防御素变体及其使用方法
阅读：673发布：2024-01-15
专利汇可以提供防御素变体及其使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及保护 植物 免受病原体，尤其是 真菌 病原体侵害的组合物和方法。组合物包括通过DNA改组生成的抗病原菌多肽的新型变体的 氨 基酸序列及其变体和 片段 ，其表现出改善的抗病原菌活性。还提供了编码所述抗病原菌多肽的多核苷酸。还提供了一种使用本文所公开的所述多核苷酸诱导植物中的病原抗性的方法。还提供了包含抗病原菌多肽或具有本发明的抗病原菌多核苷酸与载体组合的 微 生物 的组合物，以及使用这些组合物保护植物免受病原体侵害的方法。还公开了包含本发明的抗病原菌多核苷酸或多肽的植物、植物细胞、 种子 和微生物。，下面是防御素变体及其使用方法专利的具体信息内容。
1.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸由选自以下的核苷酸序列组成：
(a) SEQ ID NO: 9或11中示出的核苷酸序列；
(b) 编码SEQ ID NO: 10或12的氨基酸序列的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO: 10或12的氨基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸编码具有抗病原体活性的多肽，并且其中所述氨基酸序列具有选自如下的氨基酸残基中的至少一者：
(a) SEQ ID NO: 10或12的第1位残基对应的位置处的精氨酸(Arg)残基；
(b) SEQ ID NO: 10或12的第16位残基对应的位置处的丝氨酸(Ser)残基；
(c) SEQ ID NO: 10或12的第25位残基对应的位置处的精氨酸(Arg)残基；
(d) SEQ ID NO: 10或12的第36位残基对应的位置处的丝氨酸(Ser)残基；以及(e) SEQ ID NO: 10或12的第42位残基对应的位置处的丝氨酸(Ser)残基。
3.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有抗真菌活性的多肽，其中所述多肽的抗真菌活性与包含SEQ ID NO: 2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时有所提高。
4.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码的多肽与包含SEQ ID NO: 2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有对禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。
5.一种表达盒，所述表达盒包含权利要求1所述的多核苷酸。
6.制备宿主细胞的方法，所述宿主细胞包含权利要求5所述的表达盒。
7.一种微生物，所述微生物包含权利要求5所述的表达盒。
8.一种产生植物或植物部分的方法，所述植物或植物部分包含有效连接至驱动在所述植物中表达的启动子的异源多核苷酸，其中所述异源多核苷酸由选自如下的核苷酸序列组成：
(a) SEQ ID NO: 9或11中示出的核苷酸序列；
(b) 编码SEQ ID NO: 10或12的氨基酸序列的核苷酸序列
所述方法包括将有效连接至驱动在所述植物中表达的启动子的异源多核苷酸引入所述植物或植物部分的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO: 10或12的氨基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸编码具有抗病原体活性的多肽，并且其中所述氨基酸序列具有选自如下的氨基酸残基中的至少一者：
(a) SEQ ID NO: 10或12的第1位残基对应的位置处的精氨酸(Arg)残基；
(b) SEQ ID NO: 10或12的第16位残基对应的位置处的丝氨酸(Ser)残基；
(c) SEQ ID NO: 10或12的第25位残基对应的位置处的精氨酸(Arg)残基；
(d) SEQ ID NO: 10或12的第36位残基对应的位置处的丝氨酸(Ser)残基；以及(e) SEQ ID NO: 10或12的第42位残基对应的位置处的丝氨酸(Ser)残基。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述多肽与由SEQ ID NO: 2或4中示出的氨基酸序列组成的多肽相比时，具有改善的抗真菌活性。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述多肽与由SEQ ID NO: 2或4中示出的氨基酸序列组成的多肽相比时，具有对禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述植物是选自细胞、种子和籽粒的植物部分。
13.根据权利要求8所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。
14.根据权利要求8所述的方法，其中所述植物是双子叶植物。
15.根据权利要求8所述的方法，其中所述多核苷酸稳定整合到所述植物的基因组。
16.一种增强植物中植物病原体抗性的方法，所述方法包括为所述植物提供SEQ ID NO: 10或12中示出的氨基酸序列的多肽。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述多肽氨基酸序列为SEQ ID NO: 10或12，并且其中所述氨基酸序列具有选自如下的氨基酸残基中的至少一者：
(a) SEQ ID NO: 10或12的第1位残基对应的位置处的精氨酸(Arg)残基；
(b) SEQ ID NO: 10或12的第16位残基对应的位置处的丝氨酸(Ser)残基；
(c) SEQ ID NO: 10或12的第25位残基对应的位置处的精氨酸(Arg)残基；
(d) SEQ ID NO:10或12的第36位残基对应的位置处的丝氨酸(Ser)残基；以及(e) SEQ ID NO: 10或12的第42位残基对应的位置处的丝氨酸(Ser)残基。
18.一种抗病原体组合物，所述抗病原体组合物包含根据权利要求2中所描述的至少一种多肽。
19.根据权利要求18所述的组合物，还包含载体。
20.一种保护植物免受病原体侵害的方法，所述方法包括将根据权利要求18所述的组合物施用至植物病原体的环境。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述组合物通过选自喷雾、喷粉、撒播和种子包衣的方法施用。
防御素变体及其使用方法
技术领域
背景技术
[0002] 植物病害通常严重限制了农业生产力，因此影响了农耕作业的历程和发展。多种病原体导致植物病害，包括真菌、细菌、病毒和线虫。然而，在农作物传染病的致病病原中，真菌是经济上最重要的植物病原体群，它们每年造成大批适销食物、纤维和饲料损失。
[0003] 在传统上是通过农耕作业，包括轮作、使用农用化学品以及常规的繁育技术，来控制植物病害的发生。然而，使用化学品控制植物病原体会增加农民的成本，并且对生态系统造成有害影响。消费者和政府管理者等越来越关切生产和使用保护植物免受病原体侵害的合成农用化学品相关的环境危害。由于这些关切，管理者已禁止或限制使用更具危害性的化学品中的一些。通过繁育抗性作物在一定程度上控制了真菌病害的发生。然而，传统繁育方法是耗时的，且随着病原体的进化需要连续的努力来维持病害抗性。参见（例如）Grover and Gowthaman(2003)Curr.Sci.84:330-340（Grover和Gowthaman，2003年，《现代科学》，第84卷，第330-340页）。因此，研究人员对于开发用于控制植物病原体的新型替代方法表现出极大的兴趣，该方法与基于传统农用化学品的方法特性相比具有更低污染和环境危害风险，并且与常规繁育技术相比繁琐性更低。
[0004] 最近，农业科学家通过对植物进行基因工程操作使之表达抗病原蛋白，培育出了病原抗性增强的农作物。目前正不断努力，进行抗病原菌药剂的鉴别以及病害抗性植物的基因工程操作。
[0005] 因此，鉴于植物病原体，尤其是真菌病原体对作物产量和质量的显著影响，需要保护植物免受病原体侵害的新组合物和方法。
发明内容
[0006] 提供了保护植物免受病原体侵害的组合物和方法。该组合物包含抗病原菌（尤其是抗真菌）多肽的新型核苷酸和氨基酸序列。本发明所公开的多肽显示出对植物真菌病原体的抗病原菌活性。还提供了包含编码本发明所公开的抗病原菌多肽的核苷酸序列的多核苷酸。通过使用DNA改组鉴别多肽和编码该多肽的核苷酸序列。在一些实施例中，与用于产生新型抗病原菌多肽编码序列的DNA改组事件的亲本多肽相比时，抗真菌多肽显示出具有改善的抗病原菌活性。组合物还包含表达盒，其包含编码本文所公开的抗病原菌多肽的多核苷酸。还提供了包含本发明所公开的多核苷酸和多肽的植物、植物细胞、种子和微生物。
[0007] 该组合物用于涉及在植物中诱导病原抗性，尤其是真菌抗性的方法。在特定实施例中，该方法包括将编码抗病原多肽的至少一种多核苷酸引入植物。因此，抗病原多肽在植物中表达，并且病原体暴露于病原体攻击位点的优选蛋白质，从而增强病原抗性。组织优选的启动子可用于驱动抗病原菌蛋白在尤其易受病原体攻击的特定植物组织，例如根、叶、茎、维管组织和种子中的表达。病原体诱导型启动子也可用于驱动病原体感染位点处或附近抗病原菌蛋白的表达。
[0008] 还提供了抗病原菌组合物和制剂，以及将它们用于保护植物免受病原体，尤其是真菌病原体侵害的方法。在一些实施例中，组合物包含抗病原菌多肽，或包含具有编码抗病原菌多肽的多核苷酸与载体组合的微生物。使用这些组合物保护植物免受病原体侵害的方法包括通过（例如）喷雾、喷粉、撒播或种子包衣将抗病原菌组合物施用至植物病原体的环境。本发明所公开的方法和组合物可用于保护植物免受病原体，包括真菌病原体、病毒、线虫等等的侵害。
[0009] 本发明涵盖以下实施例：
[0010] 1.一种分离的多肽，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：
[0011] (a)SEQ ID NO:6、8、10或12中示出的氨基酸序列；以及
[0012] (b)与SEQ ID NO:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有抗病原菌活性。
[0013] 2.实施例1的分离的多肽，其中所述多肽具有与SEQ ID NO:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述氨基酸序列具有选自如下的氨基酸残基中的至少一者：
[0014] (a)SEQ ID NO:6、8、10或12的第1位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；
[0015] (b)SEQ ID NO:6、8、10或12的第16位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；
[0016] (c)SEQ ID NO:6、8、10或12的第25位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；
[0017] (d)SEQ ID NO:6、8、10或12的第36位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；以及[0018] (e)SEQ ID NO:6、8、10或12的第42位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基。
[0019] 3.实施例1或实施例2的分离的多肽，其中所述多肽具有抗真菌活性。
[0020] 4.实施例3的分离的多肽，其中所述多肽与包含SEQ ID NO:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有改善的抗真菌活性。
[0021] 5.实施例2的分离的多肽，其中所述多肽与包含SEQ ID NO:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有对禾生炭疽菌(Colletotrichum graminocola)和禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)中至少一者的改善的抗真菌活性。
[0022] 6.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
[0023] (a)SEQ ID NO:3、5、7或9中示出的核苷酸序列；
[0024] (b)编码包含SEQ ID NO:6、8、10或12的氨基酸序列的核苷酸序列；
[0025] (c)与SEQ ID NO:5、7、9或11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽；以及
[0026] (d)编码与SEQ ID NO:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽。
[0027] 7.实施例6的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有与SEQ ID NO:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽，并且其中所述氨基酸序列具有选自如下的氨基酸残基中的至少一者：
[0028] (a)SEQ ID NO:6、8、10或12的第1位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；
[0029] (b)SEQ ID NO:6、8、10或12的第16位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；
[0030] (c)SEQ ID NO:6、8、10或12的第25位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；
[0031] (d)SEQ ID NO:6、8、10或12的第36位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；以及[0032] (e)SEQ ID NO:6、8、10或12的第42位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基。
[0033] 8.实施例6的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有抗真菌活性的多肽。
[0034] 9.实施例8的分离的多核苷酸，其中所述多肽与包含SEQ ID NO:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时具有改善的抗真菌活性。
[0035] 10.实施例8的分离的多核苷酸，其中所述多肽与包含SEQ ID NO:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有对禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。
[0036] 11.包含实施例6-10中任一项的多核苷酸的表达盒。
[0037] 12.实施例11的表达盒，其中所述多核苷酸有效连接至驱动在植物中表达的启动子。
[0038] 13.实施例11的表达盒，其中所述多核苷酸有效连接至驱动在微生物中表达的启动子。
[0039] 14.包含实施例6-10中任一项的多核苷酸的宿主细胞。
[0040] 15.包含实施例11的表达盒的宿主细胞。
[0041] 16.包含有效连接至驱动在植物中表达的启动子的异源多核苷酸的植物，其中所述异源多核苷酸包含选自如下的核苷酸序列：
[0042] (a)SEQ ID NO:5、7、9或11中示出的核苷酸序列；
[0043] (b)编码包含SEQ ID NO:6、8、10或12的氨基酸序列的核苷酸序列；
[0044] (c)与SEQ ID NO:5、7、9或11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽；以及
[0045] (d)编码与SEQ ID NO:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽。
[0046] 17.实施例16的植物，其中所述多核苷酸编码具有与SEQ ID NO:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽，并且其中所述氨基酸序列具有选自如下的氨基酸残基中的至少一者：
[0047] (a)SEQ ID NO:6、8、10或12的第1位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；
[0048] (b)SEQ ID NO:6、8、10或12的第16位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；
[0049] (c)SEQ ID NO:6、8、10或12的第25位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；
[0050] (d)SEQ ID NO:6、8、10或12的第36位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；以及[0051] (e)SEQ ID NO:6、8、10或12的第42位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基。
[0052] 18.实施例16的植物，其中所述多核苷酸编码具有抗真菌活性的多肽。
[0053] 19.实施例18的植物，其中所述多肽与包含SEQ ID NO:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有改善的抗真菌活性。
[0054] 20.实施例18的植物，其中所述多肽与包含SEQ ID NO:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有对禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。
[0055] 21.实施例16-20中任一项的植物，其中所述核苷酸序列经过优化，以便在植物中表达。
[0056] 22.实施例16-20中任一项的植物，其中所述植物是选自细胞、种子和籽粒的植物部分。
[0057] 23.实施例16-20中任一项的植物，其中所述植物是单子叶植物。
[0059] 25.实施例16-20中任一项的植物，其中所述植物是双子叶植物。
[0060] 26.实施例25的植物，其中所述双子叶植物是大豆、芸苔、向日葵、棉花或苜蓿。
[0061] 27.实施例16-20中任一项的植物，其中所述多核苷酸稳定整合到植物的基因组。
[0062] 28.实施例16-20中任一项的植物，其中所述植物显示出增强了对植物病原体的抗性。
[0063] 29.实施例28的植物，其中所述植物病原体是真菌。
[0064] 30.实施例29的植物，其中所述真菌为禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中的至少一者。
[0065] 31.实施例16-20中任一项的植物，其中所述启动子是组织优选的启动子。
[0066] 32.实施例31的植物，其中所述组织优选的启动子选自叶优选的启动子、根优选的启动子、种子优选的启动子、茎优选的启动子和维管组织优选的启动子。
[0067] 33.实施例16-20中任一项的植物，其中所述启动子是病原体诱导型启动子。
[0068] 34.实施例16-33中任一项的植物的转化种子。
[0069] 35.增强植物中植物病原抗性的方法，所述方法包括为所述植物提供选自如下的多肽：
[0070] (a)包含SEQ ID NO:6、8、10或12中示出的氨基酸序列的多肽；以及
[0071] (b)包含与SEQ ID NO:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽具有抗病原菌活性。
[0072] 36.实施例35的方法，其中所述多肽具有与SEQ ID NO:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述氨基酸序列具有选自如下的氨基酸残基中的至少一者：
[0073] (a)SEQ ID NO:6、8、10或12的第1位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；
[0074] (b)SEQ ID NO:6、8、10或12的第16位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；
[0075] (c)SEQ ID NO:6、8、10或12的第25位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；
[0076] (d)SEQ ID NO:6、8、10或12的第36位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；以及[0077] (e)SEQ ID NO:6、8、10或12的第42位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基。
[0078] 37.实施例35的方法，其中所述多肽具有抗真菌活性。
[0079] 38.实施例37的方法，其中所述多肽与包含SEQ ID NO:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有改善的抗真菌活性。
[0080] 39.实施例37的方法，其中所述多肽与包含SEQ ID NO:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有对禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。
[0081] 40.实施例35-39中任一项的方法，其中所述植物是选自细胞、种子和籽粒的植物部分。
[0082] 41.实施例35-39中任一项的方法，其中所述植物是单子叶植物。
[0083] 42.实施例41的方法，其中所述单子叶植物是玉米、甘蔗、小麦、水稻、大麦、高粱或裸麦。
[0084] 43.实施例35-39中任一项的方法，其中所述植物是双子叶植物。
[0085] 44.实施例43的方法，其中所述双子叶植物是大豆、芸苔、向日葵、棉花或苜蓿。
[0086] 45.实施例35-39中任一项的方法，其中所述植物病原体是真菌。
[0087] 46.实施例45的植物，其中所述真菌是禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中的至少一者。
[0088] 47.实施例35的方法，其中所述植物种植在耕作区，其中所述耕作区具有所述植物病原体，或其中所述种植区的环境条件有利于所述植物病原体的生长。
[0089] 48.实施例35的方法，其中提供多肽包括将包含选自如下核苷酸序列的异源多核苷酸引入所述植物：
[0090] (a)SEQ ID NO:5、7、9或11中示出的核苷酸序列；
[0091] (b)编码包含SEQ ID NO:6、8、10或12的氨基酸序列的核苷酸序列；
[0092] (c)与SEQ ID NO:5、7、9或11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽；以及
[0093] (d)编码与SEQ ID NO:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽。
[0094] 49.实施例48的方法，其中所述多核苷酸编码具有与SEQ ID NO:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽，并且其中所述氨基酸序列具有选自如下的氨基酸残基中的至少一者：
[0095] (a)SEQ ID NO:6、8、10或12的第1位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；
[0096] (b)SEQ ID NO:6、8、10或12的第16位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；
[0097] (c)SEQ ID NO:6、8、10或12的第25位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；
[0098] (d)SEQ ID NO:6、8、10或12的第36位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；以及[0099] (e)SEQ ID NO:6、8、10或12的第42位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基。
[0100] 50.实施例48的方法，其中所述多核苷酸编码具有抗真菌活性的多肽。
[0101] 51.实施例50的方法，其中所述多肽与包含SEQ ID NO:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有改善的抗真菌活性。
[0102] 52.实施例50的方法，其中所述多肽与包含SEQ ID NO:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有对禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。
[0103] 53.实施例48-52中任一项的方法，其中所述多核苷酸稳定整合到植物的基因组。
[0104] 54.实施例48-52中任一项的方法，其中所述异源多核苷酸有效连接至所述植物中具有活性的启动子。
[0105] 55.实施例54的方法，其中所述启动子是组织优选的启动子。
[0106] 56.实施例55的方法，其中所述组织优选的启动子选自叶优选的启动子、根优选的启动子、种子优选的启动子、茎优选的启动子和维管组织优选的启动子。
[0107] 57.实施例54的方法，其中所述启动子是病原体诱导型启动子。
[0108] 58.包含根据实施例1-5中任一项的至少一种多肽的抗病原菌组合物。
[0109] 59.实施例58的组合物，还包含载体。
[0110] 60.保护植物免受植物病原体侵害的方法，该方法包括将根据实施例58的组合物施用至植物病原体的环境。
[0111] 61.实施例60的方法，其中所述组合物通过选自喷雾、喷粉、撒播和种子包衣的方法施用。
[0112] 62.实施例60的方法，其中所述植物病原体是真菌。
[0113] 63.实施例62的方法，其中所述真菌为禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中的至少一者。
[0114] 64.包含有效连接至驱动在微生物中表达的启动子的至少一种异源多核苷酸的微生物，其中所述多核苷酸包含选自如下的核苷酸序列：
[0115] (a)SEQ ID NO:5、7、9或11中示出的核苷酸序列；
[0116] (b)编码包含SEQ ID NO:6、8、10或12的氨基酸序列的核苷酸序列；
[0117] (c)与SEQ ID NO:5、7、9或11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽；以及
[0118] (d)编码与SEQ ID NO:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽。
[0119] 65.实施例64的微生物，其中所述多核苷酸编码具有与SEQ ID NO:4、6、8或10具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽，并且其中所述氨基酸序列具有选自如下的氨基酸残基中的至少一者：
[0120] (a)SEQ ID NO:6、8、10或12的第1位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；
[0121] (b)SEQ ID NO:6、8、10或12的第16位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；
[0122] (c)SEQ ID NO:6、8、10或12的第25位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；
[0123] (d)SEQ ID NO:6、8、10或12的第36位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；以及[0124] (e)SEQ ID NO:6、8、10或12的第42位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基。
[0125] 66.实施例64的微生物，其中所述多核苷酸编码具有抗真菌活性的多肽。
[0126] 67.实施例66的微生物，其中所述多肽与包含SEQ ID NO:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有改善的抗真菌活性。
[0127] 68.实施例66的微生物，其中所述多肽与包含SEQ ID NO:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有对禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。
[0128] 69.包含根据实施例64-68中任一项的至少一种微生物的抗病原菌组合物。
[0129] 70.实施例69的组合物，还包含载体。
[0130] 71.保护植物免受病原体侵害的方法，该方法包括将根据实施例69的组合物施用至植物病原体的环境。
[0131] 72.实施例71的方法，其中所述组合物通过选自喷雾、喷粉、撒播和种子包衣的方法施用。
[0132] 73.实施例71的方法，其中所述植物病原体是真菌。
[0133] 74.实施例73的方法，其中所述真菌为禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中的至少一者。
[0134] 75.控制耕作区中的病原体的方法，所述方法包括：
[0135] a)评估耕作区的环境条件是否存在病原体或条件是否有利于病原体生长；
[0136] b)选择有效量的抗病原菌组合物，其中所述抗病原菌组合物为根据实施例58或实施例69的组合物；以及
[0137] c)将所述抗病原菌组合物施用至作物、作物部分、种子或所述作物的耕作区。
[0138] 76.控制耕作区中的病原体的方法，所述方法包括：
[0139] a)评估耕作区的环境条件是否存在病原体或条件是否有利于病原体生长；以及[0140] b)在耕作区种植包含有效连接至驱动在植物中表达的启动子的异源多核苷酸的作物种子或植物，其中所述异源多核苷酸包含选自如下的核苷酸序列：
[0141] (i)SEQ ID NO:5、7、9或11中示出的核苷酸序列；
[0142] (ii)编码包含SEQ ID NO:6、8、10或12的氨基酸序列的核苷酸序列；
[0143] (iii)与SEQ ID NO:5、7、9或11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽；以及
[0144] (iv)编码与SEQ ID NO:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽。
[0145] 77.实施例76的方法，其中所述多核苷酸编码具有与SEQ ID NO:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸编码具有抗病原菌活性的多肽，并且其中所述氨基酸序列具有选自如下的氨基酸残基中的至少一者：
[0146] (a)SEQ ID NO:6、8、10或12的第1位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；
[0147] (b)SEQ ID NO:6、8、10或12的第16位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；
[0148] (c)SEQ ID NO:6、8、10或12的第25位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；
[0149] (d)SEQ ID NO:6、8、10或12的第36位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；以及[0150] (e)SEQ ID NO:6、8、10或12的第42位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基。
[0151] 78.实施例76的方法，其中所述多核苷酸编码具有抗真菌活性的多肽。
[0152] 79.实施例78的方法，其中所述多肽与包含SEQ ID NO:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有改善的抗真菌活性。
[0153] 80.实施例78的方法，其中所述多肽与包含SEQ ID NO:2或4中示出的氨基酸序列的多肽相比时，具有对禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。
[0154] 81.实施例75-80中任一项的方法，其中所述病原体是真菌。
[0155] 82.实施例81的方法，其中所述真菌为禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中的至少一者。
[0157] 图1示出了本发明所公开的五雄苦木(Picramnia pentandra)植物防御素(Pp-PDF1)变体氨基酸序列与Pp-PDF1氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的序列比对。
具体实施方式
[0158] 提供了涉及诱导植物中的病原抗性，尤其是真菌抗性的组合物和方法。该组合物包含抗病原菌多肽的新型核苷酸和氨基酸序列。具体地讲，提供了具有SEQ ID NO:6、8、10和12中示出的氨基酸序列的分离的多肽及其变体和片段。还提供了包含编码SEQ ID NO:6、8、10和12中示出的氨基酸序列的核苷酸序列的分离的多核苷酸及其变体和片段。
[0159] 新型抗病原菌多肽和编码该多肽的核苷酸序列通过已知植物防御素序列，包括五雄苦木植物防御素Pp-PDF1的DNA改组生成。参见美国专利No.6,911,577和7,396,980，每个专利全文以引用的方式并入本文。植物防御素包括硫堇、富含半胱氨酸的小肽、蛋白酶抑制剂、淀粉酶抑制剂等等。按照蛋白质结构分类(SCOP)系统，它们被称为防御素基因。防御素有防御作用，更具体地讲植物对病原体的防御中发挥作用，并且它们的一级和二级结构与昆虫防御素具有相似性。本发明的防御素归为蝎毒素样蛋白超家族和植物防御素家族。虽然不受任何作用机制的限制，但序列和相关基因在病害引起的病斑周围的表达可控制症状发展，如在过敏性反应(HR)中，通过控制蛋白酶介导的细胞死亡机制来控制症状发展。组合物也可以通过抑制病原体产生的蛋白酶或通过结合病原体的细胞壁组分直接起到抗病原菌蛋白的作用。第三，它们也可以作为扰乱膜功能，导致病原体细胞毒性的两亲性蛋白。防御素通常为富含半胱氨酸的小肽，并且显示出抗微生物活性。
[0160] 植物防御素通常包含约45-54个氨基酸，具有四个二硫键（Broekaert et al.(1995)Plant Physiol.(Bethesda)108:1353-1358（Broekaert等人，1995年，《植物生理学》，贝塞斯达，第108卷，第1353-1358页））。本发明的防御素抑制一系列病原体的生长，包括（但不限于）：微摩尔浓度的真菌、线虫、细菌、昆虫和病毒。防御素通过多种机制抑制病原体损伤，包括（但不限于）：膜离子渗透性的改变以及真菌靶标中菌丝分支的诱导（Garcia-Olmeda et al.(1998)Biopolymers,Peptide Science47:479-491（Garcia-Olmeda等人，1998年，《生物聚合物（肽科学）》，第47卷，第479-491页），以引用的方式并入本文）。
[0161] 此前公开的植物防御素（参见美国专利No.6,911,577和7,396,980）根据序列同源性分为85组，并且用“CS”后面加三位数字来表示。用于产生本发明所公开的Pp-PDF1变体的DNA改组分析的Pp-PDF1多肽属于第18组，也可以用CS164来表示。全长Pp-PDF1多肽的核苷酸和氨基酸序列分别在SEQ ID NO:1和2中示出，而成熟Pp-PDF1多肽的核苷酸和氨基酸序列分别在SEQ ID NO:3和4中示出。Pp-PDF1多肽及本发明所公开的其变体表现出至少对真菌禾谷镰孢菌(FGR)、禾生炭疽菌(CGR)、轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)(FVE)和玉米色二孢(Diplodia maydis)(DMA)的抗真菌活性。
[0162] 表1示出了Pp-PDF1和改组的变体的IC50数据。
[0163] 表1.
[0164]
[0165]
[0166] 本发明所公开的Pp-PDF1多肽变体（SEQ ID NO:6、8、10和12）通过DNA改组鉴别，其与亲本多肽（如，SEQ ID NO:2或4）相比时，表现出对至少一个病原体靶标的改善的活性。在一些实施例中，本发明所公开的Pp-PDF1变体表现出对禾谷镰孢菌和禾生炭疽菌中至少一者的改善的抗真菌活性。变体Pp-PDF1核苷酸序列在SEQ ID NO:5、7、9和11中示出。
[0167] 包含编码本发明所公开的抗病原菌多肽的多核苷酸的植物、植物细胞、种子和微生物也在本文中有所公开。还提供了包含分离的抗病原菌（尤其是抗真菌）多肽或表达本发明所公开的多肽的微生物与载体的组合的抗病原菌组合物。组合物可用于产生病原体抗性植物，以及保护植物免受病原体，尤其是真菌病原体侵害。
[0168] 本发明的多核苷酸和多肽可用于诱导植物中的病原抗性的方法。因此，本文所公开的组合物和方法可用于保护植物免受植物病原体侵害。所谓“植物病原体”是指可通过抑制或减缓植物的生长，通过破坏植物的组织，通过削弱植物的免疫系统，降低植物对非生物胁迫的抗性，和/或通过造成植物的过早死亡等对植物造成伤害的任何生物体。植物病原体包括真菌、病毒、细菌、线虫等等。
[0169] “病原抗性”或“病害抗性”旨在意指植物避免作为植物-病原体相互作用结果的病害症状。即，防止病原体造成植物病害以及相关的病害症状，或者使病原体造成的病害症状减至最小或减轻，例如减少胁迫和相关的产量损失。
[0170] “抗病原菌组合物”或“抗病原菌多肽”旨在意指本发明的组合物具有抗病原菌活性，因此能够抑制、控制和/或杀死侵入的病原生物体。本发明的抗病原菌多肽或组合物可使病原体攻击造成的病害症状减少至少约2%，包括（但不限于）：约2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、
96%、97%、98%、99%或更多。在特定实施例中，本发明的抗病原菌多肽或组合物可使病原体攻击造成的病害症状减少至少约5%至约50%、至少约10%至约60%、至少约30%至约70%、至少约
40%至约80%、或至少约50%至约90%或更多。从而，本发明的方法可用于保护植物免受病害，尤其是植物病原体造成的那些病害。在特定实施例中，本发明的多肽表现出的抗病原菌活性是抗真菌活性。如本文所用，“抗真菌活性”是指抑制、控制和/或杀死侵入的真菌病原体的能力。同样，“真菌抗性”是指与未处理的或野生型植物相比时，对真菌病原体的增强耐性。抗性可以是不同的，从对真菌病原体影响的耐性稍微增加（如，部分抑制）至完全抗性，使得植物不受真菌病原体存在的影响。对特定真菌病原体或对更广谱真菌病原体抗性水平的提高均可构成抗真菌活性或改善的真菌抗性。同样，具有“改善的抗病原菌活性”或“改善的抗真菌活性”的多肽可以指与参考多肽相比，表现出抵抗单个病原体或真菌的活性或者抵抗更广谱病原体或真菌的活性增强的多肽。
96%、97%、98%、99%或更多。在特定实施例中，本发明的抗病原菌多肽或组合物可使病原体攻击造成的病害症状减少至少约5%至约50%、至少约10%至约60%、至少约30%至约70%、至少约
40%至约80%、或至少约50%至约90%或更多。从而，本发明的方法可用于保护植物免受病害，尤其是植物病原体造成的那些病害。在特定实施例中，本发明的多肽表现出的抗病原菌活性是抗真菌活性。如本文所用，“抗真菌活性”是指抑制、控制和/或杀死侵入的真菌病原体的能力。同样，“真菌抗性”是指与未处理的或野生型植物相比时，对真菌病原体的增强耐性。抗性可以是不同的，从对真菌病原体影响的耐性稍微增加（如，部分抑制）至完全抗性，使得植物不受真菌病原体存在的影响。对特定真菌病原体或对更广谱真菌病原体抗性水平的提高均可构成抗真菌活性或改善的真菌抗性。同样，具有“改善的抗病原菌活性”或“改善的抗真菌活性”的多肽可以指与参考多肽相比，表现出抵抗单个病原体或真菌的活性或者抵抗更广谱病原体或真菌的活性增强的多肽。
[0171] 测量抗病原菌活性的测定法通常是本领域已知的，定量病原体感染后植物中病害抗性的方法亦如此。参见（例如）美国专利No.5,614,395，该专利以引用的方式并入本文。此类技术包括随时间推移测量平均病斑直径、病原体生物量和腐败植物组织的总百分数。例如，表达抗病原菌多肽或具有施用至其表面或环境的抗病原菌组合物的植物与未暴露至抗病原菌组合物的对照植物相比时，显示出在病原体攻击后组织坏死（即，病斑直径）减少或植物死亡率下降。或者，抗病原菌活性可通过病原体生物量的减少量来测量。例如，用所关注的病原体攻击表达抗病原菌多肽或暴露至抗病原菌组合物的植物。经过一段时间以后，获得来自病原体接种组织的组织样品，并且提取RNA。可利用特定病原体RNA转录物相对于植物特异性转录物水平的百分数，来测定病原体生物量的水平。参见（例如）Thomma et al.(1998)Plant Biology95:15107-15111（Thomma等人，1998年，《植物生物学》，第95卷，第15107-15111页），其以引用的方式并入本文。
[0172] 此外，体外抗病原菌测定法包括（例如）向纸片加入不同浓度的抗病原菌组合物，并且将纸片置于包含所关注的病原体悬浮液的琼脂上。温育后，在包含有效浓度的抗病原菌多肽的纸片周围形成明显的抑制圈（Liu et al.(1994)Plant Biology91:1888-1892（Liu等人，1994年，《植物生物学》，第91卷，第1888-1892页），其以引用的方式并入本文）。此外，显微分光光度分析可用于测量组合物的体外抗病原菌特性（Hu et al.(1997)Plant Mol.Biol.34:949-959（Hu等人，1997年，《植物分子生物学》，第34卷，第949-959页）和Cammue et al.(1992)J.Biol.Chem.267:2228-2233（Cammue等人，1992年，《生物化学杂志》，第267卷，第2228-2233页），它们二者以引用的方式并入本文）。特异性测量抗真菌活性的测定法也是本领域熟知的。参见（例如）Duvick et al.(1992)J.Biol.Chem.267:18814-18820（Duvick等人，1992年，《生物化学杂志》，第267卷，第18814-18820页）；Lacadena et al.(1995)Arch.Biochem.Biophys.324:273-281（Lacadena等人，1995年，《生物化学和生物物理集刊》，第324卷，第273-281页）；Xu et al.(1997)Plant Mol.Biol.34:949-959（Xu等人，1997年，《植物分子生物学》，第34卷，第949-959页）；Lee et al.(1999)
Biochem.Biophys.Res.Comm.263:646-651（Lee等人，1999年《，生物化学和生物物理研究通讯》，第263卷，第646-651页）；Vila et al.(2001)Mol.Plant Microbe Interact.14:1327-
1331（Vila等人，2001年，《分子植物-微生物相互作用》，第14卷，第1327-1331页）；Moreno et al.(2003)Phytpathol.93:1344-1353（Moreno等人，2003年，《植物病理学》，第93卷，第
1344-1353页）；Kaiserer et al.(2003)Arch.Microbiol.180:204-210（Kaiserer等人，
2003年，《微生物学集刊》，第180卷，第204-210页）；以及美国专利No.6,015,941；以上各文献均以引用的方式并入本文。
Biochem.Biophys.Res.Comm.263:646-651（Lee等人，1999年《，生物化学和生物物理研究通讯》，第263卷，第646-651页）；Vila et al.(2001)Mol.Plant Microbe Interact.14:1327-
1331（Vila等人，2001年，《分子植物-微生物相互作用》，第14卷，第1327-1331页）；Moreno et al.(2003)Phytpathol.93:1344-1353（Moreno等人，2003年，《植物病理学》，第93卷，第
1344-1353页）；Kaiserer et al.(2003)Arch.Microbiol.180:204-210（Kaiserer等人，
2003年，《微生物学集刊》，第180卷，第204-210页）；以及美国专利No.6,015,941；以上各文献均以引用的方式并入本文。
[0173] 在一些实施例中，本发明所公开的抗病原菌多肽或它们的变体或片段与亲本多肽相比时，显示出具有改善的抗病原菌（尤其是抗真菌）活性，所述抗病原菌多肽通过DNA改组技术从所述亲本多肽得到（如，SEQ ID NO:2或4）。在某些实施例中，本发明所公开的抗病原菌多肽表现出对至少一种敏感病原体的抗病原菌活性是亲本多肽的2倍至100倍，包括（但不限于）：约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍和100倍。对特定病原体的抗病原菌活性可使用本领域已知的任何方法测量，包括（但不限于）：如上所述的体外测定法以及实例2中描述的抗真菌平板测定法。抗真菌平板测定法可在低或高盐条件下进行。低盐为1/8×浓度的液体培养基（用于玉米色二孢、禾谷镰孢菌和轮枝镰孢菌的马铃薯葡萄糖肉汤，用于禾生炭疽菌的察氏肉汤），加有0.25mM氯化钙、12.5mM氯化钾。高盐为如上所述的1/2×液体培养基，加有1mM氯化钙、50mM氯化钾。
[0174] 在某些实施例中，本发明所公开的抗病原菌多肽或它们的变体或片段表现出对禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌中的至少一者具有更高的抗真菌活性。在特定实施例中，抗病原菌多肽与SEQ ID NO:2或4中示出的多肽相比时，在高盐条件下进行的体外抗真菌平板测定法（例如实例2中描述的测定法）中显示出对真菌禾生炭疽菌的抗真菌活性增加约15倍，或在低盐条件下进行的类似测定法中显示出对禾生炭疽菌的活性提高约45倍。在其他实施例中，抗病原菌多肽与SEQ ID NO:2或4中示出的多肽相比时，在高盐条件下进行的体外抗真菌平板测定法中显示出对真菌禾谷镰孢菌的抗真菌活性增加约3倍。
[0175] 本文所公开的组合物包含编码抗病原菌多肽的分离的多核苷酸、含有本发明所公开的抗病原菌多核苷酸的表达盒、和分离的抗病原菌多肽。还提供了包含本发明所公开的多肽与载体的组合的抗病原菌组合物。本发明还公开了包含编码抗病原菌蛋白的多核苷酸的植物和微生物。
[0176] 如本文所用，“多核苷酸”包括指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否则涵盖在以下方面具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物（如肽核酸）：其以与天然存在的核苷酸相似的方式杂交至单链核酸。
[0177] 术语“多核苷酸”的使用并不旨在将本发明局限于包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员会认识到，多核苷酸可包含核糖核苷酸以及包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然的分子也包括合成的类似物。本发明所公开的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括（但不限于）：单链形式、双链形式、发夹结构、茎-环结构等。
[0178] 术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。本发明的多肽可从本文所公开的多核苷酸，或使用标准分子生物学或生物化学技术产生。例如，本发明的截短的蛋白质可通过在适当的宿主细胞中表达本发明的重组多核苷酸，或者通过体外方法的组合，例如蛋白酶消化和纯化产生。
[0179] 如本文所用，在指定多核苷酸的语境中使用时，术语“编码”或“编码的”意指所述多核苷酸包含了指导核苷酸序列翻译成所指定蛋白质的必要信息。据以编码蛋白质的信息是通过使用密码子来确定的。编码蛋白质的多核苷酸可在该多核苷酸的翻译区内包含非翻译序列（如内含子），或可缺少这种居间的非翻译序列（如在cDNA中）。
[0180] 本发明涵盖分离的或大体上纯化的多核苷酸或蛋白质组合物。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白质，或其生物活性部分大体上或基本上不含在其天然存在的环境（或亲本防御素多核苷酸或蛋白质的天然存在的环境）中具有的与多核苷酸或蛋白质通常相伴或相互作用的组分。因此，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质，当通过重组技术产生时基本上不含其他细胞物质或培养基，或者当通过化学法合成时基本上不含化学前体或其他化学品。最佳的是，“分离的”多核苷酸不含在得到该亲本防御素的生物体的基因组DNA中天然位于该多核苷酸的旁侧的序列（即位于该多核苷酸的5'和3'末端的序列）（最佳的是蛋白质编码序列）。例如，在各种实施例中，分离的多核苷酸可包含少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在得到该多核苷酸的细胞的基因组DNA中天然位于该亲本防御素多核苷酸的旁侧的核苷酸序列。基本上不含细胞物质的蛋白质包括具有小于约30%、20%、10%、5%或1%（以干重计）的污染性蛋白质的蛋白质的制品。当本发明所公开的抗病原菌蛋白或其生物活性部分用重组法产生时，最佳的是，培养基具有少于约30%、20%、10%、5%或1%（以干重计）的化学前体或非所关注的蛋白的化学品。
[0181] 本发明所公开的多核苷酸以及由其编码的蛋白质的片段和变体也为本发明所涵盖。所谓“片段”是指多核苷酸的一部分或由其编码的氨基酸序列以及蛋白质的一部分。多核苷酸的片段可编码保持本发明所公开的抗病原菌蛋白的生物活性因而具有抗病原菌活性的蛋白质片段。或者，可用作杂交探针的多核苷酸片段通常不编码保持生物活性的片段蛋白质。因此，核苷酸序列的片段可在至少约20个核苷酸、约50个核苷酸直至编码本发明所公开的蛋白质的全长多核苷酸的范围内。
[0182] 编码本发明所公开的抗病原菌蛋白的生物活性部分的多核苷酸片段将编码至少15、25、30或50个连续的氨基酸，或直至存在于本发明的全长抗病原菌蛋白的氨基酸总数（例如SEQ ID NO:6、8、10和12的50个氨基酸）。用作杂交探针或PCR引物的多核苷酸的片段通常不必编码抗病原菌蛋白的生物活性部分。
[0183] 因此，本发明所公开的多核苷酸的片段可以编码抗病原菌多肽的生物活性部分，或在使用本发明以下所公开的方法时可以是用作杂交探针或PCR引物的片段。抗病原菌多肽的生物活性部分可通过分离本发明多核苷酸中的一者的一部分，表达该抗病原菌蛋白的编码部分（例如，通过体外重组表达），以及评估该抗病原菌蛋白的编码部分的活性来制备。作为本发明核苷酸序列的片段的多核苷酸包含至少16、20、50、75、100或150个连续的核苷酸，或直至存在于本文所公开的全长多核苷酸的核苷酸数目（例如SEQ ID NO:5、7、9或11的
150个核苷酸）。
150个核苷酸）。
[0184] “变体”旨在意指基本上类似的序列。对于多核苷酸，变体包含本文所公开的抗病原菌多核苷酸内一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或本发明所公开的抗病原菌多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的置换。
[0185] 对于多核苷酸，保守变体包括那些这样的序列，其由于遗传密码的简并性而编码本发明的抗病原菌多肽中的一者的氨基酸序列。变体多核苷酸可以是合成法获得的多核苷酸，如那些（例如）通过使用定点诱变产生但仍编码本发明的抗病原菌蛋白的多核苷酸。通常，通过本文别处所述的序列比对程序和参数测定，本发明的特定多核苷酸的变体将具有与该特定多核苷酸至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性。
[0186] 本发明的特定多核苷酸（即参比多核苷酸）的变体，还可通过比较变体多核苷酸所编码的多肽与该参比多核苷酸所编码的多肽之间的序列同一性百分数来进行评估。因此，例如，公开了编码与SEQ ID NO:6、8、10或12的多肽具有给定序列同一性百分数的多肽的分离的多核苷酸。任何两个多肽之间的序列同一性百分数，可用本文别处描述的序列比对程序和参数来计算。在任何给定的本发明多核苷酸对是通过比较它们编码的两个多肽所共享序列同一性百分数进行评估的情况中，两个被编码的多肽之间的序列同一性百分数为至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性。
[0187] “变体”蛋白旨在意指通过在本发明所公开的抗病原菌蛋白中的一个或多个内部位点处缺失或添加一个或多个氨基酸，和/或在抗病原菌蛋白中的一个或多个位点处置换一个或多个氨基酸，从本文所公开的抗病原菌蛋白获得的蛋白质。本发明所涵盖的变体蛋白质是具有生物活性的，即它们继续拥有本发明所公开的抗病原菌蛋白的所需生物活性，即本文所述的抗病原菌活性。此类变体可由（例如）人工操作产生。通过本文别处所述的序列比对程序和参数测定，本发明所公开的抗病原菌蛋白的生物活性变体将与本发明所公开的抗病原菌蛋白的氨基酸序列具有至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性。本发明的蛋白质的生物活性变体与该蛋白可相差少至1-15个氨基酸残基，少至1-10个（如6-10个）、少至5个、少至4、3、2或甚至1个氨基酸残基。
[0188] 在一些实施例中，本发明的多肽变体保留了与亲本多肽（如SEQ ID NO:4）不同的、有助于增强本发明所公开的多肽的抗病原菌活性的氨基酸残基（那些氨基酸残基可通过参考图1中示出的比对确定）。例如，SEQ ID NO:6、8、10或12的变体可包含如下氨基酸残基中的至少一者：SEQ ID NO:6、8、10或12的第1位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；SEQ ID NO:6、8、10或12的第16位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；SEQ ID NO:6、8、10或12的第25位残基对应位置处的精氨酸(Arg)残基；SEQ ID NO:6、8、10或12的第36位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基；以及SEQ ID NO:6、8、10或12的第42位残基对应位置处的丝氨酸(Ser)残基。在某些实施例中，SEQ ID NO:6、8、10或12的变体可包含SEQ ID NO:6、8、10或12的第22位残基对应位置处的天冬酰胺(Asn)或组氨酸(His)残基。在特定实施例中，SEQ ID NO:6、8、10或12的变体可包含SEQ ID NO:6、8、10或12的第47位残基对应位置处的赖氨酸(Lys)或苏氨酸(Thr)残基。具体地讲，第36和42位的丝氨酸残基与改善的活性，尤其是改善的CGR活性相关。
[0189] 本发明的蛋白质可通过多种方式（包括氨基酸置换、缺失、截短和插入）进行变更。这类操纵的方法是本领域公知的。例如，抗病原菌蛋白的氨基酸序列变体和片段可通过在DNA中作出突变来制备。诱变和多核苷酸变更的方法是本领域公知的。参见（例如）Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492（Kunkel，1985年，《美国国家科学院院刊》，第
82卷，第488-492页）；Kunkel et al.(1987)Methods in Enzymol.154:367-382（Kunkel等人，1987年，《酶学方法》，第154卷，第367-382页）；美国专利No.4,873,192；Walker and Gaastra,eds.(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing
Company,New York)（Walker和Gaastra编辑，1983年《，分子生物学技术》，麦克米伦出版公司，纽约）以及其中所引用的参考文献。有关不影响所关注的蛋白质的生物活性的适当氨基酸置换的指导，可在Dayhoff et al.(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)（Dayhoff等人，1978年，《蛋白质序列和结构图册》，国家生物医学研究基金会，华盛顿哥伦比亚特区）的模型中找到，其以引用的方式并入本文。可能最佳的是保守置换，例如将一个氨基酸用另一个具有相似性质的氨基酸进行交换。
82卷，第488-492页）；Kunkel et al.(1987)Methods in Enzymol.154:367-382（Kunkel等人，1987年，《酶学方法》，第154卷，第367-382页）；美国专利No.4,873,192；Walker and Gaastra,eds.(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing
Company,New York)（Walker和Gaastra编辑，1983年《，分子生物学技术》，麦克米伦出版公司，纽约）以及其中所引用的参考文献。有关不影响所关注的蛋白质的生物活性的适当氨基酸置换的指导，可在Dayhoff et al.(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)（Dayhoff等人，1978年，《蛋白质序列和结构图册》，国家生物医学研究基金会，华盛顿哥伦比亚特区）的模型中找到，其以引用的方式并入本文。可能最佳的是保守置换，例如将一个氨基酸用另一个具有相似性质的氨基酸进行交换。
[0190] 显然，将在编码该变体的DNA中所作的突变必须不将序列设置在阅读框外，并且优选将不会产生互补区，该互补区可以产生二级mRNA结构。参见欧洲专利申请公开No.75,444。
[0191] 预期本文所涵盖的蛋白质序列的缺失、插入和置换不会造成该蛋白质特性的根本变化。然而，当在进行置换、缺失或插入之前难以预测其确切效应时，本领域技术人员将认识到该效应将通过常规的筛选测定法进行评估。即，活性可通过测量抗病原菌活性的测定法，例如抗真菌平板测定法进行评估。参见（例如）Duvick et al.(1992)J.Biol.Chem.267:18841-18820（Duvick等人，1992年，《生物化学杂志》，第267卷，第18841-18820页），其以引用的方式并入本文。
[0192] 变体多核苷酸和蛋白质还涵盖由诱变和重组工程方法（如DNA改组）获得的序列和蛋白质。通过此类方法，可操纵一个或多个不同的抗病原菌蛋白编码序列来产生具有所需特性的新型抗病原菌蛋白。按这种方式，从包含具有基本的序列同一性的序列区域的相关序列多核苷酸的群体产生重组多核苷酸的文库，并可将文库在体外或体内进行同源重组。例如，编码所关注的结构域的序列基序可使用该方法在本发明所公开的抗病原菌多核苷酸和其他已知抗病原菌基因，例如防御素基因之间进行改组，以获得编码具有改善的所关注的性质，例如增强的抗病原菌活性的蛋白质的新基因。这种DNA改组的策略是本领域已知的。参见（例如）Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10747-10751（Stemmer，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第10747-10751页）；Stemmer(1994)Nature370:389-
391（Stemmer，1994年，《自然》，第370卷，第389-391页）；Crameri et al.(1997)Nature Biotech.15:436-438（Crameri等人，1997年，《自然生物技术》，第15卷，第436-438页）；
Moore et al.(1997)J.Mol.Biol.272:336-347（Moore等人，1997年《，分子生物学杂志》，第
272卷，第336-347页）；Zhang et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:4504-4509（Zhang等人，1997年，《美国国家科学院院刊》，第94卷，第4504-4509页）；Crameri et al.(1998)Nature391:288-291（Crameri等人，1998年，《自然》，第391卷，第288-291页）；以及美国专利No.5,605,793和5,837,458。
391（Stemmer，1994年，《自然》，第370卷，第389-391页）；Crameri et al.(1997)Nature Biotech.15:436-438（Crameri等人，1997年，《自然生物技术》，第15卷，第436-438页）；
Moore et al.(1997)J.Mol.Biol.272:336-347（Moore等人，1997年《，分子生物学杂志》，第
272卷，第336-347页）；Zhang et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:4504-4509（Zhang等人，1997年，《美国国家科学院院刊》，第94卷，第4504-4509页）；Crameri et al.(1998)Nature391:288-291（Crameri等人，1998年，《自然》，第391卷，第288-291页）；以及美国专利No.5,605,793和5,837,458。
[0193] 本发明的多核苷酸可用于从其他生物，尤其是其他植物，更具体地讲其他真菌分离相应的序列。按此方式，可使用例如PCR、杂交等方法，对此类序列基于其与本文示出的序列的序列同一性来进行鉴定。本发明涵盖基于其与本文示出的整个序列或与其变体和片段的序列同一性而分离的序列。因此，本发明涵盖编码抗病原菌蛋白并且在严格条件下与本文所公开的序列杂交，或与其变体或片段杂交的分离的多核苷酸。
[0194] 在PCR方法中，可设计寡核苷酸引物用于PCR反应来从提取自任何所关注的生物体的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。设计PCR引物和PCR克隆的方法通常是本领域已知的，并且在Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York)（Sambrook等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约普莱恩维尤）中有所公开。还可参见Innis et al.,eds.(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Academic Press,New York)（Innis等人编辑，1990年，《PCR方案：方法和应用指导》，学术出版社，纽约）；Innis and Gelfand,eds.(1995)PCR Strategies(Academic Press,New York)（Innis和Gelfand编辑，1995年，《PCR策略》，学术出版社，纽约）；以及Innis and Gelfand,eds.(1999)PCR Methods Manual(Academic Press,New York)（Innis and Gelfand编辑，1999年，《PCR方法手册》，学术出版社，纽约）。已知的PCR方法包括但不限于利用成对引物、巢式引物、单一特异引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。
[0195] 在杂交技术中，将已知的多核苷酸的全部或部分用作探针，该探针选择性地杂交至来自选定生物体的克隆的基因组DNA片段或cDNA片段的群体（即基因组文库或cDNA文库）中存在的其他相应多核苷酸。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可用可检测基团（如32P）或任何其他可检测标志物进行标记。因此，例如，杂交用探针可通过基于本发明的多核苷酸对合成的寡核苷酸进行标记来制备。制备杂交用探针和构建cDNA和基因组文库的方法通常是本领域已知的，并且在Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York)（Sambrook等人，1989年《，分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约普莱恩维尤）中有所公开。
[0196] 例如，本文所公开的整个多核苷酸序列或其一个或多个部分，可用作能够与相应的多核苷酸和信使RNA特异性杂交的探针。为了实现在多种条件下的特异性杂交，此类探针包括在抗病原菌多核苷酸序列当中独特的序列，并且优选长度为至少约10个核苷酸，最优选长度为至少约20个核苷酸。此类探针可用于通过PCR扩增来自选定生物体的对应多核苷酸。这个技术可用于从所需生物体分离另外的编码序列，或者用作诊断测定法以确定编码序列在生物体中的存在。杂交技术包括对平板DNA文库（噬菌斑或菌落）的杂交筛选；参见（例如）Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York)（Sambrook等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约普莱恩维尤）。
[0197] 这类序列的杂交可在严格条件下进行。所谓“严格条件”或“严格杂交条件”意指探针与其靶标序列杂交的程度将可检测地大于与其他序列杂交的程度（例如比背景大至少2倍）的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同的环境中将会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴定与探针100%互补的靶标序列（同源探测）。或者，可调节严格性条件以允许序列中有一些错配，以使得检测到较低程度的相似性（异源探测）。通常，探针长度小于约1000个核苷酸，优选长度小于500个核苷酸。
[0198] 通常，严格条件将为其中盐浓度低于约1.5M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子浓度（或其他盐），pH为7.0至8.3，对短探针（例如，10至50个核苷酸）而言温度为至少30℃，对长探针（例如超过50个核苷酸）而言温度为至少约60℃的那些条件。严格条件还可通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。示例性的低严格性条件包括在37℃下用30至35%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS（十二烷基硫酸钠）的缓冲溶液杂交，并在50至55℃下在1X至2X SSC（20X SSC=3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠）中洗涤。示例性的中等严格性条件包括在40%至45%甲酰胺、
1.0M NaCl、1%SDS中在37℃下杂交和在0.5X至1X SSC中在55℃至60℃下洗涤。示例性的高严格性条件包括在50%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS中在37℃下杂交和在0.1X SSC中在60至65℃下洗涤。任选地，洗涤缓冲液可包含约0.1%至约1%SDS。杂交的持续时间通常少于约24小时，往往约4至约12小时。洗涤的持续时间将为至少足以达到平衡的时间长度。
1.0M NaCl、1%SDS中在37℃下杂交和在0.5X至1X SSC中在55℃至60℃下洗涤。示例性的高严格性条件包括在50%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS中在37℃下杂交和在0.1X SSC中在60至65℃下洗涤。任选地，洗涤缓冲液可包含约0.1%至约1%SDS。杂交的持续时间通常少于约24小时，往往约4至约12小时。洗涤的持续时间将为至少足以达到平衡的时间长度。
[0199] 特异性通常决定于杂交后的洗涤，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可以从Meinkoth and Wahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284（Meinkoth和Wahl，1984年，《分析生物化学》，第138卷，第267-284页）的等式近似获得：Tm=
81.5℃+16.6(log M)+0.41(%GC)-0.61(%form)-500/L；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，%GC为DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分数，%form为杂交溶液中甲酰胺的百分数，L为杂交体的长度（单位为碱基对）。Tm为50%的互补靶标序列与完美匹配的探针杂交时的温度（在确定的离子强度和pH下）。每1%的错配，Tm降低约1℃；因此，可以调节Tm、杂交、和/或洗涤条件以与具有所需同一性的序列杂交。例如，如果寻求具有≥90%同一性的序列，则可将Tm降低10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃。然而，极端严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；适度严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤；利用该公式、杂交和洗涤组成以及所需的Tm，普通技术人员将认识到，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化固有地得到了描述。如果所需程度的错配导致Tm低于45℃（水溶液）或32℃（甲酰胺溶液），则优选的是增加SSC浓度以便可使用较高的温度。对核酸杂交的广泛指导存在于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular
Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I,Chapter2(Elsevier,New York)（Tijssen，1993年，《生物化学和分子生物学实验室技术—与核酸探针杂交》，第I部分，第2章，爱思唯尔，纽约）；和Ausubel et al.,eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology,Chapter2(Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York)（Ausubel等人编辑，1995年，《分子生物学实验室指南》，第2章，格林和威利出版社，纽约）中。参见Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York)（Sambrook等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约普莱恩维尤）。
81.5℃+16.6(log M)+0.41(%GC)-0.61(%form)-500/L；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，%GC为DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分数，%form为杂交溶液中甲酰胺的百分数，L为杂交体的长度（单位为碱基对）。Tm为50%的互补靶标序列与完美匹配的探针杂交时的温度（在确定的离子强度和pH下）。每1%的错配，Tm降低约1℃；因此，可以调节Tm、杂交、和/或洗涤条件以与具有所需同一性的序列杂交。例如，如果寻求具有≥90%同一性的序列，则可将Tm降低10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃。然而，极端严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；适度严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤；利用该公式、杂交和洗涤组成以及所需的Tm，普通技术人员将认识到，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化固有地得到了描述。如果所需程度的错配导致Tm低于45℃（水溶液）或32℃（甲酰胺溶液），则优选的是增加SSC浓度以便可使用较高的温度。对核酸杂交的广泛指导存在于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular
Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I,Chapter2(Elsevier,New York)（Tijssen，1993年，《生物化学和分子生物学实验室技术—与核酸探针杂交》，第I部分，第2章，爱思唯尔，纽约）；和Ausubel et al.,eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology,Chapter2(Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York)（Ausubel等人编辑，1995年，《分子生物学实验室指南》，第2章，格林和威利出版社，纽约）中。参见Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York)（Sambrook等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约普莱恩维尤）。
[0200] 以下术语用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列同一性”以及(d)“序列同一性百分数”。
[0201] (a)如本文所用，“参考序列”是用作序列比较依据的确定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部；例如，作为全长cDNA或基因序列的片段或完整的cDNA或基因序列。
[0202] (b)如本文所用，“比较窗口”是指多核苷酸序列的连续和指定的区段，其中该比较窗口中的该多核苷酸序列相比于参考序列（不包含添加或缺失）可包含添加或缺失（即空位），以便两个多核苷酸的最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续的核苷酸，并且任选地可为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员认识到，为避免由于在多核苷酸序列中加入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。
[0203] 将序列进行比对以作比较的方法是本领域公知的。因此，对任何两个序列之间的序列同一性百分数的确定，可使用数学算法来完成。此类数学算法的非限制性例子是Myers and Miller(1988)CABIOS4:11-17（Myers和Miller，1988年，《计算机在生物科学中的应用》，第4卷，第11-17页）的算法；Smith et al.(1981)Adv.Appl.Math.2:482（Smith等人，1981年《，应用数学进展》，第2卷，第482页）的局部比对算法；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453（Needleman和Wunsch，1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443-
453页）的全局比对算法；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-2448（Pearson和Lipman，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444-2448页）的搜索局部比对方法；Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264（Karlin和Altschul，1990年，《美国国家科学院院刊》，第872264页）的算法，其在Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877（Karlin和Altschul，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873-5877页）中作了修正。
453页）的全局比对算法；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-2448（Pearson和Lipman，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444-2448页）的搜索局部比对方法；Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264（Karlin和Altschul，1990年，《美国国家科学院院刊》，第872264页）的算法，其在Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877（Karlin和Altschul，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873-5877页）中作了修正。
[0204] 可利用这些数学算法的计算机实现进行序列的比较，从而确定序列同一性。此类计算机实现包括但不限于：PC/Gene程序（可获自Intelligenetics公司，加利福尼亚州山景城(Mountain View,California)）中的CLUSTAL；ALIGN程序（2.0版本）和GCG威斯康星遗传学软件包(GCG Wisconsin Genetics Software Package)版本10（可得自Accelrys公司，美国加利福尼亚州圣迭哥斯克兰顿路9685号(Accelrys Inc.,9685Scranton Road,San Diego,California,USA)）中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用这些程序的序列比对可用默认参数来进行。CLUSTAL程序在Higgins et al.(1988)Gene73:237-244(1988)（Higgins等人，1988年，《基因》，第73卷，第237-244页）；Higgins et al.(1989)CABIOS5:151-153（Higgins等人，1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页）；
Corpet et al.(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90（Corpet等人，1988年，《核酸研究》，第16卷，第10881-10890页）；Huang et al.(1992)CABIOS8:155-65（Huang等人，1992年，《计算机在生物科学中的应用》，第8卷，第155-165页）；以及Pearson et al.(1994)Meth.Mol.Biol.24:307-331（Pearson等人，1994年，《分子生物学方法》，第24卷，第307-331页）中作了充分描述。ALIGN程序是基于Myers and Miller(1988)supra（Myers和Miller，
1998年，出处同上）的算法。当比较氨基酸序列时，ALIGN程序可使用PAM120加权残基表(weight残基table)、空位长度罚分12和空位罚分4。Altschul et al(1990)
J.Mol.Biol.215:403（Altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第215卷，第403页）的BLAST程序是基于Karlin and Altschul(1990)supra（Karlin和Altschul，1990年，出处同上）的算法。BLAST核苷酸搜索可用BLASTN程序、score(得分)=100、wordlength(字长)=12来进行，以获得与编码本发明蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可用BLASTX程序、得分=50、字长=3来进行，以获得与本发明蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为了出于比较目的获得带空位的比对，可如Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:
3389（Altschul等人，1997年《，核酸研究》，第25卷，第3389页）中所描述采用Gapped BLAST（在BLAST2.0中）。或者，可使用PSI-BLAST（在BLAST2.0中）来进行迭代搜索，该搜索可检测分子之间的远源关系。参见Altschul et al.(1997)supra（Altschul等人，1997年，出处同上）。当采用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST时，可使用各个程序的默认参数（例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白质）。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。还可以手动方式通过检查来进行比对。
Corpet et al.(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90（Corpet等人，1988年，《核酸研究》，第16卷，第10881-10890页）；Huang et al.(1992)CABIOS8:155-65（Huang等人，1992年，《计算机在生物科学中的应用》，第8卷，第155-165页）；以及Pearson et al.(1994)Meth.Mol.Biol.24:307-331（Pearson等人，1994年，《分子生物学方法》，第24卷，第307-331页）中作了充分描述。ALIGN程序是基于Myers and Miller(1988)supra（Myers和Miller，
1998年，出处同上）的算法。当比较氨基酸序列时，ALIGN程序可使用PAM120加权残基表(weight残基table)、空位长度罚分12和空位罚分4。Altschul et al(1990)
J.Mol.Biol.215:403（Altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第215卷，第403页）的BLAST程序是基于Karlin and Altschul(1990)supra（Karlin和Altschul，1990年，出处同上）的算法。BLAST核苷酸搜索可用BLASTN程序、score(得分)=100、wordlength(字长)=12来进行，以获得与编码本发明蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可用BLASTX程序、得分=50、字长=3来进行，以获得与本发明蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为了出于比较目的获得带空位的比对，可如Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:
3389（Altschul等人，1997年《，核酸研究》，第25卷，第3389页）中所描述采用Gapped BLAST（在BLAST2.0中）。或者，可使用PSI-BLAST（在BLAST2.0中）来进行迭代搜索，该搜索可检测分子之间的远源关系。参见Altschul et al.(1997)supra（Altschul等人，1997年，出处同上）。当采用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST时，可使用各个程序的默认参数（例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白质）。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。还可以手动方式通过检查来进行比对。
[0205] 除非另外指明，否则本文提供的序列同一性/相似性值指使用采用如下参数的GAP版本10或其任何等同程序获得的值：核苷酸序列的%同一性和%相似性采用GAP权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp打分矩阵；氨基酸序列的%同一性和%相似性使用GAP权重8和长度权重2以及BLOSUM62打分矩阵。所谓“等同程序”意指任何这样的序列比较程序，其对于任何两个所考虑的序列，相比于GAP版本10所产生的相应比对，能产生出具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分数的比对。
[0206] GAP使用Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453（Needleman和Wunsch，1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443-453页）的算法，以找到两个完全序列的比对，该比对能使匹配数最大和使空位数最小。GAP会考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。其允许提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，都必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。对于蛋白质序列，GCG威斯康星遗传学软件包(GCG Wisconsin Genetics Software Package)的版本10中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，默认空位产生罚分为50，而默认空位延伸罚分为3。空位产生罚分和空位延伸罚分可以选自0-200的整数来表示。因此，例如，空位产生罚分和空位延伸罚分可为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。
[0207] GAP给出具有最好的比对的家族中的一个成员。这个家族可能存在许多成员，但其他成员没有更好的品质。GAP显示用于比对的四个优值因子：品质、比率、同一性和相似性。品质是为了比对序列而被最大化的指标(metric)。比率是品质除以较短区段中的碱基数。
同一性百分数是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将对应于空位的符号忽略。当一对符号的打分矩阵值大于或等于0.50（相似性阈值）时，对相似性打分。GCG威斯康星遗传学软件包(GCG Wisconsin Genetics Software Package)的版本10中使用的打分矩阵为BLOSUM62（参见Henikoff and Henikoff(1989)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915（Henikoff和Henikoff，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页））。
同一性百分数是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将对应于空位的符号忽略。当一对符号的打分矩阵值大于或等于0.50（相似性阈值）时，对相似性打分。GCG威斯康星遗传学软件包(GCG Wisconsin Genetics Software Package)的版本10中使用的打分矩阵为BLOSUM62（参见Henikoff and Henikoff(1989)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915（Henikoff和Henikoff，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页））。
[0208] (c)如本文所用，“序列同一性”或“同一性”在两个多核苷酸或多肽序列的情形中是指当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白质使用时，应认识到，不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基被其他具有相似的化学性质（例如电荷或疏水性）的氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。当序列差别在于保守置换，则可上调序列同一性百分数以校正置换的保守性质。差异在于这种保守置换的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调整的方法是本领域技术人员所熟知的。通常，这涉及将保守置换打分为部分错配而不是完全错配，从而提高序列同一性百分数。因而，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。保守置换的打分是例如如在程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,California)中所执行那样进行计算。
[0209] (d)如本文所用，“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参考序列（不包含添加或缺失）相比包含添加或缺失（即空位），以便两个序列的最佳比对。该百分数是这样计算的：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。
[0210] 在特定方面，诱导植物中病原抗性的方法包括将至少一种多核苷酸引入植物，其中该多核苷酸包含编码本发明的抗病原菌多肽的核苷酸序列。该多核苷酸有效连接至驱动在植物中表达的启动子。该植物表达抗病原菌多肽，从而使病原体暴露至病原体攻击的位点处的多肽。在特定实施例中，多肽具有抗真菌活性，并且病原体是真菌，例如禾谷镰孢菌或禾生炭疽菌。本发明抗病原菌多肽的表达可以靶向特定植物组织，其中病原抗性是尤其重要的，例如叶、根、茎或维管组织。此类组织优选的表达可以通过根优选的、叶优选的、维管组织优选的、茎优选的或种子优选的启动子实现。此外，本发明的多肽也可以靶向植物细胞内的特定亚细胞位置，或者从细胞分泌，如本文下面所描述。
[0211] 正如本发明的抗病原菌多肽的表达可以通过使用适当的启动子靶向特定植物组织或细胞类型，该多肽的表达也可以通过使用靶向信息或“靶向标记”靶向细胞内不同的位置。与在转录水平发挥作用的启动子不同的是，此类靶向信息是初始翻译产物的部分。取决于病原体感染的模式或者组织或细胞类型的代谢功能，蛋白质在细胞的不同区室中的定位使其对给定病原体更有效，或使其对细胞功能的干扰更少。例如，可以通过在构建体（即表达盒）内添加编码信号肽的序列（此类序列也可以称为“信号序列”），来产生前面有信号肽的蛋白质，信号肽引导翻译产物进入内质网。所用的信号序列可以是（例如）与编码多肽的基因相关的序列，或其可以取自另一个基因。
[0212] 文献中描述了多个信号肽，它们在很大程度上是可互换的（Raikhel and Chrispeels“,Protein sorting and vesicle traffic”in Buchanan et al.,eds,(2000)Biochemistry and Molecular Biology of Plants(American Society of Plant
Physiologists,Rockville,MD)（Raikhel和Chrispeels，“蛋白质分选和囊泡运输”，载于Buchanan等人编辑，2000年，《植物生物化学和分子生物学》，美国植物生理学家学会，马里兰州罗克维尔），其以引用的方式并入本文）。信号肽的添加将使翻译产物进入内质网（在该过程中信号肽自身从多肽移除），但蛋白质的最终细胞内定位取决于其他因素，可对这些因素进行控制以产生最适合病原体和细胞类型的定位。默认途径，即不包含其他靶向标记的多肽采用的途径，将使多肽的分泌跨过细胞膜（Raikhel and Chrispeels,supra（Raikhel和Chrispeels，出处同上））进入质外体。质外体是质膜系统外部的区域，包括细胞壁、细胞间隙和木质部导管，其形成水和溶质可从中穿行的连续、可渗透系统。这通常在合适的位置。在特定实施例中，编码大麦α-淀粉酶(BAA)信号肽的核苷酸序列加入本发明多核苷酸的阅读框。编码BAA信号肽的核苷酸序列和BAA信号肽的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中示出。
Physiologists,Rockville,MD)（Raikhel和Chrispeels，“蛋白质分选和囊泡运输”，载于Buchanan等人编辑，2000年，《植物生物化学和分子生物学》，美国植物生理学家学会，马里兰州罗克维尔），其以引用的方式并入本文）。信号肽的添加将使翻译产物进入内质网（在该过程中信号肽自身从多肽移除），但蛋白质的最终细胞内定位取决于其他因素，可对这些因素进行控制以产生最适合病原体和细胞类型的定位。默认途径，即不包含其他靶向标记的多肽采用的途径，将使多肽的分泌跨过细胞膜（Raikhel and Chrispeels,supra（Raikhel和Chrispeels，出处同上））进入质外体。质外体是质膜系统外部的区域，包括细胞壁、细胞间隙和木质部导管，其形成水和溶质可从中穿行的连续、可渗透系统。这通常在合适的位置。在特定实施例中，编码大麦α-淀粉酶(BAA)信号肽的核苷酸序列加入本发明多核苷酸的阅读框。编码BAA信号肽的核苷酸序列和BAA信号肽的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中示出。
[0213] 将肽定位在细胞内而不是细胞膜外，可以更有效地对抗其他病原体。这可以（例如）通过将内质网滞留信号编码序列添加至基因的序列来实现。该步骤的方法和序列在Raikhel and Chrispeels,supra（Raikhel和Chrispeels，出处同上）中有所描述；例如，将顺序编码氨基酸K、D、E和L的序列，或在文献中描述的其变体添加至多肽的蛋白编码部分末端可实现该步骤。ER滞留序列是本领域熟知的，包括（例如）KDEL(SEQ ID NO:15)、SEKDEL(SEQ ID NO:16)、HDEL(SEQ ID NO:17)和HDEF(SEQ ID NO:18)。参见（例如）Denecke et al.(1992).EMBO J.11:2345-2355（Denecke等人，1992年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第11卷，第2345-2355页）；Wandelt et al.(1992)Plant J.2:181-192（Wandelt等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第181-192页）；Denecke et al.(1993)J.Exp.Bot.44:213-221（Denecke等人，1993年《，实验植物学杂志》，第44卷，第213-221页）；Vitale et al.(1993)J.Exp.Bot.44:1417-1444（Vitale等人，1993年《，实验植物学杂志》，第44卷，第1417-1444页）；Gomord et al.(1996)Plant Physiol.Biochem.34:165-181（Gomord等人，1996年，《植物生理学和生物化学》，第34卷，第165-181页）；Lehmann et al.(2001)Plant Physiol.127(2):436–449（Lehmann等人，2001年，《植物生理学》，第127卷，第2期，第436-449页）。
[0214] 或者，除了信号肽以外，还可使用液泡靶向标记（例如Raikhel and Chrispeels,supra（Raikhel和Chrispeels，出处同上）所述的那些标记）使肽定位在液泡结构中。如Raikhel and Chrispeels,supra（Raikhel和Chrispeels，出处同上）中所述，液泡靶向标记可置于构建体中的不同位置。使用质体转运肽编码序列代替信号肽编码序列将使多肽定位在所选细胞类型的质体中（Raikhel and Chrispeels,supra（Raikhel和Chrispeels，出处同上））。此类转运肽是本领域已知的。参见（例如）Von Heijne et al.(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9:104-126（Von Heijne等人，1991年，《植物分子生物学报告》，第9卷，第104-126页）；Clark et al.(1989)J.Biol.Chem.264:17544-17550（Clark等人，1989年，《生物化学杂志》，第264卷，第17544-17550页）；Della-Cioppa et al.(1987)Plant Physiol.84:965-968（Della-Cioppa等人，1987年，《植物生理学》，第84卷，第965-968页）；
Romer et al.(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421（Romer等人，1993年，《生物化学和生物物理研究通讯》，第196卷，第1414-1421页）；以及Shah et al.(1986)Science233:478-481（Shah等人，1986年，《科学》，第233卷，第478-481页）。编码此类转运肽的叶绿体靶向序列也是本领域已知的，包括叶绿体核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的小亚基（de Castro Silva Filho et al.(1996)Plant Mol.Biol.30:769-780（de Castro Silva Filho等人，1996年，《植物分子生物学》，第30卷，第769-780页）；Schnell et al.(1991)J.Biol.Chem.266(5):3335-3342（Schnell等人，1991年《，生物化学杂志》，第266卷，第5期，第3335-3342页））、5-(烯醇式丙酮酰)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)（Archer et al.(1990)J.Bioenerg.Biomemb.22(6):789-810（Archer等人，1990年，《生物能学和生物膜杂志》，第22卷，第6期，第789-810页））、色氨酸合酶（Zhao et al.(1995)J.Biol.Chem.270(11):6081-6087（Zhao等人，1995年《，生物化学杂志》，第270卷，第11期，第6081-6087页））、质体蓝素（Lawrence et al.(1997)J.Biol.Chem.272(33):20357-20363（Lawrence等人，
1997年，《生物化学杂志》，第272卷，第33期，第20357-20363页））、分支酸合酶（Schmidt et al.(1993)J.Biol.Chem.268(36):27447-27457（Schmidt等人，1993年《，生物化学杂志》，第
268卷，第36期，第27447-27457页））以及捕光叶绿素a/b结合蛋白(LHBP)（Lamppa et al.(1988)J.Biol.Chem.263:14996-14999（Lamppa等人，1988年，《生物化学杂志》，第263卷，第
14996-14999页））。本领域的技术人员也可以设想培育转基因植物，该植物内转化了叶绿体，可过量表达抗病原菌肽的基因。参见（例如）Daniell(1999)Nature Biotech17:855-856（Daniell，1999年，《自然生物技术》，第17卷，第855-856页）；以及美国专利No.6,338,168。
Romer et al.(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421（Romer等人，1993年，《生物化学和生物物理研究通讯》，第196卷，第1414-1421页）；以及Shah et al.(1986)Science233:478-481（Shah等人，1986年，《科学》，第233卷，第478-481页）。编码此类转运肽的叶绿体靶向序列也是本领域已知的，包括叶绿体核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的小亚基（de Castro Silva Filho et al.(1996)Plant Mol.Biol.30:769-780（de Castro Silva Filho等人，1996年，《植物分子生物学》，第30卷，第769-780页）；Schnell et al.(1991)J.Biol.Chem.266(5):3335-3342（Schnell等人，1991年《，生物化学杂志》，第266卷，第5期，第3335-3342页））、5-(烯醇式丙酮酰)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)（Archer et al.(1990)J.Bioenerg.Biomemb.22(6):789-810（Archer等人，1990年，《生物能学和生物膜杂志》，第22卷，第6期，第789-810页））、色氨酸合酶（Zhao et al.(1995)J.Biol.Chem.270(11):6081-6087（Zhao等人，1995年《，生物化学杂志》，第270卷，第11期，第6081-6087页））、质体蓝素（Lawrence et al.(1997)J.Biol.Chem.272(33):20357-20363（Lawrence等人，
1997年，《生物化学杂志》，第272卷，第33期，第20357-20363页））、分支酸合酶（Schmidt et al.(1993)J.Biol.Chem.268(36):27447-27457（Schmidt等人，1993年《，生物化学杂志》，第
268卷，第36期，第27447-27457页））以及捕光叶绿素a/b结合蛋白(LHBP)（Lamppa et al.(1988)J.Biol.Chem.263:14996-14999（Lamppa等人，1988年，《生物化学杂志》，第263卷，第
14996-14999页））。本领域的技术人员也可以设想培育转基因植物，该植物内转化了叶绿体，可过量表达抗病原菌肽的基因。参见（例如）Daniell(1999)Nature Biotech17:855-856（Daniell，1999年，《自然生物技术》，第17卷，第855-856页）；以及美国专利No.6,338,168。
[0215] 也可以设想通过添加合适的靶向信息将抗病原菌多肽定位在其他细胞隔室中。（Raikhel and Chrispeels,supra（Raikhel和Chrispeels，出处同上））。万维网上提供各种靶向序列识别有关的信息和参考文献的可用站点可见于：psort.nibb.ac.jp/mit。蛋白质靶向领域现状有关的其他参考文献包括Silva-Filho(2003)Curr.Opin.Plant Biol.6:
589-595（Silva-Filho，2003年，《当代植物生物学观点》，第6卷，第589-595页）；Nicchitta(2002)Curr.Opin.Cell Biol.14:412-416（Nicchitta，2002年，《细胞生物学新见》，第14卷，第412-416页）；Bruce(2001)Biochim Biophys Acta1541:2-21（Bruce，2001年，《生物化学和生物物理学学报》，第1541卷，第2-21页）；Hadlington&Denecke(2000)
Curr.Opin.Plant Biol.3:461-468（Hadlington和Denecke，2000年，《当代植物生物学观点》，第3卷，第461-468页）；Emanuelsson et al.(2000)J Mol.Biol.300:1005-1016（Emanuelsson等人，2000年，《分子生物学杂志》，第300卷，第1005-1016页）；Emanuelsson&von Heijne(2001)Biochim Biophys Acta1541:114-119（Emanuelsson和von Heijne，2001年，《生物化学和生物物理学学报》，第1541卷，第114-119页），其以引用方式并入本文。
589-595（Silva-Filho，2003年，《当代植物生物学观点》，第6卷，第589-595页）；Nicchitta(2002)Curr.Opin.Cell Biol.14:412-416（Nicchitta，2002年，《细胞生物学新见》，第14卷，第412-416页）；Bruce(2001)Biochim Biophys Acta1541:2-21（Bruce，2001年，《生物化学和生物物理学学报》，第1541卷，第2-21页）；Hadlington&Denecke(2000)
Curr.Opin.Plant Biol.3:461-468（Hadlington和Denecke，2000年，《当代植物生物学观点》，第3卷，第461-468页）；Emanuelsson et al.(2000)J Mol.Biol.300:1005-1016（Emanuelsson等人，2000年，《分子生物学杂志》，第300卷，第1005-1016页）；Emanuelsson&von Heijne(2001)Biochim Biophys Acta1541:114-119（Emanuelsson和von Heijne，2001年，《生物化学和生物物理学学报》，第1541卷，第114-119页），其以引用方式并入本文。
[0216] 事实上，一些多肽以复合物前体产生，所述前体除靶向标记（例如本专利申请别处所讨论的信号肽）之外，还包含其他肽片段，这些肽片段在蛋白质成熟期间的某个时间点被移除（加工），从而得到不同于初级翻译产物的成熟形式的多肽（姑且不论信号肽的移除）。“成熟蛋白”是指翻译后加工的多肽；即，初级翻译产物中存在的任何原肽或前肽被移除的多肽。“前体蛋白”或“前原肽”或“前原蛋白”均指mRNA翻译的初级产物；即，原肽和前肽仍然存在。原肽和前肽可以包括（但不限于）：细胞内定位信号。该命名中的“原”通常是指信号肽。只移除信号肽但未进一步加工的翻译产物形式称为“前肽”或“前蛋白”。要移除的片段本身也称为“前肽”。因此，前蛋白或前肽已将信号肽移除，但包含前肽（此处称为前肽片段）和构成成熟蛋白的部分。根据表达蛋白质的物种以及所需的细胞内定位，技术人员能够确定是否使用只编码成熟形式蛋白、具有信号肽的成熟形式或具有信号肽的前蛋白（即，包括前肽的形式）的基因构建体可获得更高的表达水平。要实现植物或真菌中的最佳表达，可能需要原肽和前肽序列。前肽片段可能起到促进肽正确折叠的作用。在一些实施例中，本发明的抗病原菌多肽表达为融合蛋白，其中Pp-PDF1蛋白或另一个抗病原菌多肽（如，另一种防御素）的前肽片段（任选地前面有信号肽）融合到本发明多肽的氨基末端。Pp-PDF1前肽的核苷酸和氨基酸序列分别在SEQ ID NO:19和20中示出。
[0217] 本发明的多核苷酸可在宿主细胞，例如细菌、真菌、酵母、昆虫、哺乳动物或优选地植物细胞中表达。所谓“宿主细胞”是指包含本发明的异源多核苷酸的细胞。宿主细胞可以是原核细胞，例如大肠杆菌(E.coli)，或真核细胞，例如酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞。在一些实施例中，宿主细胞是单子叶植物或双子叶植物细胞。在特定实施例中，单子叶植物宿主细胞是玉米宿主细胞。
[0218] 本发明的抗病原菌多核苷酸可在表达盒中提供，用于在所关注的生物体中表达。本发明的表达盒可用于产生转化的植物、植物细胞和微生物，以及用于实施本文所公开的诱导病原抗性的方法。表达盒包含与本发明的抗病原菌多核苷酸有效连接的5'和3'调控序列。“有效连接”旨在意指两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，所关注的多核苷酸和调控序列（即启动子）之间的有效连接是可使该所关注的多核苷酸得以表达的功能连接。有效连接的元件可以是连续的或非连续的。当用来指两个蛋白质编码区域的连接时，所谓有效连接意指所述编码区域处于相同的阅读框中。表达盒可另外含有至少一个待共转化到该生物体中的额外基因。或者，可在多个表达盒上提供额外的基因。此类表达盒设有多个限制性位点和/或重组位点，以使编码抗病原菌多肽的多核苷酸的插入处于调控区的转录调控之下。
[0219] 表达盒在5'-3'转录方向上包含在宿主生物体起作用的转录和翻译起始区（即，启动子）、本发明的多核苷酸以及转录和翻译终止区（即，终止区）。本发明的调控区（即，启动子、转录调控区和翻译终止区）和/或多核苷酸对于宿主细胞而言或彼此之间可以是天然的/相似的。或者，本发明的调控区和/或多核苷酸对于宿主细胞或彼此之间可以是异源的。如本文所用，针对序列所谓的“异源”为起源于外来物种的序列，或者，如果起源于相同物种的话，则通过有意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因座方面进行实质性修饰的序列。例如，有效连接至异源多核苷酸的启动子来自于与得到该多核苷酸的物种不同的物种，或如果来自于相同/相似的物种，则一者或两者基本上从它们的原始形式和/或基因座修饰而获得，或该启动子不是该被有效连接的多核苷酸的天然启动子。
[0220] 可任选地包含的终止区可以对于转录起始区而言是天然的，可以对于有效连接的所关注的多核苷酸而言是天然的，可以对于植物宿主而言是天然的，或可以从对于启动子、所关注的多核苷酸、植物宿主或它们的任何组合而言别的来源（即外来的或异源的）获得。便利的终止区可得自根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还可参见Guerineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144（Guerineau等人，1991年，《分子遗传学和基因组学》，第262卷，第141-144页）；Proudfoot(1991)Cell64:
671-674（Proudfoot，1991年，《细胞》，第64卷，第671-674页）；Sanfacon et al.(1991)Genes Dev.5:141-149（Sanfacon等人，1991年，《基因和发育》，第5卷，第141-149页）；Mogen et al.(1990)Plant Cell2:1261-1272（Mogen等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第1261-
1272页）；Munroe et al.(1990)Gene91:151-158（Munroe等人，1990年《，基因》，第91卷，第
151-158页）；Ballas et al.(1989)Nucleic Acids Res.17:7891-7903（Ballas等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第7891-7903页）；以及Joshi et al.(1987)Nucleic Acids Res.15:9627-9639（Joshi等人，1987年《，核酸研究》，第15卷，第9627-9639页）。在特定实施例中，使用马铃薯蛋白酶抑制剂II基因(PinII)终止子。参见（例如）Keil et al.(1986)Nucl.Acids Res.14:5641-5650（Keil等人，1986年，《核酸研究》，第14卷，第5641-5650页）；
以及An et al.(1989)Plant Cell1:115-122（An等人，1989年，《植物细胞》，第1卷，第115-
122页），其全文以引用的方式并入本文。
671-674（Proudfoot，1991年，《细胞》，第64卷，第671-674页）；Sanfacon et al.(1991)Genes Dev.5:141-149（Sanfacon等人，1991年，《基因和发育》，第5卷，第141-149页）；Mogen et al.(1990)Plant Cell2:1261-1272（Mogen等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第1261-
1272页）；Munroe et al.(1990)Gene91:151-158（Munroe等人，1990年《，基因》，第91卷，第
151-158页）；Ballas et al.(1989)Nucleic Acids Res.17:7891-7903（Ballas等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第7891-7903页）；以及Joshi et al.(1987)Nucleic Acids Res.15:9627-9639（Joshi等人，1987年《，核酸研究》，第15卷，第9627-9639页）。在特定实施例中，使用马铃薯蛋白酶抑制剂II基因(PinII)终止子。参见（例如）Keil et al.(1986)Nucl.Acids Res.14:5641-5650（Keil等人，1986年，《核酸研究》，第14卷，第5641-5650页）；
以及An et al.(1989)Plant Cell1:115-122（An等人，1989年，《植物细胞》，第1卷，第115-
122页），其全文以引用的方式并入本文。
[0221] 如适当的话，可对多核苷酸进行优化以使其在转化的生物体中的表达提高。例如，可使用植物优选的密码子来合成多核苷酸，以改善表达。有关宿主优选的密码子用法的讨论，参见（例如）Campbell and Gowri(1990)Plant Physiol.92:1-11（Campbell和Gowri，1990年，《植物生理学》，第92卷，第1-11页）。本领域有用来合成植物优选的基因的方法。参见（例如）美国专利No.5,380,831和5,436,391以及Murray et al.(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498（Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498页），其以引用的方式并入本文。
[0222] 已知有另外的序列修饰可增强在细胞宿主中的基因表达。这些包括消除以下序列：编码假多腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列以及其他此类得到充分表征的可能对基因表达有害的序列。可将序列的G-C含量调整到给定的细胞宿主的平均水平，这通过参考在宿主细胞中表达的已知基因计算得到。当可能时，对序列进行修饰以避免出现预测的发夹二级mRNA结构。
[0223] 表达盒可另外含有5'前导序列。此类前导序列可起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的并且包括：微小RNA病毒前导序列，例如EMCV前导序列（脑心肌炎病毒5'非编码区）（Elroy-Stein et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:6126-6130（Elroy-Stein等人，1989年《，美国国家科学院院刊》，第86页，第6126-6130页））；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列（烟草蚀纹病毒）（Gallie et al.(1995)Gene165(2):233-238（Gallie等人，1995年，《基因》，第165卷，第2期，第233-238页））、MDMV前导序列（玉米矮小花叶病毒）（Virology154:9-20（《病毒学》，第154卷，第9-20页））以及人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)（Macejak et al.(1991)Nature353:90-94（Macejak等人，1991年，《自然》，第353卷，第90-94页））；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA(AMV RNA4)的非翻译前导序列（Jobling et al.(1987)Nature325:622-625（Jobling等人，1987年，《自然》，第325卷，第
622-625页））；烟草花叶病毒前导序列(TMV)（Gallie et al.(1989)in Molecular Biology of RNA,ed.Cech(Liss,New York),pp.237-256（Gallie等人，1989年，载于《RNA的分子生物学》，Cech编辑，纽约利斯，第237-256页））；以及玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)（Lommel et al.(1991)Virology81:382-385（Lommel等人，1991年，《病毒学》，第81卷，第382-385页））。还可参见Della-Cioppa et al.(1987)Plant Physiol.84:965-968（Della-Cioppa等人，1987年，《植物生理学》，第84卷，第965-968页）。
622-625页））；烟草花叶病毒前导序列(TMV)（Gallie et al.(1989)in Molecular Biology of RNA,ed.Cech(Liss,New York),pp.237-256（Gallie等人，1989年，载于《RNA的分子生物学》，Cech编辑，纽约利斯，第237-256页））；以及玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)（Lommel et al.(1991)Virology81:382-385（Lommel等人，1991年，《病毒学》，第81卷，第382-385页））。还可参见Della-Cioppa et al.(1987)Plant Physiol.84:965-968（Della-Cioppa等人，1987年，《植物生理学》，第84卷，第965-968页）。
[0224] 在制备表达盒时，可对各种DNA片段进行操纵，以提供处于正确取向的DNA序列，且适当时提供处于正确的阅读框的DNA序列。为此目的，可应用衔接子或接头将DNA片段连接在一起，或可涉及其他的操纵以提供便利的限制性位点、移除多余的DNA、移除限制性位点等。出于这个目的，可涉及到体外诱变、引物修复、限制性酶切、退火、再置换（例如转换和易位）。
[0225] 有许多启动子可用于实施本发明，包括所关注的多核苷酸序列的天然启动子。启动子可基于所需的结果来选择。Potenza et al.(2004)In Vitro Cell Dev Biol–Plant40:1-22（Potenza等人，2004年，《体外细胞和发育生物学–植物》，第40卷，第1-22页）的综述中讨论了一系列植物启动子，其以引用的方式并入本文。例如，可将核酸与组成型启动子、组织优选的启动子、或其他启动子进行组合，以在植物中表达。此类组成型启动子包括（例如）Rsyn7启动子的核心启动子和WO99/43838和美国专利No.6,072,050中公开的其他组成型启动子；CaMV35S核心启动子（Odell et al.(1985)Nature313:810-812（Odell等人，
1985年，《自然》，第313卷，第810-812页））；水稻肌动蛋白（McElroy et al.(1990)Plant Cell2:163-171（McElroy等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第163-171页））；泛素（Christensen et al.(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632（Christensen等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第619-632页）和Christensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.18:
675-689（Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页））；pEMU（Last et al.(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588（Last等人，1991年，《理论和应用遗传学》，第81卷，第581-588页））；MAS（Velten et al.(1984)EMBO J.3:2723-2730（Velten等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2723-2730页））；ALS启动子（美国专利No.5,659,026）等。其他组成型启动子包括（例如）美国专利No.5,608,149、5,608,144、5,
604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611。
1985年，《自然》，第313卷，第810-812页））；水稻肌动蛋白（McElroy et al.(1990)Plant Cell2:163-171（McElroy等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第163-171页））；泛素（Christensen et al.(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632（Christensen等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第619-632页）和Christensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.18:
675-689（Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页））；pEMU（Last et al.(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588（Last等人，1991年，《理论和应用遗传学》，第81卷，第581-588页））；MAS（Velten et al.(1984)EMBO J.3:2723-2730（Velten等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2723-2730页））；ALS启动子（美国专利No.5,659,026）等。其他组成型启动子包括（例如）美国专利No.5,608,149、5,608,144、5,
604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611。
[0226] 一般来讲，从诱导型启动子，特别是从病原体诱导型启动子表达基因将会是有利的。此类启动子包括来自病程相关蛋白（PR蛋白）的那些，该蛋白在病原体感染后诱导；例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1,3-葡聚糖酶、壳多糖酶等。参见（例如）Redolfi et al.(1983)Neth.J.Plant Pathol.89:245-254（Redolfi等人，1983年《，荷兰植物病理学杂志》，第89卷，第245-254页）；Uknes et al.(1992)Plant Cell4:645-656（Uknes等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第645-656页）；以及Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.4:111-116（Van Loon，1985年，《植物分子病毒学》，第4卷，第111-116页）。另参见WO99/43819，其以引用的方式并入本文。
[0227] 在病原体感染位点处或附近局部表达的启动子值得关注。参见（例如）Marineau et al.(1987)Plant Mol.Biol.9:335-342（Marineau等人，1987年《，植物分子生物学》，第9卷，第335-342页）；Matton et al.(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions2:325-331（Matton等人，1989年，《分子植物-微生物相互作用》，第2卷，第325-331页）；Somsisch et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:2427-2430（Somsisch等人，1986年《，美国国家科学院院刊》，第83卷，第2427-2430页）；Somsisch et al.(1988)Mol.Gen.Genet.2:93-98（Somsisch等人，1988年，《分子遗传学和基因组学》，第2卷，第93-98页）以及Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:14972-14977（Yang，1996年，《美国国家科学院院刊》，第93卷，第14972-14977页）。还可参见Chen et al.(1996)Plant J.10:955-966（Chen等人，1996年，《植物杂志》，第10卷，第955-966页）；Zhang et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:
2507-2511（Zhang等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第2507-2511页）；Warner et al.(1993)Plant J.3:191-201（Warner等人，1993年，《植物杂志》，第3卷，第191-201页）；Siebertz et al.(1989)Plant Cell1:961-968（Siebertz等人，1989年，《植物细胞》，第1卷，第961-968页）；美国专利No.5,750,386（线虫诱导型）；以及其中所引用的参考文献。
玉米PRms基因的诱导型启动子特别值得关注，该基因的表达是由病原体串珠镰孢菌
(Fusarium moniliforme)（参见（例如）Cordero et al.(1992)Physiol.Mol.Plant Path.41:189-200（Cordero等人，1992年，《生理学和分子植物病理学》，第41卷，第189-200页））以及美国专利No.6,429,362中描述的诱导型玉米启动子（如，Zm-PR1-81和Zm-PR1-83启动子）诱导的，所有这些文献全文以引用的方式并入本文。美国专利No.6,720,480中描述的启动子，例如Zm-BB11启动子也可用于本发明的实施。
2507-2511（Zhang等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第2507-2511页）；Warner et al.(1993)Plant J.3:191-201（Warner等人，1993年，《植物杂志》，第3卷，第191-201页）；Siebertz et al.(1989)Plant Cell1:961-968（Siebertz等人，1989年，《植物细胞》，第1卷，第961-968页）；美国专利No.5,750,386（线虫诱导型）；以及其中所引用的参考文献。
玉米PRms基因的诱导型启动子特别值得关注，该基因的表达是由病原体串珠镰孢菌
(Fusarium moniliforme)（参见（例如）Cordero et al.(1992)Physiol.Mol.Plant Path.41:189-200（Cordero等人，1992年，《生理学和分子植物病理学》，第41卷，第189-200页））以及美国专利No.6,429,362中描述的诱导型玉米启动子（如，Zm-PR1-81和Zm-PR1-83启动子）诱导的，所有这些文献全文以引用的方式并入本文。美国专利No.6,720,480中描述的启动子，例如Zm-BB11启动子也可用于本发明的实施。
[0228] 此外，因为病原体可通过伤口或昆虫损伤进入植物中，可将伤口诱导型启动子（其包括病原体诱导型启动子）用于本发明的构建体中。此类伤口诱导型启动子包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因（Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28:425-449（Ryan，1990年，《植物病理学年评》，第28卷，第425-449页）；Duan et al.(1996)Nature Biotechnology14:494-498（Duan等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第494-498页））；wun1和wun2，美国专利No.5,428,148；win1和win2（Stanford et al.(1989)Mol.Gen.Genet.215:200-208（Stanford等人，1989年，《分子遗传学和基因组学》，第215卷，第200-208页））；系统素（McGurl et al.(1992)Science225:1570-1573（McGurl等人，1992年《，科学》，第225卷，第
1570-1573页））；WIP1（Rohmeier et al.(1993)Plant Mol.Biol.22:783-792（Rohmeier等人，1993年，《植物分子生物学》，第22卷，第783-792页）；Eckelkamp et al.(1993)FEBS Letters323:73-76（Eckelkamp等人，1993年，《欧洲生物化学学会联盟快报》，第323卷，第
73-76页））；MPI基因（Corderok et al.(1994)Plant J.6(2):141-150（Corderok等人，1994年，《植物杂志》，第6卷，第2期，第141-150页））；等等，这些文献以引用的方式并入本文。
1570-1573页））；WIP1（Rohmeier et al.(1993)Plant Mol.Biol.22:783-792（Rohmeier等人，1993年，《植物分子生物学》，第22卷，第783-792页）；Eckelkamp et al.(1993)FEBS Letters323:73-76（Eckelkamp等人，1993年，《欧洲生物化学学会联盟快报》，第323卷，第
73-76页））；MPI基因（Corderok et al.(1994)Plant J.6(2):141-150（Corderok等人，1994年，《植物杂志》，第6卷，第2期，第141-150页））；等等，这些文献以引用的方式并入本文。
[0229] 可将化学调节启动子用于通过施加外源化学调节剂来调控基因在植物中的表达。取决于目标，启动子可以是化学诱导型启动子，其中施用化学物质可诱导基因表达，或者是化学抑制型启动子，其中施用化学物质可抑制基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知的，包括但不限于玉米In2-2启动子（其通过苯磺酰胺除草剂安全剂激活）、玉米GST启动子（其通过用作前突生(pre-emergent)除草剂的疏水性亲电化合物激活）和烟草PR-1a启动子（其通过水杨酸激活）。其他所关注的化学调节启动子包括类固醇响应启动子（参见（例如）Schena et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:10421-10425（Schena等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第10421-10425页）和McNellis et al.(1998)Plant J.14(2):247-257（McNellis等人，1998年《，植物杂志》，第14卷，第2期，第247-257页）中的糖皮质素诱导型启动子）以及四环素诱导型和四环素抑制型启动子（参见（例如）Gatz et al.(1991)Mol.Gen.Genet.227:229-237（Gatz等人，1991年，《分子遗传学和基因组学》，第227卷，第229-237页）以及美国专利No.5,814,618和5,789,156），这些文献以引用的方式并入本文。
[0230] 组织优选的启动子可用于本发明的抗病原菌多肽在特定植物组织内的靶向增强表达。例如，组织优选的启动子可用于在病害抗性尤其重要的植物组织，例如根或叶中表达抗病原菌多肽。组织优选的启动子包括Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2):255-265（Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第2期，第255-265页）；Kawamata et al.(1997)Plant Cell Physiol.38(7):792-803（Kawamata等人，1997年，《植物细胞生理学》，第38卷，第7期，第792-803页）；Hansen et al.(1997)Mol.Gen Genet.254(3):337-343（Hansen等人，1997年，《分子遗传学和基因组学》，第254卷，第3期，第337-343页）；Russell et al.(1997)Transgenic Res.6(2):157-168（Russell等人，1997年，《转基因研究》，第6卷，第2期，第157-168页）；Rinehart et al.(1996)Plant Physiol.112(3):1331-1341（Rinehart等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第3期，第1331-1341页）；Van Camp et al.(1996)Plant Physiol.112(2):525-535（Van Camp等人，1996年《，植物生理学》，第112卷，第2期，第525-535页）；Canevascini et al.(1996)Plant Physiol.112(2):513-524（Canevascini等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第2期，第513-524页）；Yamamoto et al.(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773-778（Yamamoto等人，1994年，《植物细胞生理学》，第35卷，第5期，第773-778页）；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20:181-196（Lam等人，1994年，《细胞分化的结果和问题》，第20卷，第181-196页）；Orozco et al.(1993)Plant Mol Biol.23(6):1129-1138（Orozco等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第6期，第1129-1138页）；Matsuoka et al.(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA90(20):9586-9590（Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第20期，第9586-9590页）；以及Guevara-Garcia et al.(1993)Plant J.4(3):495-505（Guevara-Garcia等人，
1993年，《植物杂志》，第4卷，第3期，第495-505页）。如有必要，可对这种启动子进行修饰以用于弱表达。
1993年，《植物杂志》，第4卷，第3期，第495-505页）。如有必要，可对这种启动子进行修饰以用于弱表达。
[0231] 维管组织优选的启动子是本领域已知的，包括选择性驱动蛋白质在（例如）木质部和韧皮部组织中表达的那些启动子。维管组织优选的启动子包括（但不限于）：野黑樱桃(Prunus serotina)野黑樱苷水解酶基因启动子（参见（例如）国际专利公开No.WO03/006651），以及可见于美国专利No.6,921,815中的那些启动子。
[0232] 茎优选的启动子可用于驱动本发明抗病原菌多肽的表达。示例性茎优选的启动子包括玉米MS8-15基因启动子（参见（例如）美国专利No.5,986,174和国际专利公开No.WO98/00533），以及可见于Graham et al.(1997)Plant Mol Biol33(4):729-735（Graham等人，
1997年，《植物分子生物学》，第33卷，第4期，第729-735页）中的那些启动子。在本发明的某些实施例中，Zm-419启动子用于玉米茎组织中的组织优选的表达。参见（例如）国际专利公开No.WO2007/050509和美国专利No.7,538,261。
1997年，《植物分子生物学》，第33卷，第4期，第729-735页）中的那些启动子。在本发明的某些实施例中，Zm-419启动子用于玉米茎组织中的组织优选的表达。参见（例如）国际专利公开No.WO2007/050509和美国专利No.7,538,261。
[0233] 叶优选的启动子是本领域已知的。参见（例如）Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2):255-265（Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第2期，第255-265页）；Kwon et al.(1994)Plant Physiol.105:357-67（Kwon等人，1994年，《植物生理学》，第105卷，第357-367页）；Yamamoto et al.(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773-778（Yamamoto等人，1994年，《植物细胞生理学》，第35卷，第5期，第773-778页）；Gotor et al.(1993)Plant J.3:509-18（Gotor等人，1993年，《植物杂志》，第3卷，第509-518页）；Orozco et al.(1993)Plant Mol.Biol.23(6):1129-1138（Orozco等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第6期，第1129-1138页）；以及Matsuoka et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20):9586-
9590（Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第20期，第9586-9590页）。
9590（Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第20期，第9586-9590页）。
[0234] 根优选的启动子是已知的，可选自许多可从文献得到的启动子，或者从多种相容物种从头分离。参见（例如）Hire et al.(1992)Plant Mol.Biol.20(2):207-218（Hire等人，1992年，《植物分子生物学》，第20卷，第2期，第207-218页）（大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因）；Keller and Baumgartner(1991)Plant Cell3(10):1051-1061（Keller和Baumgartner，1991年，《植物细胞》，第3卷，第10期，第1051-1061页）（法国菜豆的GRP1.8基因中的根特异性控制元件）；Sanger et al.(1990)Plant Mol.Biol.14(3):433-443（Sanger等人，1990年，《植物分子生物学》，第14卷，第3期，第433-443页）（根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)甘露碱合酶(MAS)基因的根特异性启动子）；以及Miao et al.(1991)Plant Cell3(1):11-22（Miao等人，1991年，《植物细胞》，第3卷，第1期，第11-22页）（编码胞液型谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，该酶在大豆的根和根瘤中表达）。还可参见Bogusz et al.(1990)Plant Cell2(7):633-641（Bogusz等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第7期，第633-641页），其中描述了从来自固氮非豆科榆科山黄麻(Parasponia andersonii)和相关的非固氮非豆科山黄麻(Trema tomentosa)的血红蛋白基因分离的两种根特异性启动子。将这些基因的启动子连接至β-葡糖醛酸酶报道基因并引入非豆科植物烟草(Nicotiana tabacum)和豆科植物百脉根(Lotus corniculatus)二者中，在这两种情况中根特异性启动子活性得以保持。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的高度表达的rolC和rolD根诱导基因的分析（参见Plant Science(Limerick)79(1):69-76（《植物科学》，Limerick，第79卷，第1期，第69-76页））。他们得出结论认为，增强子和组织优选的DNA决定子在那些启动子中是分离的。Teeri等人（1989年）使用与lacZ的基因融合显示，编码章鱼碱合酶的农杆菌(Agrobacterium)T-DNA基因在根尖的表皮中特别活跃，TR2'基因在完整植物中是根特异性的并且通过叶组织中的创伤刺激，这是用于杀昆虫或杀幼虫基因的特别理想的特性组合（参见EMBO J.8(2):343-350（《欧洲分子生物学组织杂志》，第8卷，第2期，第343-350页））。与nptII（新霉素磷酸转移酶II）融合的TR1'基因显示了相似的特性。另外的根优选的启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子（Kuster et al.(1995)Plant Mol.Biol.29(4):759-772（Kuster等人，1995年，《植物分子生物学》，第29卷，第4期，第759-772页））；和rolB启动子（Capana et al.(1994)Plant Mol.Biol.25(4):681-691（Capana等人，1994年，《植物分子生物学》，第25卷，第4期，第681-691页））。还可参见美国专利No.5,837,876、5,750,386、5,633,363、5,459,252、5,401,836、
5,110,732和5,023,179。
5,110,732和5,023,179。
[0235] “种子优选的”启动子包括“种子特异性”启动子（那些启动子在种子发育期间活跃，例如种子贮藏蛋白的启动子）以及“种子萌发”启动子（那些启动子在种子萌发期间活跃）。参见Thompson et al.(1989)BioEssays10:108（Thompson等人，1989年，《生物学论文集》，第10卷，第108页），其以引用方式并入本文。这类种子优选的启动子包括但不限于Cim1（细胞分裂素诱导信息）；cZ19B1（玉蜀黍19kDa玉米蛋白）；milps（肌醇-1-磷酸合酶）（参见WO00/11177和美国专利No.6,225,529；所述专利通过引用方式并入本文)。γ-玉米蛋白基因启动子是胚乳特异性启动子。球蛋白1(Glb-1)基因启动子是代表性的胚芽特异性启动子。对于双子叶植物而言，种子特异性启动子包括（但不限于）菜豆β-菜豆素基因启动子、油菜籽蛋白(napin)基因启动子、β-伴球蛋白基因启动子、大豆凝集素基因启动子、十字花科蛋白基因启动子等。对于单子叶植物而言，种子特异性启动子包括（但不限于）玉蜀黍15kDa玉米蛋白基因启动子、22kDa玉米蛋白基因启动子、27kDa玉米蛋白基因启动子、γ-玉米蛋白基因启动子、糯性蛋白基因启动子、超甜蛋白1基因启动子、超甜蛋白2基因启动子、球蛋白1基因启动子等。还可参见WO00/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子优选的启动子；所述专利以引用的方式并入本文。
[0236] 表达盒还可包含用于选择转化细胞的选择性标志物基因。选择性标志物基因被利用于转化细胞或组织的选择。选择性标志物基因包括编码抗生素抗性的基因，如那些编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物为例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)。另外的选择性标志物包括表型标志物如β-半乳醣苷酶和荧光蛋白如绿荧光蛋白(GFP)（Su et al.(2004)Biotechnol Bioeng85:610-9（Su等人，2004年《，生物技术和生物工程》，第85卷，第610-619页）和Fetter et al.(2004)Plant Cell16:215-28（Fetter等人，2004年，《植物细胞》，第16卷，第215-228页））、青色荧光蛋白(CYP)（Bolte et al.(2004)J.Cell Science117:943-54（Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-954页）和Kato et al.(2002)Plant Physiol129:913-42（Kato等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第913-942页））和黄色荧光蛋白（来自Evrogen的PhiYFPTM，参见Bolte et al.(2004)J.Cell Science117:943-54（Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-954页））。对于另外的选择性标志物，通常参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3:506-511
（Yarranton，1992年，《生物技术新见》，第3卷，第506-511页）；Christopherson et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6314-6318（Christopherson等人，1992年《，美国国家科学院院刊》，第89卷，第6314-6318页）；Yao et al.(1992)Cell71:63-72（Yao等人，1992年，《细胞》，第71卷，第63-72页）；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6:2419-2422（Reznikoff等人，1992年，《分子微生物学》，第6卷，第2419-2422页）；Barkley et al.(1980)in The Operon,pp.177-220（Barkley等人，1980年，载于《操纵子》，第177-220页）；
Hu et al.(1987)Cell48:555-566（Hu等人，1987年，《细胞》，第48卷，第555-566页）；Brown et al.(1987)Cell49:603-612（Brown等人，1987年，《细胞》，第49卷，第603-612页）；Figge et al.(1988)Cell52:713-722（Figge等人，1988年，《细胞》，第52卷，第713-722页）；
Deuschle et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA86:5400-5404（Deuschle等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第5400-5404页）；Fuerst et al.(1989)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2549-2553（Fuerst等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第
86卷，第2549-2553页）；Deuschle et al.(1990)Science248:480-483（Deuschle等人，1990年，《科学》，第248卷，第480-483页）；Gossen(1993)Ph.D.Thesis,University of Heidelberg（Gossen，1993年，海德堡大学博士论文）；Reines et al.(1993)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:1917-1921（Reines等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第
90卷，第1917-1921页）；Labow et al.(1990)Mol.Cell.Biol.10:3343-3356（Labow等人，
1990年，《分子细胞生物学》，第10卷，第3343-3356页）；Zambretti et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:3952-3956（Zambretti等人，1992年《，美国国家科学院院刊》，第89卷，第3952-3956页）；Baim et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:5072-5076（Baim等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第5072-5076页）；Wyborski et al.(1991)Nucleic Acids Res.19:4647-4653（Wyborski等人，1991年《，核酸研究》，第19卷，第
4647-4653页）；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10:143-162
（Hillenand-Wissman，1989年，《分子和结构生物学专题》，第10卷，第143-162页）；
Degenkolb et al.(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35:1591-1595（Degenkolb等人，
1991年《，抗微生物剂和化学治疗》，第35卷，第1591-1595页）；Kleinschnidt et al.(1988)Biochemistry27:1094-1104（Kleinschnidt等人，1988年，《生物化学》，第27卷，第1094-
1104页）；Bonin(1993)Ph.D.Thesis,University of Heidelberg（Bonin，1993年，海德堡大学博士论文）；Gossen et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5547-5551（Gossen等人，
1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第5547-5551页）；Oliva et al.(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36:913-919（Oliva等人，1992年，《抗微生物剂和化学治疗》，第36卷，第913-919页）；Hlavka et al.(1985)Handbook of Experimental Pharmacology,Vol.78(Springer-Verlag,Berlin)（Hlavka等人，1985年《，实验药理学手册》，第78卷，第页，斯普林格出版社，柏林）；Gill et al.(1988)Nature334:721-724（Gill等人，1988年，《自然》，第334卷，第721-724页）。将这些公开内容以引用的方式并入本文。
（Yarranton，1992年，《生物技术新见》，第3卷，第506-511页）；Christopherson et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6314-6318（Christopherson等人，1992年《，美国国家科学院院刊》，第89卷，第6314-6318页）；Yao et al.(1992)Cell71:63-72（Yao等人，1992年，《细胞》，第71卷，第63-72页）；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6:2419-2422（Reznikoff等人，1992年，《分子微生物学》，第6卷，第2419-2422页）；Barkley et al.(1980)in The Operon,pp.177-220（Barkley等人，1980年，载于《操纵子》，第177-220页）；
Hu et al.(1987)Cell48:555-566（Hu等人，1987年，《细胞》，第48卷，第555-566页）；Brown et al.(1987)Cell49:603-612（Brown等人，1987年，《细胞》，第49卷，第603-612页）；Figge et al.(1988)Cell52:713-722（Figge等人，1988年，《细胞》，第52卷，第713-722页）；
Deuschle et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA86:5400-5404（Deuschle等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第5400-5404页）；Fuerst et al.(1989)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2549-2553（Fuerst等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第
86卷，第2549-2553页）；Deuschle et al.(1990)Science248:480-483（Deuschle等人，1990年，《科学》，第248卷，第480-483页）；Gossen(1993)Ph.D.Thesis,University of Heidelberg（Gossen，1993年，海德堡大学博士论文）；Reines et al.(1993)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:1917-1921（Reines等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第
90卷，第1917-1921页）；Labow et al.(1990)Mol.Cell.Biol.10:3343-3356（Labow等人，
1990年，《分子细胞生物学》，第10卷，第3343-3356页）；Zambretti et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:3952-3956（Zambretti等人，1992年《，美国国家科学院院刊》，第89卷，第3952-3956页）；Baim et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:5072-5076（Baim等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第5072-5076页）；Wyborski et al.(1991)Nucleic Acids Res.19:4647-4653（Wyborski等人，1991年《，核酸研究》，第19卷，第
4647-4653页）；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10:143-162
（Hillenand-Wissman，1989年，《分子和结构生物学专题》，第10卷，第143-162页）；
Degenkolb et al.(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35:1591-1595（Degenkolb等人，
1991年《，抗微生物剂和化学治疗》，第35卷，第1591-1595页）；Kleinschnidt et al.(1988)Biochemistry27:1094-1104（Kleinschnidt等人，1988年，《生物化学》，第27卷，第1094-
1104页）；Bonin(1993)Ph.D.Thesis,University of Heidelberg（Bonin，1993年，海德堡大学博士论文）；Gossen et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5547-5551（Gossen等人，
1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第5547-5551页）；Oliva et al.(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36:913-919（Oliva等人，1992年，《抗微生物剂和化学治疗》，第36卷，第913-919页）；Hlavka et al.(1985)Handbook of Experimental Pharmacology,Vol.78(Springer-Verlag,Berlin)（Hlavka等人，1985年《，实验药理学手册》，第78卷，第页，斯普林格出版社，柏林）；Gill et al.(1988)Nature334:721-724（Gill等人，1988年，《自然》，第334卷，第721-724页）。将这些公开内容以引用的方式并入本文。
[0237] 上面关于选择性标志物基因的列表并不意指是限制性的。任何选择性标志物基因均可用于本发明。
[0238] 原核细胞可用作表达的宿主。原核生物最通常由大肠杆菌的各种菌株代表；然而，也可使用其他微生物株。在本文中定义为包括用于转录起始的启动子（任选具有操纵子）以及核糖体结合序列的常用原核控制序列，包括例如β-内酰胺酶（青霉素酶）和乳糖(lac)启动子系统（Chang et al.(1977)Nature198:1056（Chang等人，1977年，《自然》，第198卷，第1056页））、色氨酸(trp)启动子系统（Goeddel et al.(1980)Nucleic Acids Res.8:4057（Goeddel等人，1980年，《核酸研究》，第8卷，第4057页））和λ来源PL启动子和N-基因核糖体结合位点（Simatake and Rosenberg(1981)Nature292:128（Simatake和Rosenberg，1981年《，自然》，第292卷，第128页））的此类常用启动子。用于大肠杆菌的选择标志物的例子包括（例如）指定氨苄青霉素、四环素或氯霉素抗性的基因。
[0239] 选择载体以使得能引入到适当的宿主细胞中。细菌载体通常是质粒或噬菌体起源的。将适当的细菌细胞用噬菌体载体颗粒转染或用裸噬菌体载体DNA转染。如果使用质粒载体，则将细菌细胞用质粒载体DNA转染。表达本发明蛋白质的表达系统可以使用芽孢杆菌(Bacillus sp.)和沙门氏菌(Salmonella)（Palva et al.(1983)Gene22:229-235（Palva等人，1983年，《基因》，第22卷，第229-235页）和Mosbach et al.(1983)Nature302:543-545（Mosbach等人，1983年，《自然》，第302卷，第543-545页））进行。
[0240] 多种真核表达系统如酵母、昆虫细胞系、植物和哺乳动物细胞是本领域技术人员已知的。如下面简要解释的，可在这些真核系统中表达本发明的多核苷酸。在一些实施例中，将转化的/转染的植物细胞（如下文所论述的）用作表达系统，用于产生本发明的蛋白质。
[0241] 异源核苷酸序列在酵母中的合成是所熟知的。Sherman,F.,et al.(1982)Methods in Yeast Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory（Sherman,F.等人，1982年，《酵母遗传学方法》，冷泉港实验室）是描述多种可用于在酵母中产生蛋白质的方法的广泛认可的著作。两种广泛采用的用于产生真核蛋白质的酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。用于在酿酒酵母和毕赤酵母中进行的表达的载体、菌株和方案是本领域已知的，可从商业供应商（如，英杰(Invitrogen)）获得。根据需要，合适的载体通常具有表达控制序列如启动子（包括3-磷酸甘油酸激酶或醇氧化酶启动子）和复制起始区、终止序列等。
[0242] 本发明的蛋白质，一旦表达，就可通过裂解细胞并且向溶胞产物应用标准蛋白质分离技术来从酵母分离。可通过使用蛋白质印迹技术、放射免疫测定法或其他标准免疫测定技术来完成对纯化过程的监测。
[0243] 还可将本发明的序列连接到多种用于转染例如哺乳动物、昆虫或植物来源的细胞培养物的表达载体。可用于产生肽的示例性细胞培养物是哺乳动物细胞。本领域已经开发了多种能够表达完整蛋白质的合适的细胞系，包括HEK293、BHK21和CHO细胞系。用于这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，例如复制起点、启动子（如CMV启动子、HSV tk启动子或pgk（磷酸甘油酸激酶）启动子）、增强子（Queen et al.(1986)Immunol.Rev.89:49（Queen等人，1986年，《免疫学评述》，第89卷，第49页））和必要的加工信息位点例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点（如，SV40大T Ag多聚A添加位点）和转录终止子序列。可用于产生本发明蛋白质的其他动物细胞可（例如）从美国典型培养物保藏中心获得。
[0244] 用于在昆虫细胞中表达本发明的蛋白质的适当载体通常源于SF9杆状病毒。合适的昆虫细胞系包括蚊幼虫、蚕、行军虫、蛾和果蝇(Drosophila)细胞系，例如Schneider细胞系（参见Schneider(1987)J.Embryol.Exp.Morphol.27:353-365（Schneider，1987年，《胚胎学和实验形态学杂志》，第27卷，第353-365页））。
[0245] 如使用酵母一样，当采用高等动物或植物宿主细胞时，通常将多腺苷酸化或转录终止子序列掺入载体中。终止子序列的实例是来自牛生长激素基因的多腺苷酸化序列。还可包括用于转录物的精确剪接的序列。剪接序列的例子是来自SV40的VP1内含子（Sprague,et al.(1983)J.Virol.45:773-781（Sprague等人，1983年，《病毒学杂志》，第45卷，第773-781页））。另外，可将控制在宿主细胞中的复制的基因序列整合进载体，例如牛乳头瘤病毒类型的载体中存在的那些。Saveria-Campo,M.,(1985)Bovine Papilloma Virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector in DNA Cloning Vol.II a Practical Approach,
D.M.Glover,Ed.,IRL Press,Arlington,Virginia pp.213-238（Saveria-Campo,M.，1985年，“牛乳头瘤病毒DNA：一种真核克隆载体”，载于《DNA克隆第II卷实用方法》，D.M.Glover编辑，IRL出版社，弗吉尼亚州阿灵顿，第213-238页）。
D.M.Glover,Ed.,IRL Press,Arlington,Virginia pp.213-238（Saveria-Campo,M.，1985年，“牛乳头瘤病毒DNA：一种真核克隆载体”，载于《DNA克隆第II卷实用方法》，D.M.Glover编辑，IRL出版社，弗吉尼亚州阿灵顿，第213-238页）。
[0246] 动物和低等真核（如，酵母）宿主细胞是感受态的或通过多种方法赋予对转染的感受态。存在若干为人所熟知的将DNA引入动物细胞中的方法。这些方法包括：磷酸钙沉淀、受体细胞与含有该DNA的细菌原生质体融合、用含有该DNA的脂质体处理受体细胞、DEAE糊精法、电穿孔法、基因枪法和将DNA直接显微注射进细胞中。转染的细胞通过本领域熟知的方法培养。Kuchler,R.J.(1997)Biochemical Methods in Cell Culture and Virology,Dowden,Hutchinson and Ross,Inc.（Kuchler,R.J.，1997年《，细胞培养和病毒学中的生物化学方法》，道登、哈钦森和罗斯公司）。
[0247] 在某些实施例中，本发明的多核苷酸可与所关注的多核苷酸序列的任何组合堆叠，以产生具有所需表型的植物。例如，本发明的多核苷酸可与其他抗病原菌基因等堆叠。所产生的组合还可包括所关注多核苷酸中的任何一者的多个拷贝。本发明的多核苷酸也可与任何其他基因或基因的组合堆叠，以产生具有多种所需的性状组合的植物，所述性状包括（但不限于）：动物饲料所需的性状例如高油基因（如美国专利No.6,232,529）、平衡氨基酸（如，hordothionins（美国专利No.5,990,389、5,885,801、5,885,802和5,703,409）、大麦高赖氨酸（Williamson et al.(1987)Eur.J.Biochem.165:99-106（Williamson等人，1987年，《欧洲生物化学杂志》，第165卷，第99-106页）和WO98/20122）和高甲硫氨酸蛋白（Pedersen et al.(1986)J.Biol.Chem.261:6279（Pedersen等人，1986年，《生物化学杂志》，第261卷，第6279页）；Kirihara et al.(1988)Gene71:359（Kirihara等人，1988年，《基因》，第71卷，第359页）；以及Musumura et al.(1989)Plant Mol.Biol.12:123（Musumura等人，1989年《，植物分子生物学》，第12卷，第123页））、增加的消化性（如，改性贮藏蛋白（美国专利No.6,858,778）和硫氧还蛋白（美国专利No.7,009,087））；以上公开内容以引用的方式并入本文。
[0248] 本发明的多核苷酸也可与如下性状堆叠：抗虫、抗病或抗除草剂所需的性状（如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白（美国专利No.5,366,892、5,747,450、5,737,514、5,723,756、5,593,881；Geiser et al.(1986)Gene48:109（Geiser等人，1986年，《基因》，第48卷，第109页））；凝集素（Van Damme et al.(1994)Plant Mol.Biol.24:825（Van Damme等人，1994年，《植物分子生物学》，第24卷，第825页））；伏马毒素解毒基因（美国专利No.5,792,931）；无毒性和病害抗性基因（Jones et al.(1994)Science266:789（Jones等人，1994年《，科学》，第266卷，第789页）；Martin et al.(1993)Science262:1432（Martin等人，1993年，《科学》，第262卷，第1432页）；Mindrinos et al.(1994)Cell78:1089（Mindrinos等人，1994年，《细胞》，第78卷，第1089页）），包括（但不限于）其他植物防御素基因（美国专利No.6,911,577和7,396,980）；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体，例如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶的抑制剂例如草丁膦或basta（如，bar基因）；以及草甘膦抗性（EPSPS基因））；以及加工或加工产物所需的性状例如高油（如，美国专利No.6,232,
529）、改性油（如，脂肪酸去饱和酶基因（美国专利No.5,952,544、WO94/11516））；改性淀粉（如，ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉去分支酶(SDBE)）；
和聚合物或生物塑料（如，美国专利No.5.602,321；β-酮硫解酶、聚羟丁酸合酶和乙酰乙酰-CoA还原酶（Schubert et al.(1988)J.Bacteriol.170:5837-5847（Schubert等人，1988年，《细菌学杂志》，第170卷，第5837-5847页））有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达）；以上公开内容以引用的方式并入本文。还可将本发明的多核苷酸与提供例如雄性不育（如，参见美国专利No.5.583,210）、茎秆强度、开花时间之类的农艺性状或例如细胞周期调节或基因靶向（如，WO99/61619、WO00/17364和WO99/25821）之类的转化技术性状的多核苷酸进行组合；以上公开内容以引用的方式并入本文。
529）、改性油（如，脂肪酸去饱和酶基因（美国专利No.5,952,544、WO94/11516））；改性淀粉（如，ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉去分支酶(SDBE)）；
和聚合物或生物塑料（如，美国专利No.5.602,321；β-酮硫解酶、聚羟丁酸合酶和乙酰乙酰-CoA还原酶（Schubert et al.(1988)J.Bacteriol.170:5837-5847（Schubert等人，1988年，《细菌学杂志》，第170卷，第5837-5847页））有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达）；以上公开内容以引用的方式并入本文。还可将本发明的多核苷酸与提供例如雄性不育（如，参见美国专利No.5.583,210）、茎秆强度、开花时间之类的农艺性状或例如细胞周期调节或基因靶向（如，WO99/61619、WO00/17364和WO99/25821）之类的转化技术性状的多核苷酸进行组合；以上公开内容以引用的方式并入本文。
[0249] 这些堆叠组合可通过任何方法产生，包括但不限于通过任何常规方法或顶交(TopCross)方法进行的杂交育种植株，或者遗传转化。如果序列通过遗传转化植株来堆叠，则所关注的多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。例如，可将包括一种或多种期望性状的转基因植物用作靶标，通过后续的转化引入更多性状。可以用共转化规程将性状与所关注的多核苷酸同时引入，所述多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如，如果将引入两条序列，则可将该两条序列包含在单独的转化盒中（反式）或包含在同一转化盒中（顺式）。可通过相同启动子或不同启动子驱动序列表达。进一步认识到可使用位点特异性重组体系在期望基因组位点堆叠多核苷酸序列。参见（例如）WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，将这些文献都以引用方式并入本文。
[0250] 本发明的方法涉及将多肽或多核苷酸引入到植物中。“引入”旨在意指将多核苷酸或多肽给予植物，使得该序列能够进入植物细胞的内部。本发明的方法不取决于将序列引入植物中的具体方法，只要多核苷酸或多肽可进入植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物中的方法是本领域已知的，包括（但不限于）稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的转化方法。多肽也可引入植物，使得其能够进入植物细胞的内部，或留在细胞的外部但与其紧密接触。
[0251] “稳定转化”旨在意指被引入到植物中的核苷酸构建体整合到了植物的基因组中，并能够被其后代遗传。“瞬时转化”旨在意指多核苷酸被引入到植物中但没有整合到植物的基因组中，或者多肽被引入到植物中。
[0252] 转化规程以及将多肽或多核苷酸序列引入到植物中的规程，可根据要进行转化的植物或植物细胞的类型（即单子叶植物或双子叶植物）而异。将多肽和多核苷酸引入植物细胞的合适方法包括显微注射（Crossway et al.(1986)Biotechniques4:320-334（Crossway等人，1986年，《生物技术》，第4卷，第320-334页））、电穿孔（Riggs et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:5602-5606（Riggs等人，1986年，《美国国家科学院院刊》，第83卷，第5602-5606页）、农杆菌介导的转化（美国专利No.5,563,055和美国专利No.5,981,840）、直接基因转移（Paszkowski et al.(1984)EMBO J.3:2717-2722（Paszkowski等人，
1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2717-2722页））和弹道粒子加速（参见（例如）美国专利No.4,945,050、美国专利No.5,879,918、美国专利No.5,886,244和5,932,782；
Tomes et al.(1995)in Plant Cell,Tissue,and Organ Culture:Fundamental Methods,ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag,Berlin)（Tomes等人，1995年，《植物细胞、组织和器官培养：基本方法》，Gamborg和Phillips编辑，斯普林格出版社，柏林）；McCabe et al.(1988)Biotechnology6:923-926（McCabe等人，1988年《，生物技术》，第6卷，第923-926页））和Lec1转化（WO00/28058）。还可参见Weissinger et al.(1988)Ann.Rev.Genet.22:
421-477（Weissinger等人，1988年《，遗传学年评》，第22卷，第421-477页）；Sanford et al.(1987)Particulate Science and Technology5:27-37（Sanford等人，1987年《，粒子科学和技术》，第5卷，第27-37页）（洋葱）；Christou et al.(1988)Plant Physiol.87:671-674（Christou等人，1988年，《植物生理学》，第87卷，第671-674页）（大豆）；McCabe et al.(1988)Bio/Technology6:923-926（McCabe等人，1988年《，生物/技术》，第6卷，第923-926页）（大豆）；Finer and McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P:175-182（Finer和McMullen，1991年，《体外细胞和发育生物学》，第27卷，第175-182页）（大豆）；Singh et al.(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324（Singh等人，1998年，《理论和应用遗传学》，第96卷，第319-324页）（大豆）；Datta et al.(1990)Biotechnology8:736-740（Datta等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第736-740页）（水稻）；Klein et al.(1988)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:4305-4309（Klein等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第4305-4309页）（玉米）；Klein et al.(1988)Biotechnology6:559-563（Klein等人，
1988年《，生物技术》，第6卷，第559-563页）（玉米）；美国专利No.5,240,855、5,322,783和5,
324,646；Klein et al.(1988)Plant Physiol.91:440-444（Klein等人，1988年，《植物生理学》，第91卷，第440-444页）（玉米）；Fromm et al.(1990)Biotechnology8:833-839（Fromm等人，1990年《，生物技术》，第8卷，第833-839页）（玉米）；Hooykaas-Van Slogteren et al.(1984)Nature(London)311:763-764（Hooykaas-Van Slogteren等人，1984年，《自然（伦敦）》，第311卷，第763-764页）；美国专利No.5,736,369（谷物）；Bytebier et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:5345-5349（Bytebier等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第5345-5349页）（百合科）；De Wet et al.(1985)in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues,ed.Chapman et al.(Longman,New York),pp.197-209（De Wet等人，1985年，载于《胚珠组织的实验操作》，Chapman等人编辑，朗文，纽约，第197-
209页）（花粉）；Kaeppler et al.(1990)Plant Cell Reports9:415-418（Kaeppler等人，
1990年，《植物细胞报道》，第9卷，第415-418页）和Kaeppler et al.(1992)
Theor.Appl.Genet.84:560-566（Kaeppler等人，1992年，《理论和应用遗传学》，第84卷，第
560-566页）（触须介导的转化）；D'Halluin et al.(1992)Plant Cell4:1495-1505（D'Halluin等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第1495-1505页）（电穿孔）；Li et al.(1993)Plant Cell Reports12:250-255（Li等人，1993年，《植物细胞报道》，第12卷，第250-255页）和Christou and Ford(1995)Annals of Botany75:407-413（Christou和Ford，1995年，《植物学年鉴》，第75卷，第407-413页）（水稻）；Osjoda et al.(1996)Nature
Biotechnology14:745-750（Osjoda等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第745-750页）（通过根癌农杆菌转化玉米）；所有文献以引用的方式并入本文。
1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2717-2722页））和弹道粒子加速（参见（例如）美国专利No.4,945,050、美国专利No.5,879,918、美国专利No.5,886,244和5,932,782；
Tomes et al.(1995)in Plant Cell,Tissue,and Organ Culture:Fundamental Methods,ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag,Berlin)（Tomes等人，1995年，《植物细胞、组织和器官培养：基本方法》，Gamborg和Phillips编辑，斯普林格出版社，柏林）；McCabe et al.(1988)Biotechnology6:923-926（McCabe等人，1988年《，生物技术》，第6卷，第923-926页））和Lec1转化（WO00/28058）。还可参见Weissinger et al.(1988)Ann.Rev.Genet.22:
421-477（Weissinger等人，1988年《，遗传学年评》，第22卷，第421-477页）；Sanford et al.(1987)Particulate Science and Technology5:27-37（Sanford等人，1987年《，粒子科学和技术》，第5卷，第27-37页）（洋葱）；Christou et al.(1988)Plant Physiol.87:671-674（Christou等人，1988年，《植物生理学》，第87卷，第671-674页）（大豆）；McCabe et al.(1988)Bio/Technology6:923-926（McCabe等人，1988年《，生物/技术》，第6卷，第923-926页）（大豆）；Finer and McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P:175-182（Finer和McMullen，1991年，《体外细胞和发育生物学》，第27卷，第175-182页）（大豆）；Singh et al.(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324（Singh等人，1998年，《理论和应用遗传学》，第96卷，第319-324页）（大豆）；Datta et al.(1990)Biotechnology8:736-740（Datta等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第736-740页）（水稻）；Klein et al.(1988)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:4305-4309（Klein等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第4305-4309页）（玉米）；Klein et al.(1988)Biotechnology6:559-563（Klein等人，
1988年《，生物技术》，第6卷，第559-563页）（玉米）；美国专利No.5,240,855、5,322,783和5,
324,646；Klein et al.(1988)Plant Physiol.91:440-444（Klein等人，1988年，《植物生理学》，第91卷，第440-444页）（玉米）；Fromm et al.(1990)Biotechnology8:833-839（Fromm等人，1990年《，生物技术》，第8卷，第833-839页）（玉米）；Hooykaas-Van Slogteren et al.(1984)Nature(London)311:763-764（Hooykaas-Van Slogteren等人，1984年，《自然（伦敦）》，第311卷，第763-764页）；美国专利No.5,736,369（谷物）；Bytebier et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:5345-5349（Bytebier等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第5345-5349页）（百合科）；De Wet et al.(1985)in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues,ed.Chapman et al.(Longman,New York),pp.197-209（De Wet等人，1985年，载于《胚珠组织的实验操作》，Chapman等人编辑，朗文，纽约，第197-
209页）（花粉）；Kaeppler et al.(1990)Plant Cell Reports9:415-418（Kaeppler等人，
1990年，《植物细胞报道》，第9卷，第415-418页）和Kaeppler et al.(1992)
Theor.Appl.Genet.84:560-566（Kaeppler等人，1992年，《理论和应用遗传学》，第84卷，第
560-566页）（触须介导的转化）；D'Halluin et al.(1992)Plant Cell4:1495-1505（D'Halluin等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第1495-1505页）（电穿孔）；Li et al.(1993)Plant Cell Reports12:250-255（Li等人，1993年，《植物细胞报道》，第12卷，第250-255页）和Christou and Ford(1995)Annals of Botany75:407-413（Christou和Ford，1995年，《植物学年鉴》，第75卷，第407-413页）（水稻）；Osjoda et al.(1996)Nature
Biotechnology14:745-750（Osjoda等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第745-750页）（通过根癌农杆菌转化玉米）；所有文献以引用的方式并入本文。
[0253] 在特定实施例中，可使用多种瞬时转化方法将本发明的抗病原菌序列提供给植物。此类瞬时转化方法包括（但不限于）：将抗病原菌蛋白或其变体和片段直接引入到植物中，或将抗病原菌蛋白转录物引入到植物中。这类方法包括例如显微注射或粒子轰击。参见（例如）Crossway et al.(1986)Mol Gen.Genet.202:179-185（Crossway等人，1986年，《分子遗传学和基因组学》，第202卷，第179-185页）；Nomura et al.(1986)Plant Sci.44:53-58（Nomura等人，1986年，《植物科学》，第44卷，第53-58页）；Hepler et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91:2176-2180（Hepler等人，1994年《，美国国家科学院院刊》，第91卷，第2176-2180页）和Hush et al.(1994)The Journal of Cell Science107:775-784（Hush等人，1994年，《细胞科学杂志》，第107卷，第775-784页），所有文献均以引用的方式并入本文。或者，可使用本领域已知的技术将多核苷酸瞬时转化到植物中。这类技术包括病毒载体系统以及将多核苷酸以避免该DNA随后释放的方式进行的沉淀。因此，从粒子结合的DNA可发生转录，但其释放出来而整合到基因组中的频率则大大降低。此类方法包括使用包被有聚乙基亚胺(PEI;Sigma#P3143)的粒子。
[0254] 在其他实施例中，可通过使植物与病毒或病毒核酸接触而将本发明的多核苷酸引入到植物中。通常，这类方法涉及将本发明的核苷酸构建体掺入在病毒DNA或RNA分子内。应认识到，本发明的抗病原菌多肽可最初作为病毒多聚蛋白的一部分来合成，其以后可通过体内或体外蛋白水解加工而产生所需的重组蛋白。此外，应认识到，本发明的启动子还涵盖用于通过病毒RNA聚合酶进行的转录的启动子。涉及病毒DNA或RNA分子的将多核苷酸引入到植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法，是本领域已知的。参见（例如）美国专利No.5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931和Porta et al.(1996)Molecular Biotechnology5:209-221（Porta等人，1996年《，分子生物技术》，第5卷，第209-221页）；这些文献以引用的方式并入本文。
[0255] 用于将多核苷酸定向插入在植物基因组中的特定位置的方法是本领域已知的。在一个实施例中，将多核苷酸插入所需的基因组位置是用位点特异性重组系统来实现的。参见（例如）WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，将这些文献都以引用方式并入本文。简单而言，可将本发明的多核苷酸包含在转移盒中，该转移盒旁侧带有两个非重组产生的(non-recombinogenic)重组位点。将转移盒引入到在其基因组中稳定掺入了这样的靶标位点的植物中，该靶标位点两侧带有两个对应于该转移盒的所述位点的非重组工程的重组位点。提供适当的重组酶，将该转移盒整合在该靶标位点处。所关注的多核苷酸因此整合在植物基因组中的特定染色体位置。
[0256] 可根据常规方式将已转化的细胞培育成植株。参见例如McCormick et al.(1986)Plant Cell Reports5:81-84（McCormick等人，1986年，《植物细胞报道》，第5卷，第81-84页）。然后可使这些植物生长，用相同的转化植株或不同的植株进行授粉，所得的子代具有所鉴定的所需表型特征的组成型表达。可培养两代或更多代以确保所需表型特性的表达得到稳定保持和遗传，然后收获种子以确保所需表型特征的表达已得到实现。以此方式，本发明提供在其基因组中稳定掺入了本发明的多核苷酸（例如本发明的表达盒）的转化种子（也称为“转基因种子”）。
[0257] 系谱育种从两种基因型的杂交开始，例如将所关注的骨干系和具有一种或多种所需特性（即，具有稳定整合的本发明多核苷酸、具有调节活性和/或水平的本发明多肽等）的另一个骨干自交系（其与所关注的骨干系互补）杂交。如果两个原始亲本不提供所有所需特性，则其他来源可包括在繁育种群中。在系谱法中，使优势植株自交，并在连续杂交后代中选择。在连续杂交后代中，经过自花传粉和选择，杂合条件为纯合品系所代替。通常在系谱育种方法中，对五代或更多代连续杂交后代实行自交和选择：F1→F2；F2→F3；F3→F4；F4→F5等。在足够数量的自交后，连续子代用于增加所培育的自交株的种子。在特定实施例中，自交系包含在约95%或更多其基因座上的纯合等位基因。
[0258] 除用于进行回交转育之外，回交也可与系谱育种联合使用，以改良所关注的骨干系和使用改良的骨干系产生的杂交体。如此前所讨论，可采用回交从一个品系供体亲本将一个或多个特别需要的性状转移到称为轮回亲本的自交株，其具有总体良好的农艺特性，但缺乏所需的一个或多个性状。然而，可采用相同的方法促使子代演变为轮回亲本的基因型，但同时通过在早期停止回交并继续自交和选择来保持非轮回亲本的多种组分。例如，产生F1，如商业化杂交体。该商业化杂交体可与其亲本品系中的一者回交，产生BC1或BC2。使子代自交并进行选择，以使得新培育的自交株具有轮回亲本的多种属性，以及非轮回亲本的若干所需属性。该方法利用了用于新杂交体和育种的轮回亲本的价值和优势。
[0259] 因此，本发明的实施例是对所关注的玉米自交系进行回交转育的方法，该方法包括以下步骤：将所关注的玉米自交系植株与包含赋予所需性状（即，增强的病原抗性）的突变基因或转基因的供体植株杂交，选择包含赋予所需性状的该突变基因或转基因的F1子代植株，以及将所选择的F1子代植株与所关注的玉米自交系植株回交。该方法还可包括以下步骤：获得所关注的玉米自交系的分子标志物图谱，以及使用分子标志物图谱选择具有所需性状和所关注的自交系的分子标志物图谱的子代植株。同样地，该方法可用于通过添加如下最终步骤来产生F1杂交种子：将所需性状转育的所关注玉米自交系与不同的玉米植株杂交以产生包含赋予所需性状的突变基因或转基因的F1杂交玉米种子。
[0260] 轮回选择是用于改善植物种群的植物育种计划的方法。该方法需要单个植物彼此异花授粉形成子代。使子代生长，并且通过任何数量的选择方法来选择优势子代，其包括单个植株、半同胞子代、全同胞子代、自交子代和顶交。所选择的子代彼此异花授粉形成另一个种群的子代。种植该种群，并且再次选择优势植株用于彼此异花授粉。轮回选择是循环过程，因此可根据需要重复多次。轮回选择的目的是改善种群的性状。然后，改善的种群可用作育种材料的来源，以获得用于杂交体或用作综合品种的亲代的自交系。综合品种是通过若干所选自交株的互交形成的子代。
[0261] 当与分子标志物增强选择联合使用时，混合选择是可用的技术。在混合选择中，根据表型和/或基因型选择来自个体的种子。然后将这些选择的种子混在一起，并且用于栽培下一代。集团选择需要在大块田地中栽培植物种群，使植物自花授粉，整批收获种子，然后使用整批收获的种子样品种植下一代。除自花授粉之外，定向授粉也可用作育种计划的一部分。
[0262] 诱变育种为可用于将新性状引入骨干系的多种方法中的一种。自发进行或人工诱导的突变可以是对植物育种家有用的变异来源。人工诱变的目标是增加所需特性的突变率。突变率可通过多种不同的方法增加，包括温度、长期种子贮藏、组织培养条件、辐射（例如X-射线、γ射线（如钴60或铯137）、中子（原子反应堆中铀235的核裂变产物）、β辐射（由放射性同位素例如磷32或碳14发射）或紫外线辐射（优选地2500至2900nm））或化学突变剂（例如碱基类似物（5-溴-尿嘧啶）、相关化合物（8-乙氧基咖啡因）、抗生素（链黑菌素）、烷化剂（硫芥、氮芥、环氧化物、乙烯亚胺、硫酸盐、磺酸盐、砜、内酯）、叠氮化物、羟胺、亚硝酸或吖啶）。一旦通过诱变观察到所需的性状，该性状即可通过传统的育种技术例如回交整合到现有的种质中。诱变育种的详情可见于“Principals of Cultivar Development”Fehr,1993Macmillan Publishing Company（“品种选育的原则”，Fehr，1993年，麦克米伦出版公司），其公开内容以引用的方式并入本文。此外，其他品系中产生的突变可用于对骨干系进行回交转育，使之包含此类突变。
[0263] 如本文所用，术语植物还包括植物细胞、植物原生质体、从中可再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、在植物或植物部分中完好的植物块和植物细胞例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、仁、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花粉囊等。谷粒旨在表示商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的生产的成熟种子。再生的植物的子代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，条件是这些部分包含所引入的多核苷酸。
[0264] 本发明可用于诱导病原抗性或保护任何植物物种（包括（但不限于）单子叶植物和双子叶植物）免受病原菌攻击。所关注的植物物种的例子包括（但不限于）：玉米(Zea mays)、芸苔(Brassica sp.)（如，甘蓝型油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea)）尤其是可用作种子油来源的那些芸苔属物种、苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、裸麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor,Sorghum vulgare)、粟（如，珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黄米(Panicum miliaceum)、谷子(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana)）、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、落花生(Arachis hypogaea)、棉花（海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum)）、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、杏树(Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
[0265] 蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣（例如Lactuca sativa）、青豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)和黄瓜属(Cucumis)的成员如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃花(Rhododendron spp.)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、朱槿(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipa spp.)、水仙花(Narcissus spp.)、矮牵牛花(Petunia杂交体)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)和菊花。
[0266] 可用于实施本发明的针叶树包括（例如）松树如火炬松(Pinus taeda)、湿地松(Pinus elliotii)、西黄松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinus contorta)和辐射松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；西部铁杉(Tsuga canadensis)；西加云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoia sempervirens)；真冷杉(true fir)如银杉(Abies amabilis)和香脂冷杉(Abies balsamea)；以及香柏如西部红柏(Thuja plicata)和阿拉斯加黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis)。在特定实施例中，本发明的植物是作物植物（例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、稷、烟草等等）。在其他实施例中，玉米和大豆以及植物是最佳的，在另外的实施例中玉米植物是最佳的。
[0267] 所关注的其他植物包括提供所关注的种子的谷物植物、油料种子植物和豆科植物。所关注的种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、裸麦等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉米、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆类和豌豆。荚果类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等等。
[0268] 本发明的组合物还可用于涉及保护植物免受病原菌侵害的方法。“保护植物免受病原菌侵害”旨在意指杀死病原菌或者阻止或限制植物上病害的形成。在一些实施例中，将包含抗病原菌多肽和载体的抗病原菌组合物直接施用至植物病原菌的环境，例如施用至植物上或土壤中或围绕植物的根的其他栽培基质，以保护植物免受病原菌攻击。还提供了包含编码本发明抗病原菌蛋白的多核苷酸的微生物以及将它们用于保护植物免受病原菌侵害的方法。在一些实施例中，将转化微生物直接施用至植物或施用至栽培有植物的土壤。
[0269] 本发明还涵盖抗病原菌组合物，尤其是抗真菌组合物。抗病原菌组合物可包含抗病原菌多肽或含编码抗病原菌多肽的异源多核苷酸的微生物。本发明的抗病原菌组合物可以根据本文如下所述施用至植物病原菌的环境，从而保护植物免受病原菌攻击。此外，抗病原菌组合物可与可接受的载体，即（例如）悬浮液、溶液、乳状液、扑粉、可分散颗粒、可湿性粉末和可乳化浓缩物、气雾剂、浸渍颗粒、辅剂、可涂覆型糊剂进行配制，且包封于（例如）聚合物物质中。
[0270] 抗病原菌组合物还可用于动物或人食用籽粒的加工过程中、饲料加工过程中以及青贮料用植物材料的加工过程中。在该实施例中，将本发明的防御素以抗微生物活性的有效量施予籽粒、青贮料用植物材料或污染的粮食作物，或在加工程序的适当阶段期间施予。
[0271] 编码本发明的抗病原菌多肽，尤其是抗真菌多肽的多核苷酸可根据本领域的标准方法引入任何合适的微生物宿主。例如，可选择已知占据所关注的一种或多种作物的“植物圈”（叶面、叶际、根际和/或根面）的微生物宿主。选择这些微生物以便能够在特定环境中与野生型微生物成功地竞争，并且提供表达抗病原菌蛋白的基因的稳定维持和表达。
[0272] 此类微生物包括细菌、藻类和真菌。特别要关注的是微生物例如细菌如假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、甲基菌属(Methylius)、农杆菌属(Agrobacterium)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、节细菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)和产碱杆菌属(Alcaligenes)，真菌尤其是酵母如酵母菌属(Saccharomyces)、隐球菌属(Cryptococcus)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母(Rhodotorula)和短梗霉属(Aureobasidium)。特别要关注的是植物圈细菌物种如丁香假单胞菌
(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、农杆菌属(Agrobacteria)、球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas
campestris)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium melioti)、真养产碱杆菌(Alcaligenes
entrophus)、木质棍状杆菌(Clavibacter xyli)和棕色固氮菌(Azotobacter
vinelandii)，以及植物圈酵母物种例如深红类酵母菌(Rhodotorula rubra)、粘红酵母(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙黄红酵母(R.aurantiaca)、浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus)、流散隐球酵母(C.diffluens)、罗伦隐球酵母(C.laurentii)、罗斯酵母(Saccharomyces rosei)、普地酵母(S.pretoriensis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、玫红掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)、香气掷孢酵母(S.odorus)、维罗纳克鲁维酵母(Kluyveromyces veronae)和普鲁兰短梗霉(Aureobasidium pollulans)。特别要关注的是产色素微生物。
(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、农杆菌属(Agrobacteria)、球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas
campestris)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium melioti)、真养产碱杆菌(Alcaligenes
entrophus)、木质棍状杆菌(Clavibacter xyli)和棕色固氮菌(Azotobacter
vinelandii)，以及植物圈酵母物种例如深红类酵母菌(Rhodotorula rubra)、粘红酵母(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙黄红酵母(R.aurantiaca)、浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus)、流散隐球酵母(C.diffluens)、罗伦隐球酵母(C.laurentii)、罗斯酵母(Saccharomyces rosei)、普地酵母(S.pretoriensis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、玫红掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)、香气掷孢酵母(S.odorus)、维罗纳克鲁维酵母(Kluyveromyces veronae)和普鲁兰短梗霉(Aureobasidium pollulans)。特别要关注的是产色素微生物。
[0273] 其他示 例性革兰氏 阴性和革 兰氏 阳性 原核生物包 括肠杆菌 科(Enterobacteriaceae)，例如埃希杆菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、志贺氏杆菌属(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)、和变形杆菌属(Proteus)；芽胞杆菌科(Bacillaceae)；根瘤菌科(Rhizobiaceae)，例如根瘤菌属(Rhizobium)；螺菌科
(Spirillaceae，例如发光杆菌属(photobacterium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、气单胞菌属(Aeromonas)、弧菌属(Vibrio)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、螺菌属(Spirillum)；乳杆菌科(Lactobacillaceae)；假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，例如假单胞菌属(Pseudomonas)和醋酸杆菌属；固氮菌科(Azotobacteraceae)和硝化杆菌科(Nitrobacteraceae)。真核生物包括真菌，例如藻菌(Phycomycetes)和子囊菌
(Ascomycetes)，其包括酵母，例如酵母属(Saccharomyces)和裂殖酵母属
(Schizosaccharomyces)；以及担子菌(Basidiomycetes)酵母，例如红酵母(Rhodotorula)、短梗霉属(Aureobasidium)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)等。
(Spirillaceae，例如发光杆菌属(photobacterium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、气单胞菌属(Aeromonas)、弧菌属(Vibrio)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、螺菌属(Spirillum)；乳杆菌科(Lactobacillaceae)；假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，例如假单胞菌属(Pseudomonas)和醋酸杆菌属；固氮菌科(Azotobacteraceae)和硝化杆菌科(Nitrobacteraceae)。真核生物包括真菌，例如藻菌(Phycomycetes)和子囊菌
(Ascomycetes)，其包括酵母，例如酵母属(Saccharomyces)和裂殖酵母属
(Schizosaccharomyces)；以及担子菌(Basidiomycetes)酵母，例如红酵母(Rhodotorula)、短梗霉属(Aureobasidium)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)等。
[0274] 特别要关注的微生物宿主生物包括酵母，例如红酵母(Rhodotorula spp.)、短梗霉(Aureobasidium spp.)、酵母(Saccharomyces spp.)和掷孢酵母(Sporobolomyces spp.)，叶面生物体例如假单胞菌(Pseudomonas spp.)、欧文氏菌(Erwinia spp.)和黄杆菌(Flavobacterium spp.)和其他此类生物体，包括铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。
[0275] 可将编码本发明抗病原菌蛋白的多核苷酸引入在植物上繁殖的微生物（附生菌），以将抗病原菌蛋白递送至潜在的目标害虫。附生菌（例如）可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。
[0276] 根定殖菌（例如）可通过本领域已知的方法从所关注的植物分离。特别地，定殖于根的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株可从植物的根分离（参见（例如）Handelsman et al.(1991)Appl.Environ.Microbiol.56:713-718（Handelsman等人，1991年，《应用和环境微生物学》，第56卷，第713-718页））。编码本发明抗病原菌多肽的多核苷酸可通过本领域已知的标准方法引入根定殖的蜡状芽孢杆菌。
[0277] 编码抗病原菌蛋白的多核苷酸可通过电转化方法引入（例如）根定殖的芽孢杆菌属(Bacillus)。特别地，编码抗病原菌蛋白的多核苷酸可以克隆到穿梭载体，例如pHT3101（Lerecius et al.(1989)FEMS Microbiol.Letts.60:211-218（Lerecius等人，1989年，《欧洲生物化学学会联盟微生物学快报》，第60卷，第211-218页））。包含特定抗病原菌蛋白编码序列的穿梭载体pHT3101可以（例如）通过电穿孔方法转化到根定殖的芽孢杆菌属（Lerecius et al.(1989)FEMS Microbiol.Letts.60:211-218（Lerecius等人，1989年，《欧洲生物化学学会联盟微生物学快报》，第60卷，第211-218页））。
[0278] 提供了保护植物免受病原菌侵害的方法，该方法包括将有效量的本发明抗病原菌蛋白或组合物施用至病原菌的环境。“有效量”旨在意指足以控制病原菌的蛋白质或组合物的量。抗病原菌蛋白和组合物可通过本领域普通技术人员已知的方法施用至病原菌的环境。
[0279] 在将本发明的抗病原菌组合物施用至耕作区之前，可评估环境以确定所关注的病原菌是否存在或条件是否有利于病原菌生长或侵染。本文所用的“耕作区”包括期望在其中栽培植物的任何区域。此类耕作区包括（但不限于）：其中栽培植物的田地（例如农田、草地、林地、经营林、果实和蔬菜栽培田地等）、温室、生长箱等。环境的评估有助于确定控制耕作区内病原菌所需的本发明抗病原菌蛋白或组合物的有效量。
[0280] 可评估的环境条件包括（但不限于）：地下和地表水污染问题、作物的预期使用、作物耐性、土壤残留物、耕作区中存在的杂草、湿度、土壤结构、土壤的pH、土壤中有机物质的量、土壤的水含量、施用设备和耕作方式。在评估环境条件后，可将有效量的本发明抗病原菌组合物施用至作物、作物部分、作物的种子或耕作区。
[0281] 本发明的抗病原菌组合物可以通过加入表面活性剂、惰性载体、防腐剂、湿润剂、取食刺激剂、引诱剂、包封剂、粘结剂、乳化剂、染料、紫外线保护剂、缓冲剂、流平剂或肥料、微量营养素供体或影响植物生长的其他制剂来获得。可将一种或多种农用化学品（包括（但不限于）除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀螨剂、植物生长调节剂、辅助收获剂和肥料）与通常用于制剂领域的载体、表面活性剂或辅剂或其他组分组合，以便有利于产物处理以及施用于特定目标病原菌。合适的载体和辅剂可以是固体或液体，并且与通常用于制剂技术的物质，如，天然或再生的矿物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增粘剂、粘结剂、或肥料相对应。本发明的活性成分通常以组合物的形式施用，并且可施用至待处理的作物区、植物或种子。例如，可在粮仓或筒仓等内贮藏准备时或贮藏期间，将本发明的组合物施用至籽粒。本发明的组合物可与其他化合物同时施用或相继施用。施用包含本发明抗病原菌蛋白，更具体地讲抗真菌蛋白中的至少一者的本发明活性成分或本发明农用化学组合物的方法包括（但不限于）：叶面喷施、种子包衣和土壤施用。施用数量和施用比率取决于对应害虫或病原菌的侵染强度。
[0282] 合适的表面活性剂包括（但不限于）：阴离子化合物例如金属的羧酸盐；长链脂肪酸的羧酸盐；N-酰基肌氨酸盐；磷酸与脂肪醇乙氧基化物的单酯或二酯或此类酯的盐；脂肪醇硫酸盐例如十二烷基硫酸钠、十八烷基硫酸钠或十六烷基硫酸钠；乙氧基化脂肪醇硫酸盐；乙氧基化烷基酚硫酸盐；木质素磺酸盐；石油磺酸盐；烷基芳基磺酸盐例如烷基-苯磺酸盐或低级烷基萘磺酸盐，如丁基-萘磺酸盐；磺化萘-甲醛缩合物的盐；磺化酚-甲醛缩合物的盐；更复杂的磺酸盐例如酰胺磺酸盐，如油酸和N-甲基牛磺酸的磺化缩合产物；或二烷基磺基琥珀酸盐，如琥珀酸二辛酯磺酸钠。非离子剂包括脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酸酰胺或脂肪-烷基或烯基取代酚与环氧乙烷的缩合产物、多元醇醚的脂肪酯如脱水山梨糖醇脂肪酸酯、此类酯与环氧乙烷的缩合产物如聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物、炔二醇例如2,4,7,9-四乙基-5-十烯-4,7-二醇或乙氧基化炔二醇。阳离子表面活性剂的例子包括（例如）脂肪族一元胺、二元胺或多元胺例如乙酸盐、环烷酸盐或油酸盐；或含氧胺例如聚氧乙烯烷基胺的氧化胺；通过羧酸与二元胺或多元胺缩合制备的酰胺连接的胺；或季铵盐。
[0284] 本发明的抗病原菌组合物可以合适的形式直接施用或作为在施用前需要用适当量的水或其他稀释剂稀释的主要组合物的浓缩物。抗病原菌多肽的浓度将根据特定制剂的性质而变化，具体地讲，该制剂是浓缩物还是直接使用。该组合物包含1至98%的固体或液体惰性载体，以及0至50%，最佳地0.1至50%的表面活性剂。这些组合物以商品标签上注明的比率施用，最佳地干燥形式时每英亩约0.01磅-5.0磅，以及液体形式时每英亩约0.01品脱-10品脱。
[0285] 在另外的实施例中，本发明的组合物以及转化微生物和抗病原菌蛋白可以在配制前处理，以在施用至目标病原菌的环境时延长抗病原菌活性，尤其是抗真菌活性，只要预处理对活性无害。此类处理可通过化学和/或物理方法进行，只要该处理不会有害地影响一种或多种组合物的特性。化学试剂的例子包括（但不限于）：卤化剂；醛，例如甲醛和戊二醛；抗感染剂，例如苯扎氯胺；醇，例如异丙醇和乙醇；以及组织固定剂，例如布英固定剂和海利氏固定剂（参见（例如）Humason(1967)Animal Tissue Techniques(W.H.Freeman and Co.)（Humason，1967年，《动物组织技术》，W.H.弗里曼公司））。
[0286] 本发明的抗病原菌组合物可以通过（例如）喷雾、雾化、喷粉、播散、包衣或灌注、引入土壤中或土壤上、引入灌溉水中施用至植物病原菌的环境，在病原菌开始出现时或病原菌出现之前作为保护措施通过种子处理或一般施用或喷粉施用至植物病原菌的环境。例如，本发明的抗病原菌蛋白和/或转化微生物可与籽粒混合，以在贮藏期间保护籽粒。在植物生长的早期阶段实现对病原菌的良好控制通常是重要的，因为此时植物可能受到最严重的损伤。在本发明的一个实施例中，在种植时将组合物以颗粒状形式的载体和本发明的抗病原菌多肽或转化微生物的组合物直接施用至土壤。另一个实施例是颗粒状形式的包含农用化学品例如除草剂、杀虫剂、肥料、惰性载体和本发明的抗病原菌多肽或转化微生物的组合物。
[0287] 本发明的组合物可用于以多种方式保护植物、种子和植物产品。例如，组合物可用于涉及通过选自喷雾、喷粉、撒播或种子包衣的方法将有效量的抗病原菌组合物，更具体地讲抗真菌组合物置于病原菌的环境中的方法。
[0288] 其中抗病原菌组合物施用至所关注区域（以及其中的任何植物）的时间对于实现病原菌最佳控制可为重要的。其中抗病原菌组合物施用的时间可以参照植物的大小和/或所关注区域中的植物的生长和/或发育阶段来确定。植物的生长和/或发育阶段是本领域已知的。例如，大豆植株通常经历称为VE（出苗）、VC（子叶）、V1（单叶）和V2至VN的营养生长阶段。然后大豆响应光周期信号转到生殖生长阶段；生殖阶段包括R1（开始开花）、R2（完全开花）、R3（开始结荚）、R4（完全结荚）、R5（开始结实）、R6（完全结实）、R7（开始成熟）和R8（完全成熟）。玉米植株通常经历以下营养阶段：VE（出苗）、V1（第一叶）、V2（第二叶）、V3（第三叶）、V(n)（第N叶）和VT（抽穗）。玉米经历以下生殖阶段；R1（吐丝）、R2（灌浆）、R3（乳熟）、R4（蜡熟）、R5（顶陷）和R6（生理成熟）。棉花植株通常经历VE（出苗）、VC（子叶）、V1（第一真叶）和V2至VN。然后，生殖阶段在V14左右开始，包括R1（开始开花）、R2（完全开花）、R3（开始成铃）、R4（打顶、蕾铃发育）、R5（开始成熟、第一次吐絮）、R6（成熟、50%吐絮）和R7（完全成熟、80-90%吐絮）。因此，例如抗病原菌组合物或其他化学品施用至栽培有植物的所关注区域的时间可以是在特定区域中的一些或所有植物达到至少特定大小和/或生长和/或发育阶段的时间，或在特定区域中的一些或所有植物未达到特定大小和/或生长和/或发育阶段的时间。
[0289] 本领域的技术人员将会知道本文所公开的组合物和方法可与本领域可用的其他组合物和方法一起用于保护植物免受昆虫和病原菌攻击。例如，本发明的方法可包括将一种或多种除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀细菌剂、杀螨剂、生长调节剂、化学不育剂、化学信息素、驱避剂、引诱剂、信息素、取食刺激剂或其他生物活性化合物或昆虫病原细菌、病毒或真菌用于形成多组分混合物，从而给予甚至更广谱的农业保护。这些农业保护剂的一般参考文献包括The Pesticide Manual,13th Edition,C.D.S.Tomlin,Ed.,British Crop Protection Council,Farnham,Surrey,U.K.,2003（《杀虫剂手册》，第13版，C.D.S.Tomlin编辑，英国作物保护理事会，英国萨里郡法纳姆，2003年）和The BioPesticide Manual,2nd Edition,L.G.Copping,Ed.,British Crop Protection
Council,Farnham,Surrey,U.K.,2001（《生物杀虫剂手册》，第2版，L.G.Copping编辑，英国作物保护理事会，英国萨里郡法纳姆，2001年）。
Council,Farnham,Surrey,U.K.,2001（《生物杀虫剂手册》，第2版，L.G.Copping编辑，英国作物保护理事会，英国萨里郡法纳姆，2001年）。
[0290] 在植物繁殖材料（果实、块茎、球茎、鳞茎、籽粒、种子），但尤其是种子，作为商品出售之前，其通常用保护包衣进行处理，所述保护包衣包含除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或多种这些制品的混合物，如果需要的话还进一步加上制剂领域常用的载体、表面活性剂或促施用助剂，以提供对抗细菌、真菌或动物害虫造成的损害的保护。为了处理种子，可通过如下方法将保护包衣施用至种子：用液体制剂浸渍块茎或籽粒，或用组合的湿或干制剂对种子进行涂覆。另外，在特殊的情况中，其他施用至植物的方法也是可能的，例如针对芽或果实进行的处理。
[0291] 包含编码本发明抗病原菌多肽的多核苷酸的本发明植物种子可以用包含种子处理化合物，例如克菌丹、萎锈灵、福美双、甲基立枯磷、甲基嘧啶磷以及通常用于种子处理的其他化合物的种子保护包衣处理。或者，本发明的种子包括种子保护包衣，其包含本发明的抗病原菌组合物，更具体地讲抗真菌组合物，所述组合物单独或与通常用于种子处理的种子保护包衣中的一者结合使用。
[0292] 在本发明的实施例中，本发明的抗病原菌组合物可用作处理人和其他动物中的真菌和微生物病原体的药物组合物。真菌和微生物病原体造成的疾病和障碍包括（但不限于）：真菌脑膜脑炎、浅部真菌感染、环癣、足癣、组织胞浆菌病、念珠菌病、鹅口疮、球孢子菌瘤、肺隐球菌病、毛孢子菌病、发结节病、掌黑癣、真菌性角膜炎、甲癣、头癣、着色真菌病、曲菌病、支气管肺曲霉病、毛霉菌病、着色芽生菌病、皮肤真菌病、癣、镰刀菌病、糠疹、足分支菌病、假性阿利什利菌病和孢子丝菌病。
[0293] 在这些实施例的一些中，抗病原菌多肽与可药用载体组合。如本文所用，术语“可药用载体”包括与给药相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。补充的活性化合物也可整合到组合物中。
[0294] 具体地讲，本发明的抗病原菌多肽以及包含该多肽的药物组合物可用于为以下真菌病原体（但不限于它们）相关的疾病和障碍提供治疗：荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、假丝酵母(Candida spp.)（白假丝酵母(C.albicans)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)、高里假丝酵母(C.guilliermondii)、光滑假丝酵母(C.glabrata)、光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)、克柔假丝酵母(C.krusei)、葡萄牙假丝酵母(C.lusitaniae)）、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(A.flavus)、黑曲霉(A.niger)、根霉(Rhizopus spp.)、根毛霉(Rhizomucor spp.)、小克银汉霉(Cunninghamella spp.)、鳞质霉(Apophysomyces spp.)、瓶霉(Saksenaee spp.)、毛霉(Mucor spp.)和犁头霉(Absidia spp)。本发明的组合物作为抗真菌治疗的功效可以通过本领域技术人员已知的抗真菌测定法测定。
[0295] 本发明所公开的药物组合物可以通过多种方法施用至患者。系统施用也可通过经粘膜或经皮方法进行。对于经粘膜或经皮施用，将适于穿透屏障的渗透剂用于制剂。此类渗透剂通常是本领域已知的，包括（例如）用于经粘膜施用的洗涤剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜施用可通过使用鼻腔喷剂或栓剂实现。对于经皮施用，活性化合物配制为通常本领域已知的软膏、油膏、凝胶或霜剂。化合物也可以栓剂（如，具有常规的栓剂基质例如椰子油和其他甘油酯）或用于直肠递送的保留灌肠剂的形式制备。
[0296] 在一个实施例中，活性化合物使用避免化合物从身体快速消除的可药用载体，例如控释制剂来制备，包括植入物和微胶囊递送系统。可使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类制剂的方法对于本领域的技术人员将显而易见。该材料也可从阿尔扎公司(Alza Corporation)和诺华制药公司(Nova Pharmaceuticals,Inc.)商购获得。脂质体悬浮液（包括靶向感染细胞的脂质体，其中单克隆抗体靶向病毒抗原）也可用作可药用载体。这些可根据本领域的技术人员已知的方法制备，例如美国专利No.4,522,811中所描述。
[0297] 以剂量单位形式配制口服或肠胃外给药的组合物是尤其有利的，所述形式有利于施用和剂量的均匀度。本文所用的剂量单位形式是指适合用作单一剂量的物理上独立的单位，所述单一剂量用于使用包含预定量活性化合物的每个单位处理的受试者，所述预定量经计算与所需的药物载体结合产生所需的治疗效果。取决于疾病的类型和严重性，以约1μg/kg至约15mg/kg（如，0.1至20mg/kg）的活性化合物作为初始候选剂量例如通过一种或多种单独施用或通过连续灌注给患者施用。典型的日剂量取决于上述因素可以在约1μg/kg至约100mg/kg或更多的范围内。对于超过数天或更长的重复给药，取决于条件，保持治疗直到达到所需的疾病症状抑制。然而，也可使用其他剂量方案。该治疗的进展可通过常规的技术和测定法轻松监测。示例性给药方案在WO94/04188中有所公开。本发明剂量单位形式的说明通过活性化合物的独特特性和实现的特定治疗效果，以及将此类活性化合物组合用于个体的治疗的本领域固有限制来规定并且直接依赖于它们。
[0298] “治疗”在本文中定义为给患者施用或施加治疗剂，或给来自患者的分离的组织或细胞系施用或施加治疗剂，所述患者具有疾病、疾病的症状或疾病的倾向，其目的是治疗、治愈、缓解、减轻、改变、矫正、改良、改善或影响疾病、疾病的症状或疾病的倾向。“治疗剂”包括（但不限于）：本发明的多肽和药物组合物。
[0299] 本发明的抗病原菌多肽可用于任何应用，包括涂敷至目标微生物表面。这样，目标微生物包括人病原体或微生物。可涂覆本发明防御素的表面包括铺盖和无菌医疗设施。本发明的聚合物键合多肽可用于涂覆表面。将具有抗菌特性的组合物整合到聚合物的方法是本领域已知的。参见美国专利No.5,847,047，其以引用的方式并入本文。
[0300] 本发明的实施例可对多种植物病原体，尤其是真菌病原体例如禾生炭疽菌和禾谷镰孢菌有效。本发明的病原体包括（但不限于）：病毒或类病毒、细菌、昆虫、线虫、真菌等。病毒包括任何植物病毒，例如烟草或黄瓜花叶病毒、环斑病毒、坏死病毒、玉米矮花叶病毒等。真菌病原体包括（但不限于）：禾生炭疽菌、玉米色二孢、禾谷镰孢菌和轮枝镰孢菌。主要作物的特定病原体包括：大豆：大豆疫霉(Phytophthora megasperma fsp.glycinea)、菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、核盘菌
(Sclerotinia sclerotiorum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、菜豆间座壳大豆变种(Diaporthe phaseolorum var.sojae)（大豆拟茎点霉(Phomopsis sojae)）、菜豆间座壳(Diaporthe phaseolorum var.caulivora)、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)、菊池尾孢(Cercospora kikuchii)、大豆尾孢(Cercospora sojina)、东北霜霉(Peronospora manshurica)、束状刺盘孢(Colletotrichum dematium)（平头刺盘孢(Colletotichum truncatum)）、多主棒孢(Corynespora cassiicola)、大豆褐纹壳针孢(Septoria
glycines)、叶点霉(Phyllosticta sojicola)、链格孢(Alternaria alternata)、丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae p.v.glycinea)、野油菜黄单胞菌菜豆疫病致病变种(Xanthomonas campestris p.v.phaseoli)、散生叉丝壳(Microsphaera diffusa)、半裸镰孢菌(Fusarium semitectum)、瓶霉(Phialophora gregata)、大豆花叶病毒、大豆小丛壳(Glomerella glycines)、烟草环斑病毒、烟草条纹病毒、大豆锈菌(Phakopsora pachyrhizi)、瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)、终极腐霉(Pythium ultimum)、德巴利腐霉(Pythium debaryanum)、烟草斑枯病毒、大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)；卡诺拉油菜：白锈菌(Albugo candida)、甘蓝黑斑病菌(Alternaria brassicae)、小球腔菌(Leptosphaeria maculans)、立枯丝核菌
(Rhizoctonia solani)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、芸苔生球腔菌(Mycosphaerella brassicicola)、终极腐霉(Pythium ultimum)、寄生霜霉菌
(Peronospora parasitica)、粉红镰孢菌(Fusarium roseum)、链格孢(Alternaria alternata)；苜蓿：密执安棒杆菌诡谲亚种(Clavibacter michiganese
subsp.insidiosum)、终极腐霉(Pythium ultimum)、畸雌腐霉(Pythium irregulare)、华丽腐霉(Pythium splendens)、德巴利腐霉、瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)、大豆疫霉病菌(Phytophthora megasperma)、三叶草霜霉(Peronospora trifoliorum)、苜蓿茎点霉(Phoma medicaginis var.medicaginis)、苜蓿尾孢(Cercospora medicaginis)、苜蓿假盘菌(Pseudopeziza medicaginis)、苜蓿黄斑病菌(Leptotrochila medicaginis)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、苜蓿黄萎病菌(Verticillium albo-atrum)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris p.v.alfalfae)、根腐丝囊霉(Aphanomyces euteiches)、匍柄霉(Stemphylium herbarum)、苜蓿匍柄霉(Stemphylium alfalfae)、红花三叶草炭疽病菌(Colletotrichum trifolii)、苜蓿小光壳(Leptosphaerulina briosiana)、条纹单胞锈菌(Uromyces striatus)、三叶草核盘菌(Sclerotinia trifoliorum)、草木樨壳多孢
(Stagonospora meliloti)、葱叶枯病菌(Stemphylium botryosum)、苜蓿纤毛菌
(Leptotrichila medicaginis)；小麦：丁香假单胞菌致黑致病变种(Pseudomonas
syringae p.v.atrofaciens)、小麦秆黑粉病菌(Urocystis agropyri)、野油菜黄单胞菌小麦致病变种(Xanthomonas campestris p.v.translucens)、丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae p.v.syringae)、链格孢、腊叶芽枝霉(Cladosporium herbarum)、禾谷镰孢菌、燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)、大刀镰刀菌(Fusarium culmorum)、小麦散黑粉菌(Ustilago tritici)、小麦裾叶炫菌(Ascochyta tritici)、禾条斑头孢霉(Cephalosporium gramineum)、禾生炭疽菌(Collotetrichum graminicola)、小麦白粉病菌(Erysiphe graminis f.sp.tritici)、小麦秆锈菌(Puccinia graminis
f.sp.tritici)、小麦叶锈病菌(Puccinia recondita f.sp.tritici)、条锈菌(Puccinia striiformis)、小麦黄斑病真菌(Pyrenophora tritici-repentis)、颖枯病菌(Septoria nodorum)、叶枯病菌(Septoria tritici)、燕麦壳针孢(Septoria avenae)、小麦基腐病菌(Pseudocercosporella herpotrichoides)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis var.tritici)、瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)、强雄腐霉(Pythium arrhenomanes)、终极腐霉、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、大麦黄矮病毒、雀麦花叶病毒、土传小麦花叶病毒、小麦条纹花叶病毒、小麦梭条纹病毒、美洲小麦条点病毒、麦角菌(Claviceps purpurea)、小麦腥黑粉菌(Tilletia tritici)、光腥黑穗病(Tilletia laevis)、小麦散黑粉菌
(Ustilago tritici)、小麦印度腥黑粉菌(Tilletia indica)、立枯丝核菌、腐霉菌(Pythium arrhenomannes)、禾生腐霉(Pythium gramicola)、瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)、高原病毒、欧洲小麦条点病毒；向日葵：向日葵露菌病菌(Plasmopora halstedii)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、翠菊黄化(Aster Yellows)、向日葵壳针孢(Septoria helianthi)、向日葵茎溃疡病菌(Phomopsis helianthi)、向日葵链格孢(Alternaria helianthi)、百日菊链格孢(Alternaria zinniae)、草莓灰霉病菌(Botrytis cinerea)、麦氏茎点霉(Phoma macdonaldii)、菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina)、二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearum)、米根霉菌(Rhizopus oryzae)、无根根霉菌(Rhizopus arrhizus)、匍茎根霉菌(Rhizopus stolonifer)、向日葵柄锈菌
(Puccinia helianthi)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、欧文氏菌(Erwinia carotovorum pv.carotovora)、顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)、隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)、婆罗门参白锈(Albugo tragopogonis)；玉米：禾生炭疽菌、串珠镰孢菌亚粘团变种(Fusarium moniliforme var.subglutinans)、斯氏欧文菌(Erwinia stewartii)、轮枝镰孢菌、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)（禾谷镰孢菌）、玉米狭壳柱孢(Stenocarpella maydi)（玉米色二孢）、畸雌腐霉(Pythium irregulare)、德巴利腐霉、禾生腐霉(Pythium graminicola)、华丽腐霉、终极腐霉、瓜果腐霉菌、黄曲霉、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis O,T)(异旋孢腔菌(Cochliobolus heterostrophus)）、玉米圆斑病菌(Helminthosporium carbonum I,II&III)（玉米对圆斑病菌(Cochliobolus carbonum)）、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum I,II&III)、小柄长蠕孢(Helminthosporium pedicellatum)、玉米节壶菌(Physoderma maydis)、玉米黄叶枯病菌(Phyllosticta maydis)、玉米球梗孢(Kabatiella maydis)、高粱尾孢(Cercospora sorghi)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、普通锈病菌(Puccinia sorghi)、多堆柄锈菌(Puccinia polysora)、菜豆炭腐病菌(Macrophomina phaseolina)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)、稻黑孢菌(Nigrospora oryzae)、腊叶芽枝霉Cladosporium herbarum)、月状弯孢霉(Curvularia lunata)、不等弯孢霉(Curvularia inaequalis)、苍白弯孢霉(Curvularia pallescens)、密执安棒杆菌内布拉斯加州亚种(Clavibacter michiganense subsp.nebraskense)、绿色木霉(Trichoderma viride)、玉米矮花叶病毒A&B、小麦条纹花叶病毒、玉米褪绿矮病毒、高粱麦角菌(Claviceps sorghi)、燕麦假单胞菌(Pseudonomas avenae)、菊欧文氏杆菌玉米致病变种(Erwinia chrysanthemi pv.zea)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、谷物矮小螺原体(Corn stunt spiroplasma)、大孢色二孢(Diplodia macrospora)、大孢指疫霉(Sclerophthora macrospora)、高粱指霜霉(Peronosclerospora sorghi)、菲律宾指霜霉(Peronosclerospora philippinensis)、玉米指霜霉(Peronosclerospora maydis)、甘蔗指霜霉(Peronosclerospora sacchari)、高粱丝黑穗病菌(Sphacelotheca
reiliana)、玉米壳锈菌(Physopella zeae)、玉米枯萎头孢霉(Cephalosporium maydis)、顶头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)、玉米褪绿斑驳病毒、高原病毒、玉米花叶病毒、玉米雷亚多非纳病毒、玉米条纹病毒、玉米斑纹病毒、玉米粗缩病毒；高粱：玉米大斑病菌、高梁炭疽菌(C.sublineolum)、高粱尾孢(Cercospora sorghi)、高粱胶尾孢
(Gloeocercospora sorghi)、高粱粗斑壳二孢(Ascochyta sorghina)、丁香假单胞菌丁香致病变种、野油菜黄单胞菌栖绒毛草致病变种(Xanthomonas campestris
p.v.holcicola)、芒草假单胞菌(Pseudomonas andropogonis)、紫柄锈菌(Puccinia purpurea)、菜豆炭腐病菌(Macrophomina phaseolina)、拳须黑团孢(Perconia
circinata)、串珠镰孢菌、链格孢、高粱生平脐蠕孢(Bipolaris sorghicola)、高梁生长蠕孢(Helminthosporium sorghicola)、月状弯孢霉、高粱茎点霉(Phoma insidiosa)、燕麦假单胞菌(Pseudomonas avenae)（白沉淀假单胞菌(Pseudomonas alboprecipitans)）、高粱座枝孢(Ramulispora sorghi)、高粱生座枝孢(Ramulispora sorghicola)、甘蔗黑痣菌(Phyllachara sacchari)、高粱丝黑穗病菌(Sporisorium reilianum)、高粱散黑粉菌(Sphacelotheca cruenta)、高粱坚孢堆黑粉菌(Sporisorium sorghi)、甘蔗花叶病毒H、玉米矮花叶病毒A&B、高粱麦角菌、立枯丝核菌、直立顶孢霉(Acremonium strictum)、大孢指疫霉(Sclerophthona macrospora)、高粱指霜霉、菲律宾指霜霉、禾生指梗霉(Sclerospora graminicola)、禾谷镰孢菌、尖孢镰孢菌、强雄腐霉、禾生腐霉等。
(Sclerotinia sclerotiorum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、菜豆间座壳大豆变种(Diaporthe phaseolorum var.sojae)（大豆拟茎点霉(Phomopsis sojae)）、菜豆间座壳(Diaporthe phaseolorum var.caulivora)、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)、菊池尾孢(Cercospora kikuchii)、大豆尾孢(Cercospora sojina)、东北霜霉(Peronospora manshurica)、束状刺盘孢(Colletotrichum dematium)（平头刺盘孢(Colletotichum truncatum)）、多主棒孢(Corynespora cassiicola)、大豆褐纹壳针孢(Septoria
glycines)、叶点霉(Phyllosticta sojicola)、链格孢(Alternaria alternata)、丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae p.v.glycinea)、野油菜黄单胞菌菜豆疫病致病变种(Xanthomonas campestris p.v.phaseoli)、散生叉丝壳(Microsphaera diffusa)、半裸镰孢菌(Fusarium semitectum)、瓶霉(Phialophora gregata)、大豆花叶病毒、大豆小丛壳(Glomerella glycines)、烟草环斑病毒、烟草条纹病毒、大豆锈菌(Phakopsora pachyrhizi)、瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)、终极腐霉(Pythium ultimum)、德巴利腐霉(Pythium debaryanum)、烟草斑枯病毒、大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)；卡诺拉油菜：白锈菌(Albugo candida)、甘蓝黑斑病菌(Alternaria brassicae)、小球腔菌(Leptosphaeria maculans)、立枯丝核菌
(Rhizoctonia solani)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、芸苔生球腔菌(Mycosphaerella brassicicola)、终极腐霉(Pythium ultimum)、寄生霜霉菌
(Peronospora parasitica)、粉红镰孢菌(Fusarium roseum)、链格孢(Alternaria alternata)；苜蓿：密执安棒杆菌诡谲亚种(Clavibacter michiganese
subsp.insidiosum)、终极腐霉(Pythium ultimum)、畸雌腐霉(Pythium irregulare)、华丽腐霉(Pythium splendens)、德巴利腐霉、瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)、大豆疫霉病菌(Phytophthora megasperma)、三叶草霜霉(Peronospora trifoliorum)、苜蓿茎点霉(Phoma medicaginis var.medicaginis)、苜蓿尾孢(Cercospora medicaginis)、苜蓿假盘菌(Pseudopeziza medicaginis)、苜蓿黄斑病菌(Leptotrochila medicaginis)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、苜蓿黄萎病菌(Verticillium albo-atrum)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris p.v.alfalfae)、根腐丝囊霉(Aphanomyces euteiches)、匍柄霉(Stemphylium herbarum)、苜蓿匍柄霉(Stemphylium alfalfae)、红花三叶草炭疽病菌(Colletotrichum trifolii)、苜蓿小光壳(Leptosphaerulina briosiana)、条纹单胞锈菌(Uromyces striatus)、三叶草核盘菌(Sclerotinia trifoliorum)、草木樨壳多孢
(Stagonospora meliloti)、葱叶枯病菌(Stemphylium botryosum)、苜蓿纤毛菌
(Leptotrichila medicaginis)；小麦：丁香假单胞菌致黑致病变种(Pseudomonas
syringae p.v.atrofaciens)、小麦秆黑粉病菌(Urocystis agropyri)、野油菜黄单胞菌小麦致病变种(Xanthomonas campestris p.v.translucens)、丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae p.v.syringae)、链格孢、腊叶芽枝霉(Cladosporium herbarum)、禾谷镰孢菌、燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)、大刀镰刀菌(Fusarium culmorum)、小麦散黑粉菌(Ustilago tritici)、小麦裾叶炫菌(Ascochyta tritici)、禾条斑头孢霉(Cephalosporium gramineum)、禾生炭疽菌(Collotetrichum graminicola)、小麦白粉病菌(Erysiphe graminis f.sp.tritici)、小麦秆锈菌(Puccinia graminis
f.sp.tritici)、小麦叶锈病菌(Puccinia recondita f.sp.tritici)、条锈菌(Puccinia striiformis)、小麦黄斑病真菌(Pyrenophora tritici-repentis)、颖枯病菌(Septoria nodorum)、叶枯病菌(Septoria tritici)、燕麦壳针孢(Septoria avenae)、小麦基腐病菌(Pseudocercosporella herpotrichoides)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis var.tritici)、瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)、强雄腐霉(Pythium arrhenomanes)、终极腐霉、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、大麦黄矮病毒、雀麦花叶病毒、土传小麦花叶病毒、小麦条纹花叶病毒、小麦梭条纹病毒、美洲小麦条点病毒、麦角菌(Claviceps purpurea)、小麦腥黑粉菌(Tilletia tritici)、光腥黑穗病(Tilletia laevis)、小麦散黑粉菌
(Ustilago tritici)、小麦印度腥黑粉菌(Tilletia indica)、立枯丝核菌、腐霉菌(Pythium arrhenomannes)、禾生腐霉(Pythium gramicola)、瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)、高原病毒、欧洲小麦条点病毒；向日葵：向日葵露菌病菌(Plasmopora halstedii)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、翠菊黄化(Aster Yellows)、向日葵壳针孢(Septoria helianthi)、向日葵茎溃疡病菌(Phomopsis helianthi)、向日葵链格孢(Alternaria helianthi)、百日菊链格孢(Alternaria zinniae)、草莓灰霉病菌(Botrytis cinerea)、麦氏茎点霉(Phoma macdonaldii)、菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina)、二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearum)、米根霉菌(Rhizopus oryzae)、无根根霉菌(Rhizopus arrhizus)、匍茎根霉菌(Rhizopus stolonifer)、向日葵柄锈菌
(Puccinia helianthi)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、欧文氏菌(Erwinia carotovorum pv.carotovora)、顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)、隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)、婆罗门参白锈(Albugo tragopogonis)；玉米：禾生炭疽菌、串珠镰孢菌亚粘团变种(Fusarium moniliforme var.subglutinans)、斯氏欧文菌(Erwinia stewartii)、轮枝镰孢菌、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)（禾谷镰孢菌）、玉米狭壳柱孢(Stenocarpella maydi)（玉米色二孢）、畸雌腐霉(Pythium irregulare)、德巴利腐霉、禾生腐霉(Pythium graminicola)、华丽腐霉、终极腐霉、瓜果腐霉菌、黄曲霉、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis O,T)(异旋孢腔菌(Cochliobolus heterostrophus)）、玉米圆斑病菌(Helminthosporium carbonum I,II&III)（玉米对圆斑病菌(Cochliobolus carbonum)）、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum I,II&III)、小柄长蠕孢(Helminthosporium pedicellatum)、玉米节壶菌(Physoderma maydis)、玉米黄叶枯病菌(Phyllosticta maydis)、玉米球梗孢(Kabatiella maydis)、高粱尾孢(Cercospora sorghi)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、普通锈病菌(Puccinia sorghi)、多堆柄锈菌(Puccinia polysora)、菜豆炭腐病菌(Macrophomina phaseolina)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)、稻黑孢菌(Nigrospora oryzae)、腊叶芽枝霉Cladosporium herbarum)、月状弯孢霉(Curvularia lunata)、不等弯孢霉(Curvularia inaequalis)、苍白弯孢霉(Curvularia pallescens)、密执安棒杆菌内布拉斯加州亚种(Clavibacter michiganense subsp.nebraskense)、绿色木霉(Trichoderma viride)、玉米矮花叶病毒A&B、小麦条纹花叶病毒、玉米褪绿矮病毒、高粱麦角菌(Claviceps sorghi)、燕麦假单胞菌(Pseudonomas avenae)、菊欧文氏杆菌玉米致病变种(Erwinia chrysanthemi pv.zea)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、谷物矮小螺原体(Corn stunt spiroplasma)、大孢色二孢(Diplodia macrospora)、大孢指疫霉(Sclerophthora macrospora)、高粱指霜霉(Peronosclerospora sorghi)、菲律宾指霜霉(Peronosclerospora philippinensis)、玉米指霜霉(Peronosclerospora maydis)、甘蔗指霜霉(Peronosclerospora sacchari)、高粱丝黑穗病菌(Sphacelotheca
reiliana)、玉米壳锈菌(Physopella zeae)、玉米枯萎头孢霉(Cephalosporium maydis)、顶头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)、玉米褪绿斑驳病毒、高原病毒、玉米花叶病毒、玉米雷亚多非纳病毒、玉米条纹病毒、玉米斑纹病毒、玉米粗缩病毒；高粱：玉米大斑病菌、高梁炭疽菌(C.sublineolum)、高粱尾孢(Cercospora sorghi)、高粱胶尾孢
(Gloeocercospora sorghi)、高粱粗斑壳二孢(Ascochyta sorghina)、丁香假单胞菌丁香致病变种、野油菜黄单胞菌栖绒毛草致病变种(Xanthomonas campestris
p.v.holcicola)、芒草假单胞菌(Pseudomonas andropogonis)、紫柄锈菌(Puccinia purpurea)、菜豆炭腐病菌(Macrophomina phaseolina)、拳须黑团孢(Perconia
circinata)、串珠镰孢菌、链格孢、高粱生平脐蠕孢(Bipolaris sorghicola)、高梁生长蠕孢(Helminthosporium sorghicola)、月状弯孢霉、高粱茎点霉(Phoma insidiosa)、燕麦假单胞菌(Pseudomonas avenae)（白沉淀假单胞菌(Pseudomonas alboprecipitans)）、高粱座枝孢(Ramulispora sorghi)、高粱生座枝孢(Ramulispora sorghicola)、甘蔗黑痣菌(Phyllachara sacchari)、高粱丝黑穗病菌(Sporisorium reilianum)、高粱散黑粉菌(Sphacelotheca cruenta)、高粱坚孢堆黑粉菌(Sporisorium sorghi)、甘蔗花叶病毒H、玉米矮花叶病毒A&B、高粱麦角菌、立枯丝核菌、直立顶孢霉(Acremonium strictum)、大孢指疫霉(Sclerophthona macrospora)、高粱指霜霉、菲律宾指霜霉、禾生指梗霉(Sclerospora graminicola)、禾谷镰孢菌、尖孢镰孢菌、强雄腐霉、禾生腐霉等。
[0301] 线虫包括（但不限于）：寄生线虫例如根结、孢囊和根腐线虫，包括异皮线虫属(Heterodera)和球孢囊线虫(Globodera spp.)；尤其是马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯白线虫(Globodera pailida)（马铃薯孢囊线虫）；大豆异皮线虫(Heterodera glycines)（大豆孢囊线虫）；甜菜异皮线虫(Heterodera schachtii)（甜菜孢囊线虫）；以及禾谷异皮线虫(Heterodera avenae)（禾谷孢囊线虫）。另外的线虫包括：木豆异皮线虫(Heterodera cajani)；三叶草异皮线虫(Heterodera trifolii)；水稻异皮线虫(Heterodera oryzae)；烟草胞囊线虫(Globodera tabacum)；南方根结线虫(Meloidogyne incognita)；爪哇根结线虫(Meloidogyne javonica)；北方根结线虫(Meloidogyne hapla)；花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)；禾谷类根结线虫(Meloidogyne naasi)；
短小根结线虫(Meloidogyne exigua)；弩剑线虫(Xiphinema index)；意大利剑线虫(Xiphinema italiae)；美洲剑线虫(Xiphinema americanum)；土壤剑线虫(Xiphinema diversicaudatum)；穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)；最短尾短体线虫
(Pratylenchus brachyurus)；玉米短体线虫(Pratylenchus zeae)；咖啡短体线虫
(Pratylenchus coffeae)；索氏短体线虫(Pratylenchus thornei)；斯克里布纳短体线虫(Pratylenchus scribneri)；伤残短体线虫(Pratylenchus vulnus)；弯曲短体线虫(Pratylenchus curvitatus)；香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)；柑橘穿孔线虫(Radopholus citrophilus)；鳞球茎茎线虫(Ditylenchus dipsaci)；多带螺旋线虫(Helicotylenchus multicintus)；肾形肾状线虫(Rotylenchulus reniformis)；刺线虫(Belonolaimus spp.)；银链花拟毛刺线虫(Paratrichodorus anemones)；毛刺线虫(Trichodorus spp.)；原始线虫(Primitivus spp.)；小麦粒瘿线虫(Anguina tritici)；禾谷线虫(Bider avenae)；栖根拟粒线虫(Subanguina radicicola)；矮化线虫
(Tylenchorhynchus spp.)；纽带线虫(Haplolaimus seinhorsti)；柑橘半穿刺线虫(Tylenchulus semipenetrans)；蚤缀鞘线虫(Hemicycliophora arenaria)；刺线虫(Belonolaimus langicaudatus)；拟毛刺剑线虫(Paratrichodorus xiphinema)；拟毛刺线虫(Paratrichodorus christiei)；红轮线虫(Rhadinaphelenchus cocophilus)；微小拟毛刺线虫(Paratrichodorus minor)；盔状纽带线虫(Hoplolaimus galeatus)；哥伦布纽带线虫(Hoplolaimus columbus)；小环线虫(Criconemella spp.)；针属线虫(Paratylenchus spp.)；异常珍珠线虫(Nacoabbus aberrans)；水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)；
水稻茎线虫(Ditylenchus angustus)；潜根线虫(Hirchmaniella spp.)；盾线虫
(Scutellonema spp.)；卡纳亚拟鞘线虫(Hemicriconemoides kanayaensis)；矮化线虫(Tylenchorynchus claytoni)和瘟疫坏死线虫(Cacopaurus pestis)。
短小根结线虫(Meloidogyne exigua)；弩剑线虫(Xiphinema index)；意大利剑线虫(Xiphinema italiae)；美洲剑线虫(Xiphinema americanum)；土壤剑线虫(Xiphinema diversicaudatum)；穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)；最短尾短体线虫
(Pratylenchus brachyurus)；玉米短体线虫(Pratylenchus zeae)；咖啡短体线虫
(Pratylenchus coffeae)；索氏短体线虫(Pratylenchus thornei)；斯克里布纳短体线虫(Pratylenchus scribneri)；伤残短体线虫(Pratylenchus vulnus)；弯曲短体线虫(Pratylenchus curvitatus)；香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)；柑橘穿孔线虫(Radopholus citrophilus)；鳞球茎茎线虫(Ditylenchus dipsaci)；多带螺旋线虫(Helicotylenchus multicintus)；肾形肾状线虫(Rotylenchulus reniformis)；刺线虫(Belonolaimus spp.)；银链花拟毛刺线虫(Paratrichodorus anemones)；毛刺线虫(Trichodorus spp.)；原始线虫(Primitivus spp.)；小麦粒瘿线虫(Anguina tritici)；禾谷线虫(Bider avenae)；栖根拟粒线虫(Subanguina radicicola)；矮化线虫
(Tylenchorhynchus spp.)；纽带线虫(Haplolaimus seinhorsti)；柑橘半穿刺线虫(Tylenchulus semipenetrans)；蚤缀鞘线虫(Hemicycliophora arenaria)；刺线虫(Belonolaimus langicaudatus)；拟毛刺剑线虫(Paratrichodorus xiphinema)；拟毛刺线虫(Paratrichodorus christiei)；红轮线虫(Rhadinaphelenchus cocophilus)；微小拟毛刺线虫(Paratrichodorus minor)；盔状纽带线虫(Hoplolaimus galeatus)；哥伦布纽带线虫(Hoplolaimus columbus)；小环线虫(Criconemella spp.)；针属线虫(Paratylenchus spp.)；异常珍珠线虫(Nacoabbus aberrans)；水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)；
水稻茎线虫(Ditylenchus angustus)；潜根线虫(Hirchmaniella spp.)；盾线虫
(Scutellonema spp.)；卡纳亚拟鞘线虫(Hemicriconemoides kanayaensis)；矮化线虫(Tylenchorynchus claytoni)和瘟疫坏死线虫(Cacopaurus pestis)。
[0302] 本发明所公开的抗病原菌多肽可显示出对昆虫害虫的活性，这些昆虫害虫可包括经济上重要的农艺害虫、森林害虫、温室害虫、苗圃害虫、观赏植物害虫、食物和纤维害虫、公共健康和动物健康害虫、家庭和商业设施害虫、居室害虫和仓储害虫。昆虫害虫包括选自以下各目的昆虫：鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthoptera)、缨尾目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等，特别是鞘翅目和鳞翅目。
[0303] 鳞翅目(Lepidoptera)昆虫包括（但不限于）：夜蛾科(Noctuidae)中的行军虫、地老虎、尺蠖和棉铃虫，小地老虎(Agrotis ipsilon Hufnagel)（黑地老虎）；灰地老虎(A.orthogonia Morrison)（西部地老虎）；黄地老虎(A.segetum Denis#Schiffermüller)（蔓青蛾）；粒肤地老虎(A.subterranea Fabricius)（粒肤地蚕）；叶波纹须蛾(Alabama argillacea Hübner)（棉叶虫）；黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis Hübner)（黎豆毛虫）；粗皮夜蛾(Athetis mindara Barnes and McDunnough)（粗皮地蚕）；棉斑实蛾(Earias insulana Boisduval)（多刺螟蛉）；翠纹钻夜蛾(E.vittella Fabricius)（斑点棉铃虫）；柑橘夜蛾(Egira(Xylomyges)curialis Grote)（柑橘切根虫）；暗缘地老虎(Euxoa messoria Harris)（暗面地老虎）；棉铃虫(Helicoverpa armigera Hübner)（美洲棉铃虫）；美洲棉铃虫(H.zea Boddie)（玉米穗虫或棉铃虫）；烟芽夜蛾(Heliothis virescens Fabricius)（烟青虫）；苜蓿绿叶蛾(Hypena scabra Fabricius)（绿夜蛾）；Hyponeuma taltula Schaus；蓓带夜蛾(Mamestra configurata Walker)（贝莎粘虫）；甘蓝夜蛾(M.brassicae Linnaeus)（小菜蛾）；斑马纹夜蛾(Melanchra picta Harris)（斑马毛虫）；小毛胫夜蛾(Mocis latipes Guenée)（小毛胫夜蛾）；普通夜盗蛾(Pseudaletia unipuncta Haworth)（夜蛾）；
大豆夜蛾(Pseudoplusia includens Walker)（大豆尺蠖）；西部豆夜蛾(Richia albicosta Smith)（西部豆夜蛾）；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda JE Smith)（秋粘虫）；甜菜夜蛾(S.exigua Hübner)（甜菜夜蛾）；斜纹贪夜蛾(S.litura Fabricius)（斜纹夜蛾、茶虫）；
粉纹夜蛾(Trichoplusia ni Hübner)（卷心菜尺蠖）；来自螟蛾科(Pyralidae)和草螟科(Crambidae)的钻心虫、鞘蛾、结网虫、球果蛾和雕叶虫，例如小蜡螟(Achroia grisella Fabricius)（小蜡螟）；脐橙螟蛾(Amyelois transitella Walker)（脐橙螟）；地中海粉螟蛾(Anagasta kuehniella Zeller)（地中海粉斑螟）；粉斑螟蛾(Cadra cautella Walker)（杏仁蛾）；玉米螟(Chilo partellus Swinhoe)（斑茎螟）；二化螟(C.suppressalis Walker)（条杆/稻螟）；甘蔗茎螟(C.terrenellus Pagenstecher)（甘蔗蛀茎虫）；外米缀蛾(Corcyra cephalonica Stainton)（米蛾）；玉米根草螟(Crambus caliginosellus Clemens)（玉米根结网毛虫）；早熟禾草螟(C.teterrellus Zincken)（禾螟）；稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis Guenée)（稻卷叶虫）；葡萄野螟(Desmia funeralis Hübner)（葡萄卷叶虫）；甜瓜绢野螟(Diaphania hyalinata Linnaeus)（甜瓜野螟）；黄瓜绢野螟(D.nitidalis Stoll)（泡菜虫）；Diatraea flavipennella Box；西南玉米螟(D.grandiosella Dyar)（西南玉米钻心虫）、小蔗螟(D.saccharalis Fabricius)（甘蔗钻心虫）；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus Zeller)（小玉米茎钻心虫）；墨西哥稻螟(Eoreuma loftini Dyar)（墨西哥水稻螟）；烟草粉螟(Ephestia elutella Hübner)（烟草（可可）飞蛾）；大蜡螟(Galleria mellonella Linnaeus)（大蜡螟）；甘蔗卷叶蛾(Hedylepta accepta Butler)（甘蔗卷叶虫）；水稻切叶野螟(Herpetogramma licarsisalis Walker)（草地螟）；向日葵同斑螟(Homoeosoma electellum Hulst)（向日葵螟）；草地螟(Loxostege sticticalis Linnaeus)（甜菜网螟）；豇豆荚螟(Maruca testulalis Geyer)（豆荚螟）；茶树螟(Orthaga thyrisalis Walker)（茶树螟）；玉米螟(Ostrinia nubilalis Hübner)（欧洲玉米钻心虫）；
印度谷螟(Plodia interpunctella Hübner)（印度谷蛾）；三化螟(Scirpophaga
incertulas Walker)（三化螟）；芹菜网螟(Udea rubigalis Guenée)（芹菜叶虫）；以及卷蛾科(Tortricidae)的卷叶虫、蚜虫、种实虫和果实虫，西部黑头长翅卷蛾(Acleris
gloverana Walsingham)（西部黑头长翅卷蛾）；东部黑头长翅卷蛾(A.variana Fernald)（东部黑头长翅卷蛾）；苹小卷叶蛾(Adoxophyes orana Fischer von )（苹
果小卷蛾）；黄卷蛾属(Archips spp.)，包括果树黄卷蛾(A.argyrospila Walker)（果树卷叶虫）和欧洲卷叶蛾(A.rosana Linnaeus)（欧洲卷叶蛾）；条卷蛾属(Argyrotaenia spp.)；
巴西苹果卷叶虫(Bonagota salubricola Meyrick)（巴西苹果卷叶虫）；色卷蛾属
(Choristoneura spp.)；向日葵细卷蛾(Cochylis hospes Walsingham)（向日葵斑螟）；榛小卷蛾(Cydia latiferreana Walsingham)（榛小卷蛾）；苹果蠹蛾(C.pomonella
Linnaeus)（苹果小卷蛾）；萄果实蛀虫(Endopiza viteana Clemens)（葡萄浆果蛾）；女贞细卷蛾(Eupoecilia ambiguella Hübner)（葡萄蛾）；梨小食心虫(Grapholita molesta Busck)（梨小食心虫）；欧洲葡萄小卷叶蛾(Lobesia botrana Denis&Schiffermüller)（欧洲葡萄蛾）；杂色卷叶蛾(Platynota flavedana Clemens)（杂色卷叶蛾）；杂食卷叶蛾(P.stultana Walsingham)（杂食卷叶蛾）；苹芽小卷叶蛾(Spilonota ocellana Denis&Schiffermüller)（苹果芽小卷叶蛾）；以及向日葵芽蛾(Suleima helianthana Riley)（向日葵芽蛾）。
大豆夜蛾(Pseudoplusia includens Walker)（大豆尺蠖）；西部豆夜蛾(Richia albicosta Smith)（西部豆夜蛾）；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda JE Smith)（秋粘虫）；甜菜夜蛾(S.exigua Hübner)（甜菜夜蛾）；斜纹贪夜蛾(S.litura Fabricius)（斜纹夜蛾、茶虫）；
粉纹夜蛾(Trichoplusia ni Hübner)（卷心菜尺蠖）；来自螟蛾科(Pyralidae)和草螟科(Crambidae)的钻心虫、鞘蛾、结网虫、球果蛾和雕叶虫，例如小蜡螟(Achroia grisella Fabricius)（小蜡螟）；脐橙螟蛾(Amyelois transitella Walker)（脐橙螟）；地中海粉螟蛾(Anagasta kuehniella Zeller)（地中海粉斑螟）；粉斑螟蛾(Cadra cautella Walker)（杏仁蛾）；玉米螟(Chilo partellus Swinhoe)（斑茎螟）；二化螟(C.suppressalis Walker)（条杆/稻螟）；甘蔗茎螟(C.terrenellus Pagenstecher)（甘蔗蛀茎虫）；外米缀蛾(Corcyra cephalonica Stainton)（米蛾）；玉米根草螟(Crambus caliginosellus Clemens)（玉米根结网毛虫）；早熟禾草螟(C.teterrellus Zincken)（禾螟）；稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis Guenée)（稻卷叶虫）；葡萄野螟(Desmia funeralis Hübner)（葡萄卷叶虫）；甜瓜绢野螟(Diaphania hyalinata Linnaeus)（甜瓜野螟）；黄瓜绢野螟(D.nitidalis Stoll)（泡菜虫）；Diatraea flavipennella Box；西南玉米螟(D.grandiosella Dyar)（西南玉米钻心虫）、小蔗螟(D.saccharalis Fabricius)（甘蔗钻心虫）；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus Zeller)（小玉米茎钻心虫）；墨西哥稻螟(Eoreuma loftini Dyar)（墨西哥水稻螟）；烟草粉螟(Ephestia elutella Hübner)（烟草（可可）飞蛾）；大蜡螟(Galleria mellonella Linnaeus)（大蜡螟）；甘蔗卷叶蛾(Hedylepta accepta Butler)（甘蔗卷叶虫）；水稻切叶野螟(Herpetogramma licarsisalis Walker)（草地螟）；向日葵同斑螟(Homoeosoma electellum Hulst)（向日葵螟）；草地螟(Loxostege sticticalis Linnaeus)（甜菜网螟）；豇豆荚螟(Maruca testulalis Geyer)（豆荚螟）；茶树螟(Orthaga thyrisalis Walker)（茶树螟）；玉米螟(Ostrinia nubilalis Hübner)（欧洲玉米钻心虫）；
印度谷螟(Plodia interpunctella Hübner)（印度谷蛾）；三化螟(Scirpophaga
incertulas Walker)（三化螟）；芹菜网螟(Udea rubigalis Guenée)（芹菜叶虫）；以及卷蛾科(Tortricidae)的卷叶虫、蚜虫、种实虫和果实虫，西部黑头长翅卷蛾(Acleris
gloverana Walsingham)（西部黑头长翅卷蛾）；东部黑头长翅卷蛾(A.variana Fernald)（东部黑头长翅卷蛾）；苹小卷叶蛾(Adoxophyes orana Fischer von )（苹
果小卷蛾）；黄卷蛾属(Archips spp.)，包括果树黄卷蛾(A.argyrospila Walker)（果树卷叶虫）和欧洲卷叶蛾(A.rosana Linnaeus)（欧洲卷叶蛾）；条卷蛾属(Argyrotaenia spp.)；
巴西苹果卷叶虫(Bonagota salubricola Meyrick)（巴西苹果卷叶虫）；色卷蛾属
(Choristoneura spp.)；向日葵细卷蛾(Cochylis hospes Walsingham)（向日葵斑螟）；榛小卷蛾(Cydia latiferreana Walsingham)（榛小卷蛾）；苹果蠹蛾(C.pomonella
Linnaeus)（苹果小卷蛾）；萄果实蛀虫(Endopiza viteana Clemens)（葡萄浆果蛾）；女贞细卷蛾(Eupoecilia ambiguella Hübner)（葡萄蛾）；梨小食心虫(Grapholita molesta Busck)（梨小食心虫）；欧洲葡萄小卷叶蛾(Lobesia botrana Denis&Schiffermüller)（欧洲葡萄蛾）；杂色卷叶蛾(Platynota flavedana Clemens)（杂色卷叶蛾）；杂食卷叶蛾(P.stultana Walsingham)（杂食卷叶蛾）；苹芽小卷叶蛾(Spilonota ocellana Denis&Schiffermüller)（苹果芽小卷叶蛾）；以及向日葵芽蛾(Suleima helianthana Riley)（向日葵芽蛾）。
[0304] 鳞翅目(Lepidoptera)中选择的其他农艺学害虫包括（但不限于）：秋星尺蠖(Alsophila pometariaHarris)（秋星尺蠖）；桃枝麦蛾(Anarsia lineatella Zeller)（桃条麦蛾）；橙条大蚕蛾(Anisota senatoria J.E.Smith)（橙条大蚕蛾）；柞蚕(Antheraeapernyi Guérin-Méneville)（柞蚕）；家蚕(Bombyx mori Linnaeus)（蚕）；棉潜蛾(Bucculatrix thurberiella Busck)（棉花钻叶虫）；苜蓿粉蝶(Colias eurytheme Boisduval)（苜蓿粉蝶）；胡桃黄蝶(Datana integerrima Grote&Robinson)（胡桃毛虫）；落叶松毛虫(Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov)（西伯利亚蚕蛾），白尺蠖(Ennomos subsignaria Hübner)（榆尺蠖）；菩提尺蠖(Erannis tiliaria Harris)（椴木尺蠖）；甘蔗芽蛾(Erechthias flavistriata Walsingham)（甘蔗芽蛾）；黄毒蛾(Euproctis
chrysorrhoea Linnaeus)（棕尾毒蛾）；黑拟蛉蛾(Harrisina americana Guérin-Méneville)（葡萄叶食虫）；Heliothis subflexa Guenée；牧草天蚕蛾(Hemileuca oliviae Cockrell)(range caterpillar)；美国白蛾(Hyphantria cunea Drury)（美国白蛾）；番茄蠹蛾(Keiferia lycopersicella Walsingham)（番茄蠹蛾）；东部铁杉尺蠖(Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst)（东部铁杉尺蠖）；异叶铁杉尺蠖(L.fiscellaria lugubrosa Hulst)（西部铁杉尺蠖）；柳毒蛾(Leucoma salicis Linnaeus)（柳毒蛾）；舞毒蛾(Lymantria dispar Linnaeus)（舞毒蛾）；幕枯叶蛾属(Malacosoma spp.)；番茄天蛾(Manduca quinquemaculata Haworth)（五斑天蛾、番茄天蛾）；烟草天蛾(M.sexta Haworth)（番茄天蛾、烟草天蛾）；冬尺蠖(Operophtera brumata Linnaeus)（松白条尺蠖蛾）；古毒蛾属(Orgyia spp.)；春尺蠖(Paleacrita vernata Peck)（春尺蛾）；大凤蝶(Papilio cresphontes Cramer)（大黄带凤蝶、橙凤蝶）；加州槲蛾(Phryganidia californica Packard)（加州槲蛾）；柑桔潜叶蛾(Phyllocnistis citrella Stainton)（柑桔潜叶蛾）；斑幕潜叶蛾(Phyllonorycter blancardella Fabricius)（斑幕潜叶蛾）；大菜粉蝶(Pieris brassicae Linnaeus)（大菜粉蝶）；小菜粉蝶(P.rapae Linnaeus)（菜白蛾）；
暗脉菜粉蝶(P.napi Linnaeus)（暗脉菜粉蝶）；洋蓟羽蛾(Platyptilia carduidactyla Riley)（洋蓟羽蛾）；小菜蛾(Plutella xylostella Linnaeus)（小菜蛾）；棉红铃虫(Pectinophora gossypiella Saunders)（棉红铃虫）；南方菜青虫(Pontia protodice Boisduval&Leconte)（南方菜青虫）；杂食性尺蠖(Sabulodes aegrotata Guenée)（杂食性尺蠖）；红疣天社蛾(Schizura concinna J.E.Smith)（红疣天社蛾）；麦蛾(Sitotroga cerealella Olivier)（麦蛾）；大蔗螟(Telchin licus Drury)（大蔗螟）；松异带蛾(Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller)（松异带蛾）；结网衣蛾(Tineola
bisselliella Hummel)（结网衣蛾）；番茄斑潜蝇(Tuta aboluta Meyrick)（番茄斑潜蝇）和苹果巢蛾(Yponomeuta padella Linnaeus)（苹果巢蛾）。
chrysorrhoea Linnaeus)（棕尾毒蛾）；黑拟蛉蛾(Harrisina americana Guérin-Méneville)（葡萄叶食虫）；Heliothis subflexa Guenée；牧草天蚕蛾(Hemileuca oliviae Cockrell)(range caterpillar)；美国白蛾(Hyphantria cunea Drury)（美国白蛾）；番茄蠹蛾(Keiferia lycopersicella Walsingham)（番茄蠹蛾）；东部铁杉尺蠖(Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst)（东部铁杉尺蠖）；异叶铁杉尺蠖(L.fiscellaria lugubrosa Hulst)（西部铁杉尺蠖）；柳毒蛾(Leucoma salicis Linnaeus)（柳毒蛾）；舞毒蛾(Lymantria dispar Linnaeus)（舞毒蛾）；幕枯叶蛾属(Malacosoma spp.)；番茄天蛾(Manduca quinquemaculata Haworth)（五斑天蛾、番茄天蛾）；烟草天蛾(M.sexta Haworth)（番茄天蛾、烟草天蛾）；冬尺蠖(Operophtera brumata Linnaeus)（松白条尺蠖蛾）；古毒蛾属(Orgyia spp.)；春尺蠖(Paleacrita vernata Peck)（春尺蛾）；大凤蝶(Papilio cresphontes Cramer)（大黄带凤蝶、橙凤蝶）；加州槲蛾(Phryganidia californica Packard)（加州槲蛾）；柑桔潜叶蛾(Phyllocnistis citrella Stainton)（柑桔潜叶蛾）；斑幕潜叶蛾(Phyllonorycter blancardella Fabricius)（斑幕潜叶蛾）；大菜粉蝶(Pieris brassicae Linnaeus)（大菜粉蝶）；小菜粉蝶(P.rapae Linnaeus)（菜白蛾）；
暗脉菜粉蝶(P.napi Linnaeus)（暗脉菜粉蝶）；洋蓟羽蛾(Platyptilia carduidactyla Riley)（洋蓟羽蛾）；小菜蛾(Plutella xylostella Linnaeus)（小菜蛾）；棉红铃虫(Pectinophora gossypiella Saunders)（棉红铃虫）；南方菜青虫(Pontia protodice Boisduval&Leconte)（南方菜青虫）；杂食性尺蠖(Sabulodes aegrotata Guenée)（杂食性尺蠖）；红疣天社蛾(Schizura concinna J.E.Smith)（红疣天社蛾）；麦蛾(Sitotroga cerealella Olivier)（麦蛾）；大蔗螟(Telchin licus Drury)（大蔗螟）；松异带蛾(Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller)（松异带蛾）；结网衣蛾(Tineola
bisselliella Hummel)（结网衣蛾）；番茄斑潜蝇(Tuta aboluta Meyrick)（番茄斑潜蝇）和苹果巢蛾(Yponomeuta padella Linnaeus)（苹果巢蛾）。
[0305] 值得关注的是鞘翅目的幼虫和成体，其包括来自长角象科(Anthribidae)、豆象科(Bruchidae)和象甲科(Curculionidae)的象鼻虫，包括、但不限于：棉铃象甲(Anthonomus grandis Boheman)（棉铃象甲）；向日葵茎象甲(Cylindrocopturus adspersus LeConte)（向日葵茎象甲）；蔗根非耳象(Diaprepes abbreviatus Linnaeus)（蔗根非耳象）；三叶草叶象(Hypera punctata Fabricius)（三叶草叶象叶）；稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel)（稻水象甲）；西印度蔗象甲(Metamasius hemipterus hemipterus Linnaeus)（西印度蔗象甲）；丝光蔗象甲(M.hemipterus sericeus Olivier)（丝光蔗象甲）；谷象(Sitophilus granarius Linnaeus)（谷象)；米象(S.oryzae Linnaeus)（米象）；
红色葵花籽象甲(Smicronyx fulvus LeConte)（红色葵花籽象甲）；灰色葵花籽象甲(S.sordidus LeConte)（灰色葵花籽象甲）；玉米象虫(Sphenophorus maidis Chittenden)（玉米象虫）；甘蔗象虫(S.livis Vaurie)（甘蔗象虫）；新几内亚蔗象甲(Rhabdoscelus obscurus Boisduval)（新几内亚蔗象甲）；叶甲科(Chrysomelidae)的跳甲、黄瓜叶甲、根虫、叶甲、马铃薯叶甲以及潜叶虫，包括、但不限于：荒地玉米跳甲(Chaetocnema ectypa Horn)（荒地玉米跳甲）；玉米跳甲(C.pulicaria Melsheimer)（玉米跳甲）；葡萄肖叶甲(Colaspis brunnea Fabricius)（葡萄肖叶甲）；巴氏根叶甲(Diabrotica barberi Smith&Lawrence)（北部玉米根虫）；黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctata howardi Barber)（南方玉米根虫）；玉米根萤叶甲(D.virgifera virgifera LeConte)（西方玉米根虫）；科罗拉多州马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata Say)（科罗拉多州马铃薯甲虫）；橙足负泥虫(Oulema melanopus Linnaeus)（橙足负泥虫）；蔬菜黄条跳甲(Phyllotreta cruciferae Goeze)（玉米跳甲）；向日葵叶甲(Zygogramma exclamationis Fabricius)（向日葵甲）；来自瓢甲科(Coccinellidae)的甲虫，包括、但不限于：墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis Mulsant)（墨西哥豆瓢虫）；来自金龟科(Scarabaeidae)的金龟子和其他甲虫，包括、但不限于：牧草金龟(Antitrogus parvulus Britton)（牧草金龟）；北方圆头犀金龟
(Cyclocephala borealis Arrow)（北方圆头犀金龟、蛴螬）；南方圆头犀金龟
(C.immaculata Olivier)（南方圆头犀金龟、蛴螬）；灰背甘蔗甲虫(Dermolepida albohirtum Waterhouse)（灰背甘蔗甲虫）；甘蔗甲虫(Euetheola humilis rugiceps LeConte)（甘蔗甲虫）；法国甘蔗蛴螬(Lepidiota frenchi Blackburn)（法国甘蔗蛴螬）；胡萝卜金龟(Tomarus gibbosus De Geer)（胡萝卜甲虫）；甘蔗蛴螬(T.subtropicus Blatchley)（甘蔗蛴螬）；蛴螬(Phyllophaga crinita Burmeister)（蛴螬）；六月鳃金龟(P.latifrons LeConte)（六月鳃金龟）；日本金龟(Popillia japonica Newman)（日本金龟）；欧洲金龟(Rhizotrogus majalis Razoumowsky)（欧洲金龟）；来自皮蠹科
(Dermestidae)的地毯圆皮蠹(carpet beetle)；来自叩甲科(Elateridae)的铁线虫、伪金针虫属(Eleodes spp.)物种、梳爪叩甲属(Melanotus spp.)物种，包括铁线虫(M.communis Gyllenhal)（铁线虫）；单叶叩甲属(Conoderus spp.)物种；Limonius属物种；锥尾叩甲属(Agriotes spp.)物种；Ctenicera属物种；Aeolus属物种；来自小蠹科(Scolytidae)的小蠹(bark beetle)；来自拟步甲科(Tenebrionidae)的甲虫；来自天牛科(Cerambycidae)的甲虫，例如（但不限于）：天牛(Migdolus fryanus Westwood)（天牛）；以及来自吉丁虫科(Buprestidae)的甲虫，包括（但不限于）：潜叶吉丁虫(Aphanisticus cochinchinae seminulum Obenberger)（潜叶吉丁虫）。
红色葵花籽象甲(Smicronyx fulvus LeConte)（红色葵花籽象甲）；灰色葵花籽象甲(S.sordidus LeConte)（灰色葵花籽象甲）；玉米象虫(Sphenophorus maidis Chittenden)（玉米象虫）；甘蔗象虫(S.livis Vaurie)（甘蔗象虫）；新几内亚蔗象甲(Rhabdoscelus obscurus Boisduval)（新几内亚蔗象甲）；叶甲科(Chrysomelidae)的跳甲、黄瓜叶甲、根虫、叶甲、马铃薯叶甲以及潜叶虫，包括、但不限于：荒地玉米跳甲(Chaetocnema ectypa Horn)（荒地玉米跳甲）；玉米跳甲(C.pulicaria Melsheimer)（玉米跳甲）；葡萄肖叶甲(Colaspis brunnea Fabricius)（葡萄肖叶甲）；巴氏根叶甲(Diabrotica barberi Smith&Lawrence)（北部玉米根虫）；黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctata howardi Barber)（南方玉米根虫）；玉米根萤叶甲(D.virgifera virgifera LeConte)（西方玉米根虫）；科罗拉多州马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata Say)（科罗拉多州马铃薯甲虫）；橙足负泥虫(Oulema melanopus Linnaeus)（橙足负泥虫）；蔬菜黄条跳甲(Phyllotreta cruciferae Goeze)（玉米跳甲）；向日葵叶甲(Zygogramma exclamationis Fabricius)（向日葵甲）；来自瓢甲科(Coccinellidae)的甲虫，包括、但不限于：墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis Mulsant)（墨西哥豆瓢虫）；来自金龟科(Scarabaeidae)的金龟子和其他甲虫，包括、但不限于：牧草金龟(Antitrogus parvulus Britton)（牧草金龟）；北方圆头犀金龟
(Cyclocephala borealis Arrow)（北方圆头犀金龟、蛴螬）；南方圆头犀金龟
(C.immaculata Olivier)（南方圆头犀金龟、蛴螬）；灰背甘蔗甲虫(Dermolepida albohirtum Waterhouse)（灰背甘蔗甲虫）；甘蔗甲虫(Euetheola humilis rugiceps LeConte)（甘蔗甲虫）；法国甘蔗蛴螬(Lepidiota frenchi Blackburn)（法国甘蔗蛴螬）；胡萝卜金龟(Tomarus gibbosus De Geer)（胡萝卜甲虫）；甘蔗蛴螬(T.subtropicus Blatchley)（甘蔗蛴螬）；蛴螬(Phyllophaga crinita Burmeister)（蛴螬）；六月鳃金龟(P.latifrons LeConte)（六月鳃金龟）；日本金龟(Popillia japonica Newman)（日本金龟）；欧洲金龟(Rhizotrogus majalis Razoumowsky)（欧洲金龟）；来自皮蠹科
(Dermestidae)的地毯圆皮蠹(carpet beetle)；来自叩甲科(Elateridae)的铁线虫、伪金针虫属(Eleodes spp.)物种、梳爪叩甲属(Melanotus spp.)物种，包括铁线虫(M.communis Gyllenhal)（铁线虫）；单叶叩甲属(Conoderus spp.)物种；Limonius属物种；锥尾叩甲属(Agriotes spp.)物种；Ctenicera属物种；Aeolus属物种；来自小蠹科(Scolytidae)的小蠹(bark beetle)；来自拟步甲科(Tenebrionidae)的甲虫；来自天牛科(Cerambycidae)的甲虫，例如（但不限于）：天牛(Migdolus fryanus Westwood)（天牛）；以及来自吉丁虫科(Buprestidae)的甲虫，包括（但不限于）：潜叶吉丁虫(Aphanisticus cochinchinae seminulum Obenberger)（潜叶吉丁虫）。
[0306] 翅目(Diptera)的成体和未成熟体是值得关注的，包括潜叶虫美洲黍潜叶蝇(Agromyza parvicornis Loew)（玉米斑潜叶蝇）；摇蚊，包括、但不限于：高粱瘿蚊(Contarinia sorghicola Coquillett)（高粱摇蚊）；黑森瘿蚊(Mayetiola destructor Say)（黑森蝇）；向日葵籽摇蚊(Neolasioptera murtfeldtiana Felt)（向日葵籽摇蚊）；麦红吸浆虫(Sitodiplosis mosellana Géhin)（小麦摇蚊）；果实蝇（实蝇科(Tephritidae)）、黑麦秆蝇(Oscinella frit Linnaeus)（瑞典秆蝇）；蛆，包括、但不限于：地种蝇属(Delia spp.)物种，包括灰地种蝇(Delia platura Meigen)（种蝇）；麦种蝇(D.coarctata Fallen)（麦秆蝇）；夏厕蝇(Fannia canicularis Linnaeus)、小舍蝇(F.femoralis Stein)（夏厕蝇）；美洲麦杆蝇(Meromyza americana Fitch)（麦秆蝇）；舍蝇(Musca domestica Linnaeus)（家蝇类）；厩螫蝇(Stomoxys calcitrans Linnaeus)（厩蝇类）；秋家蝇、角蝇、丽蝇，金蝇属(Chrysomya spp.)物种；伏蝇属(Phormia spp.)物种；以及其他蝇类害虫、马蝇类虻属(Tabanus)物种；肤蝇类马胃蝇属(Gastrophilus)物种；狂蝇属(Oestrus)物种；牛蝇类牛皮蝇属(Hypoderma)物种；鹿蝇类斑虻属(Chrysops)物种；绵羊虱蝇(Melophagus ovinus Linnaeus)（虱蝇类）；和其他的短角亚目(Brachycera)、蚊类伊蚊属(Aedes)物种；
按蚊属(Anopheles)物种；库蚊属(Culex)物种；黑蝇类原蚋属(Prosimulium)物种；蚋属(Simulium)物种；拟蚊蠓、白蛉、眼蕈蚊和其他长角亚目(Nematocera)。
按蚊属(Anopheles)物种；库蚊属(Culex)物种；黑蝇类原蚋属(Prosimulium)物种；蚋属(Simulium)物种；拟蚊蠓、白蛉、眼蕈蚊和其他长角亚目(Nematocera)。
[0307] 关注的昆虫包括半翅目的那些昆虫，例如、但不限于以下科：球蚜科(Adelgidae)、粉虱科(Aleyrodidae)、蚜科(Aphididae)、链蚧科(Asterolecaniidae)、沫蝉科(Cercopidae)、叶蝉科(Cicadellidae)、蝉科(Cicadidae)、菱飞虱科(Cixiidae)、软介壳虫科(Coccidae)、缘蝽科(Coreidae)、胭蚧科(Dactylopiidae)、飞虱科(Delphacidae)、盾蚧科(Diaspididae)、毡蚧科(Eriococcidae)、蛾蜡蝉科(Flatidae)、蜡蝉科(Fulgoridae)、圆飞虱科(Issidae)、长蝽科(Lygaeidae)、硕蚧科(Margarodidae)、角蝉科(Membracidae)、盲蝽科(Miridae)、旌介壳虫科(Ortheziidae)、蝽科(Pentatomidae)、刺葵介壳虫科
(Phoenicococcidae)、根瘤蚜科(Phylloxeridae)、粉蚧科(Pseudococcidae)、木虱科(Psyllidae)、红蝽科(Pyrrhocoridae)和网蝽科(Tingidae)。
(Phoenicococcidae)、根瘤蚜科(Phylloxeridae)、粉蚧科(Pseudococcidae)、木虱科(Psyllidae)、红蝽科(Pyrrhocoridae)和网蝽科(Tingidae)。
[0308] 来自半翅目的农艺学上重要的成员包括、但不限于：喜绿蝽(Acrosternum hilare Say)（稻绿蝽）；豌豆蚜(Acyrthisiphon pisum Harris)（豆长管蚜）；球蚜属(Adelges)物种（球蚜类）；苜蓿褐盲蝽(Adelphocoris rapidus Say)（苜蓿褐盲蝽）；南瓜缘蝽(Anasa tristis De Geer)（南瓜缘蝽）；花生蚜(Aphis craccivora Koch)（黑豆蚜）；黑豆蚜(A.fabae Scopoli)（蚕豆蚜）；棉蚜(A.gossypii Glover)（棉蚜、瓜蚜）；玉米根蚜(A.maidiradicis Forbes)（玉米根蚜）；苹果蚜(A.pomi De Geer)（苹果蚜）；绣线菊蚜(A.spiraecola Patch)（卷叶蚜）；印尼轮盾介壳虫(Aulacaspis tegalensis Zehntner)（印尼轮盾介壳虫）；茄无网长管蚜(Aulacorthum solani Kaltenbach)（茄无网长管蚜）；烟粉虱(Bemisia tabaci Gennadius)（烟粉虱、甘薯粉虱）；银叶粉虱(B.argentifolii Bellows&Perring)（银叶粉虱）；美洲谷长蝽(Blissus leucopterus leucopterus Say)（高粱长蝽）；负子蝽科(Blostomatidae)物种；甘蓝短棒蚜(Brevicoryne brassicae Linnaeus)（甘蓝蚜）；梨木虱(Cacopsylla pyricola Foerster)（梨黄木虱）；马铃薯衣壳蝽(Calocoris norvegicus Gmelin)（马铃薯衣壳蝽）；草莓蚜(Chaetosiphon fragaefolii Cockerell)（草莓蚜）；臭虫科(Cimicidae)物种；缘蝽科(Coreidae)物种；方翅网蝽(Corythuca gossypii Fabricius)（棉花网蝽）；番茄蝽(Cyrtopeltis modesta Distant)（番茄蝽）；烟草小盲蝽(C.notatus Distant)（烟草小盲蝽）；沫蝉(Deois flavopicta )（沫蝉）；柑桔白粉虱(Dialeurodes citri Ashmead)（柑桔白粉虱）；植物臭虫(Diaphnocoris chlorionis Say)（植物臭虫）；俄罗斯小麦蚜(Diuraphis noxia
Kurdjumov/Mordvilko)（俄罗斯小麦蚜）；竹禾盾介壳虫(Duplachionaspis divergens Green)（竹禾盾介壳虫）；红苹果蚜(Dysaphis plantaginea Paaserini)（红苹果蚜）；棉蝽(Dysdercus suturellus )（污棉虫）；蔗洁粉蚧(Dysmicoccus boninsis
Kuwana)（灰色甘蔗粉蚧）；马铃薯小绿叶蝉(Empoasca fabae Harris)（马铃薯小绿叶蝉）；
苹果绵蚜(Eriosoma lanigerum Hausmann)（苹果绵蚜）；Erythroneoura科物种（葡萄斑叶蝉）；港岛甘蔗飞虱(Eumetopina flavipes Muir)（港岛甘蔗飞虱）；扁盾蝽属(Eurygaster)物种；褐臭椿(Euschistus servus Say)（褐臭椿）；一斑臭蝽(E.variolarius Palisot de Beauvois)（一斑臭蝽）；长蝽属(Graptostethus)物种（长蝽系群(complex of seed bugs)）；以及桃大尾蚜(Hyalopterus pruni Geoffroy)（桃大尾蚜）；吹绵蚧(Icerya purchasi Maskell)（吹绵介壳虫）；洋葱蝽(Labopidicola allii Knight)（洋葱蝽）；灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen)（灰飞虱）；松叶根蝽(Leptoglossus corculus Say)（松叶根蝽）；甘蔗网蝽(Leptodictya tabida Herrich-Schaeffer)（甘蔗网蝽）；罗卜蚜(Lipaphis erysimi Kaltenbach)（罗卜蚜）；原丽盲蝽(Lygocoris pabulinus Linnaeus)（原丽盲蝽）；牧草盲蝽(Lygus lineolaris Palisot de Beauvois)（牧草盲蝽）；西部牧草盲蝽(L.Hesperus Knight)（西部牧草盲蝽）；牧草盲蝽(L.pratensis Linnaeus)（牧草盲蝽）；长毛草盲蝽(L.rugulipennis Poppius)（欧洲牧草盲蝽）；马铃薯蚜(Macrosiphum euphorbiae Thomas)（马铃薯蚜）；翠菊叶蝉(Macrosteles quadrilineatus Forbes)（二点叶蝉）；周期蝉(Magicicada septendecim Linnaeus)（周期蝉）；甘蔗沫蝉(Mahanarva fimbriolata )（甘蔗沫蝉）；甘蔗小蝉(M.posticata （甘蔗小蝉）；高粱蚜
(Melanaphis sacchari Zehntner)（甘蔗蚜）；黑白介壳虫(Melanaspis glomerata Green)（黑白介壳虫）；麦无网长管蚜(Metopolophium dirhodum Walker)（麦无网长管蚜）；烟蚜(Myzus persicae Sulzer)（桃蚜）；莴苣蚜(Nasonovia ribisnigri Mosley)（莴苣蚜）；黑尾叶蝉(Nephotettix cinticeps Uhler)（青叶蝉）；二条黑尾叶蝉(N.nigropictus )（黑尾叶蝉）；稻绿蝽(Nezara viridula Linnaeus)（南部稻绿蝽）；褐飞虱(Nilaparvata lugens )（褐飞虱）；小长蝽(Nysius ericae Schilling)（假高粱长蝽）；茶黄蓟马(Nysius raphanus Howard)（假高粱长蝽）；稻蝽(Oebalus pugnax Fabricius)（稻褐蝽）；
大马利筋长蝽(Oncopeltus fasciatus Dallas)（大马利筋长蝽）；奥盲蝽(Orthops campestris Linnaeus)；天疱疮(Pemphigus)属物种（根蚜和瘿蚜）；玉米飞虱(Peregrinus maidis Ashmead)（玉米飞虱）；甘蔗扁角飞虱(Perkinsiella saccharicida Kirkaldy)（甘蔗扁角飞虱）；美洲山核桃根瘤蚜(Phylloxera devastatrix Pergande)（美洲山核桃根瘤蚜）；桔臀纹粉蚧(Planococcus citri Risso)（柑桔粉蚧）；苹盲蝽(Plesiocoris rugicollis Fallen)（苹盲蝽）；四线叶虫(Poecilocapsus lineatus Fabricius)（四线叶虫）；棉盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus Reuter)（棉盲蝽）；粉蚧属(Pseudococcus)物种（其他的粉蚧系群）；棉草介壳虫(Pulvinaria elongata Newstead（棉草介壳虫）；甘蔗叶蝉(Pyrilla perpusilla Walker（甘蔗叶蝉）；红蝽科(Pyrrhocoridae)属物种；梨园蚧(Quadraspidiotus perniciosus Comstock)（圣约瑟虫）；猎蝽科(Reduviidae)物种；玉米缢管蚜(Rhopalosiphum maidis Fitch)（玉米叶蚜）；禾谷缢管蚜(R.padi Linnaeus)（禾谷缢管蚜）；甘蔗红粉蚧(Saccharicoccus sacchari Cockerell)（甘蔗红粉蚧）；褐根椿象(Scaptacoris castanea Perty)（褐根椿象）；麦二叉蚜(Schizaphis graminum Rondani)（麦二叉蚜）；甘蔗黄蚜(Sipha flava Forbes)（甘蔗黄蚜）；麦长管蚜(Sitobion avenae Fabricius)（麦长管蚜）；白背飞虱(Sogatella furcifera Horvath)（白背飞虱）；稻条背飞虱(Sogatodes oryzicola Muir)（稻飞虱）；白斑盲蝽(Spanagonicus albofasciatus Reuter)（白斑盲蝽）；斑点苜蓿蚜(Therioaphis maculata Buckton)（斑点苜蓿蚜）；谷蛾科(Tinidae)物种；桔二叉蚜(Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe)（桔二叉蚜）；以及褐色橘蚜(T.citricida Kirkaldy)（褐色橘蚜）；纹翅粉虱(Trialeurodes abutiloneus)（纹翅粉虱）和温室白粉虱(T.vaporariorum Westwood)（温室白粉虱）；柿木虱(Trioza diospyri Ashmead)（柿木虱）；以及苹果白叶蝉(Typhlocyba pomaria McAtee)（苹果白叶蝉）。
Kurdjumov/Mordvilko)（俄罗斯小麦蚜）；竹禾盾介壳虫(Duplachionaspis divergens Green)（竹禾盾介壳虫）；红苹果蚜(Dysaphis plantaginea Paaserini)（红苹果蚜）；棉蝽(Dysdercus suturellus )（污棉虫）；蔗洁粉蚧(Dysmicoccus boninsis
Kuwana)（灰色甘蔗粉蚧）；马铃薯小绿叶蝉(Empoasca fabae Harris)（马铃薯小绿叶蝉）；
苹果绵蚜(Eriosoma lanigerum Hausmann)（苹果绵蚜）；Erythroneoura科物种（葡萄斑叶蝉）；港岛甘蔗飞虱(Eumetopina flavipes Muir)（港岛甘蔗飞虱）；扁盾蝽属(Eurygaster)物种；褐臭椿(Euschistus servus Say)（褐臭椿）；一斑臭蝽(E.variolarius Palisot de Beauvois)（一斑臭蝽）；长蝽属(Graptostethus)物种（长蝽系群(complex of seed bugs)）；以及桃大尾蚜(Hyalopterus pruni Geoffroy)（桃大尾蚜）；吹绵蚧(Icerya purchasi Maskell)（吹绵介壳虫）；洋葱蝽(Labopidicola allii Knight)（洋葱蝽）；灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen)（灰飞虱）；松叶根蝽(Leptoglossus corculus Say)（松叶根蝽）；甘蔗网蝽(Leptodictya tabida Herrich-Schaeffer)（甘蔗网蝽）；罗卜蚜(Lipaphis erysimi Kaltenbach)（罗卜蚜）；原丽盲蝽(Lygocoris pabulinus Linnaeus)（原丽盲蝽）；牧草盲蝽(Lygus lineolaris Palisot de Beauvois)（牧草盲蝽）；西部牧草盲蝽(L.Hesperus Knight)（西部牧草盲蝽）；牧草盲蝽(L.pratensis Linnaeus)（牧草盲蝽）；长毛草盲蝽(L.rugulipennis Poppius)（欧洲牧草盲蝽）；马铃薯蚜(Macrosiphum euphorbiae Thomas)（马铃薯蚜）；翠菊叶蝉(Macrosteles quadrilineatus Forbes)（二点叶蝉）；周期蝉(Magicicada septendecim Linnaeus)（周期蝉）；甘蔗沫蝉(Mahanarva fimbriolata )（甘蔗沫蝉）；甘蔗小蝉(M.posticata （甘蔗小蝉）；高粱蚜
(Melanaphis sacchari Zehntner)（甘蔗蚜）；黑白介壳虫(Melanaspis glomerata Green)（黑白介壳虫）；麦无网长管蚜(Metopolophium dirhodum Walker)（麦无网长管蚜）；烟蚜(Myzus persicae Sulzer)（桃蚜）；莴苣蚜(Nasonovia ribisnigri Mosley)（莴苣蚜）；黑尾叶蝉(Nephotettix cinticeps Uhler)（青叶蝉）；二条黑尾叶蝉(N.nigropictus )（黑尾叶蝉）；稻绿蝽(Nezara viridula Linnaeus)（南部稻绿蝽）；褐飞虱(Nilaparvata lugens )（褐飞虱）；小长蝽(Nysius ericae Schilling)（假高粱长蝽）；茶黄蓟马(Nysius raphanus Howard)（假高粱长蝽）；稻蝽(Oebalus pugnax Fabricius)（稻褐蝽）；
大马利筋长蝽(Oncopeltus fasciatus Dallas)（大马利筋长蝽）；奥盲蝽(Orthops campestris Linnaeus)；天疱疮(Pemphigus)属物种（根蚜和瘿蚜）；玉米飞虱(Peregrinus maidis Ashmead)（玉米飞虱）；甘蔗扁角飞虱(Perkinsiella saccharicida Kirkaldy)（甘蔗扁角飞虱）；美洲山核桃根瘤蚜(Phylloxera devastatrix Pergande)（美洲山核桃根瘤蚜）；桔臀纹粉蚧(Planococcus citri Risso)（柑桔粉蚧）；苹盲蝽(Plesiocoris rugicollis Fallen)（苹盲蝽）；四线叶虫(Poecilocapsus lineatus Fabricius)（四线叶虫）；棉盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus Reuter)（棉盲蝽）；粉蚧属(Pseudococcus)物种（其他的粉蚧系群）；棉草介壳虫(Pulvinaria elongata Newstead（棉草介壳虫）；甘蔗叶蝉(Pyrilla perpusilla Walker（甘蔗叶蝉）；红蝽科(Pyrrhocoridae)属物种；梨园蚧(Quadraspidiotus perniciosus Comstock)（圣约瑟虫）；猎蝽科(Reduviidae)物种；玉米缢管蚜(Rhopalosiphum maidis Fitch)（玉米叶蚜）；禾谷缢管蚜(R.padi Linnaeus)（禾谷缢管蚜）；甘蔗红粉蚧(Saccharicoccus sacchari Cockerell)（甘蔗红粉蚧）；褐根椿象(Scaptacoris castanea Perty)（褐根椿象）；麦二叉蚜(Schizaphis graminum Rondani)（麦二叉蚜）；甘蔗黄蚜(Sipha flava Forbes)（甘蔗黄蚜）；麦长管蚜(Sitobion avenae Fabricius)（麦长管蚜）；白背飞虱(Sogatella furcifera Horvath)（白背飞虱）；稻条背飞虱(Sogatodes oryzicola Muir)（稻飞虱）；白斑盲蝽(Spanagonicus albofasciatus Reuter)（白斑盲蝽）；斑点苜蓿蚜(Therioaphis maculata Buckton)（斑点苜蓿蚜）；谷蛾科(Tinidae)物种；桔二叉蚜(Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe)（桔二叉蚜）；以及褐色橘蚜(T.citricida Kirkaldy)（褐色橘蚜）；纹翅粉虱(Trialeurodes abutiloneus)（纹翅粉虱）和温室白粉虱(T.vaporariorum Westwood)（温室白粉虱）；柿木虱(Trioza diospyri Ashmead)（柿木虱）；以及苹果白叶蝉(Typhlocyba pomaria McAtee)（苹果白叶蝉）。
[0309] 还包括蜱螨目(Acari)（螨类）的成体和幼虫，例如小麦瘤瘿螨(Aceria tosichella Keifer)（小麦卷叶螨）；苹果全爪螨(Panonychus ulmi Koch)（欧洲红螨）；麦岩螨(Petrobia latens Müller)（褐色小麦螨）；班氏细螨(Steneotarsonemus bancrofti Michael)（甘蔗细螨）；叶螨科(Tetranychidae)的叶螨和红螨、Oligonychus grypus Baker&Pritchard、甘蔗叶螨(O.indicus Hirst)（甘蔗叶螨）、草地小爪螨(O.pratensis Banks)（草地小爪螨）、甘蔗叶螨(O.stickneyi McGregor)（甘蔗叶螨）；二斑叶螨(Tetranychus urticae Koch)（二斑叶螨）；迈叶螨(T.mcdanieli McGregor)（迈叶螨）；朱砂叶螨(T.cinnabarinus Boisduval)（朱砂叶螨）；土耳其斯坦叶螨(T.turkestani Ugarov&Nikolski)（草莓叶螨）、细须螨科(Tenuipalpidae)的扁平螨类、葡萄短须螨(Brevipalpus lewisi McGregor)（柑橘红蜘蛛）；瘿螨科(Eriophyidae)中的锈螨和芽瘿螨以及其他食叶螨和对人类和动物健康重要的螨，即表皮螨科(Epidermoptidae)的尘螨、蠕形螨科(Demodicidae)的毛囊螨、食甜螨科(Glycyphagidae)的谷螨，硬蜱科(Ixodidae)的蜱类。黑脚硬蜱(Ixodes scapularis Say)（鹿蜱）；全环硬蜱(I.holocyclus Neumann)（澳洲寄生蜱）；变异革蜱(Dermacentor variabilis Say)（美洲犬蜱）；美洲钝眼蜱(Amblyomma americanum Linnaeus)（孤星蜱）；以及痒螨科(Psoroptidae)、蒲螨科(Pyemotidae)和疥螨科(Sarcoptidae)的痒螨和疥螨。
[0310] 缨尾目(Thysanura)的昆虫害虫是值得关注的，例如衣鱼(Lepisma saccharina Linnaeus)（衣鱼）；家衣鱼(Thermobia domestica Packard)（小灶衣鱼）。
[0311] 所涵盖的其他节肢害虫包括：蜘蛛目(Araneae)中的蜘蛛，例如棕色遁蛛(Loxosceles reclusa Gertsch&Mulaik（棕色隐士蛛）；和红斑寇蛛(Latrodectus mactans Fabricius)（黑寡妇蜘蛛）；以及蚰蜓目(Scutigeromorpha)的多足类，例如蚰蜒(Scutigera coleoptrata Linnaeus)（蚰蜒）。此外，等翅目(Isoptera)中的病害昆虫是值得关注的，包括白蚁科(termitidae)的那些病害昆虫，例如（但不限于）：白蚁(Cornitermes cumulans Kollar)、Cylindrotermes nordenskioeldi Holmgren和Pseudacanthotermes militaris Hagen（甘蔗白蚁）；以及鼻白蚁科(Rhinotermitidae)的那些病害昆虫，包括（但不限于）：大别山散白蚁(Heterotermes tenuis Hagen)。缨翅目(Thysanoptera)的昆虫也是值得关注的，包括（但不限于）：蓟马类，例如微直鬃蓟马(Stenchaetothrips minutus van Deventer)（甘蔗蓟马）。
[0312] 应当注意，术语“一个”或“一种”实体是指该实体的一者或多者；例如，“多肽”应理解为表示一个或多个多肽。同样地，术语“一个”（或“一种”）、“一（个）种或多（个）种”和“至少一（个）种”在本文中可互换使用。
[0314] 本文所用的术语“约”当指值时，意在涵盖偏离指定的量达，在一些实施例中，±50%的偏差，在一些实施例中，±20%的偏差，在一些实施例中，±10%的偏差，在一些实施例中，±5%的偏差，在一些实施例中，±1%的偏差，在一些实施例中，±0.5%的偏差，在一些实施例中，±0.1%的偏差，只要这种偏差适于执行所公开的方法或采用所公开的组合物。
[0315] 另外，在量、浓度或其他值或参数以范围（优选范围）或上限优选值和下限优选值列表给出时，这应该理解为具体地公开了由任何范围上限或上限优选值和任何范围下限或下限优选值的任何配对形成的所有范围，而无论是否单独公开了这些范围。如果本文中叙述了数值的范围，除非另外指明，否则该范围旨在包括它们的端点，以及该范围内的所有整数和分数。当限定范围时，无意于使本公开的主题的范围受限于所叙述的具体值。
[0316] 除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义。虽然，本文中类似的任何方法和材料可用于本发明的实施或测试，但优选的方法和材料在本文中也有所描述。
[0317] 以下实例以说明性方式而不是以限制性方式提供。
[0318] 实验
[0319] 实例1.DNA改组
[0320] 基因改组利用Pp-PDF1成熟肽的编码序列。通过将合成寡核苷酸加标到改组（装配）反应中，从相关的防御素序列引入有限多样性。有助于提高活性的氨基酸变化为变体第36和42位的丝氨酸残基，其具有提高的CGR活性。参见图1。其中所识别的每个变体的改组轮次以序列命名结构表示。名称始于Pp-PDF1-1的变体来自第一轮改组；Pp-PDF1-2来自第二轮改组；Pp-PDF1-3来自第三轮改组；Pp-PDF1-4来自第四轮改组。
[0321] 在一轮DNA改组后，分离Pp-PDF1基因变体Pp-PDF1-1C-7A4(SEQ ID NO:6)。Pp-PDF1-1C-7A4变体示出了对引起杆腐病的真菌禾生炭疽菌（CGR；参见实例2）的体外抑制活性的显著提高。另外的变体在一轮改组后识别，包括Pp-PDF1-1C-7C4(SEQ ID NO:8)、Pp-PDF1(C2B5)(SEQ ID NO:10)、Pp-PDF1(4B11)(SEQ ID NO:12)、Pp-PDF1-1C-6D3(SEQ ID NO:23)、Pp-PDF1-1F-1C5(SEQ ID NO:25)、PP-PDF1-1F-12H3(SEQ ID NO:27)和PP-PDF1-1F-7H6(SEQ ID NO:29)。这些Pp-PDF1变体的核苷酸序列在SEQ ID NO:5、7、9、11、21、22、
24、26和28中示出。
24、26和28中示出。
[0322] 在两轮改组后，识别Pp-PDF1基因变体，包括Pp-PDF1-2CA-1A6(SEQ ID NO:31)、Pp-PDF1-2CE-4A7(SEQ ID NO:33)、Pp-PDF1-2CA-1H4(SEQ ID NO:35)、Pp-PDF1-2CA-5H4(SEQ ID NO:37)、PP-PDF1-2CF-2D8(SEQ ID NO:39)、Pp-PDF1-2CF-10F3(SEQ ID NO:41)和PP-PDF1-2CE-41G2(SEQ ID NO:59)。这些Pp-PDF1变体的核苷酸序列在SEQ ID NO:30、32、34、36、38、40和58中示出。
[0323] 在三轮改组后，识别Pp-PDF1基因变体，包括Pp-PDF1-3CA-1A2(SEQ ID NO:43)、Pp-PDF1-3CA-1A7(SEQ ID NO:45)、Pp-PDF1-3CA-1B2(SEQ ID NO:47)、Pp-PDF1-3CA-1E6(SEQ ID NO:49)和Pp-PDF1-3CA-2D3(SEQ ID NO:51)。这些Pp-PDF1变体的核苷酸序列在SEQ ID NO:42、44、46、48和50中示出。
[0324] 在四轮改组后，识别Pp-PDF1基因变体，包括Pp-PDF1-4CB-6E6(SEQ ID NO:53)、Pp-PDF1-4CB-6E9(SEQ ID NO:55)和Pp-PDF1-4CB-12G9(SEQ ID NO:57)。这些Pp-PDF1变体的核苷酸序列在SEQ ID NO:52、54和56中示出。
[0325] 实例2.抗真菌平板测定法。
[0326] 防御素变体对禾谷镰孢菌（FGR；分离株73B ISU）和禾生炭疽菌（CGR；分离株Carroll-IA-99）的抗真菌活性使用标准平板测定法评估。如上文所述，低盐为1/8×浓度的液体培养基（用于玉米色二孢、禾谷镰孢菌和轮枝镰孢菌的马铃薯葡萄糖肉汤，用于禾生炭疽菌的察氏肉汤），加有0.25mM氯化钙、12.5mM氯化钾。高盐为1/2×液体培养基，加有1mM氯化钙、50mM氯化钾。
[0327] 产孢子培养物的制备
[0328] FVE的培养物使用V8琼脂平板制备。FGR、CGR和DMA培养物使用1/2×燕麦琼脂制备。培养基配方在下面提供。
[0329] 具体地讲，使保存在–20℃的包含硅胶真菌原液的试管短暂加热，并且将大约5个晶体喷洒在琼脂表面上。每种真菌分离物制备2-3个平板。新接种的培养物保存在塑料盒中，防止培养物变干。FVE培养物在室温下暗处生长。CGR培养物在室温的环境光线下生长。FGR和DMA培养物在27℃照明生长室内生长。每隔一周制备新的培养物，以保持孢子的持续供应。
[0330] 孢子制备
[0331] 孢子从2-4周的FVE、FGR、CGR和DMA培养物制备。对于FGR、FVE和DMA，使用少量测定培养基漂洗部分培养平板。允许漂洗溶液保留在DMA平板上足以使分生孢子破裂的时间。然后，将测定培养基转移到无菌试管。涡旋样品，并且使用血球计对孢子进行定量。
[0332] 对于CGR，将无菌环轻轻划过培养平板的橙色区域。然后将环插入少量测定培养基中，并且将培养基与环混合，使孢子悬浮。涡旋样品，并且使用血球计对孢子进行定量。
[0333] 用测定培养基将孢子稀释至所需的浓度（对于FGR、FVE和CGR，4,000个孢子/mL，对于DMA，6,000个孢子/mL），在抗真菌活性测定开始前保持在冰上。
[0334] 测定平板制备详情
[0335] 将标准非组织培养物处理的96孔平底板或1/2区域非处理平板(Costar)用于抗真菌平板测定法。对于FVE、FGR和DMA，测定培养基为1/4×马铃薯葡萄糖肉汤，对于CGR，使用1/4×察氏肉汤V8。
[0336] 对于标准测定平板，将各种浓度的抗真菌多肽以50μL/孔加入平板中，或对于半区平板，以25μL/孔加入平板中。然后，加入上述浓度2倍的含真菌孢子的等体积培养基，以开始测定。使用透气膜（“Breathe-Easy”，Cat.No.BEM-1，马萨诸塞州波士顿，多元生物技术(Diversified Biotech,Boston,MA)）密封平板，使测定在28℃的暗处进行24至48小时。
[0337] 在温育期后，将平板置于倒置显微镜上，检查每个孔并且评分，以确定抗真菌多肽的IC50。
[0338] 结果
[0339] 表2提供了使用防御素变体的抗真菌活性测定结果。
[0340] 表2.在高盐条件下测量的防御素变体对禾生炭疽菌的抗真菌活性（IC50，以ppm计）。
[0341]PDF1蛋白 IC50(ppm)
Pp-PDF1(SEQ ID NO:4) 15
Pp-PDF1-1C-7A4(SEQ ID NO:6) 5
Pp-PDF1-1C-7C4(SEQ ID NO:8) 5
Pp-PDF1(C2B5)(SEQ ID NO:10) 0.8
Pp-PDF1(4B11)(SEQ ID NO:12) 1
Pp-PDF1(SEQ ID NO:4) 15
Pp-PDF1-1C-7A4(SEQ ID NO:6) 5
Pp-PDF1-1C-7C4(SEQ ID NO:8) 5
Pp-PDF1(C2B5)(SEQ ID NO:10) 0.8
Pp-PDF1(4B11)(SEQ ID NO:12) 1
[0342] 培养基配方
[0343] 1×察氏V8肉汤：
[0344] 对于每升，将35克Difco察氏肉汤(#233810)悬浮于dH2O中，加入180毫升通过离心（3,000×g已足够）澄清的V8液。使最终体积升至1升，用高压釜在121℃下灭菌20分钟。使培养基过滤灭菌，移除任何剩余的残渣。
[0345] 1×马铃薯葡萄糖肉汤：
[0346] 对于每升，将24克Difco马铃薯葡萄糖肉汤(#0549-17-9)悬浮于dH2O中，使最终体积升至1升，用高压釜在121℃下灭菌20分钟。使培养基过滤灭菌，移除任何剩余的残渣。
[0347] V8琼脂：
[0348] 对于每升，在4升容器内将180mL V8液和3克碳酸钙溶解于820mL去离子水中，然后在dH2O中加入17克细菌琼脂粉。每升制备物可以任选地加入10滴5%消泡剂A。封盖，并用高压釜在121℃下灭菌20分钟。在无菌罩下倾倒平板。
[0349] 燕麦琼脂：
[0350] 对于每升，在4升容器内将36.24克Difco燕麦琼脂(#0552-17-3)和4.25克琼脂悬浮于dH2O中，封盖，并用高压釜在121℃下灭菌20分钟。在无菌罩下倾倒平板。
[0351]
[0352] 实例3农杆菌介导的玉米转化和转基因植物的再生
[0353] 对于使用编码SEQ ID NO:6、8、10或12的多肽的核苷酸序列进行的农杆菌介导的玉米转化，使用Zhao的方法（美国专利No.5,981,840和PCT专利公布WO98/32326；其内容据此以引用方式并入）。简单而言，从玉米分离出未成熟胚并且使胚与农杆菌的悬浮液接触，其中该细菌能够将多核苷酸构建体转移到未成熟胚中的至少一者的至少一个细胞（步骤1：感染步骤）。在这个步骤中，将未成熟胚浸入农杆菌悬浮液中以引发接种。将胚与农杆菌共培养一段时间（步骤2：共培养步骤）。在感染步骤之后，将未成熟胚在固体培养基上培养。在这个共培养期之后，进行任选的“静息”步骤。在该静息步骤中，将胚在至少一种已知能抑制农杆菌生长的抗生素的存在下进行温育，不添加植物转化体的选择剂（步骤3：静息步骤）。
将未成熟胚在固体培养基上与抗生素一起培养，但不添加选择剂，这为了消除农杆菌并且为了受感染细胞的静息期。接着，将经接种的胚在含有选择剂的培养基上进行培养，回收生长出的转化愈伤组织（步骤4：选择步骤）。将未成熟胚在固体培养基上与选择剂一起进行培养，从而导致转化细胞的选择性生长。然后将愈伤组织再生为植株（步骤5：再生步骤），并且将在选择性培养基上生长的愈伤组织在固体培养基上进行培养以再生出植株。
将未成熟胚在固体培养基上与抗生素一起培养，但不添加选择剂，这为了消除农杆菌并且为了受感染细胞的静息期。接着，将经接种的胚在含有选择剂的培养基上进行培养，回收生长出的转化愈伤组织（步骤4：选择步骤）。将未成熟胚在固体培养基上与选择剂一起进行培养，从而导致转化细胞的选择性生长。然后将愈伤组织再生为植株（步骤5：再生步骤），并且将在选择性培养基上生长的愈伤组织在固体培养基上进行培养以再生出植株。
[0354] 实例4用禾生炭疽菌浸染叶鞘。
[0355] 用小螺丝刀在边缘和中脉之间大约中间的中脉两侧上的叶鞘形成创伤后，用50μL的5×106个孢子/mL的量接种T0植物在V5阶段的叶4或5的叶鞘。用塑料包裹物覆盖叶鞘5天。接种九天后测量病斑区。
[0356] 构建包含RB-ATTB4-E35S-UBI-BAA::Pp-PDF1(MAT)(7C4)-PINII-ATTB3+UBI-MOPAT-PINII-LB的PHP28956质粒。强组成型启动子E35S-UBI与大麦α-淀粉酶的信号序列BAA相连，以向胞外间隙分泌抗真菌蛋白。使用转基因玉米愈伤组织的蛋白质印迹分析和LC-质谱分析发现，表达了玉米优化的基因，导致正确加工肽的积累。蛋白质印迹还示出了Pp-PDF1-1C-7C4在进行感染测定的叶鞘组织中的积累。CGR病斑的分析表明含PHP28956的转基因植物比空载体对照构建体PHP17812具有显著更小的病斑。
[0357] 此外，使用以下的另外玉米转化构建体观察到玉米叶鞘对禾生炭疽菌的增强抗性：
[0358] PHP28071：RB-E35S-UBI-ATTB1-BAA::Pp-PDF1(MAT)(7A4)::KDEL-ATTB2-PINII+FRT6+FRT1+E35S-35S-ADH1-BAR-PINII+FRT1-LB
[0359] PHP29782：RB-ATTB1-E35S-UBI-BAA::Pp-PDF1(MAT)(C2B5)-PINII-ATTB2+UBI-MOPAT-PINII-LB
[0360] PHP29792：RB-ATTB1-E35S-UBI-BAA::Pp-PDF1(MAT)(4B11-2)-PINII-ATTB2+UBI-MOPAT-PINII-LB。
[0361] AFP靶向的标准方法是使用构建体中的以下组分：
[0362] 强组成型E35S-UBI启动子；
[0363] 用于向质外体分泌：BAA-AFP；
[0364] 用于ER滞留：BAA-AFP-KDEL；
[0365] 用于液泡靶向：BAA-AFP-CTPP；
[0366] BAA：SEQ ID NO:14。
[0367] 其他ER滞留序列以SEQ ID NO:15、16、17和18提供。
[0368] CTPP：ZmPDF20-CTPP(LAAAEAEADGASQQAVATPRLN)用于液泡靶向；其他序列包括Cc-DFn37CTPP(VFDNIPNDVGTILVQDAKTLEAQLLEEEILGL)
[0369] 表达PHP30739：E35S-UBI-BAA-Pp-PDF1(7A4)-ZmPDF20-CTPP或PHP30807：E35S-UBI-BAA-Pp-PDF1(7A4)-Cc-Dfn37-CTPP（表达PHP）的愈伤组织或叶样品通过LCMS分析，结果表明积累了正确加工的成熟AFP（BAA和CTPP在细胞中被切除）。
[0370] 玉米用设计为使Pp-PDF1-1C-7A4在植物细胞的内质网中积累的载体转化。在通过CGR测量V5阶段T0植物的叶鞘浸染的温室实验中，两种不同的转化构建体与空载体对照相比，产生了显著提高的事件。Pp-PDF1-1C-7A4蛋白的水平与病害发展呈负相关。
[0371] 实例5大豆胚的转化。
[0372] 培养条件
[0373] 大豆胚发生悬浮培养物（栽培变种Jack）在150rpm、26℃的旋转摇荡器上保持在35ml液体培养基SB196（参见下文配方）中，该旋转摇荡器具有冷白色荧光灯，光周期为16:8小时白天/黑夜，光强度为60-85μE/m2/s。每7天至两个星期，通过将大约35mg的组织接种到
35ml的新鲜液体SB196中，对培养物进行继代（优选的继代间隔为每7天）。
35ml的新鲜液体SB196中，对培养物进行继代（优选的继代间隔为每7天）。
[0374] 以下示例描述大豆胚发生悬浮培养物通过粒子枪轰击方法与质粒和DNA片段一起转化（Klein et al.(1987)Nature,327:70（Klein等人，1987年，《自然》，第327卷，第70页）），用以下实例中所述的质粒和DNA片段转化大豆胚发生悬浮培养物。
[0375] 大豆胚发生悬浮培养物的引发
[0376] 每月两次对大豆培养物进行引发，每次引发之间间隔5-7天。
[0377] 在种植45-55天后从可用的大豆植株挑取带有不成熟种子的豆荚，剥壳并放入无菌绛红色盒子中。将大豆种子在含有1滴象牙皂的5%Clorox溶液（95ml的高压灭菌蒸馏水加5ml Clorox和1滴皂）中振摇15分钟，对其进行灭菌。充分混合。用2个1升瓶子的无菌蒸馏水清洗种子，将小于4mM的种子各自放在单独的显微镜载玻片上。切开种子的小的一端，将子叶挤出种皮。将子叶转移到含有SB1培养基的板（每板25-30个子叶）。将各板用纤维带包住，存放8个星期。这个时间后，切取次生胚并放入SB196液体培养基中7天。
[0378] 用于轰击的DNA的制备
[0379] 将含有所关注基因和选择性标志物基因的完整质粒或DNA质粒片段用于轰击。用于轰击的质粒DNA用PromegaTM Protocols and Applications Guide（第二版第106页）中所述的方法按常规进行制备和纯化。携带抗真菌蛋白编码序列的质粒片段通过双消化质粒的凝胶分离获得。在每种情况中，将100μg的质粒DNA在0.5ml的适于所关注的质粒的特异性酶混合物中进行消化。通过在1%SeaPlaque GTG琼脂糖（生物惠特克分子应用(BioWhitaker Molecular Applications)）上进行凝胶电泳来分离所得的DNA片段，并且将含有抗真菌蛋白编码序列的DNA片段从琼脂糖凝胶上切下来。用GELase消化酶按生产商的方案从琼脂糖纯化DNA。
[0380] 将含有3mg金粒子（3mg金）的50μl无菌蒸馏水等分试样加到5μl1μg/μl DNA溶液（如上所述制备的完整质粒或DNA片段）、50μl2.5MCaCl2和20μl0.1M亚精胺。将混合物在涡旋摇荡器的水平3上振摇3分钟，然后在台式微量离心机中离心10秒钟。用400μl100%乙醇洗涤后，通过在40μl100%乙醇中进行超声处理使沉淀悬浮。向Biolistic PDS1000/HE仪碟的每个飞碟(flying disk)分配5μl的DNA悬浮液。每个5μl等分试样含有大约0.375mg金/次轰击（即每碟）。
[0381] 组织制备和用DNA轰击
[0382] 将大约150-200mg的7天龄胚悬浮培养物放在空的无菌60×15mM平皿中，用塑料网盖住平皿。每板的组织轰击1或2次，膜破裂压力设定为1100PSI，腔室抽真空至27-28英寸汞柱。将组织放在离阻滞网/停止网大约3.5英寸处。
[0383] 转化胚的选择
[0384] 用潮霉素（当使用磷酸转移酶HPT基因作为选择性标志物时）或氯磺隆（当使用乙酰乳酸合酶ALS基因作为选择性标志物时）选择转化胚。
[0385] 潮霉素(HPT)选择
[0386] 在轰击后，将组织放入新鲜的SB196培养基中，如上所述进行培养。轰击后6天，将该SB196用含有30mg/L潮霉素选择剂的新鲜SB196更换。每周更新选择培养基。在选择后四至六个星期，可观察到绿色的转化组织从未转化的坏死胚发生簇中生长出来。移取分离的绿色组织，接种到多孔板中，以产生新的克隆繁殖的转化胚发生悬浮培养物。
[0387] 氯磺隆(ALS)选择
[0388] 在轰击后，将组织在2个含有新鲜SB196培养基的烧瓶之间分配，如上所述进行培养。轰击后六至七天，将该SB196用含有100ng/ml氯磺隆选择剂的新鲜SB196更换。每周更新选择培养基。在选择后四至六个星期，可观察到绿色的转化组织从未转化的坏死胚发生簇中生长出来。移取分离的绿色组织，接种到含有SB196的多孔板中，以产生新的克隆繁殖的转化胚发生悬浮培养物。
[0389] 大豆体细胞胚再生成植株
[0390] 为了从胚发生悬浮培养物获得整株植物，组织必须进行再生。
[0391] 胚成熟
[0392] 将胚在SB196中在冷白色荧光灯泡（菲利普冷白色Econowatt F40/CW/RS/EW(Phillips cool white Econowatt F40/CW/RS/EW)）和Agro（菲利普F40Agro(Phillips F40Agro)）灯泡（40瓦）下于26℃培养4-6周，光周期为16:8小时，光强度为90-120uE/m2s。这个时间后，将胚簇移取到固体琼脂培养基SB166达1-2个星期。然后将胚簇继代到培养基SB103持续3个星期。在此期间，单个胚可从胚簇移除，并且筛选真菌抗性。
[0393] 胚干燥和萌发
[0394] 将各个成熟的胚放入空的小平皿(35×10mM)中大约4-7天，对它们进行干燥。将各板用纤维带密封（产生小的湿度腔室）。将经干燥的胚种植到SB71-4培养基中，让它们在与如上所述相同的培养条件下萌发。从萌发培养基移取萌发的小植株，用水彻底清洗，然后种植在24孔托盘(pack tray)中的Redi-Earth中，用透明塑料罩盖住。2个星期后，将罩移开，使植物强壮一个星期。如果小植株看起来强壮，将它们移植到10英寸Redi-Earth盘，每盘最多3株小植株。10至16个星期后，收获成熟的种子，破成碎片并分析蛋白质。
[0395] 培养基配方
[0396]
[0397] FN Lite母液
[0398]
[0399]
[0400] SB1固体培养基（每升）包含：1包装。MS盐（Gibco/BRL-目录号11117-066）；1ml B5维生素1000×母液；31.5g蔗糖；2ml2,4-D（20mg/L终浓度）；pH5.7；和8g TC琼脂。
[0401] SB166固体培养基（每升）包含：1包装。MS盐（Gibco/BRL-目录号11117-066）；1ml B5维生素1000×母液；60g麦芽糖；750mg MgCl2六水合物；5g活性炭；pH5.7；和2g结冷胶。
[0402] SB103固体培养基（每升）包含：1包装。MS盐（Gibco/BRL-目录号11117-066）；1ml B5维生素1000×母液；60g麦芽糖；750mg MgCl2六水合物；pH5.7；和2g结冷胶。
[0403] SB71-4固体培养基（每升）包含：1瓶含蔗糖的甘博格B5盐（Gibco/BRL-目录号21153-036）；pH5.7；和5g TC琼脂。
[0404] 2,4-D母液为预制备的，获自Phytotech目录号D295，浓度为1mg/ml。
[0405] 在-20℃下以小份保存的B5维生素母液（每100ml）包含：10g肌醇；100mg烟酸；100mg盐酸吡哆醇；和1g硫胺素。如果溶液没有足够快地溶解，通过热搅拌板施加低水平的热量。氯磺隆母液包含：1mg/ml溶于0.01N氢氧化铵中
[0406] 本说明书中提及的所有公布和专利申请指示了本发明所属领域的技术人员的水平。所有公布和专利申请在相同程度上全文以引用方式并入本文，如同每个单独的公布或专利申请被具体地和独立地指出全文以引用方式并入本文一样。
[0407] 借助前面的描述和随附的附图中给出的教导，本发明所属领域的技术人员将会想到本发明的许多修改形式和其他实施例。因此，应当了解，本发明不限于所公开的特定实施例，并且旨在将修改形式和其他实施例包括在上述实施例列表和所附权利要求的范围内。虽然本文采用了特定术语，但它们仅以一般性和描述性含义使用而不出于限制目的。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种以太阳能为热源的生物质炭化设备 | 2020-06-01 | 0 |
| 一种新型污水处理装置 | 2022-02-26 | 2 |
| 带加湿功能的空气净化器 | 2021-12-10 | 2 |
| 一种高生物相容性的氟橡胶配方 | 2023-03-19 | 0 |
| 多电极电絮凝-厌氧微生物电镀综合废水处理装置及方法以及回收重金属的方法 | 2020-06-01 | 2 |
| 一种芬顿组合工艺处理香料废水的方法 | 2021-06-25 | 1 |
| 对有机磷具有高效降解作用的枯草芽孢杆菌及其制备方法 | 2020-06-26 | 2 |
| 移动式一体化养殖场粪污废水处理装置 | 2021-05-26 | 0 |
| 再生可能原料及び有機残渣材料の水熱炭化のためのプラントからの処理水の処理方法 | 2022-08-06 | 2 |
| 一种微动力污水处理装置 | 2023-05-29 | 0 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
生物炭热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈