功能蛋白POX03016及其编码基因与应用
阅读：749发布：2024-02-23
专利汇可以提供功能蛋白POX03016及其编码基因与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种功能蛋白POX03016及其编码基因与应用。本发明首先提供了一种 蛋白质 ，获自 草酸 青霉，命名为POX03016蛋白，是如下(a1)或(a2)：(a1)由 序列表 中序列1所示的 氨 基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。编码POX03016蛋白的基因也属于本发明的保护范围。POX03016蛋白在调控草酸青霉在固体 发酵 条件下 纤维 素酶基因和木聚糖酶基因的表达过程中起关键性作用，在提高 纤维素 酶、木聚糖酶产量中具有应用潜 力 。，下面是功能蛋白POX03016及其编码基因与应用专利的具体信息内容。
1.一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)：
(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(1)-(4)中任一所述的DNA分子：
(1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
(2)序列表的序列3所示的DNA分子；
(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
(4)与(1)或(2)或(3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.权利要求1所述蛋白质，或，权利要求2或3所述基因的应用，为如下(b1)-(b12)中的至少一种：
(b1)调控微生物在固体发酵中的纤维素酶活力；
(b2)调控微生物在固体发酵中的半纤维素酶活力；
(b3)调控微生物在固体发酵中的羧甲基纤维素酶活力；
(b4)调控微生物在固体发酵中的外切纤维素酶活力；
(b5)调控微生物在固体发酵中的β-葡萄糖苷酶活力；
(b6)调控微生物在固体发酵中的木聚糖酶活力；
(b7)调控微生物在固体发酵中的纤维素酶基因的表达量；
(b8)调控微生物在固体发酵中的纤维二糖水解酶基因的表达量；
(b9)调控微生物在固体发酵中的内切β-1,4-葡聚糖酶基因的表达量；
(b10)调控微生物在固体发酵中的β-葡萄糖苷酶基因的表达量；
(b11)调控微生物在固体发酵中的半纤维素酶基因的表达量；
(b12)调控微生物在固体发酵中的木聚糖酶基因的表达量。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述(b4)和(b5)为正向调控；所述(b3)和(b6)为负向调控。
7.提高微生物在固体发酵中的木聚糖酶活力和/或羧甲基纤维素酶活力的方法，为方法A或方法B；
所述方法A包括如下步骤：抑制所述微生物中权利要求2或3所述基因的表达，得到在固体发酵中的木聚糖酶活力活力提高和/或羧甲基纤维素酶活力提高的微生物；
所述方法B包括如下步骤：降低所述微生物中权利要求1所述蛋白质的表达量和/或活性，得到在固体发酵中的木聚糖酶活力活力提高和/或羧甲基纤维素酶活力提高的微生物。
8.降低抑制微生物在固体发酵中的外切纤维素酶活力和/或β-葡萄糖苷酶活力方法，为方法C或方法D；
所述方法C包括如下步骤：抑制所述微生物中权利要求2或3所述基因的表达，得到在固体发酵中的外切纤维素酶活力和/或β-葡萄糖苷酶活力降低的微生物；
所述方法D包括如下步骤：降低所述微生物中权利要求1所述蛋白质的表达量和/或活性，得到在固体发酵中的外切纤维素酶活力和/或β-葡萄糖苷酶活力降低的微生物。
9.一种制备重组微生物的方法，包括如下步骤：将抑制权利要求2或3所述基因表达的物质导入出发微生物，得到重组微生物；所述重组微生物具有如下(c1)-(c4)中的的至少一种特征：
(c1)在固体发酵中的木聚糖酶活力活力提高；
(c2)在固体发酵中的羧甲基纤维素酶活力提高；
(c3)在固体发酵中的外切纤维素酶活力降低；
(c4)在固体发酵中的β-葡萄糖苷酶活力降低。
10.采用权利要求9所述的方法制备得到的重组微生物。
功能蛋白POX03016及其编码基因与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及遗传工程领域，具体涉及一种功能蛋白POX03016及其编码基因与应用。
背景技术
[0002] 木质纤维素生物炼制生产生物燃料或高附加值生化产品是缓解目前气候变暖和农村经济改革问题最有效的途径之一(Lynd LR.The grand challenge of cellulosic biofuels[J].Nature Biotechnology 2017,35(10):912-915；De Bhowmick G,Sarmah AK,Sen R.Lignocellulosic biorefinery as a model for sustainable development of biofuels and value added products[J].Bioresource Technology 2018,247:1144-1154；Shylesh S,Gokhale AA,Ho CR,Bell AT.Novel strategies for the production of fuels,lubricants,and chemicals from biomass.Accounts of Chemical Research
2017,50:2589-2597)。木质纤维素如秸秆、稻草和甘蔗渣等具有抗降解性,需要高活力的纤维素酶和木聚糖酶进行高效、‘绿色’水解为可发酵的葡萄糖、木糖。自然界中许多丝状真菌可分泌纤维素酶和木聚糖酶,但产量低,是木质纤维素生物炼制的重要瓶颈。真菌纤维素酶基因和木聚糖酶基因在转录水平受转录因子的严格调控。
2017,50:2589-2597)。木质纤维素如秸秆、稻草和甘蔗渣等具有抗降解性,需要高活力的纤维素酶和木聚糖酶进行高效、‘绿色’水解为可发酵的葡萄糖、木糖。自然界中许多丝状真菌可分泌纤维素酶和木聚糖酶,但产量低,是木质纤维素生物炼制的重要瓶颈。真菌纤维素酶基因和木聚糖酶基因在转录水平受转录因子的严格调控。
[0003] 丝状真菌固态发酵生产纤维素酶，相比液体发酵，具有独特的优势，例如可以直接利用农业和工业废弃物秸秆、杂草和甘蔗渣等，成本低，环境污染少，一直备受青睐(Behera SS and Ray RC.Solid state fermentation for production of microbial cellulases:Recent advances and improvement strategies[J].International Journal ofBiological Macromolecules,2015,86:656-669)。近几十年来，为了提高真菌纤维素酶的产量，研究主要集中在真菌菌株的筛选和发酵条件的优化，取得了一些实质性的进展，但是仍不能满足工业生物炼制的需求。其中，最主要的限制因素之一就是所用真菌菌株的酶产量不高。基于关键的纤维素酶基因的转录调控因子介导的遗传工程育种是最经济、最快速和最有效的途径之一。前提是明晰丝状真菌固态发酵中纤维素酶基因的表达调控机制。
[0004] 丝状真菌草酸青霉能分泌完整的纤维素酶系和半纤维素酶系,相比工业上普遍应用的里氏木霉(Trichoderma reesei),具有高β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BGL,EC 3.2.1.21)活性、高外切纤维素酶(cellobiohydrolase,CBH,EC 3.2.1.91)活性等优点(Gusakov AV.Alternatives to Trichoderma reesei in biofuel production[J].Trends in Biotechnology 2011,29:419-425)。基因组测序揭示草酸青霉HP7-1包含3个外切纤维素酶基因,11个内切纤维素酶(endoglucanase,EG,EC 3.2.1.4)基因、11个β-葡萄糖苷酶基因和10个内切木聚糖酶(endo-xylanase,Xyn,EC 3.2.1.8)基因(Zhao S,Yan YS,He QP,Yang L,Yin X,Li CX,Mao LC,Liao LS,Huang JQ,Xie SB,Nong QD,Zhang Z,Jing L,Xiong YR,Duan CJ,Liu JL,Feng JX.Comparative genomic,transcriptomic and secretomic profiling of Penicillium oxalicum HP7-1and its cellulase and xylanase hyper-producing mutant EU2106,and identification oftwo novel regulatory genes ofcellulase and xylanase gene expression[J].Biotechnology for Biofuels 2016,9:203)，是基因工程改造的良好出发菌株。
[0005] 目前,丝状真菌包括草酸青霉固态发酵中纤维素酶基因的表达调控研究几乎空白。因此，挖掘固态发酵中纤维素酶基因、木聚糖酶基因新的调控转录因子，对进一步遗传改造、提高酶产量具有潜在的工业应用价值。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一种功能蛋白POX03016及其编码基因与应用。
[0007] 本发明提供的蛋白质，获自草酸青霉(Penicillium oxalicum)，命名为POX03016蛋白，是如下(a1)或(a2)：
[0009] (a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。
[0010] 为了使(a1)中的POX03016蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0011] 表1标签的序列
[0012]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tagII 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tagII 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
[0013] 上述(a2)中的POX03016蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(a2)中的POX03016蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0014] 编码所述POX03016蛋白的基因(POX03016基因)也属于本发明的保护范围。
[0015] 所述基因具体可为如下(1)-(4)中任一所述的DNA分子：
[0016] (1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
[0017] (2)序列表的序列3所示的DNA分子；
[0018] (3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码所述POX03016蛋白的DNA分子；
[0019] (4)与(1)或(2)或(3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述POX03016蛋白的DNA分子。
[0020] 上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
[0021] 含有所述POX03016基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
[0022] 本发明还保护所述POX03016蛋白或POX03016基因的应用，为如下(b1)-(b12)中的至少一种：
[0023] (b1)调控微生物在固体发酵中的纤维素酶活力；
[0024] (b2)调控微生物在固体发酵中的半纤维素酶活力；
[0025] (b3)调控微生物在固体发酵中的羧甲基纤维素酶活力；
[0026] (b4)调控微生物在固体发酵中的外切纤维素酶活力；
[0027] (b5)调控微生物在固体发酵中的β-葡萄糖苷酶活力；
[0028] (b6)调控微生物在固体发酵中的木聚糖酶活力；
[0029] (b7)调控微生物在固体发酵中的纤维素酶基因的表达量；
[0030] (b8)调控微生物在固体发酵中的纤维二糖水解酶基因的表达量；
[0031] (b9)调控微生物在固体发酵中的内切β-1,4-葡聚糖酶基因的表达量；
[0032] (b10)调控微生物在固体发酵中的β-葡萄糖苷酶基因的表达量；
[0033] (b11)调控微生物在固体发酵中的半纤维素酶基因的表达量；
[0034] (b12)调控微生物在固体发酵中的木聚糖酶基因的表达量。
[0035] 所述(b4)和(b5)为正向调控；所述(b3)和(b6)为负向调控。
[0036] 所述纤维素酶基因具体可为POX05587、POX04786、POX01166、POX06147、POX06983、POX07535或POX06835。
[0037] 所述纤维二糖水解酶基因具体可为POX05587或POX04786。
[0038] 所述内切β-1,4-葡聚糖酶基因具体可为POX01166、POX06147、POX06983或POX07535。
[0039] 所述β-葡萄糖苷酶基因具体可为POX06835。
[0040] 所述半纤维素酶基因具体可为POX05916、POX06783或POX08484。
[0041] 所述木聚糖酶基因具体可为POX05916、POX06783或POX08484。
[0042] 本发明还保护提高微生物在固体发酵中的木聚糖酶活力和/或羧甲基纤维素酶活力的方法，为方法A或方法B；
[0043] 所述方法A包括如下步骤：抑制所述微生物中POX03016基因的表达，得到在固体发酵中的木聚糖酶活力活力提高和/或羧甲基纤维素酶活力提高的微生物；
[0044] 所述方法B包括如下步骤：降低所述微生物中POX03016蛋白的表达量和/或活性，得到在固体发酵中的木聚糖酶活力活力提高和/或羧甲基纤维素酶活力提高的微生物。
[0045] 本发明还保护降低抑制微生物在固体发酵中的外切纤维素酶活力和/或β-葡萄糖苷酶活力方法，为方法C或方法D；
[0046] 所述方法C包括如下步骤：抑制所述微生物中POX03016基因的表达，得到在固体发酵中的外切纤维素酶活力和/或β-葡萄糖苷酶活力降低的微生物；
[0047] 所述方法D包括如下步骤：降低所述微生物中POX03016蛋白的表达量和/或活性，得到在固体发酵中的外切纤维素酶活力和/或β-葡萄糖苷酶活力降低的微生物。
[0048] 以上任一所述“抑制所述微生物中POX03016基因的表达”是通过向所述微生物中导入POX03016基因敲除盒实现的。
[0049] 本发明还保护一种制备重组微生物的方法，包括如下步骤：将抑制POX03016基因表达的物质导入出发微生物，得到重组微生物；所述重组微生物具有如下(c1)-(c4)中的至少一种特征：
[0050] (c1)在固体发酵中的木聚糖酶活力活力提高；
[0051] (c2)在固体发酵中的羧甲基纤维素酶活力提高；
[0052] (c3)在固体发酵中的外切纤维素酶活力降低；
[0053] (c4)在固体发酵中的β-葡萄糖苷酶活力降低。
[0054] 所述抑制POX03016基因表达的物质具体可为POX03016基因敲除盒。
[0055] 所述抑制POX03016基因表达的物质还可为干扰载体；所述干扰载体为含有POX03016基因敲除盒的重组载体。
[0056] 以上任一所述POX03016基因敲除盒具体为序列表的序列4所示的DNA分子。
[0057] 以上任一所述微生物或所述出发微生物可为青霉，具体可为草酸青霉，更具体可为草酸青霉HP7-1。
[0058] 以上任一所述微生物或所述出发微生物更具体可为以草酸青霉HP7-1为出发菌，敲除其Ku70基因得到的重组菌。
[0059] 以上任一所述微生物或所述出发微生物更具体可为草酸青霉Ku70基因敲除突变体△PoxKu70。
[0060] 本发明还保护采用以上任一所述方法制备得到的重组微生物。
[0061] 本发明提供了一种草酸青霉的转录因子POX03016蛋白，POX03016蛋白在固态发酵中调控纤维素酶基因及木聚糖酶基因的表达过程中起关键性作用，在固态发酵提高纤维素酶和木聚糖酶中具有应用潜力。附图说明
[0062] 图1为POX03016基因敲除盒构建示意图。
[0063] 图2为构建POX03016基因敲除盒过程中的各种产物的电泳图。
[0064] 图3为突变株ΔPOX03016的PCR验证图。
[0065] 图4为突变株ΔPOX03016的Southern杂交验证图谱。
[0066] 图5为固体发酵中菌株的滤纸酶活力检测结果。
[0067] 图6为固体发酵中菌株的羧甲基纤维素酶活力检测结果。
[0068] 图7为固体发酵中菌株的木聚糖酶活力检测结果。
[0069] 图8为固体发酵中菌株的外切纤维素酶(pNPCase)活力检测结果。
[0070] 图9为固体发酵中菌株的β-葡萄糖苷酶(pNPGase)活力检测结果。
[0071] 图10为在葡萄糖培养条件下菌株的生物量检测结果。
[0072] 图11为固体发酵中菌株的纤维素酶基因和木聚糖酶基因的表达量的检测结果。
具体实施方式
[0073] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0074] 草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株HP7-1：参考文献：Zhao,S.,Yan,Y.S.,He,Q.P.,Yang,L.,Yin,X.,Li,C.X.,Mao,L.C.,Liao,L.S.,Huang,J.Q.,Xie S.B.,Nong,Q.D.,Zhang,Z.,Jing,L.,Xiong,Y.R.,Duan,C.J.,Liu,J.L.,Feng,J.X.Comparative genomic,transcriptomic and secretomic profiling of Penicillium oxalicum HP7-1and its cellulase and xylanase hyper-producing mutant EU2106,and identification oftwo novel regulatory genes ofcellulase and xylanase gene expression[J].Biotechnol Biofuel 2016,9:203；草酸青霉HP7-1在文献中的名称为“Penicillium oxalicum strain HP7-1”，公众也可以从广西大学获得。
[0075] 草酸青霉菌株EU2101在专利“草酸青霉EU2101及其在制备纤维素酶制剂与降解纤维素中的应用”(申请号：201610695936.X；申请公布号：CN 106047730A)中公开；保藏编号为：中国普通微生物菌株保藏中心CGMCC No.12769。
[0076] 质粒pCPXG418：参考文献：Chen MM,Jiang MG,Shang JJ,Lan XW,Yang F,Huang JK,Nuss DL,Chen BS.CYP1,a hypovirus-regulated cyclophilin,is required for virulence in the chestnut blight fungus[J].Molecular Plant Pathology 2011,12(3):239-246；质粒pCPXG418在文献中的名称为“transformation vectorpCPXG418”，公众可以从广西大学获得。
[0077] DNA纯化试剂盒：天根生化科技有限公司，货号：DP214。
[0078] 溶菌酶：索莱宝公司，货号：L8120。
[0079] 蜗牛酶：索莱宝公司，货号：S8280。
[0080] 裂解酶：Sigma-Aldrich公司，货号：L1412-5G。
[0081] PDA培养基：BD公司，货号：5056836。
[0083] 基本培养基：KH2PO44.0g、(NH4)2SO44.0g、MgSO4·7H2O 0.6g、CaCl20.6g、FeSO4·7H2O0.005g、MnSO40.0016g、ZnCl20.0017g、CoCl20.002g、吐温801.0g，蒸馏水定容至1L，pH5.5；115℃灭菌20分钟。
[0084] 葡萄糖培养基：在基本培养基配制时加入葡萄糖，葡萄糖在培养基中的浓度为1g/100mL。
[0085] 固体发酵培养基：麦麸4.0g、稻杆6.0g、20mL基础固体发酵盐溶液，121℃灭菌25分钟。
[0086] 基础固体发酵盐溶液：KH2PO42.5g、MgSO4·7H2O 2.5g、酵母提取物5.0g、吐温801mL，微量元素0.01％。
[0088] 固体发酵转接培养基：麦麸4.0g、稻杆6.0g、121℃灭菌25分钟。
[0089] 20×硝酸盐：NaNO3120g、KCl 10.4g、MgSO4·7H2O 10g、KH2PO430.4g，蒸馏水定容至1L。
[0090] 微量元素混合液：ZnSO4·7H2O 1.4g、MnSO4·H2O 1.6g、FeSO45g、CoCl22.0g，蒸馏水定容至1L。
[0091] 酶解液：溶菌酶0.2g、蜗牛酶0.3g、裂解酶0.3g，溶于50mL OM溶液中；28℃，180rpm震荡30分钟，离心，将上清液过滤除菌，得到酶解液。
[0092] OM溶液：MgSO4·7H2O 73.92g、NaH2PO40.3g，pH5.8，蒸馏水定容至500mL。
[0093] Trapping buffer溶液：山梨醇36.4g、Tris 6.05g，溶于400mL去离子水中，pH7.0，蒸馏水定容至500mL。
[0094] STC溶液：山梨醇91g、Tris 6g、CaCl25.55g，pH8.0，蒸馏水定容至500mL。
[0095] PTC溶液：聚乙二醇335040g、Tris 3g、CaCl22.25g，pH8.0，蒸馏水定容至250mL。
[0096] 0.1％吐温80溶液：由吐温80和水组成，吐温80含量为0.1％(v/v)。
[0097] 实施例1、转录因子POX03016及其编码基因的发现
[0099] 将序列表的序列1所示的蛋白命名为POX03016蛋白，由464个氨基酸残基组成。将编码POX03016蛋白的基因命名为POX03016基因，cDNA中的开放阅读框如序列表的序列2所示，基因组DNA如序列表的序列3所示。
[0100] 实施例2、POX03016基因敲除盒的构建
[0101] POX03016基因敲除盒构建示意图见图1。
[0102] 1、提取草酸青霉HP7-1的基因组DNA。
[0103] 2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用POX03016-left-F和POX03016-left-R组成的引物对进行PCR扩增，得到2495bp的PCR扩增产物即POX03016-左臂(电泳结果见图2的泳道1)。
[0104] POX03016-left-F：5’-CCATTCCAGGCAAGTACAGC-3’；
[0105] POX03016-left-R：5’-GGTAATCCTTCTTTCTAGAGATGGGGACCGATGTAGG-3’。
[0106] 3、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用POX03016-right-F和POX03016-right-R组成的引物对进行PCR扩增，得到2916bp的PCR扩增产物即POX03016-右臂(电泳结果见图2的泳道3)。
[0107] POX03016-right-F：5’-AATATCATCTTCTGTCGACAGGTGAGAGGGACCGGGAA-3’；
[0108] POX03016-right-R：5’-CGTAGCGGATGAAGTTGAGG-3’。
[0109] 4、以质粒pCPXG418为模板，采用引物对G418-F1和G418-R1组成的引物对进行PCR扩增，得到1890bp的PCR扩增产物即G418抗性基因(电泳结果见图2的泳道2)。
[0110] G418-F1：5’-TCTAGAAAGAAGGATTACCTCTAAA-3’；
[0111] G418-R1：5’-GTCGACAGAAGATGATATTGAAG-3’。
[0112] 5、将步骤2、步骤3和步骤4得到的三个PCR产物进行DNA纯化，纯化产物按照摩尔比1:1:1混合，将混合物作为模板，采用POX03016-nest-F和POX03016-nest-R组成的引物对进行PCR扩增，得到6387bp的PCR扩增产物(电泳结果见图2的泳道4)。
[0113] POX03016-nest-F：5’-TCAACTACCAGAGAAGCCCCAC-3’；
[0114] POX03016-nest-R：5’-CAAGCCTAAGTAGGAACGCAATT-3’。
[0115] 6、将步骤5得到的PCR扩增产物回收并测序，测序结果如序列表的序列4所示。
[0116] 序列表的序列4中，自5’端第1-2142位核苷酸为POX03016-左臂，第2143-4032位核苷酸为G418抗性基因，第4033-6387位核苷酸为POX03016-右臂。
[0117] 将序列表的序列4所示的双链DNA分子命名为POX03016基因敲除盒。实际应用中，也可以直接人工合成序列4所示DNA分子。
[0118] 实施例3、草酸青霉POX03016基因缺失突变株ΔPOX03016的构建与验证[0119] 一、草酸青霉突变株ΔPOX03016的构建
[0120] 1、以草酸青霉HP7-1为出发菌株，敲除其PoxKu70基因，得到草酸青霉突变体ΔPoxKu70。
[0121] 记载草酸青霉突变体ΔPoxKu70，以及敲除PoxKu70基因的具体步骤的文献如下：Zhao S,Yan YS,He QP,Yang L,Yin X,Li CX,Mao,LC.,Liao LS,Huang,JQ,Xie SB,Nong QD,Zhang,Z,Jing L,Xiong YR,Duan CJ,Liu JL,Feng JX.Comparative genomic,transcriptomic and secretomic profiling ofPenicillium oxalicum HP7-1and its cellulase and xylanase hyper-producing mutant EU2106,and identification of two novel regulatory genes of cellulase and xylanase gene expression[J].Biotechnology for Biofuels 2016,9:203；草酸青霉突变体ΔPoxKu70在文献中的名称为“mutantΔPoxKu70”。草酸青霉突变体ΔPoxKu70保藏号为：中国普通微生物菌株保藏中心CGMCC 3.15650，公众也可从广西大学获得。
[0122] 2、制备草酸青霉突变体ΔPoxKu70的原生质体
[0123] (1)将草酸青霉突变体ΔPoxKu70接种于PDA培养基平板上，28℃静置培养6天，用0.1％吐温80溶液洗脱孢子，得到孢子悬浮液(1×108个孢子/mL)。
[0124] (2)取2mL步骤(1)得到的孢子悬浮液，接种至200mL CM培养基中，28℃、180rpm振荡培养8h。
[0125] (3)完成步骤(2)后，4℃、3500rpm离心，收集菌丝，用0.6M MgSO4水溶液洗涤2次。
[0126] (4)取步骤(3)得到的菌丝，用酶解液重悬，28℃、180rpm振荡反应2-3小时以进行酶解；用显微镜观察到大部分菌丝形成原生质体后，按每管12.5mL分装到50mL离心管中,加入2倍体积的Trappingbuffer溶液，4℃、3500rpm离心30min。
[0127] (5)完成步骤(4)后，用巴氏吸管小心地吸出中间层的原生质体至新的50mL离心管中，加入2倍体积的1M山梨醇水溶液漂洗2次，4℃、3500rpm离心15min，再使用20mL STC溶液漂洗2次，离心，弃上清，得到原生质体。
[0128] 3、突变株ΔPOX03016的构建
[0129] (1)将4体积份STC溶液和1体积份PTC溶液混合，用混合液重悬步骤2得到的原生质体，得到原生质体溶液(调整浓度为1×107个/mL)。
[0130] (2)用实施例2得到的POX03016基因敲除盒转化草酸青霉突变体ΔPoxKu70的原生质体(方法参照文献：Churchill ACL,Ciuffetti LM,Hansen DR,Van Etten HD,Van Alfen NK.Transformation of the fungal pathogen Cryphonectria parasitica with a variety of heterologous plasmids[J].Current Genetics 1990,17:25-31)，具体步骤如下：
[0131] ①将5μgPOX03016基因敲除盒和1μL 100mM亚精胺溶液混合,加入到100μL步骤(1)制备的原生质体溶液中，混合均匀，冰上反应30min。
[0132] ②完成步骤①后，向体系中加入1mLPTC溶液，混合均匀，室温放置25min。
[0133] ③完成步骤②后，向体系中加入2mL STC溶液，混合均匀，将混合液加入到30mL预热的再生培养基中，混合均匀，然后倒入到无菌培养皿中(按每个培养皿分别倒入2-5mL)；待完全凝固后，室温放置30min，每个培养皿再倒入40mL含有800μg/mL G418和250μg/mL潮霉素的固体PDA培养基，完全凝固后28℃倒置培养5天。
[0134] ④完成步骤③后，收集孢子，用0.1％吐温80溶液冲洗，放入到新离心管中，用无菌水梯度稀释孢子悬浮液，将每个稀释梯度的孢子悬浮液涂在两个含有800μg/mL G418和250μg/mL潮霉素的PDA培养基平板上，28℃培养4天，挑选单菌落，随机选取三个候选突变株(菌株Δ11、菌株Δ14和菌株Δ15)，提取基因组DNA，用引物对甲(POX03016-left-F/G418-R2，靶序列位于POX03016基因敲除盒，为2749bp)、引物对乙(G418-F2/POX03016-right-R，只有POX03016基因敲除盒与草酸青霉突变体ΔPoxKu70的基因组DNA发生同源重组后得到的POX03016基因缺失突变株中存在靶序列，为3144bp)和引物对丙(POX03016-F/POX03016-R，靶序列位于草酸青霉突变体ΔPoxKu70的基因组DNA，为1396bp)进行PCR验证。引物序列如下：
[0135] POX03016-left-F：5’-CCATTCCAGGCAAGTACAGC-3’；
[0136] G418-R2：5’-GCCCTGGGTTCGCAAAGATA-3’；
[0137] G418-F2：5’-AATAATGTCCTCGTTCCTGTCTGC-3’；
[0138] POX03016-right-R：5’-CGTAGCGGATGAAGTTGAGG-3’；
[0139] POX03016-F：5’-CACCGGTACCTTTTTGCGC-3’；
[0140] POX03016-R：5’-TGCCATTCATCATCAGAGGG-3’。
[0141] 结果如图3所示。图3中，泳道M为1kb DNAMarker，泳道1为ddH2O，泳道2为为草酸青霉突变体ΔPoxKu70，泳道3为菌株Δ11，泳道4菌株Δ14，泳道5为菌株Δ15。图3甲为采用引物对甲的扩增产物，图3乙为采用引物对乙的扩增产物，图3丁为采用引物对丙的扩增产物。结果表明，采用引物对甲时，菌株Δ11、菌株Δ14和菌株Δ15都得到了预期大小的扩增产物，草酸青霉突变体ΔPoxKu70没有相应扩增产物。采用引物对乙时，菌株Δ11、菌株Δ14和菌株Δ15都得到了预期大小的扩增产物，草酸青霉突变体ΔPoxKu70没有相应扩增产物。采用引物对丙时，草酸青霉突变体ΔPoxKu70得到了预期大小的扩增产物，菌株Δ11、菌株Δ
14和菌株Δ15均没有相应扩增产物。
14和菌株Δ15均没有相应扩增产物。
[0142] ⑤将草酸青霉突变体ΔPoxKu70、菌株Δ11、菌株Δ14和菌株Δ15分别进行如下操作：提取基因组DNA，采用限制性内切酶EcoR I进行酶切，然后进行Southern杂交分析。Southern杂交分析所用的探针，是以草酸青霉突变体ΔPoxKu70的基因组DNA为模板，采用引物对丁(POX03016-S-F/POX03016-S-R)进行PCR扩增得到的。引物序列如下：
[0143] POX03016-S-F：5’-GTTATCCTCTTCAGCCCACTCT-3’；
[0144] POX03016-S-R：5’-CGGGTTCGGTTGAAATGG-3’。
[0145] 结果见图4。图4中，泳道M为1kb DNAMarker，泳道1为草酸青霉突变体ΔPoxKu70，泳道2为Δ11菌株，泳道3为Δ14菌株，泳道4为Δ15菌株。结果表明，Δ11菌株、Δ14菌株和Δ15菌株均得到大小为5520bp的杂交带，突变体ΔPoxKu70得到2900bp的杂交带，与预计结果一致。
[0146] 以上结果表明，将POX03016基因敲除盒导入草酸青霉突变体△PoxKu70得到的三个转化子(Δ11、Δ14和Δ15)均为POX03016基因被敲除的突变菌株，分别命名为ΔPOX03016-11、ΔPOX03016-14和ΔPOX03016-15。将敲除POX03016基因的该3个突变菌株均命名为突变株ΔPOX03016。
[0147] 实施例4、固体发酵中草酸青霉菌株的纤维素酶和木聚糖酶活力的测定[0148] 待测菌株分别为：草酸青霉突变体ΔPoxKu70、突变株ΔPOX03016-11、突变株ΔPOX03016-14和突变株ΔPOX03016-15。
[0149] 1、将待测菌株接种于PDA培养基平板上，28℃静置培养6天。
[0150] 2、完成步骤1后，用0.1％吐温80溶液洗脱孢子，得到孢子悬浮液(1×108个孢子/mL)。
[0151] 3、将1mL步骤2得到的孢子悬浮液接种至100mL葡萄糖培养基中，28℃、180rpm振荡培养24小时，离心收集菌体，用无菌水洗涤2-3次。
[0152] 4、取步骤3得到的菌体(湿重为1g)，转接到固体发酵转接培养基中，28℃，静置培养。
[0153] 分别于培养2天、3天、4天后收集含有菌丝体的固体发酵转接培养基，加入200mL去离子水浸提，28℃、180rpm振荡1小时，8000rpm离心10min，收集上清液，即为粗酶液。
[0154] 检测粗酶液的如下各项酶活力：滤纸酶活力(FPase酶活力)、羧甲基纤维素酶活力(CMC酶活力)、外切纤维素酶活力(pNPCase酶活力)、β-葡萄糖苷酶活力(pNPGase酶活力)和木聚糖酶活力。检测方法参照文献：Ghose TK.Measurement ofcellulase activities[J].Pure and Applied Chemistry 1959,(59):257-268；Gokhale DV,Puntambekar US,Deobagkar DN,Peberby JF.Production ofcellulolytic enzymes by mutants ofAspergillus nigerNCIM 1207[J].Enzyme and Microbial Technology 1988,(10):442-445。
[0155] 滤纸酶活力的测定结果见图5。羧甲基纤维素酶活力的测定结果见图6。木聚糖酶活力的测定结果见图7。外切纤维素酶活力的测定结果见图8。β-葡萄糖苷酶活力的测定结果见图9。结果表明，与草酸青霉突变体ΔPoxKu70相比，三株突变株(ΔPOX03016-11、ΔPOX03016-14和ΔPOX03016-15)的滤纸酶活力和羧甲基纤维素酶活力在培养第2和3天，显著升高，第4天没有显著的变化；外切纤维素酶活力和β-葡萄糖苷酶活力均显著降低；木聚糖酶活力显著升高。结果表明，POX03016蛋白为菌株生产滤纸酶、羧甲基纤维素酶、外切纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶的调控转录因子。
[0156] 实施例5、在葡萄糖培养基中草酸青霉菌株的生物量的测定
[0157] 待测菌株分别为：草酸青霉突变体ΔPoxKu70和突变株ΔPOX03016-11。
[0158] 1、将待测菌株接种于PDA培养基平板上，28℃静置培养6天。
[0159] 2、完成步骤1后，用0.1％吐温80溶液洗脱孢子，得到孢子悬浮液(1×108个孢子/mL)。
[0160] 3、将1mL步骤2得到的孢子悬浮液接种至100mL葡萄糖培养基中，28℃、180rpm振荡培养。
[0161] 分别于培养12小时、24小时、36小时、48小时、60小时和72小时后收集菌丝体，50℃烘干至恒重,测定生物量(菌丝体干重)，计算生物量在培养体系中的浓度。
[0162] 结果见图10。结果表明，培养前36小时，草酸青霉突变体ΔPoxKu70和突变株ΔPOX03016-11的生物量保持一致；第36-72小时，突变株ΔPOX03016-11的生物量相比草酸青霉突变体ΔPoxKu70降低了10.9-14.4％。
[0163] 结果表明，缺失POX03016基因影响草酸青霉菌体在葡萄糖培养基中的生长。
[0164] 实施例6、POX03016基因对草酸青霉在固体发酵中的纤维素酶基因和木聚糖酶基因转录水平的影响
[0165] 待测菌株分别为：草酸青霉突变体ΔPoxKu70和突变株ΔPOX03016-11。
[0166] 1、将待测菌株接种于PDA培养基平板上，28℃静置培养6天。
[0167] 2、完成步骤1后，用0.1％吐温80溶液洗脱孢子，得到孢子悬浮液(1×108个孢子/mL)。
[0168] 3、将1mL步骤2得到的孢子悬浮液接种至100mL葡萄糖培养基中，28℃、180rpm培养24小时，收集菌丝体。
[0169] 4、将步骤3得到的全部菌丝体转接至固体发酵转接培养基中，28℃、静置培养。
[0170] 分别于培养12小时、24小时和48小时后收集菌丝体，提取总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，进行RT-qPCR，检测关键纤维素酶基因(2个cbhs基因：POX05587和POX04786；4个egs基因：POX01166、POX06147、POX06983和POX07535；1个bgl基因：POX06835)和木聚糖酶基因(3个xyns基因：POX05916、POX06783和POX08484基因)的表达情况。用actin基因作为内参基因。
[0171] RT-qPCR检测引物如下所示(5’→3’)：
[0172] actin-F：CTCCATCCAGGCCGTTCTG；
[0173] actin-R：CATGAGGTAGTCGGTCAAGTCAC；
[0174] POX05587-F：GTACTTGCGATCCTGATGGG；
[0175] POX05587-R：CCACGGTGAAGGGAGACTTG；
[0176] POX04786-F：TACTACGCTTCCGAGGTTCAGAG；
[0177] POX04786-R：GTGTCCAGCCAAACGAAGG；
[0178] POX01166-F：CGATACTACGGCAACATCATCAC；
[0179] POX01166-R：AGGCACCAGTCCACGAGTTT；
[0180] POX06147-F：CACAATTACGCTCGCTGGAA；
[0181] POX06147-R：GGCTCGTTCATCACACCAAA；
[0182] POX06983-F：GATCAACCACCAGGGTCTCAA；
[0183] POX06983-R：CAAACAACAGCCACGGAGTAAG；
[0184] POX06835-F：GTGCTGGATGGGAACAGGA；
[0185] POX06835-R：TACGAACGCCGAGAGGAGA；
[0186] POX05916-F：ATCGAGAATCAGGGCACAAAG
[0187] POX05916-R：ATCCGCCAACGAAGGTGT
[0188] POX08484-F：ACAAGCACACGCAGGTCAA；
[0189] POX08484-R：CGCTGAAGTGGTTGGCAGT；
[0190] POX06783-F：TGAGCCCAGGACCATCAACTT；
[0191] POX06783-R：TACCCTTGCTTTTGCCGCC。
[0192] 结果如图11所示，其中差异表达量表示突变株ΔPOX03016-11在固体发酵中的纤维素酶基因或木聚糖酶基因的转录水平减去草酸青霉突变体ΔPoxKu70中这些基因的转录水平。固体发酵诱导12小时后：突变株ΔPOX03016-11中2个cbhs基因(POX05587和POX04786)、4个eg基因(POX01166、POX06147、POX06983和POX07535)与3个xyns基因(POX05916、POX06783和POX08484)的转录水平相对于草酸青霉突变体ΔPoxKu70中这些基因的转录水平显著上调，上调程度介于73.1％至458.6％之间；在固体发酵诱导24小时后，1个cbh基因(POX04786)、4个eg基因(POX01166、POX06147、POX06983和POX07535)与3个xyns基因(POX05916、POX06783和POX08484)的转录水平相对于草酸青霉突变体ΔPoxKu70中这些基因的转录水平显著上调，上调程度介于36.2％至312.5％之间；1个bgl基因POX06835的转录水平相对于草酸青霉突变体ΔPoxKu70中这个基因的转录水平显著下调19.8％。在固体发酵诱导48小时后：2个eg基因(POX06983和POX07535)和1个xyn基因POX08484的转录水平相对于草酸青霉突变体ΔPoxKu70的显著上调，上调程度介于20.0％至117.1％之间；1个cbh基因POX04786、1个eg基因POX06147、1个bgl基因POX06835和1个xyn基因POX06783的转录水平相对于草酸青霉突变体ΔPoxKu70的显著下调，下调程度介于14.2％至42.6％之间。由此可见，在固体发酵诱导条件下，POX03016基因对纤维素酶基因和木聚糖酶基因的表达主要起负调控的作用。
[0193] 以上结果表明，POX03016蛋白对草酸青霉在固体发酵中关键纤维素酶基因和木聚糖酶基因的转录表达起关键调控作用。
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