mlを含むLB培地で選択することにより得られた。 得られた形質転換体であるアグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciensC58株:RifR)
をリファンピシン50μg/ml、カナマイシン25μg/mlを含むLB培地で28℃で一昼夜培養し、得られた菌液を以下に記載される方法によるカラシナの形質転換に用いた。 カラシナ種子を1/2MS培地、2% sucrose、0.7% agarに無菌播種した。 1週間後、発芽した植物の子葉と葉柄をメスで切り取り、MS培地、3% sucrose、0.7% agar、4.5μM
BA、0.05μM 2.4-D、3.3μM AgNO ₃に移し、1日間前培養した。 上記のアグロバクテリウムの培養液を1000倍希釈したものに前培養した子葉と葉柄を移し、5分間感染した。 感染した子葉と葉柄を前培養と同じ培地に再び移し、3から4日間培養した。 培養した子葉と葉柄はMS培地、3% sucrose、4.5μM BA、0.05μM 2.4-D、3.3μM A
gNO ₃ 、500mg/l cefotaximに移し、１日間振盪しながら除菌した。 除菌した子葉と葉柄はMS培地、3% sucrose、
0.7% agar、4.5μM BA、0.05μM 2.4-D、3.3μM AgN
O ₃ 、100mg/l cefotaxim、20mg/l カナマイシンに移し、
3から4週間培養した。 次に子葉と葉柄をMS培地、3% suc
rose、0.7% agar、4.5μM BA、0.05μM 2.4-D、100mg/l
cefotaxim、20mg/l カナマイシンに移し、培養した。
この培地での培養を3から4週間で植え継ぎしながら継続した。 シュートが再生してきたら、シュートをMS培地、
3% sucrose、0.7% agar、20mg/l カナマイシンに植え継ぎ、3から4週間培養した。 発根した植物体はバーミキュライト:ピートモス=1:1に移し、21から22℃で12時間:12
時間=昼/夜で馴化した。 植物体の成長に伴い、適宜培養土で栽培した。 再生した植物体の葉から上記の方法に従ってゲノムDNAを抽出し、下記リスト14に記したプライマーを用いたPCRにより遺伝子の植物体ゲノムへの挿入を確認した。

【００５２】（リスト１４） 35S 30mer TTCCAGTATGGACGATTCAAGGCTTGCTTC NOS 25mer ATGTATAATTGCGGGACTCTAATCA RS-F 30mer AAGAGTGTATCTGAATTTTCACGCGCGGTG RS-RV 33mer ACCTTCCCATACACCTTTTGGATGAACCTTCAA

【００５３】実施例14 （ソラマメラフィノース合成酵素遺伝子によるダイズ不定胚の形質転換） ダイズ品種「Fayette」不定胚培養細胞(400から500mgFW)
を6cmの寒天プレートの中央部、直径20mmの円周内に一層にして並べた。 35S-ソラマメラフィノース合成酵素遺伝子キメラ遺伝子を持つ、実施例14で作製した2種類のプラスミドpBI221-RSとpBI221(-)-RS各々を、特願平3-2
91501に開示された内容に従ってダイズ不定胚に導入した。 即ち、組織培養、20、323頁-327頁 (1994)に記載された選抜用β-グルクロニダーゼ(GUS)/ハイグロマイシン耐性遺伝子(HPT)同時発現ベクターpSUM-GH:NotIと混合した。 これらの混合プラスミドを上記のダイズ不定胚にパーティクルガン(800mg/コーティング金粒子200μg/
shot、プロジェクタイルストッパー/試料間距離100mmの条件)により遺伝子導入した。 導入後、ハイグロマイシン25〜50μg/mlを含むMS改変増殖液体培地(Sigma社)を用い、25℃、16時間照明下で旋回培養し、形質転換不定胚を選抜した。 約3ヶ月後に選抜された黄緑色で増殖能を保持したハイグロマイシン耐性ダイズ不定胚について、上記リスト14に示すプライマーを用いてPCRを行うことにより、ソラマメラフィノース合成酵素遺伝子領域の増幅の有無を調べる。 これによりダイズ染色体へのソラマメラフィノース合成酵素遺伝子の挿入を確認する。
さらに得られた不定胚から植物個体の再生を行い、ソラマメラフィノース合成酵素遺伝子による形質転換体ダイズを取得する。

【００５４】 （培地の組成） LB培地 bacto-tryptone 10g bacto-yeast extract 5g NaCl 10g /1 liter H ₂ O (pH7.0) MS培地 KNO ₃ 2022mg/l NH ₄ NO ₃ 1650mg/l NH ₄ Cl 2140mg/l KH ₂ PO ₄ 170mg/l MgSO ₄・7H ₂ O 370mg/l CaCl ₂・2H ₂ O 440mg/l MnSO ₄・4H ₂ O 22.3mg/l ZnSO ₄・7H ₂ O 8.6mg/l CuSO ₄・5H ₂ O 0.025mg/l KI 0.83mg/l CoCl ₂・6H ₂ O 0.025mg/l H ₃ BO ₃ 6.2mg/l NaMoO ₄・2H ₂ O 0.25mg/l FeSO ₄・7H ₂ O 27.8mg/l Na ₂ EDTA 37.3mg/l nicotinic acid 0.5mg/l thiamine HCl 1mg/l pyridoxine HCl 0.5mg/l Inositol 100mg/l glycine 2mg/l

【００５５】（表の簡単な説明） １． 表1：表1は、記載された条件下で反応した際、20μ
lの反応液中で各大腸菌蛋白質抽出液により産生されたラフィノース量を示す。

【００５６】（配列の簡単な説明） １． 配列番号1：配列番号1に示される配列は、ソラマメより取得されたラフィノース合成酵素遺伝子にコードされるラフィノース合成酵素蛋白質のアミノ酸配列を示す。 ２． 配列番号2：配列番号2に示される配列は、ソラマメより取得されたラフィノース合成酵素遺伝子のcDNA塩基配列を示す。 ３． 配列番号3：配列番号3に示される配列は、ダイズより取得されたラフィノース合成酵素遺伝子にコードされるラフィノース合成酵素蛋白質のアミノ酸配列を示す。 ４． 配列番号4：配列番号4に示される配列は、ダイズより取得されたラフィノース合成酵素遺伝子のcDNA塩基配列を示す。 ５． 配列番号5：配列番号5に示される配列は、チョロギより取得されたラフィノース合成酵素遺伝子にコードされるラフィノース合成酵素蛋白質のアミノ酸配列を示す。 ６． 配列番号6：配列番号6に示される配列は、チョロギより取得されたラフィノース合成酵素遺伝子のcDNA塩基配列を示す。 ７． 配列番号7：配列番号7に示される配列は、トウモロコシより取得されたラフィノース合成酵素遺伝子にコードされるラフィノース合成酵素蛋白質のアミノ酸配列を示す。 ８． 配列番号8：配列番号8に示される配列は、トウモロコシより取得されたラフィノース合成酵素遺伝子のcDNA
塩基配列を示す。 ９． リスト１：リスト１に示される配列は、ラフィノース合成酵素遺伝子のcDNA断片の増幅に用いられるプライマーの塩基配列の一例を示す。 いずれも非翻訳領域の塩基配列に基づいている。 プライマー1はソラマメ由来ラフィノース合成酵素遺伝子のcDNA断片の5'-末端領域に相当するセンスプライマー、プライマー2と3は3'-末端領域に相当しアンチセンスプライマーである。 プライマー4はダイズ由来ラフィノース合成酵素遺伝子のcDNA断片の5'-末端領域に相当するセンスプライマー、プライマー5と6は3'-末端領域に相当しアンチセンスプライマーである。 目的に応じて適当にこの塩基配列の5'-末端に適当な制限酵素の認識配列を加えることができる。 １０． リスト２：リスト２に示される配列は、ラフィノース合成酵素遺伝子のcDNAのラフィノース合成酵素蛋白質のアミノ酸配列をコードしているオープンリーディングフレームの増幅に用いられるプライマーの塩基配列の一例を示す。 プライマー1と2はソラマメ由来ラフィノース合成酵素蛋白質のN末端領域に相当するセンスプライマー、プライマー3と4はソラマメ由来ラフィノース合成酵素蛋白質のC末端領域に相当するアンチセンスプライマーである。 プライマー5と6はダイズ由来ラフィノース合成酵素蛋白質のN末端領域に相当するセンスプライマー、プライマー7と8はダイズ由来ラフィノース合成酵素蛋白質のC末端領域に相当するアンチセンスプライマーである。 目的に応じて適当にこの配列の5'-末端に適当な制限酵素の認識配列を加えることができる。 １１． リスト３：リスト３に示されるアミノ酸配列は、
ラフィノース合成酵素蛋白質の部分アミノ酸配列を示す。 #1は配列番号1において110番目から129番目までのアミノ酸配列に相当する。 #2は配列番号1において234番目から247番目までのアミノ酸配列に相当する。 #3は配列番号1において265番目から279番目までのアミノ酸配列に相当する。 #4は配列番号1において296番目から312
番目までのアミノ酸配列に相当する。 #5は配列番号1において346番目から361番目までのアミノ酸配列に相当する。 #6は配列番号1において383番目から402番目までのアミノ酸配列に相当する。 #7は配列番号1において411番目から433番目までのアミノ酸配列に相当する。 #8は配列番号1において440番目から453番目までのアミノ酸配列に相当する。 #9は配列番号1において457番目から468
番目までのアミノ酸配列に相当する。 #10は配列番号1において471番目から516番目までのアミノ酸配列に相当する。 #11は配列番号1において517番目から559番目までのアミノ酸配列に相当する。 #12は配列番号1において574
番目から582番目までのアミノ酸配列に相当する。 #13は配列番号1において586番目から609番目までのアミノ酸配列に相当する。 #14は配列番号1において615番目から6
27番目までのアミノ酸配列に相当する。 #15は配列番号1
において716番目から724番目までのアミノ酸配列に相当する。 １２． リスト４：リスト４に示される配列は、リスト３
に示されたアミノ酸配列の一部に基づいて合成されたプライマーの一例を示す。 プライマー番号の後のFはこのプライマーがセンスの配列であることを、RVはこのプライマーがアンチセンスの配列であることを示す。 プライマー1は配列番号1で119番目のアミノ酸から129番目のアミノ酸配列に相当する。 プライマー2は配列番号1で234
番目のアミノ酸から247番目のアミノ酸配列に相当する。 プライマー3は配列番号1で265番目のアミノ酸から2
79番目のアミノ酸配列に相当する。 プライマー4は配列番号1で458番目のアミノ酸から468番目のアミノ酸配列に相当する。 プライマー5は配列番号1で522番目のアミノ酸から534番目のアミノ酸配列に相当する。 プライマー6は配列番号1で716番目のアミノ酸から724番目のアミノ酸配列に相当する。 １３． リスト５：リスト５に示される塩基配列は、精製されたソラマメのラフィノース合成酵素蛋白質の部分アミノ酸配列に基づいて合成されたプライマーである。 括弧内で示した塩基はその塩基の混合物を合成に用いたことを示す。 プライマー番号の後のRVはこのプライマーがアンチセンスの配列であることを示す。 １４． リスト６：リスト６に示される配列は、ソラマメのラフィノース合成酵素遺伝子のcDNA塩基配列の両端を
RACE法で解析する際に用いたプライマーの塩基配列を示す。 プライマー番号の後のRVはこのプライマーがアンチセンスの配列であることを示す。 １５． リスト７：リスト７に示される配列は、ソラマメのラフィノース合成酵素遺伝子のクローニングの際に用いたプライマーの塩基配列を示す。 RS-NはオープンリーディングフレームのN末端領域に相当し、BamHIとNcoIの制限酵素認識部位を5'-末端側に含む。 RS-CはオープンリーディングフレームのC末端領域に相当するアンチセンスのプライマーで、XbaIの制限酵素認識部位を5'-末端側に含む。 １６． リスト８：リスト８に示される配列は、ダイズのラフィノース合成酵素遺伝子断片のクローニングに用いたプライマーの塩基配列を示す。 Iで示した塩基はイノシンを合成に用いたことを示す。 プライマー番号の後の
RVはこのプライマーがアンチセンスの配列であることを示す。 １７． リスト９：リスト９に示される配列は、ダイズのラフィノース合成酵素遺伝子断片のcDNA塩基配列の解析の際に用いたプライマーの塩基配列を示す。 プライマー番号の後のRVはこのプライマーがアンチセンスの配列であることを示す。 SN-1とSC-3RVを用いたPCRにより遺伝子内部の塩基配列の解析を行った。 SC-5とSC-6は3'-末端領域、SN-3RVとSN-4RVは5'-末端領域の塩基配列の解析に用いた。 １８． リスト１０：リスト１０に示される配列は、チョロギのラフィノース合成酵素遺伝子断片のcDNA塩基配列の解析の際に用いたプライマーの塩基配列を示す。 Iで示した塩基はイノシンを合成に用いたことを示す。 プライマー番号の後のRVはこのプライマーがアンチセンスの配列であることを示す。 それぞれ1-Fと4-RV、2-Fと6-RV
の組み合わせでPCRを行った。 １９． リスト１１：リスト１１に示される配列は、トウモロコシのラフィノース合成酵素遺伝子断片のcDNA塩基配列の解析の際に用いたプライマーの塩基配列を示す。
Iで示した塩基はイノシンを合成に用いたことを示す。
プライマー番号の後のRVはこのプライマーがアンチセンスの配列であることを示す。 ２０． リスト１２：リスト１２に示される配列は、トウモロコシのラフィノース合成酵素遺伝子断片のcDNA塩基配列の解析の際に用いたプライマーの塩基配列を示す。
M-10とM-11は3'-末端領域の塩基配列の解析に用いた。 ２１． リスト１３：リスト１３に示される配列は、アンチセンス実験用のベクターの構築に用いたアダプターの塩基配列を示す。 これらの合成DNAは相補鎖のため、混合することで二本鎖となる。 このアダプターは両端に制限酵素BamHIとSacIの切断部位の付着末端を持ち、二本鎖領域にBamHIとSacIの認識部位を持つ。 ２２． リスト１４：リスト９に示される配列は、組換え体植物の染色体への遺伝子導入を確認するPCR実験で用いたプライマーの塩基配列を示す。 35Sは35Sプロモーター部位の下流向きのプライマー、NOSはNOSのターミネーター部位の上流向きのプライマーである。 RS-Fはソラマメラフィノースシンターゼ遺伝子のセンス、RS-RVはアンチセンスのプライマーである。

【００５７】

【発明の効果】本発明により、ラフィノース合成酵素遺伝子等を提供することが可能となった。

【００５８】

【配列表】配列番号：1 配列の長さ:799 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名:ソラマメ(Vicia faba) 品種名:仁徳一寸 組織の種類:種子 配列 Met Ala Pro Pro Ser Ile Thr Lys Thr Ala Thr Leu Gln Asp Val Ile 1 5 10 15 Ser Thr Ile Asp Ile Gly Asn Gly Asn Ser Pro Leu Phe Ser Ile Thr 20 25 30 Leu Asp Gln Ser Arg Asp Phe Leu Ala Asn Gly His Pro Phe Leu Thr 35 40 45 Gln Val Pro Pro Asn Ile Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala Ser Ser 50 55 60 Phe Leu Asn Leu Lys Ser Asn Lys Asp Thr Ile Pro Asn Asn Asn Asn 65 70 75 80 Thr Met Leu Leu Gln Gln Gly Cys Phe Val Gly Phe Asn Ser Thr Glu 85 90 95 Pro Lys Ser His His Val Val Pro Leu Gly Lys Leu Lys Gly Ile Lys 100 105 110 Phe Met Ser Ile Phe Arg Phe Lys Val Trp Trp Thr Thr His Trp Val 115 120 125 Gly Thr Asn Gly Gln Glu Leu Gln His Glu Thr Gln Met Leu Ile Leu 130 135 140 Asp Lys Asn Asp Ser Leu Gly Arg Pro Tyr Val Leu Leu Leu Pro Ile 145 150 155 160 Leu Glu Asn Thr Phe Arg Thr Ser Leu Gln Pro Gly Leu Asn Asp His 165 170 175 Ile Gly Met Ser Val Glu Ser Gly Ser Thr His Val Thr Gly Ser Ser 180 185 190 Phe Lys Ala Cys Leu Tyr Ile His Leu Ser Asn Asp Pro Tyr Ser Ile 195 200 205 Leu Lys Glu Ala Val Lys Val Ile Gln Thr Gln Leu Gly Thr Phe Lys 210 215 220 Thr Leu Glu Glu Lys Thr Ala Pro Ser Ile Ile Asp Lys Phe Gly Trp 225 230 235 240 Cys Thr Trp Asp Ala Phe Tyr Leu Lys Val His Pro Lys Gly Val Trp 245 250 255 Glu Gly Val Lys Ser Leu Thr Asp Gly Gly Cys Pro Pro Gly Phe Val 260 265 270 Ile Ile Asp Asp Gly Trp Gln Ser Ile Cys His Asp Asp Asp Asp Glu 275 280 285 Asp Asp Ser Gly Met Asn Arg Thr Ser Ala Gly Glu Gln Met Pro Cys 290 295 300 Arg Leu Val Lys Tyr Glu Glu Asn Ser Lys Phe Arg Glu Tyr Glu Asn 305 310 315 Pro Glu Asn Gly Gly Lys Lys Gly Leu Gly Gly Phe Val Arg Asp Leu 320 325 330 335 Lys Glu Glu Phe Gly Ser Val Glu Ser Val Tyr Val Trp His Ala Leu 340 345 350 Cys Gly Tyr Trp Gly Gly Val Arg Pro Gly Val His Gly Met Pro Lys 355 360 365 Ala Arg Val Val Val Pro Lys Val Ser Gln Gly Leu Lys Met Thr Met 370 375 380 Glu Asp Leu Ala Val Asp Lys Ile Val Glu Asn Gly Val Gly Leu Val 385 390 395 400 Pro Pro Asp Phe Ala His Glu Met Phe Asp Gly Leu His Ser His Leu 405 410 415 Glu Ser Ala Gly Ile Asp Gly Val Lys Val Asp Val Ile His Leu Leu 420 425 430 Glu Leu Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Gly Arg Val Glu Leu Ala Arg Ala 435 440 445 Tyr Tyr Lys Ala Leu Thr Ser Ser Val Lys Lys His Phe Lys Gly Asn 450 455 460 Gly Val Ile Ala Ser Met Glu His Cys Asn Asp Phe Phe Leu Leu Gly 465 470 475 480 Thr Glu Ala Ile Ser Leu Gly Arg Val Gly Asp Asp Phe Trp Cys Ser 485 490 495 Asp Pro Ser Gly Asp Pro Asn Gly Thr Tyr Trp Leu Gln Gly Cys His 500 505 510 Met Val His Cys Ala Tyr Asn Ser Leu Trp Met Gly Asn Phe Ile Gln 515 520 525 Pro Asp Trp Asp Met Phe Gln Ser Thr His Pro Cys Ala Glu Phe His 530 535 540 Ala Ala Ser Arg Ala Ile Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Val Ser Asp Cys 545 550 555 560 Val Gly Asn His Asn Phe Lys Leu Leu Lys Ser Leu Val Leu Pro Asp 565 570 575 Gly Ser Ile Leu Arg Cys Gln His Tyr Ala Leu Pro Thr Arg Asp Cys 580 585 590 Leu Phe Glu Asp Pro Leu His Asn Gly Lys Thr Met Leu Lys Ile Trp 595 600 605 Asn Leu Asn Lys Tyr Thr Gly Val Leu Gly Leu Phe Asn Cys Gln Gly 610 615 620 Gly Gly Trp Cys Pro Glu Ala Arg Arg Asn Lys Ser Val Ser Glu Phe 625 630 635 640 Ser Arg Ala Val Thr Cys Tyr Ala Ser Pro Glu Asp Ile Glu Trp Cys 645 650 655 Asn Gly Lys Thr Pro Met Ser Thr Lys Gly Val Asp Phe Phe Ala Val 660 665 670 Tyr Phe Phe Lys Glu Lys Lys Leu Arg Leu Met Lys Cys Ser Asp Arg 675 680 685 Leu Lys Val Ser Leu Glu Pro Phe Ser Phe Glu Leu Met Thr Val Ser 690 695 700 Pro Val Lys Val Phe Ser Lys Arg Phe Ile Gln Phe Ala Pro Ile Gly 705 710 715 720 Leu Val Asn Met Leu Asn Ser Gly Gly Ala Ile Gln Ser Leu Glu Phe 725 730 735 Asp Asp Asn Ala Ser Leu Val Lys Ile Gly Val Arg Gly Cys Gly Glu 740 745 750 Met Ser Val Phe Ala Ser Glu Lys Pro Val Cys Cys Lys Ile Asp Gly 755 760 765 Val Lys Val Lys Phe Leu Tyr Glu Asp Lys Met Ala Arg Val Gln Ile 770 775 780 Leu Trp Pro Ser Ser Ser Thr Leu Ser Leu Val Gln Phe Leu Phe 785 790 795 799

【００５９】配列番号：２ 配列の長さ:2746 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名:ソラマメ(Vicia faba) 品種名:仁徳一寸 組織の種類:種子 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：101..2500 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AATTTTCAAG CATAGCCAAG TTAACCACCT TAGAAACATT CCTACAAGCT ACTTATCCCT 60 GTCAATAAGC TACTAAGCTA CCAGAGTCTC ATCAATCACC ATG GCA CCA CCA AGC 115 Met Ala Pro Pro Ser 5 ATA ACC AAA ACT GCA ACC CTC CAA GAC GTA ATA AGC ACC ATC GAT ATT 163 Ile Thr Lys Thr Ala Thr Leu Gln Asp Val Ile Ser Thr Ile Asp Ile 10 15 20 GGT AAT GGT AAC TCA CCC TTA TTC TCC ATA ACC TTA GAC CAA TCA CGT 211 Gly Asn Gly Asn Ser Pro Leu Phe Ser Ile Thr Leu Asp Gln Ser Arg 25 30 35 GAC TTC CTT GCA AAT GGC CAC CCT TTC CTC ACC CAA GTC CCA CCT AAC 259 Asp Phe Leu Ala Asn Gly His Pro Phe Leu Thr Gln Val Pro Pro Asn 40 45 50 ATA ACA ACA ACA ACA ACA ACC ACT GCT TCC TCT TTT CTC AAT CTC AAA 307 Ile Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala Ser Ser Phe Leu Asn Leu Lys 55 60 65 TCC AAC AAA GAT ACC ATT CCC AAC AAC AAC AAC ACC ATG TTG TTG CAA 355 Ser Asn Lys Asp Thr Ile Pro Asn Asn Asn Asn Thr Met Leu Leu Gln 70 75 80 85 CAA GGT TGT TTC GTT GGT TTC AAC TCC ACC GAA CCC AAA AGC CAC CAC 403 Gln Gly Cys Phe Val Gly Phe Asn Ser Thr Glu Pro Lys Ser His His 90 95 100 GTA GTT CCA CTC GGC AAA CTA AAA GGA ATC AAA TTC ATG AGC ATA TTC 451 Val Val Pro Leu Gly Lys Leu Lys Gly Ile Lys Phe Met Ser Ile Phe 105 110 115 CGG TTC AAA GTT TGG TGG ACA ACT CAC TGG GTC GGA ACA AAT GGA CAG 499 Arg Phe Lys Val Trp Trp Thr Thr His Trp Val Gly Thr Asn Gly Gln 120 125 130 GAA CTA CAA CAC GAA ACA CAA ATG TTA ATC CTG GAC AAA AAC GAC TCC 547 Glu Leu Gln His Glu Thr Gln Met Leu Ile Leu Asp Lys Asn Asp Ser 135 140 145 CTC GGA CGA CCC TAT GTC TTA CTC CTC CCA ATC CTA GAA AAC ACC TTC 595 Leu Gly Arg Pro Tyr Val Leu Leu Leu Pro Ile Leu Glu Asn Thr Phe 150 155 160 165 CGA ACC TCA CTC CAA CCC GGT CTC AAC GAT CAC ATA GGC ATG TCC GTC 643 Arg Thr Ser Leu Gln Pro Gly Leu Asn Asp His Ile Gly Met Ser Val 170 175 180 GAA AGC GGT TCA ACA CAT GTC ACC GGG TCA AGC TTC AAA GCA TGT CTT 691 Glu Ser Gly Ser Thr His Val Thr Gly Ser Ser Phe Lys Ala Cys Leu 185 190 195 TAC ATC CAT CTC AGT AAC GAC CCA TAC AGT ATA CTA AAA GAA GCA GTT 739 Tyr Ile His Leu Ser Asn Asp Pro Tyr Ser Ile Leu Lys Glu Ala Val 200 205 210 AAA GTA ATC CAA ACT CAG TTA GGA ACA TTC AAG ACT CTT GAA GAA AAA 787 Lys Val Ile Gln Thr Gln Leu Gly Thr Phe Lys Thr Leu Glu Glu Lys 215 220 225 ACA GCA CCT AGT ATT ATA GAC AAA TTC GGT TGG TGC ACG TGG GAT GCT 835 Thr Ala Pro Ser Ile Ile Asp Lys Phe Gly Trp Cys Thr Trp Asp Ala 230 235 240 245 TTT TAC TTG AAG GTT CAT CCA AAA GGT GTA TGG GAA GGT GTA AAG TCT 883 Phe Tyr Leu Lys Val His Pro Lys Gly Val Trp Glu Gly Val Lys Ser 250 255 260 CTC ACA GAT GGT GGT TGT CCT CCC GGT TTC GTC ATA ATC GAC GAC GGT 931 Leu Thr Asp Gly Gly Cys Pro Pro Gly Phe Val Ile Ile Asp Asp Gly 265 270 275 TGG CAA TCC ATT TGT CAT GAC GAT GAC GAT GAA GAT GAT TCA GGA ATG 979 Trp Gln Ser Ile Cys His Asp Asp Asp Asp Glu Asp Asp Ser Gly Met 280 285 290 AAC CGA ACC TCA GCC GGG GAA CAA ATG CCA TGC AGA CTT GTA AAA TAC 1027 Asn Arg Thr Ser Ala Gly Glu Gln Met Pro Cys Arg Leu Val Lys Tyr 295 300 305 GAA GAG AAT TCT AAG TTT AGA GAA TAT GAG AAT CCT GAA AAT GGA GGG 1075 Glu Glu Asn Ser Lys Phe Arg Glu Tyr Glu Asn Pro Glu Asn Gly Gly 310 315 320 325 AAG AAA GGT TTG GGT GGT TTT GTG AGG GAT TTG AAG GAA GAG TTT GGG 1123 Lys Lys Gly Leu Gly Gly Phe Val Arg Asp Leu Lys Glu Glu Phe Gly 330 335 340 AGT GTG GAG AGT GTT TAT GTT TGG CAT GCG CTT TGT GGG TAT TGG GGC 1171 Ser Val Glu Ser Val Tyr Val Trp His Ala Leu Cys Gly Tyr Trp Gly 345 350 355 GGG GTT AGG CCT GGA GTG CAT GGG ATG CCG AAA GCT AGG GTT GTT GTT 1219 Gly Val Arg Pro Gly Val His Gly Met Pro Lys Ala Arg Val Val Val 360 365 370 CCG AAG GTG TCT CAG GGG TTG AAG ATG ACG ATG GAG GAT TTG GCG GTG 1267 Pro Lys Val Ser Gln Gly Leu Lys Met Thr Met Glu Asp Leu Ala Val 375 380 385 GAT AAG ATT GTT GAG AAC GGT GTG GGG CTA GTG CCG CCA GAT TTT GCA 1315 Asp Lys Ile Val Glu Asn Gly Val Gly Leu Val Pro Pro Asp Phe Ala 390 395 400 405 CAT GAG ATG TTT GAT GGG CTT CAC TCT CAT TTG GAG TCG GCG GGA ATT 1363 His Glu Met Phe Asp Gly Leu His Ser His Leu Glu Ser Ala Gly Ile 410 415 420 GAC GGT GTT AAA GTT GAT GTT ATC CAT CTG CTT GAG TTA CTA TCA GAG 1411 Asp Gly Val Lys Val Asp Val Ile His Leu Leu Glu Leu Leu Ser Glu 425 430 435 GAA TAT GGT GGA CGA GTT GAG CTA GCA AGA GCT TAT TAC AAA GCA CTA 1459 Glu Tyr Gly Gly Arg Val Glu Leu Ala Arg Ala Tyr Tyr Lys Ala Leu 440 445 450 ACC TCA TCA GTG AAG AAA CAT TTC AAA GGC AAT GGT GTA ATT GCT AGC 1507 Thr Ser Ser Val Lys Lys His Phe Lys Gly Asn Gly Val Ile Ala Ser 455 460 465 ATG GAG CAT TGC AAC GAC TTC TTT CTC CTC GGC ACC GAA GCC ATA TCC 1555 Met Glu His Cys Asn Asp Phe Phe Leu Leu Gly Thr Glu Ala Ile Ser 470 475 480 485 CTC GGC CGC GTC GGA GAT GAT TTT TGG TGC TCT GAT CCA TCT GGT GAT 1603 Leu Gly Arg Val Gly Asp Asp Phe Trp Cys Ser Asp Pro Ser Gly Asp 490 495 500 CCA AAT GGT ACA TAT TGG CTC CAA GGT TGT CAC ATG GTA CAT TGT GCC 1651 Pro Asn Gly Thr Tyr Trp Leu Gln Gly Cys His Met Val His Cys Ala 505 510 515 TAC AAC AGT TTA TGG ATG GGA AAT TTC ATT CAG CCA GAT TGG GAC ATG 1699 Tyr Asn Ser Leu Trp Met Gly Asn Phe Ile Gln Pro Asp Trp Asp Met 520 525 530 TTT CAG TCC ACT CAT CCT TGT GCT GAA TTT CAT GCC GCC TCA CGA GCC 1747 Phe Gln Ser Thr His Pro Cys Ala Glu Phe His Ala Ala Ser Arg Ala 535 540 545 ATA TCC GGC GGA CCA ATT TAT GTT AGT GAT TGT GTT GGT AAT CAC AAT 1795 Ile Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Val Ser Asp Cys Val Gly Asn His Asn 550 555 560 565 TTC AAG TTG CTC AAA TCT CTT GTT TTG CCC GAT GGT TCT ATC TTG CGT 1843 Phe Lys Leu Leu Lys Ser Leu Val Leu Pro Asp Gly Ser Ile Leu Arg 570 575 580 TGT CAA CAT TAC GCA CTC CCT ACA AGA GAT TGC TTG TTT GAA GAC CCT 1891 Cys Gln His Tyr Ala Leu Pro Thr Arg Asp Cys Leu Phe Glu Asp Pro 585 590 595 TTG CAT AAT GGC AAA ACA ATG CTG AAA ATT TGG AAT CTC AAC AAA TAT 1939 Leu His Asn Gly Lys Thr Met Leu Lys Ile Trp Asn Leu Asn Lys Tyr 600 605 610 ACA GGT GTT TTG GGT CTT TTC AAC TGC CAA GGT GGT GGG TGG TGT CCT 1987 Thr Gly Val Leu Gly Leu Phe Asn Cys Gln Gly Gly Gly Trp Cys Pro 615 620 625 GAG GCA CGG CGA AAC AAG AGT GTA TCT GAA TTT TCA CGC GCG GTG ACA 2035 Glu Ala Arg Arg Asn Lys Ser Val Ser Glu Phe Ser Arg Ala Val Thr 630 635 640 645 TGT TAT GCA AGT CCC GAA GAC ATT GAA TGG TGC AAT GGG AAA ACT CCA 2083 Cys Tyr Ala Ser Pro Glu Asp Ile Glu Trp Cys Asn Gly Lys Thr Pro 650 655 660 ATG AGC ACC AAA GGT GTG GAT TTT TTT GCT GTG TAT TTT TTC AAG GAG 2131 Met Ser Thr Lys Gly Val Asp Phe Phe Ala Val Tyr Phe Phe Lys Glu 665 670 675 AAG AAA TTG AGG CTC ATG AAG TGT TCT GAT AGA TTG AAA GTT TCG CTT 2179 Lys Lys Leu Arg Leu Met Lys Cys Ser Asp Arg Leu Lys Val Ser Leu 680 685 690 GAG CCA TTT AGT TTT GAG CTA ATG ACA GTG TCT CCA GTG AAA GTG TTT 2227 Glu Pro Phe Ser Phe Glu Leu Met Thr Val Ser Pro Val Lys Val Phe 695 700 705 TCG AAA AGG TTT ATA CAG TTT GCA CCG ATT GGG TTA GTG AAC ATG CTG 2275 Ser Lys Arg Phe Ile Gln Phe Ala Pro Ile Gly Leu Val Asn Met Leu 710 715 720 725 AAC TCT GGT GGT GCG ATT CAG TCT CTG GAG TTT GAT GAT AAT GCA AGT 2323 Asn Ser Gly Gly Ala Ile Gln Ser Leu Glu Phe Asp Asp Asn Ala Ser 730 735 740 TTG GTC AAG ATT GGG GTG AGA GGT TGC GGG GAG ATG AGC GTG TTT GCG 2371 Leu Val Lys Ile Gly Val Arg Gly Cys Gly Glu Met Ser Val Phe Ala 745 750 755 TCT GAG AAA CCG GTT TGC TGC AAA ATT GAT GGG GTT AAG GTG AAA TTT 2419 Ser Glu Lys Pro Val Cys Cys Lys Ile Asp Gly Val Lys Val Lys Phe 760 765 770 CTT TAT GAG GAC AAA ATG GCA AGA GTT CAA ATT CTG TGG CCT AGT TCT 2467 Leu Tyr Glu Asp Lys Met Ala Arg Val Gln Ile Leu Trp Pro Ser Ser 775 780 785 TCA ACA TTG TCT TTG GTC CAG TTT TTA TTT TGA TCCCTAGGAA TCCTATGCAC 2520 Ser Thr Leu Ser Leu Val Gln Phe Leu Phe 790 795 799 GTGTCTCTGT TTACAAGTAC TTTATATAAG TATAATATGT ATCTATTTCC ATTTTTAACT 2580 GTCTTTATGC AATTAGGTGG TCAATTAGTT ATTTGTTTGT GAAGTAACTA ACTTGCTTGT 2640 GTTGTAAGCT TATAATATAT GGTCAAGTTC CTCACTTGTA TATACCTGTT GTATGTATAA 2700 ATTTTACTAT ATATGACTAA CATCATTATC TTGTGAGCAA AAAAAA 2746

【００６０】配列番号：3 配列の長さ:781 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名:ダイズ(Glycine max) 品種名:Williams82 組織の種類:種子および葉 配列 Met Ala Pro Ser Ile Ser Lys Thr Val Glu Leu Asn Ser Phe Gly Leu 5 10 15 Val Asn Gly Asn Leu Pro Leu Ser Ile Thr Leu Glu Gly Ser Asn Phe 20 25 30 Leu Ala Asn Gly His Pro Phe Leu Thr Glu Val Pro Glu Asn Ile Ile 35 40 45 Val Thr Pro Ser Pro Ile Asp Ala Lys Ser Ser Lys Asn Asn Glu Asp 50 55 60 Asp Asp Val Val Gly Cys Phe Val Gly Phe His Ala Asp Glu Pro Arg 65 70 75 80 Ser Arg His Val Ala Ser Leu Gly Lys Leu Arg Gly Ile Lys Phe Met 85 90 95 Ser Ile Phe Arg Phe Lys Val Trp Trp Thr Thr His Trp Val Gly Ser 100 105 110 Asn Gly His Glu Leu Glu His Glu Thr Gln Met Met Leu Leu Asp Lys 115 120 125 Asn Asp Gln Leu Gly Arg Pro Phe Val Leu Ile Leu Pro Ile Leu Gln 130 135 140 Ala Ser Phe Arg Ala Ser Leu Gln Pro Gly Leu Asp Asp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Val Cys Met Glu Ser Gly Ser Thr Arg Val Cys Gly Ser Ser Phe Gly 165 170 175 Ser Cys Leu Tyr Val His Val Gly His Asp Pro Tyr Gln Leu Leu Arg 180 185 190 Glu Ala Thr Lys Val Val Arg Met His Leu Gly Thr Phe Lys Leu Leu 195 200 205 Glu Glu Lys Thr Ala Pro Val Ile Ile Asp Lys Phe Gly Trp Cys Thr 210 215 220 Trp Asp Ala Phe Tyr Leu Lys Val His Pro Ser Gly Val Trp Glu Gly 225 230 235 240 Val Lys Gly Leu Val Glu Gly Gly Cys Pro Pro Gly Met Val Leu Ile 245 250 255 Asp Asp Gly Trp Gln Ala Ile Cys His Asp Glu Asp Pro Ile Thr Asp 260 265 270 Gln Glu Gly Met Lys Arg Thr Ser Ala Gly Glu Gln Met Pro Cys Arg 275 280 285 Leu Val Lys Leu Glu Glu Asn Tyr Lys Phe Arg Gln Tyr Cys Ser Gly 290 295 300 Lys Asp Ser Glu Lys Gly Met Gly Ala Phe Val Arg Asp Leu Lys Glu 305 310 315 320 Gln Phe Arg Ser Val Glu Gln Val Tyr Val Trp His Ala Leu Cys Gly 325 330 335 Tyr Trp Gly Gly Val Arg Pro Lys Val Pro Gly Met Pro Gln Ala Lys 340 345 350 Val Val Thr Pro Lys Leu Ser Asn Gly Leu Lys Leu Thr Met Lys Asp 355 360 365 Leu Ala Val Asp Lys Ile Val Ser Asn Gly Val Gly Leu Val Pro Pro 370 375 380 His Leu Ala His Leu Leu Tyr Glu Gly Leu His Ser Arg Leu Glu Ser 385 390 395 400 Ala Gly Ile Asp Gly Val Lys Val Asp Val Ile His Leu Leu Glu Met 405 410 415 Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Gly Arg Val Glu Leu Ala Lys Ala Tyr Tyr 420 425 430 Lys Ala Leu Thr Ala Ser Val Lys Lys His Phe Lys Gly Asn Gly Val 435 440 445 Ile Ala Ser Met Glu His Cys Asn Asp Phe Phe Leu Leu Gly Thr Glu 450 455 460 Ala Ile Ala Leu Gly Arg Val Gly Asp Asp Phe Trp Cys Thr Asp Pro 465 470 475 480 Ser Gly Asp Pro Asn Gly Thr Tyr Trp Leu Gln Gly Cys His Met Val 485 490 495 His Cys Ala Tyr Asn Ser Leu Trp Met Gly Asn Phe Ile Gln Pro Asp 500 505 510 Trp Asp Met Phe Gln Ser Thr His Pro Cys Ala Glu Phe His Ala Ala 515 520 525 Ser Arg Ala Ile Ser Gly Gly Pro Val Tyr Val Ser Asp Cys Val Gly 530 535 540 Lys His Asn Phe Lys Leu Leu Lys Ser Leu Ala Leu Pro Asp Gly Thr 545 550 555 560 Ile Leu Arg Cys Gln His Tyr Ala Leu Pro Thr Arg Asp Cys Leu Phe 565 570 575 Glu Asp Pro Leu His Asp Gly Lys Thr Met Leu Lys Ile Trp Asn Leu 580 585 590 Asn Lys Tyr Thr Gly Val Leu Gly Leu Phe Asn Cys Gln Gly Gly Gly 595 600 605 Trp Cys Pro Val Thr Arg Arg Asn Lys Ser Ala Ser Glu Phe Ser Gln 610 615 620 Thr Val Thr Cys Leu Ala Ser Pro Gln Asp Ile Glu Trp Ser Asn Gly 625 630 635 640 Lys Ser Pro Ile Cys Ile Lys Gly Met Asn Val Phe Ala Val Tyr Leu 645 650 655 Phe Lys Asp His Lys Leu Lys Leu Met Lys Ala Ser Glu Lys Leu Glu 660 665 670 Val Ser Leu Glu Pro Phe Thr Phe Glu Leu Leu Thr Val Ser Pro Val 675 680 685 Ile Val Leu Ser Lys Lys Leu Ile Gln Phe Ala Pro Ile Gly Leu Val 690 695 700 Asn Met Leu Asn Thr Gly Gly Ala Ile Gln Ser Met Glu Phe Asp Asn 705 710 715 720 His Ile Asp Val Val Lys Ile Gly Val Arg Gly Cys Gly Glu Met Lys 725 730 735 Val Phe Ala Ser Glu Lys Pro Val Ser Cys Lys Leu Asp Gly Val Val 740 745 750 Val Lys Phe Asp Tyr Glu Asp Lys Met Leu Arg Val Gln Val Pro Trp 755 760 765 Pro Ser Ala Ser Lys Leu Ser Met Val Glu Phe Leu Phe 770 775 780 781

【００６１】配列番号：4 配列の長さ:2498 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名:ダイズ(Glycine max) 品種名:Williams82 組織の種類:種子および葉 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：62..2407 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CCAAACCATA GCAAACCTAA GCACCAAACC TCTTTCTTTC AAGATCCTTG AATTCAGTCC 60 C ATG GCT CCA AGC ATA AGC AAA ACT GTG GAA CTA AAT TCA TTT GGT 106 Met Ala Pro Ser Ile Ser Lys Thr Val Glu Leu Asn Ser Phe Gly 5 10 15 CTT GTC AAC GGT AAT TTG CCT TTG TCC ATA ACC CTA GAA GGA TCA AAT 154 Leu Val Asn Gly Asn Leu Pro Leu Ser Ile Thr Leu Glu Gly Ser Asn 20 25 30 TTC CTC GCC AAC GGC CAC CCT TTT CTC ACG GAA GTT CCC GAA AAC ATA 202 Phe Leu Ala Asn Gly His Pro Phe Leu Thr Glu Val Pro Glu Asn Ile 35 40 45 ATA GTC ACC CCT TCA CCC ATC GAC GCC AAG AGT AGT AAG AAC AAC GAG 250 Ile Val Thr Pro Ser Pro Ile Asp Ala Lys Ser Ser Lys Asn Asn Glu 50 55 60 GAC GAC GAC GTC GTA GGT TGC TTC GTG GGC TTC CAC GCG GAC GAG CCC 298 Asp Asp Asp Val Val Gly Cys Phe Val Gly Phe His Ala Asp Glu Pro 65 70 75 AGA AGC CGA CAC GTG GCT TCC CTG GGG AAG CTC AGA GGA ATA AAA TTC 346 Arg Ser Arg His Val Ala Ser Leu Gly Lys Leu Arg Gly Ile Lys Phe 80 85 90 95 ATG AGC ATA TTC CGG TTT AAG GTG TGG TGG ACC ACT CAC TGG GTC GGT 394 Met Ser Ile Phe Arg Phe Lys Val Trp Trp Thr Thr His Trp Val Gly 100 105 110 AGC AAC GGA CAC GAA CTG GAG CAC GAG ACA CAG ATG ATG CTT CTC GAC 442 Ser Asn Gly His Glu Leu Glu His Glu Thr Gln Met Met Leu Leu Asp 115 120 125 AAA AAC GAC CAG CTC GGA CGC CCC TTT GTG TTG ATT CTC CCG ATC CTC 490 Lys Asn Asp Gln Leu Gly Arg Pro Phe Val Leu Ile Leu Pro Ile Leu 130 135 140 CAA GCC TCG TTC CGA GCC TCC CTG CAA CCC GGT TTG GAT GAT TAC GTG 538 Gln Ala Ser Phe Arg Ala Ser Leu Gln Pro Gly Leu Asp Asp Tyr Val 145 150 155 GAC GTT TGC ATG GAG AGC GGG TCG ACA CGT GTC TGT GGC TCC AGC TTC 586 Asp Val Cys Met Glu Ser Gly Ser Thr Arg Val Cys Gly Ser Ser Phe 160 165 170 175 GGG AGC TGC TTA TAC GTC CAC GTT GGC CAT GAC CCG TAT CAG TTG CTT 634 Gly Ser Cys Leu Tyr Val His Val Gly His Asp Pro Tyr Gln Leu Leu 180 185 190 AGA GAA GCA ACT AAA GTC GTT AGG ATG CAT TTG GGG ACG TTC AAG CTT 682 Arg Glu Ala Thr Lys Val Val Arg Met His Leu Gly Thr Phe Lys Leu 195 200 205 CTC GAG GAG AAA ACC GCG CCA GTG ATC ATA GAC AAG TTT GGT TGG TGT 730 Leu Glu Glu Lys Thr Ala Pro Val Ile Ile Asp Lys Phe Gly Trp Cys 210 215 220 ACA TGG GAC GCG TTT TAC TTG AAG GTG CAT CCC TCA GGT GTG TGG GAA 778 Thr Trp Asp Ala Phe Tyr Leu Lys Val His Pro Ser Gly Val Trp Glu 225 230 235 GGG GTG AAA GGG TTG GTG GAG GGA GGG TGC CCT CCA GGG ATG GTC CTA 826 Gly Val Lys Gly Leu Val Glu Gly Gly Cys Pro Pro Gly Met Val Leu 240 245 250 255 ATC GAC GAC GGG TGG CAA GCC ATT TGT CAC GAC GAG GAC CCC ATA ACG 874 Ile Asp Asp Gly Trp Gln Ala Ile Cys His Asp Glu Asp Pro Ile Thr 260 265 270 GAC CAA GAG GGT ATG AAG CGA ACC TCC GCA GGG GAG CAA ATG CCA TGC 922 Asp Gln Glu Gly Met Lys Arg Thr Ser Ala Gly Glu Gln Met Pro Cys 275 280 285 AGG TTG GTG AAG TTG GAG GAA AAT TAC AAG TTC AGA CAG TAT TGT AGT 970 Arg Leu Val Lys Leu Glu Glu Asn Tyr Lys Phe Arg Gln Tyr Cys Ser 290 295 300 GGA AAG GAT TCT GAG AAG GGT ATG GGT GCC TTT GTT AGG GAC TTG AAG 1018 Gly Lys Asp Ser Glu Lys Gly Met Gly Ala Phe Val Arg Asp Leu Lys 305 310 315 GAA CAG TTT AGG AGC GTG GAG CAG GTG TAT GTG TGG CAC GCG CTT TGT 1066 Glu Gln Phe Arg Ser Val Glu Gln Val Tyr Val Trp His Ala Leu Cys 320 325 330 335 GGG TAT TGG GGT GGG GTC AGA CCC AAG GTT CCG GGC ATG CCC CAG GCT 1114 Gly Tyr Trp Gly Gly Val Arg Pro Lys Val Pro Gly Met Pro Gln Ala 340 345 350 AAG GTT GTC ACT CCG AAG CTG TCC AAT GGA CTA AAA TTG ACA ATG AAG 1162 Lys Val Val Thr Pro Lys Leu Ser Asn Gly Leu Lys Leu Thr Met Lys 355 360 365 GAT TTA GCG GTG GAT AAG ATC GTC AGT AAC GGA GTT GGA CTG GTG CCA 1210 Asp Leu Ala Val Asp Lys Ile Val Ser Asn Gly Val Gly Leu Val Pro 370 375 380 CCA CAC CTG GCT CAC CTT TTG TAC GAG GGG CTC CAC TCC CGT TTG GAA 1258 Pro His Leu Ala His Leu Leu Tyr Glu Gly Leu His Ser Arg Leu Glu 385 390 395 TCT GCG GGT ATT GAC GGT GTT AAG GTT GAC GTT ATA CAC TTG CTC GAG 1306 Ser Ala Gly Ile Asp Gly Val Lys Val Asp Val Ile His Leu Leu Glu 400 405 410 415 ATG CTA TCC GAG GAA TAC GGT GGC CGT GTT GAG CTA GCC AAA GCT TAT 1354 Met Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Gly Arg Val Glu Leu Ala Lys Ala Tyr 420 425 430 TAC AAA GCG CTC ACT GCT TCG GTG AAG AAG CAT TTC AAA GGC AAT GGG 1402 Tyr Lys Ala Leu Thr Ala Ser Val Lys Lys His Phe Lys Gly Asn Gly 435 440 445 GTC ATT GCG AGC ATG GAG CAT TGT AAT GAC TTC TTT CTC CTT GGT ACC 1450 Val Ile Ala Ser Met Glu His Cys Asn Asp Phe Phe Leu Leu Gly Thr 450 455 460 GAA GCC ATA GCC CTT GGG CGC GTA GGA GAT GAT TTT TGG TGC ACT GAT 1498 Glu Ala Ile Ala Leu Gly Arg Val Gly Asp Asp Phe Trp Cys Thr Asp 465 470 475 CCC TCT GGA GAT CCA AAT GGC ACG TAT TGG CTC CAA GGG TGT CAC ATG 1546 Pro Ser Gly Asp Pro Asn Gly Thr Tyr Trp Leu Gln Gly Cys His Met 480 485 490 495 GTG CAC TGT GCC TAC AAC AGC TTG TGG ATG GGG AAT TTT ATT CAG CCG 1594 Val His Cys Ala Tyr Asn Ser Leu Trp Met Gly Asn Phe Ile Gln Pro 500 505 510 GAT TGG GAC ATG TTC CAG TCC ACT CAC CCT TGT GCC GAA TTC CAT GC 1642 Asp Trp Asp Met Phe Gln Ser Thr His Pro Cys Ala Glu Phe His Ala 515 520 525 GCC TCT AGG GCC ATC TCT GGT GGA CCA GTT TAC GTT AGT GAT TGT GTT 1690 Ala Ser Arg Ala Ile Ser Gly Gly Pro Val Tyr Val Ser Asp Cys Val 530 535 540 GGA AAG CAC AAC TTC AAG TTG CTC AAG AGC CTC GCT TTG CCT GAT GGG 1738 Gly Lys His Asn Phe Lys Leu Leu Lys Ser Leu Ala Leu Pro Asp Gly 545 550 555 ACG ATT TTG CGT TGT CAA CAC TAT GCA CTC CCC ACA CGA GAC TGT TTG 1786 Thr Ile Leu Arg Cys Gln His Tyr Ala Leu Pro Thr Arg Asp Cys Leu 560 565 570 575 TTT GAA GAC CCC TTG CAT GAT GGG AAG ACA ATG CTC AAA ATT TGG AAT 1834 Phe Glu Asp Pro Leu His Asp Gly Lys Thr Met Leu Lys Ile Trp Asn 580 585 590 CTC AAC AAA TAT ACA GGT GTT TTG GGT CTA TTT AAT TGC CAA GGA GGT 1882 Leu Asn Lys Tyr Thr Gly Val Leu Gly Leu Phe Asn Cys Gln Gly Gly 595 600 605 GGG TGG TGT CCC GTA ACT AGG AGA AAC AAG AGT GCC TCT GAA TTT TCA 1930 Gly Trp Cys Pro Val Thr Arg Arg Asn Lys Ser Ala Ser Glu Phe Ser 610 615 620 CAA ACT GTG ACA TGC TTA GCG AGT CCT CAA GAC ATT GAA TGG AGC AAT 1978 Gln Thr Val Thr Cys Leu Ala Ser Pro Gln Asp Ile Glu Trp Ser Asn 625 630 635 GGG AAA AGC CCA ATA TGC ATA AAA GGG ATG AAT GTG TTT GCT GTA TAT 2026 Gly Lys Ser Pro Ile Cys Ile Lys Gly Met Asn Val Phe Ala Val Tyr 640 645 650 655 TTG TTC AAG GAC CAC AAA CTA AAG CTC ATG AAG GCA TCA GAG AAA TTG 2074 Leu Phe Lys Asp His Lys Leu Lys Leu Met Lys Ala Ser Glu Lys Leu 660 665 670 GAA GTT TCA CTT GAG CCA TTT ACT TTT GAG CTA TTG ACA GTG TCT CCA 2122 Glu Val Ser Leu Glu Pro Phe Thr Phe Glu Leu Leu Thr Val Ser Pro 675 680 685 GTG ATT GTG CTG TCA AAA AAG TTA ATT CAA TTT GCT CCA ATT GGA TTA 2170 Val Ile Val Leu Ser Lys Lys Leu Ile Gln Phe Ala Pro Ile Gly Leu 690 695 700 GTG AAC ATG CTT AAC ACT GGT GGT GCC ATT CAG TCC ATG GAG TTT GAC 2218 Val Asn Met Leu Asn Thr Gly Gly Ala Ile Gln Ser Met Glu Phe Asp 705 710 715 AAC CAC ATA GAT GTG GTC AAA ATT GGG GTT AGG GGT TGT GGG GAG ATG 2266 Asn His Ile Asp Val Val Lys Ile Gly Val Arg Gly Cys Gly Glu Met 720 725 730 735 AAG GTG TTT GCA TCA GAG AAA CCA GTT AGT TGC AAA CTA GAT GGG GTA 2314 Lys Val Phe Ala Ser Glu Lys Pro Val Ser Cys Lys Leu Asp Gly Val 740 745 750 GTT GTA AAA TTT GAT TAT GAG GAT AAA ATG CTG AGA GTG CAA GTT CCC 2362 Val Val Lys Phe Asp Tyr Glu Asp Lys Met Leu Arg Val Gln Val Pro 755 760 765 TGG CCT AGT GCT TCA AAA TTG TCA ATG GTT GAG TTT TTA TTT TGA TCCCT 2412 Trp Pro Ser Ala Ser Lys Leu Ser Met Val Glu Phe Leu Phe 770 775 780 GAAGGTGAAT TTGGGATACT ATGATGTTTG ACTCTCTTTT TAAGTAATAA GAGTCATATT 2472 TTTCTGTTGT AAAAAAAAAA AAAAAA 2498

【００６２】配列番号：5 配列の長さ:587 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名:チョロギ(Stachys sieboldii) 品種名: 組織の種類:葉 配列 Thr Asn Gly Ser Asp Leu Glu Arg Glu Thr Gln Ile Val Val Leu Asp 1 5 10 15 Lys Ser Asp Asp Arg Pro Tyr Ile Val Leu Leu Pro Leu Ile Glu Gly 20 25 30 Gln Phe Arg Ala Ser Leu Gln Pro Gly Val Asp Asp Phe Ile Asp Ile 35 40 45 Cys Val Glu Ser Gly Ser Thr Lys Val Asn Glu Ser Ser Phe Arg Ala 50 55 60 Ser Leu Tyr Met His Ala Gly Asp Asp Pro Phe Thr Leu Val Lys Asp 65 70 75 80 Ala Val Lys Val Ala Arg His His Leu Gly Thr Phe Arg Leu Leu Glu 85 90 95 Glu Lys Thr Pro Pro Gly Ile Val Asp Lys Phe Gly Trp Cys Thr Trp 100 105 110 Asp Ala Phe Tyr Leu Asn Val Gln Pro His Gly Val Met Glu Gly Val 115 120 125 Gln Gly Leu Val Asp Gly Gly Cys Pro Pro Gly Leu Val Leu Ile Asp 130 135 140 Asp Gly Trp Gln Ser Ile Cys His Asp Asn Asp Ala Leu Thr Thr Glu 145 150 155 160 Gly Met Gly Arg Thr Ser Ala Gly Glu Gln Met Pro Cys Arg Leu Ile 165 170 175 Lys Phe Glu Glu Asn Tyr Lys Phe Arg Glu Tyr Glu Ser Pro Asn Lys 180 185 190 Thr Gly Pro Gly Pro Asn Thr Gly Met Gly Ala Phe Ile Arg Asp Met 195 200 205 Lys Asp Asn Phe Lys Ser Val Asp Tyr Val Tyr Val Trp His Ala Leu 210 215 220 Cys Gly Tyr Trp Gly Gly Leu Arg Pro Asn Val Pro Gly Leu Pro Glu 225 230 235 240 Ala Lys Leu Ile Glu Pro Lys Leu Thr Pro Gly Leu Lys Thr Thr Met 245 250 255 Glu Asp Leu Ala Val Asp Lys Ile Val Asn Asn Gly Val Gly Leu Val 260 265 270 Pro Pro Glu Phe Val Glu Gln Met Tyr Glu Gly Leu His Ser His Leu 275 280 285 Glu Ser Val Gly Ile Asp Gly Val Lys Val Asp Val Ile His Leu Leu 290 295 300 Glu Met Leu Cys Glu Asp Tyr Gly Gly Arg Val Asp Leu Ala Lys Ala 305 310 315 320 Tyr Tyr Lys Ala Leu Ser Ser Ser Val Asn Asn His Phe Asn Gly Asn 325 330 335 Gly Val Ile Ala Gly Leu Glu His Cys Asn Asp Phe Met Phe Leu Gly 340 345 350 Thr Glu Ala Ile Thr Leu Gly Arg Val Gly Asp Asp Phe Trp Cys Thr 355 360 365 Asp Pro Ser Gly Asp Pro Asn Gly Thr Phe Trp Leu Gln Gly Cys His 370 375 380 Met Val His Cys Ala Tyr Asn Ser Ile Trp Met Gly Asn Phe Ile His 385 390 395 400 Pro Asp Trp Asp Met Phe Gln Ser Thr His Pro Cys Ala Glu Phe His 405 410 415 Ala Ala Ser Arg Ala Ile Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Val Ser Asp Ser 420 425 430 Val Gly Lys His Asn Phe Glu Leu Leu Arg Ser Leu Val Leu Pro Asp 435 440 445 Gly Ser Ile Leu Arg Cys Asp Tyr Tyr Ala Leu Pro Thr Arg Asp Cys 450 455 460 Leu Phe Glu Asp Pro Leu His Asn Gly Lys Thr Met Leu Lys Ile Trp 465 470 475 480 Asn Tyr Asn Lys Phe Thr Gly Val Val Gly Thr Phe Asn Cys Gln Gly 485 490 495 Gly Gly Trp Ser Arg Glu Val Arg Arg Asn Gln Cys Ala Ala Glu Tyr 500 505 510 Ser His Ala Val Ser Ser Ser Ala Gly Pro Ser Asp Ile Glu Trp Lys 515 520 525 Gln Gly Thr Ser Pro Ile Asp Val Asp Gly Val Lys Thr Phe Ala Leu 530 535 540 Tyr Leu Phe His Glu Lys Lys Leu Val Leu Ser Lys Pro Ser Asp Lys 545 550 555 560 Ile Asp Ile Thr Leu Glu Pro Phe Asp Phe Glu Leu Ile Thr Val Ser 565 570 575 Pro Val Lys Thr Leu Ala Asn Cys Thr Val Gln 580 585

【００６３】配列番号：6 配列の長さ:1762 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名:チョロギ(Stachys sieboldii) 品種名: 組織の種類:葉 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：2..1762 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 G ACA AAC GGG TCG GAT CTT GAG CGG GAA ACT CAA ATA GTC GTG CTC 46 Thr Asn Gly Ser Asp Leu Glu Arg Glu Thr Gln Ile Val Val Leu 1 5 10 15 GAC AAG TCC GAC GAC AGG CCC TAC ATC GTG CTG CTT CCG CTC ATC GAG 94 Asp Lys Ser Asp Asp Arg Pro Tyr Ile Val Leu Leu Pro Leu Ile Glu 20 25 30 GGG CAG TTT CGG GCT TCC CTT CAG CCC GGT GTG GAT GAT TTT ATC GAT 142 Gly Gln Phe Arg Ala Ser Leu Gln Pro Gly Val Asp Asp Phe Ile Asp 35 40 45 ATT TGT GTC GAA AGC GGG TCA ACC AAG GTC AAC GAG TCC TCG TTC CGT 190 Ile Cys Val Glu Ser Gly Ser Thr Lys Val Asn Glu Ser Ser Phe Arg 50 55 60 GCT TCG CTC TAC ATG CAC GCC GGT GAT GAC CCT TTT ACC CTG GTG AAG 238 Ala Ser Leu Tyr Met His Ala Gly Asp Asp Pro Phe Thr Leu Val Lys 65 70 75 GAC GCC GTG AAG GTG GCG CGC CAC CAC CTC GGG ACG TTC AGG CTG CTG 286 Asp Ala Val Lys Val Ala Arg His His Leu Gly Thr Phe Arg Leu Leu 80 85 90 95 GAG GAG AAA ACT CCG CCG GGG ATC GTC GAC AAA TTC GGG TGG TGC ACG 334 Glu Glu Lys Thr Pro Pro Gly Ile Val Asp Lys Phe Gly Trp Cys Thr 100 105 110 TGG GAT GCG TTC TAC CTC AAC GTC CAG CCC CAC GGC GTT ATG GAG GGC 382 Trp Asp Ala Phe Tyr Leu Asn Val Gln Pro His Gly Val Met Glu Gly 115 120 125 GTG CAG GGG CTG GTT GAC GGC GGA TGT CCG CCG GGG CTG GTG TTG ATC 430 Val Gln Gly Leu Val Asp Gly Gly Cys Pro Pro Gly Leu Val Leu Ile 130 135 140 GAC GAC GGG TGG CAG TCC ATT TGT CAC GAC AAC GAC GCG CTC ACC ACC 478 Asp Asp Gly Trp Gln Ser Ile Cys His Asp Asn Asp Ala Leu Thr Thr 145 150 155 GAG GGG ATG GGG AGA ACC TCC GCC GGA GAG CAA ATG CCC TGC AGG TTG 526 Glu Gly Met Gly Arg Thr Ser Ala Gly Glu Gln Met Pro Cys Arg Leu 160 165 170 175 ATC AAG TTT GAG GAG AAT TAC AAG TTC AGG GAG TAC GAG AGC CCG AAT 574 Ile Lys Phe Glu Glu Asn Tyr Lys Phe Arg Glu Tyr Glu Ser Pro Asn 180 185 190 AAA ACT GGG CCG GGC CCG AAT ACG GGG ATG GGG GCC TTT ATT CGT GAC 622 Lys Thr Gly Pro Gly Pro Asn Thr Gly Met Gly Ala Phe Ile Arg Asp 195 200 205 ATG AAG GAC AAT TTC AAG AGT GTG GAC TAC GTG TAC GTG TGG CAT GCG 670 Met Lys Asp Asn Phe Lys Ser Val Asp Tyr Val Tyr Val Trp His Ala 210 215 220 TTG TGT GGT TAT TGG GGC GGG CTC AGG CCC AAT GTT CCG GGC CTG CCC 718 Leu Cys Gly Tyr Trp Gly Gly Leu Arg Pro Asn Val Pro Gly Leu Pro 225 230 235 GAG GCT AAG CTC ATT GAG CCC AAA CTG ACT CCT GGG CTT AAG ACC ACC 766 Glu Ala Lys Leu Ile Glu Pro Lys Leu Thr Pro Gly Leu Lys Thr Thr 240 245 250 255 ATG GAA GAT TTG GCT GTT GAT AAG ATT GTC AAC AAT GGC GTG GGT CTG 814 Met Glu Asp Leu Ala Val Asp Lys Ile Val Asn Asn Gly Val Gly Leu 260 265 270 GTC CCA CCG GAG TTT GTT GAA CAA ATG TAT GAA GGA TTA CAT TCA CAT 862 Val Pro Pro Glu Phe Val Glu Gln Met Tyr Glu Gly Leu His Ser His 275 280 285 CTC GAA TCT GTG GGG ATT GAT GGA GTC AAA GTT GAC GTC ATC CAT TTG 910 Leu Glu Ser Val Gly Ile Asp Gly Val Lys Val Asp Val Ile His Leu 290 295 300 TTG GAA ATG TTG TGT GAA GAC TAT GGT GGG AGA GTG GAC TTA GCC AAG 958 Leu Glu Met Leu Cys Glu Asp Tyr Gly Gly Arg Val Asp Leu Ala Lys 305 310 315 GCT TAT TAC AAG GCC TTA TCA AGC TCA GTT AAC AAC CAC TTC AAC GGC 1006 Ala Tyr Tyr Lys Ala Leu Ser Ser Ser Val Asn Asn His Phe Asn Gly 320 325 330 335 AAC GGC GTC ATC GCT GGC CTG GAG CAC TGC AAT GAC TTC ATG TTT CTC 1054 Asn Gly Val Ile Ala Gly Leu Glu His Cys Asn Asp Phe Met Phe Leu 340 345 350 GGA ACC GAG GCC ATT ACC TTG GGT CGT GTC GGG GAT GAT TTT TGG TGC 1102 Gly Thr Glu Ala Ile Thr Leu Gly Arg Val Gly Asp Asp Phe Trp Cys 355 360 365 ACT GAT CCA TCT GGA GAT CCC AAT GGC ACG TTC TGG TTG CAA GGG TGT 1150 Thr Asp Pro Ser Gly Asp Pro Asn Gly Thr Phe Trp Leu Gln Gly Cys 370 375 380 CAC ATG GTG CAC TGC GCC TAC AAC AGC ATA TGG ATG GGT AAT TTC ATC 1198 His Met Val His Cys Ala Tyr Asn Ser Ile Trp Met Gly Asn Phe Ile 385 390 395 CAC CCT GAT TGG GAC ATG TTT CAA TCG ACT CAC CCT TGC GCT GAA TTC 1246 His Pro Asp Trp Asp Met Phe Gln Ser Thr His Pro Cys Ala Glu Phe 400 405 410 415 CAC GCT GCC TCA CGA GCC ATC TCC GGC GGG CCC ATT TAC GTC AGT GAC 1294 His Ala Ala Ser Arg Ala Ile Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Val Ser Asp 420 425 430 TCG GTC GGA AAG CAC AAC TTC GAG CTC CTT AGG AGC CTC GTT CTT CCC 1342 Ser Val Gly Lys His Asn Phe Glu Leu Leu Arg Ser Leu Val Leu Pro 435 440 445 GAT GGC TCC ATC CTC CGT TGT GAT TAC TAC GCG CTT CCG ACT CGC GAT 1390 Asp Gly Ser Ile Leu Arg Cys Asp Tyr Tyr Ala Leu Pro Thr Arg Asp 450 455 460 TGC CTC TTT GAA GAT CCA CTT CAC AAT GGC AAG ACT ATG CTC AAA ATT 1438 Cys Leu Phe Glu Asp Pro Leu His Asn Gly Lys Thr Met Leu Lys Ile 465 470 475 TGG AAT TAT AAC AAG TTC ACC GGA GTT GTC GGA ACT TTC AAC TGC CAA 1486 Trp Asn Tyr Asn Lys Phe Thr Gly Val Val Gly Thr Phe Asn Cys Gln 480 485 490 495 GGT GGC GGG TGG AGC CGG GAA GTG CGT CGC AAC CAA TGC GCT GCC GAG 1534 Gly Gly Gly Trp Ser Arg Glu Val Arg Arg Asn Gln Cys Ala Ala Glu 500 505 510 TAT TCC CAC GCC GTC TCC TCT AGC GCT GGT CCG AGT GAC ATT GAG TGG 1582 Tyr Ser His Ala Val Ser Ser Ser Ala Gly Pro Ser Asp Ile Glu Trp 515 520 525 AAG CAA GGA ACG AGT CCG ATC GAC GTC GAC GGC GTC AAA ACA TTC GCG 1630 Lys Gln Gly Thr Ser Pro Ile Asp Val Asp Gly Val Lys Thr Phe Ala 530 535 540 TTG TAC CTA TTC CAC GAG AAG AAA CTC GTC CTT TCT AAG CCA TCA GAC 1678 Leu Tyr Leu Phe His Glu Lys Lys Leu Val Leu Ser Lys Pro Ser Asp 545 550 555 AAA ATC GAC ATC ACG CTT GAG CCC TTC GAT TTT GAG CTG ATA ACC GTT 1726 Lys Ile Asp Ile Thr Leu Glu Pro Phe Asp Phe Glu Leu Ile Thr Val 560 565 570 575 TCT CCA GTC AAA ACT CTA GCC AAT TGC ACC GTC CAA 1762 Ser Pro Val Lys Thr Leu Ala Asn Cys Thr Val Gln 580 585

【００６４】配列番号：7 配列の長さ:271 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名:トウモロコシ(Zea mays L.) 品種名:Pioneer3358 組織の種類:葉 配列 Gln Ser Thr His Pro Cys Ala Ala Phe His Ala Ala Ser Arg Ala Ile 5 10 15 Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Val Ser Asp Ser Val Gly Gln His Asp Phe 20 25 30 Ala Leu Leu Arg Arg Leu Ala Leu Pro Asp Gly Thr Val Leu Arg Cys 35 40 45 Glu Gly His Ala Leu Pro Thr Arg Asp Cys Leu Phe Ala Asp Pro Leu 50 55 60 His Asp Gly Arg Thr Val Leu Lys Ile Trp Asn Val Asn Arg Phe Ala 65 70 75 80 Gly Val Val Gly Ala Phe Asn Cys Gln Gly Gly Gly Trp Ser Pro Glu 85 90 95 Ala Arg Arg Asn Lys Cys Phe Ser Glu Phe Ser Val Pro Leu Ala Ala 100 105 110 Arg Ala Ser Pro Ser Asp Val Glu Trp Lys Ser Gly Lys Ala Gly Pro 115 120 125 Gly Val Ser Val Lys Asp Val Ser Gln Phe Ala Val Tyr Ala Val Glu 130 135 140 Ala Arg Thr Leu Gln Leu Leu Arg Pro Asp Glu Gly Val Asp Leu Thr 145 150 155 160 Leu Gln Pro Phe Thr Tyr Glu Leu Phe Val Val Ala Pro Val Arg Val 165 170 175 Ile Ser His Glu Arg Ala Ile Lys Phe Ala Pro Ile Gly Leu Ala Asn 180 185 190 Met Leu Asn Thr Ala Gly Ala Val Gln Ala Phe Glu Ala Lys Lys Asp 195 200 205 Ala Ser Gly Val Thr Ala Glu Val Phe Val Lys Gly Ala Gly Glu Leu 210 215 220 Val Ala Tyr Ser Ser Ala Thr Pro Arg Leu Cys Lys Val Asn Gly Asp 225 230 235 240 Glu Ala Glu Phe Thr Tyr Lys Asp Gly Val Val Thr Val Asp Val Pro 245 250 255 Trp Ser Gly Ser Ser Ser Lys Leu Cys Cys Val Gln Tyr Val Tyr 260 265 270

【００６５】配列番号：8 配列の長さ:996 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名:トウモロコシ(Zea mays L.) 品種名:Pioneer3358 組織の種類:葉 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：2..817 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 C CAG TCC ACG CAC CCC TGC GCC GCC TTC CAC GCC GCG TCC CGC GCC 46 Gln Ser Thr His Pro Cys Ala Ala Phe His Ala Ala Ser Arg Ala 5 10 15 ATC TCC GGC GGG CCC ATC TAC GTC AGC GAC TCG GTG GGG CAG CAC GAC 94 Ile Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Val Ser Asp Ser Val Gly Gln His Asp 20 25 30 TTC GCG CTG CTC CGC CGC CTG GCG CTC CCC GAC GGC ACC GTC CTC CGG 142 Phe Ala Leu Leu Arg Arg Leu Ala Leu Pro Asp Gly Thr Val Leu A 35 40 45 TGC GAG GGC CAC GCG CTG CCC ACG CGC GAC TGC CTC TTC GCC GAC CCG 190 Cys Glu Gly His Ala Leu Pro Thr Arg Asp Cys Leu Phe Ala Asp Pro 50 55 60 CTC CAC GAC GGC CGG ACC GTG CTC AAG ATC TGG AAC GTG AAC CGC TTC 238 Leu His Asp Gly Arg Thr Val Leu Lys Ile Trp Asn Val Asn Arg Phe 65 70 75 GCC GGC GTC GTC GGC GCC TTC AAC TGC CAG GGC GGC GGG TGG AGC CCC 286 Ala Gly Val Val Gly Ala Phe Asn Cys Gln Gly Gly Gly Trp Ser Pro 80 85 90 95 GAG GCG CGG CGG AAC AAG TGC TTC TCG GAG TTC TCC GTG CCC CTG GCC 334 Glu Ala Arg Arg Asn Lys Cys Phe Ser Glu Phe Ser Val Pro Leu Ala 100 105 110 GCG CGC GCC TCG CCG TCC GAC GTC GAG TGG AAG AGC GGC AAG GCG GGG 382 Ala Arg Ala Ser Pro Ser Asp Val Glu Trp Lys Ser Gly Lys Ala Gly 115 120 125 CCA GGC GTC AGC GTC AAG GAC GTC TCC CAG TTC GCC GTG TAC GCG GTC 430 Pro Gly Val Ser Val Lys Asp Val Ser Gln Phe Ala Val Tyr Ala Val 130 135 140 GAG GCC AGG ACG CTG CAG CTG CTG CGC CCC GAC GAG GGC GTC GAC CTC 478 Glu Ala Arg Thr Leu Gln Leu Leu Arg Pro Asp Glu Gly Val Asp Leu 145 150 155 ACG CTG CAG CCC TTC ACC TAC GAG CTC TTC GTC GTT GCC CCC GTG CGC 526 Thr Leu Gln Pro Phe Thr Tyr Glu Leu Phe Val Val Ala Pro Val Arg 160 165 170 175 GTC ATC TCG CAT GAG CGG GCC ATC AAG TTC GCG CCC ATC GGA CTC GCC 574 Val Ile Ser His Glu Arg Ala Ile Lys Phe Ala Pro Ile Gly Leu Ala 180 185 190 AAC ATG CTC AAC ACC GCC GGC GCC GTG CAG GCG TTC GAG GCC AAG AAA 622 Asn Met Leu Asn Thr Ala Gly Ala Val Gln Ala Phe Glu Ala Lys Lys 195 200 205 GAT GCT AGC GGC GTC ACG GCA GAG GTG TTC GTG AAG GGC GCA GGG GAG 670 Asp Ala Ser Gly Val Thr Ala Glu Val Phe Val Lys Gly Ala Gly Glu 210 215 220 CTG GTG GCG TAC TCG TCG GCG ACG CCC AGG CTC TGC AAG GTG AAC GGC 718 Leu Val Ala Tyr Ser Ser Ala Thr Pro Arg Leu Cys Lys Val Asn Gly 225 230 235 GAC GAG GCC GAG TTC ACG TAC AAG GAC GGC GTG GTC ACC GTC GAC GTG 766 Asp Glu Ala Glu Phe Thr Tyr Lys Asp Gly Val Val Thr Val Asp Val 240 245 250 255 CCG TGG TCG GGG TCG TCG TCG AAG CTG TGT TGC GTC CAG TAC GTC TAC 814 Pro Trp Ser Gly Ser Ser Ser Lys Leu Cys Cys Val Gln Tyr Val Tyr 260 265 270 TGA GCCGGACGGG CCGATGACTC TGCGTCTCTG CTCCCTGCTG GCCTGCTCAG GAC 873 ATAATCTAAT GTTTAGAGCT TACCAGGTTT TACAGCTCTA TCAGTTTACT TTTGTTTTTC 933 TGCTCTTCGT TTTTTAAGAA TTATTTCTAT TGTGTGAATT AATGAGTGCT TTCCTTCTAA 993 AAA 996

【図面の簡単な説明】

【図１】図1は、塩基配列にコードされるアミノ酸の対応を示すコドン表である。 コドンは、5'-末端が左側にくるように示し、mRNAにおける塩基配列を示している。
UはRNAにおけるウラシル塩基を示しており、DNAにおいてはチミン塩基に相当する。

【図２】図2は、ラフィノース合成酵素遺伝子の大腸菌発現用プラスミドの構築を示したものである。 プラスミドpBluescriptKS-RSはラフィノース合成酵素をクローニングしたプラスミドであり、ＲＳはラフィノース合成酵素遺伝子を示し、図の上部に示した塩基配列は該ラフィノース合成酵素遺伝子の両末端部分の塩基配列を示したものである。 小文字で示した配列はベクターであるpBlu
escriptII KS-に由来する塩基配列を示す。 箱で囲った塩基配列はそれぞれラフィノース合成酵素遺伝子の翻訳開始コドン（ATG）、終止コドン（TGATAA）を示す。 塩基配列の上に制限酵素認識部位を示す。 pGEX-RSおよびp
Trc-RSはラフィノース合成酵素遺伝子の大腸菌発現用プラスミドである。 Ptacはtacプロモーター、Ptrcはtrcプロモーター、GSTはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ遺伝子、lacI ^qはラクトースリプレッサー遺伝子、rrnB
はリボゾーマルRNA転写終了シグナルを示す。

【図３】図3は、ラフィノース合成酵素遺伝子とプロモーターが連結されてなるキメラ遺伝子の植物における発現ベクターの構築を示したものである。 プラスミドpBlu
escriptKS-RSにクローニングされたラフィノース合成酵素遺伝子の制限酵素地図を下に示す。 pBI221RSおよびpB
I221(-)RSはダイズへの形質転換に用いた発現ベクターの制限酵素地図を示す。 35Sはカリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーター、NOSはノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターを示す。

【図４】図4は、ラフィノース合成酵素遺伝子とプロモーターが連結されてなるキメラ遺伝子の植物における発現ベクターの構築を示したものである。 プラスミドpBlu
escriptKS-RSにクローニングされたラフィノース合成酵素遺伝子の制限酵素地図を上に示す。 pBI121RSおよびpB
I121(-)RSはカラシナへの形質転換に用いたバイナリーベクターの制限酵素地図を示す。 該バイナリーベクターについてはライトボーダーとレフトボーダーの間の領域のみを示す。 35Sはカリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーター、NOSはノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター、NPTはカナマイシン耐性遺伝子を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. ⁶識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｑ 1/527 Ｃ１２Ｑ 1/527 1/68 Ａ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/573 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:19）