腈水解酶突变体及在普瑞巴林手性中间体合成中的应用
阅读：819发布：2020-05-08
专利汇可以提供腈水解酶突变体及在普瑞巴林手性中间体合成中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种腈 水 解 酶突变体及在普瑞巴林 手性 中间体合成中的应用，属于 生物 工程 技术领域。本发明以芜菁/高山南芥腈水解酶嵌合体BaNIT的三突变体BaNITmut为亲本，运用定点突变对127位点和260位点进行改造，所获得的腈水解酶突变体 氨 基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8。相比于亲本腈水解酶，本发明提供的腈水酶突变体催化外消旋异丁基丁二腈的活 力 及 温度 稳定性 分别有所提高；同时副产物(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺含量减少；操作易于控制，生产成本低，产品光学纯度高，在高效催化异丁基丁二腈合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸中具有良好的应用前景。，下面是腈水解酶突变体及在普瑞巴林手性中间体合成中的应用专利的具体信息内容。
1.一种腈水解酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示。
2.一种编码如权利要求1所述的腈水解酶突变体的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7所示。
3.一种包含如权利要求2所述的编码基因的重组载体。
4.一种包含如权利要求3所述的重组载体的重组基因工程菌。
5.如权利要求1所述的腈水解酶突变体在催化外消旋异丁基丁二腈制备(S)-3-氰基-
5-甲基己酸中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，包括：以含有腈水解酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养后离心获得的菌体、菌体固定化细胞、菌体超声破碎后提取的酶或者固定化酶为催化剂，以外消旋异丁基丁二腈为底物，以pH为6.0-10.0的缓冲液为反应介质，在
20-50℃、200-400r/min条件下水浴反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得(S)-3-氰基-5-甲基己酸。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，反应体系中，底物的浓度为100-130g/L，催化剂的用量以菌体干重量计为1.5g/L。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述反应介质为pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液，催化反应温度为30℃。
腈水解酶突变体及在普瑞巴林手性中间体合成中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及酶工程技术领域，涉及腈水解酶突变体、编码基因及在催化合成普瑞巴林关键手性中间体中的应用。
背景技术
[0002] 普瑞巴林，化学名(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸，是抑制性神经递质γ-氨基丁酸的3位异丁基取代物(Angew.Chem.Int.Ed.,2008,47,3500)，在治疗神经疼痛、焦虑以及癫痫等重大疾病中发挥重要作用。与同类药物相比，普瑞巴林具有服用剂量低、次数少、持续时间长、副作用小和耐受性强等优点。由于普瑞巴林R型异构体的活性仅为S型的1/10，因此，开发高光学纯度S型普瑞巴林合成技术在制药工业中具有重要意义。
[0003] (S)-3-氰基-5-甲基己酸是普瑞巴林的关键手性中间体，该化合物经一步加氢即可合成S型普瑞巴林。腈水解酶区域、立体选择性水解外消旋异丁基丁二腈合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸路线具有原料廉价、工艺简单、原子经济性高等优势。但目前已报道的腈水解酶催化活力、立体选择性低，不能满足工业化生产需求。如专利文献CN1942587B公开的利用NIT-101、NIT-102、NIT-103和拟南芥腈水解酶催化外消旋异丁基丁二腈水解的产率分别为34.2％、38.6％、35.5％、17.5％，产物光学纯度(ee值)分别为96.3％、91.1％、95.5％和98.5％。
[0004] 张琴等通过腈水解酶嵌合酶设计和定点饱和突变，获得了催化活力和立体选择性更高的腈水解酶突变体BaNIT/L223Q/H263D/Q279E(Biotechnol.Bioeng.,2019,doi:10.1002/bit.27203)。但该腈水解酶催化异丁基丁二腈水解时，除生成(S)-3-氰基-5-甲基己酸，还生成副产物(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺，其反应过程如图1所示。此外，腈水解酶的热稳定性普遍较低，也阻碍了其工业应用。
[0005] 因此，开发能够高效、高立体选择性、高反应专一性拆分外消旋异丁基丁二腈，且具有优良热稳定性的腈水解酶具有重要意义。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种能够高效拆分外消旋异丁基丁二腈，且专一性好的腈水解酶，应用于催化合成普瑞巴林手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸，满足工业化生产要求。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 本发明以实验室前期构建保藏的芜菁/高山南芥腈水解酶嵌合体的突变体BaNIT/L223Q/H263D/Q279E(以下简称BaNITmut)为模板(其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，对其进行定点饱和突变，得到腈水解酶突变体。
[0009] 所述腈水解酶突变体及突变位点具体如下：
[0010] BaNITmut/M127I(第127位的M突变为I)氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
[0011] BaNITmut/M127I/Q260T(第127位的M突变为I、第260位的Q突变为T)氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
[0012] BaNITmut/M127I/Q260H(第127位的M突变为I、第260位的Q突变为H)氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0013] 相比于亲本腈水解酶BaNITmut，上述3种腈水解酶突变体的催化性能得到了显著提高，且立体选择性无明显变化。具体地：腈水解酶突变体BaNITmut/M127I，其活力较BaNITmut提升1.8倍，酰胺副产物含量从18.9％降至6.2％；腈水解酶突变体BaNITmut/M127I/Q260T，其活力较BaNITmut提高2.3倍；腈水解酶突变体BaNITmut/M127I/Q260H，其静息细胞在55℃下的温度稳定性较BaNITmut提高3.3倍。
[0014] 对上述腈水解酶突变体的其他氨基酸位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端截断的形式，这些突变体形式也包括在本发明的范围内。
[0015] 本发明还提供了上述腈水解酶突变体的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7所示。
[0016] 本发明还提供了包含所述编码基因的重组载体。作为优选，原始载体为pET28b。
[0017] 本发明还提供了包含所述重组载体的重组基因工程菌。所述重组载体转化宿主细胞获得重组基因工程菌，所述宿主细胞可以为本领域的各种常规宿主细胞。作为优选，宿主细胞为大肠杆菌Escherichia coli BL21。
[0018] 本发明的另一个目的是提供所述的腈水解酶突变体在催化外消旋异丁基丁二腈制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。
[0019] 所述应用包括：以含有腈水解酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养后离心获得的菌体、菌体固定化细胞、菌体超声破碎后提取的酶或者固定化酶为催化剂，以外消旋异丁基丁二腈为底物，以pH为6.0-10.0的缓冲液为反应介质，在20-50℃、200-400r/min条件下水浴反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得(S)-3-氰基-5-甲基己酸。
[0020] 本发明所述的腈水解酶突变体可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶形式使用，也可以是部分纯化的或完全纯化的酶的形式使用。还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的腈水解酶突变体制成固定化酶或固定化细胞形式的生物催化剂。
[0021] 作为优选，反应体系中底物的浓度为100-130g/L，催化剂的用量以菌体干重计量为1.5g/L。
[0022] 作为优选，所述反应介质为pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液，催化反应温度为30℃。
[0023] 作为优选，所述工程菌为含腈水解酶突变体编码基因的重组工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-BaNITmut、E.coli BL21(DE3)/pET28b-BaNITmut/M127I、E.coli BL21(DE3)/pET28b-BaNITmut/M127I/Q260T、E.coli BL21(DE3)/pET28b-BaNITmut/M127I/Q260H。
[0024] 所述重组工程菌所用的培养基可以是本领域可使转化体生长并产生本发明的腈水解酶的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特别要求，只要使转化体能够生长并产生腈水解酶即可。优选下述方法：将本发明涉及的重组工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养作为种子液，在
37℃培养12h，再将种子液以2％(v/v)接种量接种至新鲜的含有卡那霉素(终浓度50μg/mL)的100mL LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD600达到0.5～0.7，再向培养液中加入终浓度为0.1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，28℃诱导培养12h，4℃、12000r/min条件下离心10min，收集菌体，即为催化剂。
37℃培养12h，再将种子液以2％(v/v)接种量接种至新鲜的含有卡那霉素(终浓度50μg/mL)的100mL LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD600达到0.5～0.7，再向培养液中加入终浓度为0.1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，28℃诱导培养12h，4℃、12000r/min条件下离心10min，收集菌体，即为催化剂。
[0025] 本发明具备的有益效果：
[0026] (1)本发明提供的腈水解酶突变体较亲本腈水解酶嵌合体(BaNITmut)的催化活力提高明显，副产物含量明显减少，尤其是双突变BaNITmut/M127I/Q260T的催化活力提高2.3倍，对映体选择率E值保持在300以上；突变体BaNITmut/M127I/Q260H温度稳定性提高明显，在55℃下静息细胞的半衰期提高3.3倍，对映体选择率E值保持在300以上。上述腈水解酶突变体在高效催化外消旋异丁基丁二腈合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸中具有良好的应用前景。
[0027] (2)本发明提供的腈水解酶突变体能够利用少量细胞催化高浓度IBSN(100g/L)水解，转化率可达49.0％(ee>99％)以上，大幅度降低工业化生产成本，满足普瑞巴林手性中间体工业化合成的要求。附图说明
[0028] 图1为腈水解酶催化异丁基丁二腈反应式。
[0029] 图2为含有腈水解酶突变体BaNITmut、BaNITmut/M127I、BaNITmut/M127I/Q260T的重组大肠杆菌静息细胞催化异丁基丁二腈(100g/L)水解的反应进程对比图。
[0030] 图3为含有腈水解酶突变体BaNITmut、BaNITmut/M127I的重组大肠杆菌静息细胞催化IBSN(100g/L)的副产物酰胺浓度对比图。
[0031] 图4为含有腈水解酶突变体BaNITmut、BaNITmut/M127I、BaNITmut/M127I/Q260H的重组大肠杆菌静息细胞在55℃下的半衰期对比图。
具体实施方式
[0032] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
[0033] 具体实施例中采用的亲本腈水解酶为本课题组前期构建的芜菁/高山南芥腈水解酶嵌合体的突变体BaNIT/L223Q/H263D/Q279E(以下简称BaNITmut)，文章发表于Biotechnol.Bioeng.,2019,doi:10.1002/bit.27203，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0034] 实施例1：含有腈水解酶BaNITmut/M127I突变体的重组大肠杆菌的构建[0035] 将亲本氨基酸序列中的第127位点的Met(M)进行定点突变，设计相对应的引物BaNITmut/M127I-F/BaNITmut/M127I-R。以含有目的基因片段的重组质粒pET28bmut为模板，根据重叠延伸PCR的方法对模板进行全质粒扩增。
[0036] PCR扩增体系为(50μL)：模板DNA0.1ng-1ng，2×Phanta Max Buffer25μL，dNTPs(10mM each)1μL，突变引物上游和下游各1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase 1μL，其余ddH2O补充至总体积。
[0037] PCR反应参数：(1)95℃预变性30s；(2)95℃变性15s；(3)63℃退火15s；(4)72℃延伸5min，步骤(2)-(4)循环30次；(5)72℃彻底延伸10min，4℃保存。
[0038] PCR产物经过0.9％琼脂糖凝胶电泳分析为阳性后，取PCR反应液20μL，加入1μL内切酶Dpn I于37℃酶切3h去除模板质粒，65℃灭活10min。42℃热击转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，37℃复苏1h后涂布于含卡那霉素的LB平板上培养过夜。随后挑取阳性克隆子至LB培养基，37℃培养过夜后取菌液测序。
[0039] 测序结果正确者即为腈水解酶组合突变体工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b-BaNITmut/M127I，其对应的的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0040] 实施例2：含有腈水解酶BaNITmut/M127I/Q260T突变体的重组大肠杆菌的构建[0041] 将亲本氨基酸序列中的第260位点的Gln(Q)突变成Thr(T)，设计相对应的引物BaNITmut/M127I/Q260T-F/BaNITmut/M127I/Q260T-R。以实施例1构建的表达质粒pET28b-BaNITmut/M127I为模板，构建方法参照实施例1。
[0042] 测序结果正确者即为腈水解酶组合突变体工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b-BaNITmut/M127I/Q260T，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0043] 实施例3:含有腈水解酶BaNITmut/M127I/Q260H突变体的重组大肠杆菌的构建[0044] 将亲本氨基酸序列中第260位点的Gln(Q)突变成His(H)，设计相对应的引物BaNITmut/M127I/Q260H-F/BaNITmut/M127I/Q260H-R。以实施例1构建的表达质粒pET28b-BaNITmut/M127I为模板，构建方法参照实施例1。
[0045] 测序结果正确者即为腈水解酶组合突变体工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b-BaNITmut/M127I/Q260H，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0046] 表1：引物设计表
[0047]
[0048] 实施例4：含有腈水解酶突变体重组大肠杆菌的制备
[0049] 将含有腈水解酶BaNITmut菌株以及实施例1、2和3中获得的突变体工程菌株接种到含50μg/mL卡那霉素100mL LB摇瓶培养基中，37℃，150r/min培养至菌体浓度OD600至0.6左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃诱导培养12h后，4℃、12000rpm离心10min收集菌体，用0.85％的生理盐水清洗后重复上述离心步骤，冷冻干燥后-20℃保藏备用(即为静息细胞，用于水解反应)。
[0050] 实施例5：含腈水解酶突变体的重组大肠杆菌静息细胞转化IBSN
[0051] 对实施例4制备的含有腈水解酶BaNITmut、BaNITmut/M127I、BaNITmut/M127I/Q260T的重组大肠杆菌静息细胞分别进行活力测定。反应体系组成为10mL的Tris-HCl缓冲溶液(50mM，pH 8.0)，异丁基丁二腈0.3g，干菌体0.03g。反应液于40℃预热2min后，200r/min反应10min。取样500μL，加入200μL 2M HCl终止反应并用乙酸乙酯进行萃取，取上层有机相用无水硫酸钠干燥后，采用气相色谱测定底物的转化率和产物的对映体过量值(eep)。
[0052] 底物异丁基丁二腈和产物3-氰基-5-甲基己酸的对映体过量值由气相色谱测定。气相色谱型号为7890N(安捷伦)，毛细管柱型号为BGB-174(BGB Analytik Switzerland)。
对映体过量值(eep)、转化率(c)的计算参考Rakels等的计算方法(Enzyme
Microb.Technol.,1993,15,1051)。
对映体过量值(eep)、转化率(c)的计算参考Rakels等的计算方法(Enzyme
Microb.Technol.,1993,15,1051)。
[0053] 含腈水解酶突变体的重组大肠杆菌活力测定结果见表2，突变体催化活力较亲本明显提高，其中BaNITmut/M127I较亲本腈水解酶BaNITmut活力提高1.8倍，双突变体BaNITmut/M127I/Q260T较亲本腈水解酶BaNITmut活力提高2.3倍，对映体过量值(eep)均在99％以上，且所有突变体的对映体选择率(E值)保持在300以上。
[0054] 表2：腈水解酶的活力对比
[0055]
[0056] 实施例6：腈水解酶重组大肠杆菌催化合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸
[0057] 对实施例4制备的含有腈水解酶BaNITmut、BaNITmut/M127I、BaNITmut/M127I/Q260T的重组大肠杆菌静息细胞分别进行水解异丁基丁二腈反应，反应体系如下：10mL的Tris-HCl缓冲溶液(50mM，pH 8.0)，IBSN 1g，湿菌体15mg。反应液于30℃反应24h至平衡。反应期间用手性气相色谱检测反应进程，气相色谱检测条件如实施例5所示。
[0058] 由图2可知，反应16-20h，突变体BaNITmut/M127I/Q260T催化的反应已达到平衡，转化率大于48％，产物eep>99％；突变体BaNITmut/M127I在反应24h后转化率也可达到48％，eep>99％；亲本腈水解酶BaNITmut在反应24h后转化率仅为37％，eep>99％。
[0059] 终止上述反应，离心除去大肠杆菌细胞，反应液减压蒸馏至1/3体积。加入2倍体积(减压蒸馏后样品)的乙酸乙酯进行萃取，收集下层水相。用2M HCl调节下层水相收集液pH至4.0。再次加入2倍体积的乙酸乙酯萃取，弃下层水相。收集上层有机相并进行旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到呈油状的(S)-3-氰基-5-甲基己酸(ee>99％)。
[0060] 实施例7：腈水解酶重组大肠杆菌催化反应副产物含量的测定
[0061] 对实施例4制备的含有腈水解酶BaNITmut、BaNITmut/M127I的重组大肠杆菌静息细胞分别进行副产物酰胺含量的测定，反应体系如下：10mL的Tris-HCl缓冲溶液(50mM，pH 8.0)，IBSN 1g，菌体15mg。反应液于30℃反应24h至平衡。取样500μL，HPLC分析副产物酰胺的浓度。高效液相型号为岛津LC-16，手性毛细管柱型号为
Column(250mm×4.6mm，5μm)。
Column(250mm×4.6mm，5μm)。
[0062] 含腈水解酶突变体的重组大肠杆菌副产物酰胺含量测定结果见表3，突变体所产生的副产物含量较亲本明显减少，其中突变体BaNITmut/M127I的副产物含量仅为6.2％。
[0063] 由图3可知，反应24h后，腈水解酶BaNITmut产生的酰胺浓度为55mM，相对应的转化率为38％，生成酰胺含量为18.9％、BaNITmut/M127I产生的酰胺浓度为20mM，相对应的转化率为49％，酰胺含量为6.2％。
[0064] 表3：腈水解酶菌株酰胺含量对比
[0065]
[0066] 实施例8：含腈水解酶突变体的重组大肠杆菌静息细胞催化高浓度IBSN[0067] 对实施例4制备的含BaNITmut/M127I/Q260T的重组大肠杆菌静息细胞进行重悬，分别催化不同浓度的IBSN(100-130g/L)，反应条件为：菌体量15mg/L，20mL 50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)，30℃。反应期间用气相色谱检测反应进程。
[0068] 反应14h，100g/L ISBN的反应转化率达到45％以上，产物eep>99％；130g/L IBSN的反应转化率为44.5％，产物eep>99％。
[0069] 以上结果表明该腈水解酶突变株具有转化高浓度IBSN的潜能，有突出的工业应用价值。
[0070] 实施例9：含腈水解酶突变体的重组大肠杆菌静息细胞55℃下温度稳定性的测定[0071] 将实施例4制备的含有腈水解酶突变体BaNITmut/M127I、BaNITmut/M127I/Q260H的重组大肠杆菌静息细胞及BaNITmut静息细胞进行55℃下全细胞温度稳定性的测定，步骤如下：将静息细胞用Tris-HCl缓冲溶液(50mM，pH 8.0)配置成15mg/L的菌悬液数瓶，同时放置于55℃水浴摇床内静置保温，分别于0h、0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h后取出，平衡至室温后进行转化反应。反应过程如下：每瓶菌悬液添加1g IBSN(100g/L)，反应液于30℃反应30min后取样500μL，加入200μL 2M HCl终止反应并用乙酸乙酯进行萃取，取上层有机相用无水硫酸钠干燥后，采用气相色谱测定底物的转化率(c)。
[0072] 含腈水解酶突变体的重组大肠杆菌静息细胞在55℃下半衰期测定结果见表4，突变体的热稳定性较亲本明显提高，其中突变体BaNITmut/M127I/Q260H在55℃下的半衰期较突变体BaNITmut提高了3.3倍。结果如图4所示。
[0073] 表4：55℃下含腈水解酶突变体的重组大肠杆菌温度稳定性比较
[0074]
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