【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はイチゴ培養細胞から得られたカルコン合成酵素遺伝子と、該遺伝子を含有する組換えベクターと、該遺伝子により形質転換された形質転換植物に関する。

【０００２】

【従来の技術】カルコン合成酵素は、植物のアントシアニン合成代謝系において重要な働きを持つ。 植物のアントシアニン合成代謝系は、ニンジンなどの植物について種々研究がなされており、マロニルＣｏＡを基質としてナリンゲニン、アントシアニンを生成する代謝経路におけるカルコン合成酵素の鍵酵素としての役割が明らかにされつつある。 また、カルコン合成酵素を産生するカルコン合成酵素遺伝子の研究も進められてきている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、アントシアニン合成能力の高いイチゴからカルコン合成酵素遺伝子を取り出し、その塩基配列を確立することを課題としている。 また本発明は、イチゴから得られたカルコン合成酵素遺伝子を含有するベクターの提供を課題としている。 さらに、本発明は、イチゴから得られたカルコン合成酵素遺伝子を植物に導入し、アントシアニン生産性の高い植物培養細胞や既存の植物と異なる色調を有する形質転換植物の提供を課題としている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】請求項１に係る発明は、
次の塩基配列、 ATG GTG ACT GTT GAG GAA GTC CGC AAG GCT CAA CGC GCT GAG GGT CCG GCC ACT GTT TTG GCC ATC GGG ACA GCA ACA CCA CCC AAC TGT ATT GAC CAG AGC ACA TAC CCC GAC TAC TAC TTT CGT ATC ACC AAC AGT GAG CAC AAG GCT GAG CTC AAG GAG AAA TTC CAG CGC ATG TGT GAC AAA TCT ATG ATC AAG AAG CGT TAC ATG TAC TTG ACT GAA GAA ATT CTT AAA GAG AAT CCT AGT ATG TGT GAG TAC ATG GCA CCT TCA CTT GAT GCA AGA CAA GAC ATG GTG GTA GTT GAA ATT CCA AAG CTT GGA AAA GAG GCC GCT GTC AAG GCC ATT AAA GGA TGG GGT CAG CCC AAG TCC AAA ATC ACC CAC TTG GTC TTT TGT ACC ACT AGT GGT GTC GAC ATG CCC GGG GCC GAT TAC CAG CTC ACT AAG CTC TTG GGC CTC CGC CCA TCC GTC AAG CGT CTC ATG ATG TAC CAG CAA GGC TGT TTC GCT GGA GGC ACG GTG CTC CGG TTG GCA AAG GAC TTG GCC GAG AAC AAC CGG GGG GCA CGT GTT CTC GTT GTT TGC TCT GAG ATC ACT GCC GTG ACC TTC CGT GGG CCT AGC GAC ACC CAT CTC GAT AGT CTT GTG GGC CAA GCT TTG TTC GGT GAT GGT GCC GCA GCC ATA ATT GTT GGG TCT GAC CCA TTG CCC GAG GTT GAG AGG CCT TTG TTT GAG CTT GTC TCA GCA GCC CAA ACT ATC CTT CCC GAT AGT GAC GGA GCC ATC GAC GGG CAC CTT CGT GAA GTT GGG CTC ACA TTT CAC CTC CTC AAA GAT GTT CCC GGG CTG ATT TCG AAG AAC ATT GAG AAG AGT CTC AAC GAG GCC TTC AAA CCT TTG AAT ATC ACT GAC TGG AAC TCA CTT TTC TGG ATT GCA CAC CCA GGT GGC CCA GCA ATT CTG GAC CAA GTT GAA GCT AAA TTG GCC CTC AAG CCT GAG AAG TTA GAA GCC ACA AGG CAT ATC CTA TCC GAG TAT GGA AAC ATG TCT AGT GCT TGT GTG TTG TTT ATT TTG GAC GAA GTC AGG AGG AAG TCT GCA GCT AAT GGG CAC AAG ACC ACC GGA GAG GGC CTG GAG TGG GGT GTT CTA TTG GGT TTG GGC CTG GGC CTC ACT GTC GAG ACC GTC GTG CTT CAC AGT GTA TCT GCT TGA ACT TTA AGG CAT CCG GGT TGA TTC GAG TGA TCT TCT CCT AGA TTT GTG CTT ATA TTT GTA TTA TTT CCA TTC TAC TTT CTG GCT ATT AAT TTT GCT TTT TTG AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AA を含有するカルコン合成酵素遺伝子である。 請求項２に係る発明は、請求項１記載の遺伝子を含有する組換えベクターである。 請求項３に係る発明は請求項１記載の遺伝子を含有する形質転換植物である。

【０００５】

【発明の実施の形態】上述した塩基配列を含有する本発明のカルコン合成酵素遺伝子（以下、本発明遺伝子という）は、イチゴの細胞中から得られたものである。 この本発明遺伝子は、植物培養細胞、例えばイチゴ培養細胞のＤＮＡに導入されることで、その細胞のアントシアニン合成代謝系に影響を及ぼし、アントシアニン生産性の極めて高い植物培養細胞を得ることが可能となる。 また、本発明遺伝子を種々の植物の遺伝子に導入することによって、既存の植物と異なる色調を有する形質転換植物を作り出すことが可能である。

【０００６】本発明による組換えベクターは、Ｔｉプラスミド（Tumor inducing plasmid）、ｐＳＰＯＲＴ１、
ｐＴ７Blue-Ｔベクターなどのプラスミド、或いはタバコモザイクウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、
ジェミニウイルスなどの植物ウイルスなどのベクターに、本発明遺伝子を組み込んだものである。 本発明遺伝子を含有した組換えベクターを作製する方法は、遺伝子工学の分野で周知の手法を適用することができ、例えば、構造が既に解析されている上記ベクターの所定の位置の塩基配列を制限酵素で切断し、次いで切断ベクターの末端に本発明遺伝子を酵素的に接合して本発明遺伝子を組み込んだ組換えベクターが得られる。

【０００７】この組換えベクターは、形質転換を企図する植物細胞（受容体細胞）に容易にかつ高い確率で導入され、本発明遺伝子を該植物細胞のＤＮＡ内に組み入れることによって、該植物細胞の本来のアントシアニン合成代謝能力を変化させる形質転換を生じさせることができる。 すなわち、この組換えベクターをイチゴ培養細胞に導入することにより、アントシアニン生産能力の極めて高いイチゴ培養細胞を得ることができる。 また、この組換えベクターを用いて種々の植物、例えばバラなどの花卉、ニンジン、イモなどの野菜の形質転換を行うことによって、既存の植物と異なる色調の花や果実を得ることができるとともに、アントシアニン含有量の高い野菜や果実を得ることができる。

【０００８】また、本発明の形質転換植物は、上述した本発明遺伝子をそのＤＮＡ中に含有することによって、
本来のアントシアニン合成代謝と異なる合成代謝を生じさせたものである。 この形質転換植物として利用される植物の種類は特に限定されず、花卉、果実植物、野菜、
根菜、穀類、観葉植物、果樹を含む樹木などの植物、それら植物の培養細胞のうちから適宜選択し得る。

【０００９】この形質転換植物を作製するには、本発明遺伝子を含有した上記組換えベクターを用い、この組換えベクターを植物細胞内に導入し、植物細胞内のＤＮＡ
中に本発明遺伝子を導入する方法を採用することができる。 その他、本発明遺伝子を付着させた金粒子を高速で植物細胞（受容体細胞）に打ち込んで（いわゆる遺伝子銃）、或いは、物理的または化学的に植物細胞の透過性を高めて該遺伝子を受容体細胞内に直接取り入れて形質転換植物を作製する方法を採用しても良い。

【００１０】この形質転換植物は、既存の植物と異なる色調の花や果実を得ることができるとともに、アントシアニン含有量の高い野菜や果実を得ることができる。

【００１１】

【実施例】

（実験１：本発明遺伝子の調製と塩基配列の決定）2,4-
ジクロロフェノキシ酢酸１ｐｐｍ、ベンジルアデニン０．１ｐｐｍ、ショ糖３ｇ／Ｌを含むＢ５液体培地中で増殖したイチゴ（四季成イチゴ（Fragaria ananassa, "
shikinari"））培養細胞を、同じ培地で光条件を約8000
lxの強光下で培養し、アントシアニンを生産し始めたイチゴ培養細胞を得る。 このイチゴ培養細胞を培地から取り出し、細胞を十分に破砕した後、フェノール抽出による除タンパク処理を行い、更にＣｓＣｌ濃度勾配超遠心分離（約48000r.pm）を行って、ＲＮＡ画分を回収する。 得られたＲＮＡ画分を、オリゴテックスビーズ（第一化学薬品社製）に吸着させ、ＴＥ Bufferを脱離剤としてｍＲＮＡを精製する。 この精製ｍＲＮＡから、ｃＤ
ＮＡライブラリーキット（ライフテックオリエンタル社製）を用いてｃＤＮＡライブラリーを作製する。 次いで、作製されたｃＤＮＡライブラリーから、ニンジン細胞のカルコン合成酵素遺伝子をプローブとして市販キット（アマシャム社製、商品名:ECL direct nucleic acid
labelling and detection kit）を用いてイチゴ細胞のカルコン合成酵素遺伝子をスクリーニングする。 このスクリーニングによって得られたイチゴ細胞のカルコン合成酵素遺伝子の塩基配列を、パーキンエルマー社製、Ｄ
ＮＡシークェンシングシステムによって決定した。 その塩基配列を配列表の配列番号１に示す。

【００１２】

【発明の効果】以上説明した通り、本発明によるカルコン合成酵素遺伝子は、植物細胞に導入することにより、
アントシアニン生産性の高い植物培養細胞や既存の植物と異なる色調を有する形質転換植物を作り出すことができる有用なものである。 また、本発明による組換えベクターは、アントシアニン生産性の高い植物培養細胞や既存の植物と異なる色調を有する形質転換植物を作り出すことができる。 さらに、本発明による形質転換植物は、
既存の植物と異なる色調の花や果実を得ることができるとともに、アントシアニン含有量の高い野菜や果実を得ることができる。

【配列表】

【００１３】配列番号：１ 配列の長さ：１３０４ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 起源：四季成イチゴ（Fragaria ananassa, "shikinar
i"） 配列 ATG GTG ACT GTT GAG GAA GTC CGC AAG GCT CAA CGC GCT GAG GGT CCG 48 GCC ACT GTT TTG GCC ATC GGG ACA GCA ACA CCA CCC AAC TGT ATT GAC 96 CAG AGC ACA TAC CCC GAC TAC TAC TTT CGT ATC ACC AAC AGT GAG CAC 144 AAG GCT GAG CTC AAG GAG AAA TTC CAG CGC ATG TGT GAC AAA TCT ATG 192 ATC AAG AAG CGT TAC ATG TAC TTG ACT GAA GAA ATT CTT AAA GAG AAT 240 CCT AGT ATG TGT GAG TAC ATG GCA CCT TCA CTT GAT GCA AGA CAA GAC 288 ATG GTG GTA GTT GAA ATT CCA AAG CTT GGA AAA GAG GCC GCT GTC AAG 336 GCC ATT AAA GGA TGG GGT CAG CCC AAG TCC AAA ATC ACC CAC TTG GTC 384 TTT TGT ACC ACT AGT GGT GTC GAC ATG CCC GGG GCC GAT TAC CAG CTC 432 ACT AAG CTC TTG GGC CTC CGC CCA TCC GTC AAG CGT CTC ATG ATG TAC 480 CAG CAA GGC TGT TTC GCT GGA GGC ACG GTG CTC CGG TTG GCA AAG GAC 528 TTG GCC GAG AAC AAC CGG GGG GCA CGT GTT CTC GTT GTT TGC TCT GAG 576 ATC ACT GCC GTG ACC TTC CGT GGG CCT AGC GAC ACC CAT CTC GAT AGT 624 CTT GTG GGC CAA GCT TTG TTC GGT GAT GGT GCC GCA GCC ATA ATT GTT 672 GGG TCT GAC CCA TTG CCC GAG GTT GAG AGG CCT TTG TTT GAG CTT GTC 720 TCA GCA GCC CAA ACT ATC CTT CCC GAT AGT GAC GGA GCC ATC GAC GGG 768 CAC CTT CGT GAA GTT GGG CTC ACA TTT CAC CTC CTC AAA GAT GTT CCC 816 GGG CTG ATT TCG AAG AAC ATT GAG AAG AGT CTC AAC GAG GCC TTC AAA 864 CCT TTG AAT ATC ACT GAC TGG AAC TCA CTT TTC TGG ATT GCA CAC CCA 912 GGT GGC CCA GCA ATT CTG GAC CAA GTT GAA GCT AAA TTG GCC CTC AAG 960 CCT GAG AAG TTA GAA GCC ACA AGG CAT ATC CTA TCC GAG TAT GGA AAC 1008 ATG TCT AGT GCT TGT GTG TTG TTT ATT TTG GAC GAA GTC AGG AGG AAG 1056 TCT GCA GCT AAT GGG CAC AAG ACC ACC GGA GAG GGC CTG GAG TGG GGT 1104 GTT CTA TTG GGT TTG GGC CTG GGC CTC ACT GTC GAG ACC GTC GTG CTT 1152 CAC AGT GTA TCT GCT TGA ACT TTA AGG CAT CCG GGT TGA TTC GAG TGA 1200 TCT TCT CCT AGA TTT GTG CTT ATA TTT GTA TTA TTT CCA TTC TAC TTT 1248 CTG GCT ATT AAT TTT GCT TTT TTG AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA 1296 AAA AAA AA 1304