関連出願の相互参照 本出願は2012年3月30日に出願された米国仮特許出願第61/618,390号明細書の利益を主張するものであり、その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。

本開示は、ペルオキシカルボン酸の生合成および酵素触媒作用の分野に関する。より具体的には、過加水分解活性を有する酵素触媒を含む多成分過酸発生系を提供する。本酵素触媒を使用してペルオキシカルボン酸を生成する方法も提供する。

ペルオキシカルボン酸組成物は、有効な抗微生物剤になり得る。ペルオキシカルボン酸を使用して、望ましくない微生物増殖に対して、硬質表面、織物、食肉加工品、生きた植物組織、および医療デバイスを清浄化、消毒、および/または衛生化する方法が記載されている(特許文献1;特許文献2;特許文献3;特許文献4;および特許文献5)。ペルオキシカルボン酸は、これらに限定されるものではないが、木材パルプの漂白/脱リグニンおよびランドリーケア用途を含む種々の漂白用途にも使用されている(特許文献6;特許文献7;特許文献8;特許文献9;および特許文献10)。ペルオキシカルボン酸の所望の効果的な濃度は、中性pH、1分〜5分の反応時間において、製品用途に応じて異なり得る(例えば、医療機器の消毒に対しては、約500ppm〜1000ppm、ランドリーの漂白または消毒用途に対しては、約30ppm〜80ppm)。

消毒(医療機器、硬質表面、織物など)、漂白(木材パルプまたは製紙用パルプの処理/脱リグニン、織物漂白、およびランドリーケア用途)のような用途、ならびに脱染、脱臭、および衛生化などの他のランドリーケア用途、ならびにパーソナルケア用途に対して効果的な濃度のペルオキシカルボン酸を生成させるために、炭水化物エステラーゼのファミリー7(CE−7)のメンバーとして構造上分類される酵素が、水中にて、塩基性〜酸性のpH範囲(約pH10〜約pH5)で、過酸化水素(または代替の過酸化物試薬)とカルボン酸のアルキルエステルとの反応を触媒するペルヒドロラーゼとして使用されている(特許文献11;特許文献12;および特許文献13;特許文献14;ならびに特許文献15;および特許文献16)。CE−7酵素は、エステル、特にアルコール、ジオール、およびグリセロールのアセチルエステルの過加水分解に対して高い比活性を有することが見出されている。向上した性能を有する、いくつかの種に由来する変異体CE−7ペルヒドロラーゼがDiCosimoらにより報告されている(特許文献17;特許文献18;特許文献19;特許文献20;特許文献21;特許文献22;特許文献23;特許文献24;および特許文献25;ならびに特許文献26;および特許文献27)。

以前に報告された、過加水分解活性を有するCE−7炭水化物エステラーゼ(野生型およびその変異体の両方)は、Vincentら(非特許文献1)により定義される、保存的な構造「シグネチャー」モチーフを含んでいた。より具体的には、CE−7炭水化物エステラーゼファミリーのメンバーを構造上同定し定義するために使用されるCE−7シグネチャーモチーフは、以下の3つの保存サブモチーフを含む:1)Arg118−Gly119−Gln120の「RGQ」サブモチーフ、2)Gly186−Xaa187−Ser188−Gln189−Gly190の「GXSQG」サブモチーフ、および3)His303−Glu304の「HE」サブモチーフ(配列番号2として示されるサーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)参照配列に関連した残基の番号付けおよび配向)。

CE−7炭水化物エステラーゼとして分類される酵素の大部分は、Vincentらにより定義されるシグネチャーモチーフで構成されるが、「HE」サブモチーフを含有しない炭水化物エステラーゼのファミリー7には、いくつかのポリペプチド配列が加えられている(非特許文献2)。このサブグループ内に過加水分解活性の存在は報告されていない。

米国特許第6,545,047号明細書

米国特許第6,183,807号明細書

米国特許第6,518,307号明細書

米国特許出願公開第2003−0026846号明細書

米国特許第5,683,724号明細書

欧州特許第1040222B1号明細書

米国特許第5,552,018号明細書

米国特許第3,974,082号明細書

米国特許第5,296,161号明細書

米国特許第5,364,554号明細書

米国特許第7,964,378号明細書

米国特許第7,951,566号明細書

米国特許第7,723,083号明細書

米国特許出願公開第2008−0176299号明細書(DiCosimo et al.)

米国特許出願公開第2012−0317733号明細書

米国特許出願公開第2012−0328534号明細書(Chisholm et al.)

米国特許第7,927,854号明細書

米国特許第7,923,233号明細書

米国特許第7,932,072号明細書

米国特許第7,910,347号明細書

米国特許第7,960,528号明細書

米国特許第8,062,875号明細書

米国特許第8,206,964号明細書

米国特許第8,389,254号明細書

米国特許第8,389,255号明細書

米国特許出願公開第2011−0236336号明細書

米国特許出願公開第2011−0236338号明細書

J.Mol.Biol.,330:593−606(2003)

Cantarel et al.,“The Carbohydrate−Active EnZymes database(CAZy):an expert resource for Glycogenomics”,NAR,37:D233−D238(2009)

一部の用途に過加水分解酵素技術を組み込むには、新規の過加水分解酵素の同定が必要となる場合がある。そのため、意味のある過加水分解活性を有するポリペプチドを含むさらなる酵素触媒を同定する必要性が依然として存在する。

効果的な濃度で過酸の生成に適した過加水分解活性を有するいくつかの酵素が同定されている。

一実施形態では、 (1) (i)構造 [X]_mR₅ [式中、 X=式R₆−C(O)Oのエステル基であり; R₆=ヒドロキシル基またはC1〜C4アルコキシ基で置換されていてもよい、C1〜C7の直鎖状、分枝状、または環状のヒドロカルビル部分であり、ここで、R₆=C2〜C7の場合には、R₆は、任意選択で1つまたは複数のエーテル結合を含み; R₅=ヒドロキシル基で置換されていてもよい、C1〜C6の直鎖状、分枝状、もしくは環状のヒドロカルビル部分、または5員環ヘテロ芳香族部分、または6員環の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり;ここで、R₅中の各炭素原子は個々に、1個以下のヒドロキシル基または1個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み;R₅は任意選択で、1つまたは複数のエーテル結合を含み; m=1からR₅中の炭素原子数までの範囲の整数である]を有し、25℃で少なくとも5ppmの水溶解性を有する1つまたは複数のエステル; (ii)構造

[式中、R₁=ヒドロキシルまたはC1〜C4アルコキシ基で置換されていてもよい、C1〜C21の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、R₃およびR₄は個々に、HまたはR₁C(O)である]を有する1つまたは複数のグリセリド; (iii)式:

[式中、R₁=ヒドロキシルまたはC1〜C4アルコキシ基で置換されていてもよい、C1〜C7の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、R₂=C1〜C10の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、(CH₂CH₂O)_nまたは(CH₂CH(CH₃)−O)_nHであり、nは1〜10である]の1つまたは複数のエステル; (iv)1つまたは複数のアセチル化単糖類、アセチル化二糖類、またはアセチル化多糖類;および (v)(i)〜(iv)の任意の組合せ からなる群から選択される少なくとも1つの基質と、 (2)過酸素源と、ならびに (3)過加水分解活性と、配列番号10に示すアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列とを有するポリペプチドを含む酵素触媒であって、触媒ヒスチジンのC末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではない酵素触媒と を含む反応成分セットを含む酵素的過酸発生系であって、適切な反応条件下で反応成分を混合すると過酸が酵素的に生成される酵素的過酸発生系を提供する。

別の実施形態では、ペルオキシカルボン酸を生成するための方法であって、 (a) (1) (i)構造 [X]_mR₅ [式中、 X=式R₆−C(O)Oのエステル基であり; R₆=ヒドロキシル基またはC1〜C4アルコキシ基で置換されていてもよい、C1〜C7の直鎖状、分枝状、または環状のヒドロカルビル部分であり、ここで、R₆=C2〜C7の場合には、R₆は、任意選択で1つまたは複数のエーテル結合を含み; R₅=ヒドロキシル基で置換されていてもよい、C1〜C6の直鎖状、分枝状、もしくは環状のヒドロカルビル部分、または5員環ヘテロ芳香族部分、または6員環の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり;ここで、R₅中の各炭素原子は個々に、1個以下のヒドロキシル基または1個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み;R₅は任意選択で、1つまたは複数のエーテル結合を含み; m=1からR₅中の炭素原子数までの範囲の整数である]を有し、25℃で少なくとも5ppmの水溶解性を有する1つまたは複数のエステル; (ii)構造

[式中、R₁=ヒドロキシルまたはC1〜C4アルコキシ基で置換されていてもよい、C1〜C21の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、R₃およびR₄は個々に、HまたはR₁C(O)である]を有する1つまたは複数のグリセリド; (iii)式:

[式中、R₁=ヒドロキシルまたはC1〜C4アルコキシ基で置換されていてもよい、C1〜C7の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、R₂=C1〜C10の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、(CH₂CH₂O)_nまたは(CH₂CH(CH₃)−O)_nHであり、nは1〜10である]の1つまたは複数のエステル; (iv)1つまたは複数のアシル化単糖類、アシル化二糖類、またはアシル化多糖類;および (v)(i)〜(iv)の任意の組合せ からなる群から選択される少なくとも1つの基質と、 (2)過酸素源と、ならびに (3)過加水分解活性と、配列番号10に示すアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列とを有するポリペプチドを含む酵素触媒であって、触媒ヒスチジンのC末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではない酵素触媒と を含む反応成分セットを準備するステップと、 (b)適切な条件下で反応成分セットを混合し、それによってペルオキシカルボン酸を生成するステップと、 (c)任意選択で、ステップ(b)で生成されるペルオキシカルボン酸を希釈するステップと を含む方法も提供する。

別の実施形態では、ステップ(b)またはステップ(c)において生成されるペルオキシカルボン酸を硬質表面、体表面、または少なくとも1点の衣類に接触させるステップ(d)をさらに含む方法を提供する。

本方法では、反応成分が混合されると所望のペルオキシカルボン酸が生成する。反応成分は使用するまで分離させておくことができる。

さらなる態様では、ペルオキシカルボン酸の発生および送達系であって、 (a) (1)過加水分解活性と、配列番号10に示すアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列とを有するポリペプチドを含む酵素触媒であって、触媒ヒスチジンのC末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではない酵素触媒と (2) (i)構造 [X]_mR₅ [式中、 X=式R₆−C(O)Oのエステル基であり; R₆=ヒドロキシル基またはC1〜C4アルコキシ基で置換されていてもよい、C1〜C7の直鎖状、分枝状、または環状のヒドロカルビル部分であり、ここで、R₆=C2〜C7の場合には、R₆は、任意選択で1つまたは複数のエーテル結合を含み; R₅=ヒドロキシル基で置換されていてもよい、C1〜C6の直鎖状、分枝状、もしくは環状のヒドロカルビル部分、または5員環ヘテロ芳香族部分、または6員環の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり;ここで、R₅中の各炭素原子は個々に、1個以下のヒドロキシル基または1個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み;R₅は任意選択で、1つまたは複数のエーテル結合を含み; m=1からR₅中の炭素原子数までの範囲の整数である]を有し、25℃で少なくとも5ppmの水溶解性を有する1つまたは複数のエステル; (ii)構造

[式中、R₁=ヒドロキシルまたはC1〜C4アルコキシ基で置換されていてもよい、C1〜C21の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、R₃およびR₄は個々に、H またはR₁C(O)である]を有する1つまたは複数のグリセリド; (iii)式:

[式中、R₁=ヒドロキシルまたはC1〜C4アルコキシ基で置換されていてもよい、C1〜C7の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、R₂=C1〜C10の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、(CH₂CH₂O)_nまたは(CH₂CH(CH₃)−O)_nHであり、nは1〜10である]の1つまたは複数のエステル; (iv)1つまたは複数のアシル化単糖類、アシル化二糖類、またはアシル化多糖類;および (v)(i)〜(iv)の任意の組合せ からなる群から選択される少なくとも1つの基質と、 (3)任意選択の緩衝液と を含む第1のコンパートメント、ならびに (b) (1)過酸素源と、 (2)過酸化物安定化剤と (3)任意選択の緩衝液と を含む第2のコンパートメント を含むペルオキシカルボン酸の発生および送達系を提供する。

さらなる実施形態では、ランドリーケア組成物であって、 a)過加水分解活性と、配列番号10に示すアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列とを有するポリペプチドであって、触媒ヒスチジンのC末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではないペプチドと b) (i)構造 [X]_mR₅ [式中、 X=式R₆−C(O)Oのエステル基であり; R₆=ヒドロキシル基またはC1〜C4アルコキシ基で置換されていてもよい、C1〜C7の直鎖状、分枝状、または環状のヒドロカルビル部分であり、ここで、R₆=C2〜C7の場合には、R₆は、任意選択で1つまたは複数のエーテル結合を含み; R₅=ヒドロキシル基で置換されていてもよい、C1〜C6の直鎖状、分枝状、もしくは環状のヒドロカルビル部分、または5員環ヘテロ芳香族部分、または6員環の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり;ここで、R₅中の各炭素原子は個々に、1個以下のヒドロキシル基または1個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み;R₅は任意選択で、1つまたは複数のエーテル結合を含み; m=1からR₅中の炭素原子数までの範囲の整数である]を有し、25℃で少なくとも5ppmの水溶解性を有する1つまたは複数のエステル; (ii)構造

[式中、R₁=ヒドロキシルまたはC1〜C4アルコキシ基で置換されていてもよい、C1〜C21の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、R₃およびR₄は個々に、HまたはR₁C(O)である]を有する1つまたは複数のグリセリド; (iii)式:

[式中、R₁=ヒドロキシルまたはC1〜C4アルコキシ基で置換されていてもよい、C1〜C7の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、R₂=C1〜C10の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、(CH₂CH₂O)_nまたは(CH₂CH(CH₃)−O)_nHであり、nは1〜10である]の1つまたは複数のエステル; (iv)1つまたは複数のアシル化単糖類、アシル化二糖類、またはアシル化多糖類;および (v)(i)〜(iv)の任意の組合せ からなる群から選択される少なくとも1つの基質と、 c)過酸素源と、 d)少なくとも1つの界面活性剤と を含むランドリーケア組成物を提供する。

さらなる実施形態では、過加水分解活性を有するポリペプチドを含むパーソナルケア製品であって、前記ポリペプチドが、配列番号10に示すアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を有するが、触媒ヒスチジンのC末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではないパーソナルケア製品を提供する。

さらなる実施形態では、パーソナルケア製品は、シャンプー、ボディーローション、シャワーゲル、局所保湿剤、練り歯磨き、歯磨きゲル、マウスウォッシュ、マウスリンス、アンチプラークリンス、または局所クレンザーである。

配列番号2、4、6、8、10、および12のCLUSTALWアライメントを示す図である。

配列番号2、4、6、8、10、および12のCLUSTALWアライメントを示す図である。

生物学的配列の簡単な説明 以下の配列は、米国特許法施行規則第1.821〜1.825条(「ヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則(Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures−the Sequence Rules)」)に準拠し、世界知的所有権機関(WIPO)標準ST.25(2009年)、ならびに欧州特許条約(EPC)および特許協力条約(PCT)の規則5.2および49.5(aの2)および実施細則の208項および付録Cの配列表の要件と一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号およびフォーマットは、米国特許法施行規則第1.822条に記載の規則に準拠する。

配列番号1は、過加水分解活性を有するサーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)アセチルキシランエステラーゼをコードするコドン最適化コード領域の核酸配列である。

配列番号2は、過加水分解活性を有するサーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。

配列番号3は、過加水分解活性を有するアクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)アセチルキシランエステラーゼをコードするコドン最適化コード領域の核酸配列である。

配列番号4は、過加水分解活性を有するアクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。

配列番号5は、過加水分解活性を有するプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)アセチルキシランエステラーゼをコードするコドン最適化コード領域の核酸配列である。

配列番号6は、過加水分解活性を有するプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。

配列番号7は、過加水分解活性を有するストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)アセチルキシランエステラーゼをコードするコドン最適化コード領域の核酸配列である。

配列番号8は、過加水分解活性を有するストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。

配列番号9は、過加水分解活性を有するスタッケブランジチア・ナッソエンシス(Stackebrandtia nassauensis)アセチルキシランエステラーゼをコードするコドン最適化コード領域の核酸配列である。

配列番号10は、過加水分解活性を有するスタッケブランジチア・ナッソエンシス(Stackebrandtia nassauensis)アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。

配列番号11は、過加水分解活性を有するストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)アセチルキシランエステラーゼをコードするコドン最適化コード領域の核酸配列である。

配列番号12は、過加水分解活性を有するストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。

配列番号13は、過加水分解活性を有するアクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)C277S変異体アセチルキシランエステラーゼをコードするコドン最適化コード領域の核酸配列である。

配列番号14は、過加水分解活性を有するアクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)C277S変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。

配列番号15は、過加水分解活性を有するアクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)C277T変異体アセチルキシランエステラーゼをコードするコドン最適化コード領域の核酸配列である。

配列番号16は、過加水分解活性を有するアクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)C277T変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。

配列番号17は、サーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)変異体C277Sのアミノ酸配列である(米国特許第8,062,875号明細書)。

配列番号18は、サーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)変異体C277Tのアミノ酸配列である(米国特許第8,062,875号明細書)。

過加水分解活性を有するポリペプチドであって、配列番号10に示すアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を有するが、触媒ヒスチジンのC末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではないポリペプチドを含む組成物および方法を提供する。この組成物および方法は、ランドリーケア製品、消毒剤、化粧品、またはパーソナルケア製品での使用に適した少なくとも1つの過酸を酵素的に生成させるのに適している。

本開示では、いくつの用語および略語を使用する。特に別記しない限り、以下の定義を適用する。

本明細書で使用する場合、本発明の要素または成分の前にある冠詞「a」、「an」、および「the」は、その要素または成分の実例(すなわち存在)の数に関して非限定的になるように意図するものである。したがって「a」、「an」、および「the」は、1つまたは少なくとも1つを含むと解釈されるべきであり、要素または成分の単数の語形は、その数が明らかに単数であることを意味しない限りは複数も含む。

「含む(comprising)」という用語は、特許請求の範囲において言及される所定の特徴、整数、ステップ、または成分の存在を意味するが、1つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、成分、またはそれらの群の存在または付加を排除しない。「含む」という用語は、「から本質的になる(consisting essentially of)」および「からなる(consisting of)」という用語によって包含される実施形態を含むことを意図するものである。同様に、「から本質的になる」という用語は、「からなる」という用語によって包含される実施形態を含むことを意図するものである。

本明細書で使用する場合、使用される材料または反応物の量を修飾する「約」という用語は、例えば、実際に濃縮物または使用溶液を作製するために使用する典型的な測定手順および液体処理手順によって、これらの手順における故意でない誤差によって、組成物の作製または方法の実施のために使用される材料の製造、供給源、または純度の差異によって等により生じ得る数量の変動を指す。「約」という用語はまた、特定の初期混合物から得られる組成物に対する平衡条件が異なることにより異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されるか否かにかかわらず、特許請求の範囲はその量と同等の量を含む。

存在する場合、すべての範囲は、包括的かつ結合可能である。例えば、「1〜5」の範囲が記載される場合、記載範囲は、「1〜4」、「1〜3」、「1〜2」、「1〜2および4〜5」、「1〜3および5」等の範囲を含むものと解釈されるべきである。

本明細書で使用する場合、「多成分系」という用語は、使用するまで成分が分離されたままである、ペルオキシカルボン酸を酵素的に発生させる系を指す。そのため、多成分系は、少なくとも1つの第2の成分から分離されたままである、少なくとも1つの第1の成分を含むことになる。第1および第2の成分は、使用するまで、異なるコンパートメント中に分離されている(すなわち、第1および第2のコンパートメントを使用して)。多成分系の設計は、多くの場合、混合される成分の物理的形態に依存することになるが、詳細は以下に説明する。

本明細書で使用する場合、「ペルオキシカルボン酸」という用語は、過酸、ペルオキシ酸(peroxyacid)、ペルオキシ酸(peroxy acid)、過カルボン酸、およびペルオキソ酸と同義である。

本明細書で使用する場合、「過酢酸」という用語は、「PAA」と略され、ペルオキシ酢酸、エタンペルオキソ酸、およびCAS登録番号79−21−0のすべての他の同義語と同義である。

本明細書で使用する場合、「モノアセチン」という用語は、グリセロールモノアセテート、グリセリンモノアセテート、およびグリセリルモノアセテートと同義である。

本明細書で使用する場合、「ジアセチン」という用語は、グリセロールジアセテート;グリセリンジアセテート、グリセリルジアセテート、およびCAS登録番号25395−31−7のすべての他の同義語と同義である。

本明細書で使用する場合、「トリアセチン」という用語は、グリセリントリアセテート;グリセロールトリアセテート;グリセリルトリアセテート;1,2,3−トリアセトキシプロパン;1,2,3−プロパントリオールトリアセテート;およびCAS登録番号102−76−1のすべての他の同義語と同義である。

本明細書で使用する場合、「モノブチリン」という用語は、グリセロールモノブチレート、グリセリンモノブチレート、およびグリセリルモノブチレートと同義である。

本明細書で使用する場合、「ジブチリン」という用語は、グリセロールジブチレートおよびグリセリルジブチレートと同義である。

本明細書で使用する場合、「トリブチリン」という用語は、グリセロールトリブチレート;1,2,3−トリブチリルグリセロール;およびCAS登録番号60−01−5のすべての他の同義語と同義である。

本明細書で使用する場合、「モノプロピオニン」という用語は、グリセロールモノプロピオネート、グリセリンモノプロピオネート、およびグリセリルモノプロピオネートと同義である。

本明細書で使用する場合、「ジプロピオニン」という用語は、グリセロールジプロピオネートおよびグリセリルジプロピオネートと同義である。

本明細書で使用する場合、「トリプロピオニン」という用語は、グリセリルトリプロピオネート、グリセロールトリプロピオネート、1,2,3−トリプロピオニルグリセロール、およびCAS登録番号139−45−7のすべての他の同義語と同義である。

本明細書で使用する場合、「アシル化糖」および「アシル化糖類」という用語は、少なくとも1つのアシル基を含む単糖類、二糖類、および多糖類を指し、ここで、アシル基は、C2〜C8の鎖長を有する直鎖脂肪族カルボキシレートからなる群から選択される。例としては、これらに限定されるものではないが、グルコースペンタアセテート、キシローステトラアセテート、アセチル化キシラン、アセチル化キシラン断片、β−D−リボフラノース−1,2,3,5−テトラアセテート、トリ−O−アセチル−D−ガラクタール、およびトリ−O−アセチル−グルカールが挙げられる。

本明細書で使用する場合、「ヒドロカルビル」、「ヒドロカルビル基」、および「ヒドロカルビル部分」という用語は、炭素−炭素の単結合、二重結合、もしくは三重結合および/またはエーテル結合によって結合し、適宜水素原子により置換された炭素原子の直鎖状、分枝状、または環状の配置を意味する。このようなヒドロカルビル基は、脂肪族および/または芳香族であり得る。ヒドロカルビル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、t−ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、ペンチル、シクロペンチル、メチルシクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、ベンジル、およびフェニルが挙げられる。一実施形態では、ヒドロカルビル部分は、炭素−炭素単結合および/またはエーテル結合によって結合し、適宜水素原子により置換された炭素原子の直鎖状、分枝状、または環状の配置である。

本明細書で使用する場合、「芳香族性」という用語は、通常複数の共役二重結合を含有する環系において電子の非局在化から生じる化学安定性の増大を特徴とする有機化合物または有機部分を指す。非局在化電子を有する平面共役単環は、(4n+2)π電子を有する場合、芳香族性になるはずである。芳香族化合物の例としては、ベンゼン誘導体(2−,3−,または4−アセトキシ安息香酸など)を挙げることができる。一実施形態では、エステル基質は4−アセトキシ安息香酸とすることができる。

本明細書で使用する場合、「ヘテロ環式」という用語は、環の少なくとも1つの中に、炭素以外の1つまたは複数の原子を有する環構造がある有機化合物または有機部分を指す。

本明細書で使用する場合、「ヘテロ芳香族」という用語は、ヘテロ環式かつ芳香族性である環構造を有する有機化合物または有機部分を指し、環はヘテロ原子である酸素、窒素、またはイオウの少なくとも1つを含む。ヘテロ芳香族部分の例としては、ピリジン部分、ピロール部分、フラン部分、およびチオフェン部分を挙げることができる。

本明細書で使用する場合、1,2−エタンジオール、1,2−プロパンジオール、1,3−プロパンジオール、1,2−ブタンジオール、1,3−ブタンジオール、2,3−ブタンジオール、1,4−ブタンジオール、1,2−ペンタンジオール、2,5−ペンタンジオール、1,6−ペンタンジオール、1,2−ヘキサンジオール、2,5−ヘキサンジオール、1,6−ヘキサンジオールの「モノエステル」および「ジエステル」という用語は、式RC(O)O(式中、RはC1〜C7直鎖状ヒドロカルビル部分である)の少なくとも1つのエステル基を含む前記化合物を指す。

本明細書で使用する場合、「適切な酵素反応製剤」、「ペルオキシカルボン酸の発生に適した成分」、「適切な反応成分」、「反応成分」、「反応製剤」、および「適切な水性反応製剤」という用語は、反応物と過加水分解活性を有する本変異体ポリペプチドを含む酵素触媒とを接触させて、所望のペルオキシカルボン酸を形成させる材料および水を指す。反応製剤の成分は、本明細書に提供され、また、当業者は、この方法に適した成分の変動範囲を認識している。一実施形態では、反応成分が混合されると、酵素反応製剤は、その場でペルオキシカルボン酸を生成する。そのため、反応成分は、使用されるまで反応成分の1つまたは複数が分離されたままである多成分系として提供され得る。複数の活性成分を分離および混合するための系および手段の設計は当技術分野で公知であり、一般に個々の反応成分の物理形態に依存することになる。例えば、複数の活性流体(液体−液体)系は、通常、所望の漂白剤が反応流体の混合で生成される一部の漂白用途で見出されるものなど、マルチチャンバーディスペンサーボトルまたは2相系を使用する(米国特許出願公開第2005−0139608号明細書、米国特許第5,398,846号明細書、米国特許第5,624,634号明細書、米国特許第6,391,840号明細書、欧州特許第0807156B1号明細書、米国特許出願公開第2005−0008526号明細書、およびPCT公報国際公開第00/61713号パンフレット)。カルボン酸エステルからペルオキシカルボン酸を酵素的に生成する多成分製剤および多成分発生系はそれぞれ、米国特許出願公開第2010−0086510号明細書および同第2010−0086621号明細書において、DiCosimoらにより記載されている。ペルオキシカルボン酸の発生に使用される多成分系の他の形態としては、これらに限定されるものではないが、多くの市販の漂白組成物中に使用される粉末(例えば、米国特許第5,116,575号明細書)、多層錠剤(例えば、米国特許第6,210,639号明細書)、複数のコンパートメントを有する水溶解性パケット(例えば、米国特許第6,995,125号明細書)、および水を添加すると反応する固体凝集体(例えば、米国特許第6,319,888号明細書)など、1つまたは複数の固体成分または固体−液体成分の組合せのために設計されたものを挙げることができる。

本明細書で使用する場合、「基質」または「カルボン酸エステル基質」という用語は、過酸化水素などの適切な過酸素源の存在下で本酵素触媒を使用して酵素的に過加水分解される反応成分を指す。一実施形態では、基質は、酵素触媒を使用して酵素的に過加水分解され得る少なくとも1つのエステル基を含み、それにより、ペルオキシカルボン酸が生成される。

本明細書で使用する場合、「過加水分解」という用語は、ペルオキシカルボン酸を形成するための、選択された基質と過酸化水素源との反応として定義される。通常、触媒の存在下で無機過酸化物を選択された基質と反応させて、ペルオキシカルボン酸を生成させる。本明細書で使用する場合、「化学的過加水分解」という用語は、基質(ペルオキシカルボン酸前駆体など)を過酸化水素源と化合させる過加水分解反応を含むが、この場合、ペルオキシカルボン酸は酵素触媒の非存在下で形成される。本明細書で使用する場合、「酵素的過加水分解」という用語は、ペルオキシカルボン酸を形成するための、選択された基質と過酸化水素源との反応を指すが、この場合、反応は過加水分解活性を有する酵素触媒によって触媒される。

本明細書で使用する場合、「ペルヒドロラーゼ活性」という用語は、タンパク質の単位質量(例えば、ミリグラム)、乾燥細胞重量、または固定化触媒重量あたりの触媒活性を指す。

本明細書で使用する場合、「酵素活性の1単位」または「活性の1単位」または「U」は、所定温度で1分当たり1μmolのペルオキシカルボン酸生成物を生成するために必要とされるペルヒドロラーゼ活性の量として定義される。「酵素活性の1単位」はまた、所定温度で1分当たり1μmolのペルオキシカルボン酸(例えば、過酢酸)を加水分解するために必要とされるペルオキシカルボン酸加水分解活性の量を指すために使用することができる。

本明細書で使用する場合、「酵素触媒」および「ペルヒドロラーゼ触媒」という用語は、過加水分解活性を有する酵素(すなわち、ポリペプチド)を含む触媒を指し、全微生物細胞、透過性になった微生物細胞、微生物細胞抽出物の1つまたは複数の細胞成分、部分精製酵素、または精製酵素の形態とすることができる。酵素触媒はまた、化学修飾することができる(例えば、ペグ化、または架橋試薬との反応により)。ペルヒドロラーゼ触媒はまた、当業者に周知の方法を使用して可溶性または不溶性の支持体に固定化することができる;例えば、Immobilization of Enzymes and Cells;(第2版)Jose M.Guisan編;Humana Press,Totowa,NJ,USA;2006を参照のこと。

本明細書で使用する場合、「CE−7酵素として構造上分類される」、「炭水化物エステラーゼファミリー7酵素として構造上分類される」、「CE−7炭水化物エステラーゼとして構造上分類される」、および「CE−7ペルヒドロラーゼ」は、CE−7炭水化物エステラーゼとして構造上分類される、過加水分解活性を有する酵素を指すために、本明細書で使用される(Cantarel et al.,“The Carbohydrate−Active EnZymes database(CAZy):an expert resource for Glycogenomics”,NAR,37:D233−D238(2009)を参照のこと)。

本明細書で使用する場合、「セファロスポリンCデアセチラーゼ」および「セファロスポリンCアセチルヒドロラーゼ」という用語は、セファロスポリンCおよび7−アミノセファロスポラン酸などのセファロスポリンの脱アセチル化を触媒する酵素(E.C.3.1.1.41)を指す(Mitsushima et al.,Appl.Environ.Microbiol.,61(6):2224−2229(1995);米国特許第5,528,152号明細書;および米国特許第5,338,676号明細書)。

本明細書で使用する場合、「アセチルキシランエステラーゼ」は、アセチル化キシランおよび他のアセチル化糖類の脱アセチル化を触媒する酵素(E.C.3.1.1.72;AXE)を指す。

本明細書で使用する場合、「サーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)」という用語は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告された細菌細胞(GENBANK(登録商標)NP_227893.1)を指す。一態様では、サーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)株は、サーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)MSB8である。サーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)由来のペルヒドロラーゼ活性を有する野生型酵素のアミノ酸配列を、配列番号2として示す。

「アミノ酸」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの基本的な化学構造単位を指す。所定のアミノ酸を特定するために以下の略語を本明細書では使用する。

本明細書で使用する場合、「生物学的汚染物質」という用語は、これらに限定されるものではないが、微生物、胞子、ウイルス、プリオン、およびそれらの混合物を含む、1つまたは複数の望まれないかつ/または病原性の生物学的実体を指す。本酵素は、生存可能な生物学的汚染物質の存在を低減および/または除去するために有用な少なくとも1つのペルオキシカルボン酸の効果的な濃度を生成するために使用することができる。好ましい実施形態では、生物学的汚染物質は生存可能な病原微生物である。

本明細書で使用する場合、「消毒する」という用語は、生物学的汚染物質を破壊するかまたはその増殖を防止するプロセスを指す。本明細書で使用する場合、「消毒剤」という用語は、生物学的汚染物質の破壊、中和、または増殖阻害により消毒する薬剤を指す。通常、消毒剤は無生物体または表面を処理するために使用される。本明細書で使用する場合、「防腐剤」という用語は、疾患を伝搬する微生物の増殖を阻害する化学薬剤を指す。実施形態の一態様では、生物学的汚染物質は病原微生物である。

本明細書で使用する場合、「衛生的」という用語は、通常健康に有害であり得る作用因子を除去、防止、または制御することによる、健康の回復または保持を意味するかまたはそれに関することを意味する。本明細書で使用する場合、「衛生化する」という用語は、衛生的にすることを意味する。本明細書で使用する場合、「清浄剤」という用語は、衛生化する薬剤を指す。本明細書で使用する場合、「衛生化」という用語は、衛生化する行為またはプロセスを指す。

本明細書で使用する場合、「殺ウイルス剤(virucide)」という用語は、ウイルスを阻害または破壊する薬剤を指し、「殺ウイルス剤(viricide)」と同義である。ウイルスを阻害または破壊する能力を示す薬剤は、「殺ウイルス」活性を有すると記載される。ペルオキシカルボン酸は殺ウイルス作用を有し得る。本発明での使用に適し得る、当技術分野で公知の通常の代替殺ウイルス剤としては、例えば、アルコール、エーテル、クロロホルム、ホルムアルデヒド、フェノール、ベータプロピオラクトン、ヨウ素、塩素、水銀塩、ヒドロキシルアミン、エチレンオキシド、エチレングリコール、第四級アンモニウム化合物、酵素、および界面活性剤が挙げられる。

本明細書で使用する場合、「殺生物剤」という用語は、微生物を不活性化または破壊する、通常は広域スペクトルの化学薬剤を指す。微生物を不活性化または破壊する能力を示す化学薬剤は、「殺生物」活性を有すると記載される。ペルオキシカルボン酸は殺生物活性を有し得る。本発明での使用に適し得る、当技術分野で公知の通常の代替殺生物剤としては、例えば、塩素、二酸化塩素、クロロイソシアヌレート、次亜塩素酸塩、オゾン、アクロレイン、アミン、塩素化フェノール類、銅塩、有機硫黄化合物、および第四級アンモニウム塩が挙げられる。

本明細書で使用する場合、「最小殺生物濃度」という語句は、所定の接触時間の間に、標的微生物の生存可能集団に致死的かつ不可逆的な所望の低減をもたらすことになる殺生物剤の最小濃度を指す。有効性は、処理後の生存可能微生物のlog₁₀低減によって測定することができる。一態様では、処理後の生存可能微生物の目標とする低減は、少なくとも3−log₁₀低減、より好ましくは少なくとも4−log₁₀低減、最も好ましくは少なくとも5−log₁₀低減である。別の態様では、最小殺生物濃度は、生存可能微生物細胞の少なくとも6−log₁₀低減である。

本明細書で使用する場合、「過酸素源」および「過酸素の源」という用語は、水溶液中にある場合、約1mM以上の濃度で過酸化水素を供給することができる化合物を指し、これらに限定されるものではないが、過酸化水素、過酸化水素付加物(例えば、尿素−過酸化水素付加物(過酸化カルバミド))、過ホウ酸塩、および過炭酸ナトリウムなどの過炭酸塩が含まれる。本明細書に記載するように、水性反応製剤中の過酸素化合物によって供給される過酸化水素の濃度は、反応成分を混合した際に最初は少なくとも1mM以上になる。一実施形態では、水性反応製剤中の過酸化水素濃度は少なくとも0.5mMである。別の実施形態では、水性反応製剤中の過酸化水素濃度は少なくとも10mMである。別の実施形態では、水性反応製剤中の過酸化水素濃度は少なくとも100mMである。別の実施形態では、水性反応製剤中の過酸化水素濃度は少なくとも200mMである。別の実施形態では、水性反応製剤中の過酸化水素濃度は500mM以上である。さらに別の実施形態では、水性反応製剤中の過酸化水素濃度は1000mM以上である。水性反応製剤中の過酸化水素とトリグリセリドなどの酵素基質とのモル比(H₂O₂:基質)は、約0.002〜20、好ましくは約0.1〜10、最も好ましくは約0.5〜5とすることができる。

本明細書で使用する場合、「有益薬剤」という用語は、有用な利点、好ましい/望ましい効果または有益性を促進または増強する物質を指す。一実施形態では、消毒、漂白、脱染、脱臭、およびそれらの任意の組合せなど所望の有益性を達成するために、ペルオキシカルボン酸を含む組成物などの有益薬剤を、織物または衣類に適用する方法を提供する。別の実施形態では、過加水分解活性を有する本異性体ポリペプチドを、パーソナルケア製品(ヘアケア製品、スキンケア製品、ネイルケア製品、または口腔ケア製品など)で使用される過酸ベースの有益薬剤を生成するために使用することができる。一実施形態では、過加水分解活性を有するポリペプチドを含むパーソナルケア製品であって、前記ポリペプチドが、配列番号10に示すアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を有するが、触媒ヒスチジンのC末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではないパーソナルケア製品を提供する。これらのパーソナルケア製品は、所望の過酸有益薬剤の安全かつ効果的な濃度を供給するように製剤化される。

本明細書で使用する場合、「パーソナルケア製品」は、毛髪、皮膚、頭皮、および歯の清浄化、漂白、および/または消毒に使用される製品を意味し、これらに限定されるものではないが、シャンプー、ボディーローション、シャワーゲル、局所保湿剤、練り歯磨き、歯磨きゲル、マウスウォッシュ、マウスリンス、アンチプラークリンス、および/または他の局所クレンザーが含まれる。一部の特に好ましい実施形態では、これらの製品はヒトに関して利用されるが、他の実施形態では、これらの製品は非ヒト動物での使用が見出されている(例えば、獣医学用途において)。

本明細書で使用する場合、「歯のホワイトニング」および「歯の漂白」という用語は互換的に使用され、1本の歯または複数の歯の輝度を改善すること(例えば、ホワイトニング)を指す。この用語は、本発明、ならびに化学処理、温和な酸処理、研磨による歯のホワイトニング、およびレーザーによる歯のホワイトニングを含む、歯をホワイトニングするのに適した任意の方法を包含することを意図する。特に好ましい実施形態では、本発明は、歯をホワイトニングするのに適したペルヒドロラーゼおよびペルヒドロラーゼ含有組成物を提供する。

過加水分解活性を有するポリペプチド 過加水分解活性を有すると以前に報告されたCE−7エステラーゼの「シグネチャーモチーフ」は、以下の3つの保存サブモチーフで構成される(参照配列である配列番号2;野生型サーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)アセチルキシランエステラーゼに関連した残基位置番号付け): a)Arg118−Gly119−Gln120;(「RGQモチーフ)」; b)Gly186−Xaa187−Ser188−Gln189−Gly190;(「GXSQGモチーフ」);および c)His303−Glu304;(「HEモチーフ」)。

通常、アミノ酸残基位置187のXaaは、グリシン、アラニン、プロリン、トリプトファン、またはスレオニンである。触媒三残基に属する3つのアミノ酸残基のうちの2つを太字にしている。

本過加水分解酵素はRGQモチーフおよびGXSQGモチーフを含有するが、表Aおよび図1に示すように、本過加水分解酵素のいずれも、保存構造モチーフとして以前に報告された「HEモチーフ」内にグルタミン酸を含有しない。

過加水分解活性を有する本ポリペプチドは、CAZyデータベース内のメンバーとして収載されているCE−7炭水化物エステラーゼのより大きな総括的クラス内の新規のサブグループを表している可能性があると考えられる(Cantarel et al.,“The Carbohydrate−Active EnZymes database(CAZy):an expert resource for Glycogenomics”,NAR,37:D233−D238(2009))。そのため、本出願内で使用される、過加水分解活性を有するポリペプチドは、以前に定義された「シグネチャーモチーフ」の一部を欠いているけれども、「CE−7炭水化物エステラーゼ」または「CE−7ペルヒドロラーゼ」と本明細書で呼ばれる。

別の実施形態では、過加水分解活性を有する本ポリペプチドは、参照配列である配列番号2に対してアライメントされた場合に、モチーフの以下の組合せを有するとしてさらに定義される(参照配列である配列番号2;野生型サーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)アセチルキシランエステラーゼに関連した残基位置番号付け): a)Arg118−Gly119−Gln120;(「RGQモチーフ)」; b)Gly186−Xaa187−Ser188−Gln189−Gly190;(「GXSQGモチーフ」);および c)His303−Xaa304;(「HXモチーフ)」;ここで、Xaaはグルタミン酸ではない。

好ましい態様では、「HXモチーフ」内の「X」アミノ酸残基は、アラニン、アスパラギン酸、またはセリンである。

別の態様では、過加水分解活性を有する本ポリペプチドは、配列番号4、6、8、10、12、14、または16からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むが、触媒ヒスチジンのC末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではない。

一実施形態では、過加水分解活性を有する本ポリペプチドは、本明細書に示す配列に対して少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、84、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95 96、97、98、99、または100%のアミノ酸同一性を有するが、触媒ヒスチジンのC末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではない。

別の態様では、過加水分解活性を有する本ポリペプチドは、配列番号10に示すアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有する少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むが、触媒ヒスチジンのC末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではない。別の態様では、過加水分解活性を有する本ポリペプチドは、アミノ酸配列の配列番号10を含む。

本明細書で使用する場合、「変異体ペルヒドロラーゼ」または「変異体」という用語は、本明細書に記載する必要なモチーフおよび付随する過加水分解活性が維持される限り、変異体が由来する対応する酵素(通常、野生型酵素)に比較したときに、少なくとも1つのアミノ酸の付加、欠失、および/または置換をもたらす改変を有する過加水分解酵素を指す。CE−7変異体ペルヒドロラーゼはまた、本組成物および本方法で使用することができる。変異体の例として、配列番号14および16を提供する。

当業者は、実質的に同様のペルヒドロラーゼ配列も本組成物および本方法において使用することができることを認識する。一実施形態では、実質的に同様の配列とは、高度にストリンジェントな条件下で、本明細書に例示した配列に関連した核酸分子とハイブリダイズするその能力により定義される。別の実施形態では、配列アライメントアルゴリズムを使用して、本明細書に示すDNA配列またはアミノ酸配列に対するパーセント同一性に基づき、実質的に同様の酵素を定義することができる。

本明細書で使用する場合、核酸分子は、第1の分子の一本鎖が、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で他の分子とアニーリングすることができる場合、cDNA、ゲノムDNA、またはRNAなどの別の核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は周知であり、Sambrook,J.and Russell,D.,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,(2001)に例示されている。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件は、遠縁の生物に由来する相同配列など中程度に類似した分子から、近縁の生物に由来する機能性酵素を再現する遺伝子など高度に類似した分子までスクリーニングできるように調整することができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、通常、ストリンジェンシー条件を決定する。1つの好ましい条件セットは、6×SSC、0.5%SDS、室温で15分間から始まり、次いで2×SSC、0.5%SDS、45℃で30分間を反復し、さらに0.2×SSC、0.5%SDS、50℃で30分間を2回反復する一連の洗浄を使用する。より好ましい条件セットは、より高温を使用するが、その洗浄は、0.2×SSC、0.5%SDSにおける最後の2回の30分間洗浄の温度を60℃に上昇させることを除いて上記のものと同じである。別の好ましい高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件セットは、0.1×SSC、0.1%SDS、65℃であり、2×SSC、0.1%SDSによる洗浄後、0.1×SSC、0.1%SDS、65℃で最終洗浄が行われる。

ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能となるけれども、ハイブリダイゼーションには、2つの核酸が相補的配列を含有することが必要となる。核酸をハイブリダイズさせるための適切なストリンジェンシーは、当技術分野で周知の変数である核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。2つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドに対するTm値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性(Tmの高さに対応する)は、RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNAの順で低下する。長さが100ヌクレオチド超のハイブリッドについては、Tmの計算式が誘導されている(上記のSambrook and Russell)。より短い核酸(すなわち、オリゴヌクレオチド)によるハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要になり、またオリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する(上記のSambrook and Russell)。一態様では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約10ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは、少なくとも約15ヌクレオチドの長さであり、より好ましくは少なくとも約20ヌクレオチドの長さであり、さらにより好ましくは少なくとも30ヌクレオチドの長さであり、さらにより好ましくは少なくとも300ヌクレオチドの長さであり、最も好ましくは少なくとも800ヌクレオチドの長さである。さらに、当業者は、プローブの長さなどの要因に応じて必要があれば、温度および洗浄溶液の塩濃度を調整することができることを認識する。

本明細書で使用する場合、「パーセント同一性」という用語は、配列の比較により決定される、2つ以上のポリペプチド配列間または2つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を指す。当技術分野では、「同一性」はまた、任意選択で、そのような配列文字列間の一致によって決定される、ポリペプチド間またはポリヌクレオチド間の配列関連性度を意味する。「同一性」および「類似性」は、これらに限定されるものではないが、Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.,ed.)Oxford University Press,NY(1988);Biocomputing:Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.,ed.)Academic Press,NY(1993);Computer Analysis of Sequence Data,Part I(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.)Humana Press,NJ(1994);Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje,G.,ed.)Academic Press(1987);およびSequence Analysis Primer(Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.)Stockton Press,NY(1991)に記載されるものを含む、公知の方法によって容易に算出することができる。同一性および類似性を決定する方法は、公的に入手できるコンピュータプログラムの中に成文化されている。配列アラインメントおよびパーセント同一性の計算は、LASERGENEバイオインフォマティクス計算スイートのMegalignプログラム(DNASTAR Inc.,Madison,WI)、Vector NTI v.7.0のAlignXプログラム(Informax,Inc.,Bethesda,MD)、またはEMBOSS Open Software Suite(EMBL−EBI、Rice et al.,Trends in Genetics 16,(6):276−277(2000))を使用して実施することができる。配列の多重アライメントは、アライメントのCLUSTAL法(CLUSTALW、例えばバージョン1.83など)(Higgins and Sharp,CABIOS、5:151−153(1989);Higgins et al.,Nucleic Acids Res.22:4673−4680(1994);およびChenna et al.,Nucleic Acids Res 31(13):3497−500(2003))、European Bioinformatics Instituteを介してEuropean Molecular Biology Laboratoryから入手可能)を、デフォルトパラメータと共に使用して実施することができる。CLUSTALWタンパク質アライメントに適したパラメーターには、GAP Existenceペナルティ=15、GAP伸長=0.2、マトリックス=Gonnet(例えば、Gonnet250)、タンパク質ENDGAP=−1、タンパク質GAPDIST=4、およびKTUPLE=1が含まれる。一実施形態では、速いまたは遅いアライメントをデフォルト設定と共に使用するが、遅いアライメントが好ましい。あるいは、CLUSTALW法(例えば、バージョン1.83)で使用するパラメーターを修正して、KTUPLE=1、GAP PENALTY=10、GAP伸長=1、マトリックス=BLOSUM(例えば、BLOSUM64)、WINDOW=5、およびTOP DIAGONALS SAVED=5を使用することもできる。

「触媒ヒスチジン」とは、セリンおよびアスパラギン酸と共に触媒三残基を形成する、本開示のペルヒドロラーゼ中のヒスチジン残基を意味する。例えば、配列番号10では、触媒ヒスチジンは、アミノ酸残基番号303である。ペルヒドロラーゼ活性を有する配列番号10の変異体では、CLUSTALWを使用して配列を比較する場合、その触媒ヒスチジンを配列番号10の触媒ヒスチジンと並置させるが、これは、変異体の触媒ヒスチジンが、必ずしもそうである必要はないが、変異体のアミノ酸位置303であり得ることを意味する。

一態様では、適切な単離核酸分子は、本明細書に報告されるアミノ酸配列に対して、少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、84、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。適切な核酸分子は、上記の相同性を有するだけでなく、通常は、約210〜340アミノ酸長、約300〜約340アミノ酸長、好ましくは約310〜約330アミノ酸長、最も好ましくは約318〜約325アミノ酸長を有するポリペプチドをコードし、各ポリペプチドは、過加水分解活性を有することを特徴とする。

カルボン酸エステルおよび過酸化水素からペルオキシカルボン酸を酵素触媒により調製するのに適した反応条件 過加水分解活性を有する酵素触媒の存在下で、カルボン酸エステルおよび無機過酸化物(過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム、または過炭酸ナトリウムなど)により、少なくとも1つのペルオキシカルボン酸を含む水性製剤を製造する方法を提供する。ここで、酵素触媒は、一実施形態では、配列番号4、6、8、10、12、14、および16からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有するが、触媒ヒスチジンのC末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではないポリペプチドを含む。さらなる実施形態では、過加水分解活性を有するポリペプチドは、配列番号4、6、8、10、12、14、および16から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、配列番号10のアミノ酸配列を有する。

一実施形態では、適切な基質は、以下の式: [X]_mR₅ [式中、X=式R₆C(O)Oのエステル基 R₆=ヒドロキシル基またはC1〜C4アルコキシ基で置換されていてもよい、C1〜C7の直鎖状、分枝状、または環状のヒドロカルビル部分であり、ここで、R₆=C2〜C7の場合には、R₆は、任意選択で1つまたは複数のエーテル結合を含み; R₅=ヒドロキシル基で置換されていてもよい、C1〜C6の直鎖状、分枝状、もしくは環状のヒドロカルビル部分、または5員環ヘテロ芳香族部分、または6員環の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり;ここで、R₅中の各炭素原子は個々に、1個以下のヒドロキシル基または1個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み;R₅は任意選択で、1つまたは複数のエーテル結合を含み; m=1からR₅中の炭素原子数までの範囲の整数である]により示され、25℃で少なくとも5ppmの水溶解性を有する1つまたは複数のエステルを含む。

別の実施形態では、R₆=任意選択で1つまたは複数のエーテル結合を含む、ヒドロキシル基またはC1〜C4アルコキシ基で置換されていてもよいC1〜C7の直鎖状ヒドロカルビル部分。さらに好ましい実施形態では、R₆=ヒドロキシル基で置換されていてもよく、かつ/または任意選択で1つまたは複数のエーテル結合を含む、C2〜C7の直鎖状ヒドロカルビル部分。

一実施形態では、適切な基質として、2−アセトキシ安息香酸、3−アセトキシ安息香酸、4−アセトキシ安息香酸、またはそれらの混合物を挙げることができる。

別の実施形態では、適切な基質はまた、式:

[式中、R₁=ヒドロキシルまたはC1〜C4アルコキシ基で置換されていてもよいC1〜C21の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、R₃およびR₄は個々にHまたはR₁C(O)である]の1つまたは複数のグリセリドを含む。一実施形態では、適切な基質は、上記の式[式中、R₁=ヒドロキシルまたはC1〜C4アルコキシ基で置換されていてもよいC1〜C7の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、R₃およびR₄は個々にHまたはR₁C(O)である]のグリセリドである。

別の態様では、適切な基質はまた、式:

[式中、R₁=ヒドロキシルまたはC1〜C4アルコキシ基で置換されていてもよい、C1〜C7の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、R₂=C1〜C10の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、(CH₂CH₂O)_n、または(CH₂CH(CH₃)−O)_nHであり、nは1〜10である]の1つまたは複数のエステルを含むことができる。

適切な基質はまた、アシル化された単糖類、二糖類、および多糖類からなる群から選択される1つまたは複数のアシル化糖類を含むことができる。別の実施形態では、アシル化糖類は、アセチル化キシラン、アセチル化キシランの断片、アセチル化キシロース(キシローステトラアセテートなど)、アセチル化グルコース(α−D−グルコースペンタアセテート;β−D−グルコースペンタアセテートなど)、β−D−ガラクトースペンタアセテート、ソルビトールヘキサアセテート、スクロースオクタアセテート、β−D−リボフラノース−1,2,3,5−テトラアセテート、トリ−O−アセチル−D−ガラクタール、トリ−O−アセチル−D−グルカール、テトラアセチルキシロフラノース、α−D−グルコピラノースペンタアセテート、α−D−マンノピラノースペンタアセテート、およびアセチル化セルロースからなる群から選択される。好ましい実施形態では、アセチル化糖類は、β−D−リボフラノース−1,2,3,5−テトラアセテート、トリ−O−アセチル−D−ガラクタール、トリ−O−アセチル−D−グルカール、スクロースオクタアセテート、およびアセチル化セルロースからなる群から選択される。

別の実施形態では、適切な基質は、モノアセチン;ジアセチン;トリアセチン;モノプロピオニン;ジプロピオニン;トリプロピオニン;モノブチリン;ジブチリン;トリブチリン;グルコースペンタアセテート;キシローステトラアセテート;アセチル化キシラン;アセチル化キシラン断片;β−D−リボフラノース−1,2,3,5−テトラアセテートトリ−O−アセチル−D−ガラクタール;トリ−O−アセチル−D−グルカール;1,2−エタンジオール、1,2−プロパンジオール、1,3−プロパンジオール、1,2−ブタンジオール、1,3−ブタンジオール、2,3−ブタンジオール、1,4−ブタンジオール、1,2−ペンタンジオール、2,5−ペンタンジオール、1,6−ペンタンジオール、1,2−ヘキサンジオール、2,5−ヘキサンジオール、1,6−ヘキサンジオールのモノエステルまたはジエステル;およびそれらの混合物からなる群から選択される。

別の実施形態では、カルボン酸エステルは、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、およびそれらの組合せからなる群から選択される。別の実施形態では、基質は、1つまたは複数のエステル基を含むC1〜C6ポリオールである。好ましい実施形態では、C1〜C6ポリオール上のヒドロキシル基の1つまたは複数は、1つまたは複数のアセトキシ基で置換されている(1,3−プロパンジオールジアセテート、1,4−ブタンジオールジアセテート等)。さらなる実施形態では、基質は、プロピレングリコールジアセテート(PGDA)、エチレングリコールジアセテート(EGDA)、またはそれらの混合物である。

別の実施形態では、適切な基質は、酢酸エチル;乳酸メチル;乳酸エチル;グリコール酸メチル;グリコール酸エチル;メトキシ酢酸メチル;メトキシ酢酸エチル;3−ヒドロキシ酪酸メチル;3−ヒドロキシ酪酸エチル;2−アセチルクエン酸トリエチル;グルコースペンタアセテート;グルコノラクトン;モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、モノプロピオニン、ジプロピオニン(グリセリルジプロピオネート)、トリプロピオニン(1,2,3−トリプロピオニルグリセロール)、モノブチリン、ジブチリン(グリセリルジブチレート)、トリブチリン(1,2,3−トリブチリルグリセロール)などのグリセリド(モノ−、ジ−、およびトリグリセリド);アセチル化糖類;およびそれらの混合物からなる群から選択される。

さらなる実施形態では、適切な基質は、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、モノプロピオニン、ジプロピオニン、トリプロピオニン、モノブチリン、ジブチリン、トリブチリン、酢酸エチル、および乳酸エチルからなる群から選択される。さらに別の態様では、基質は、ジアセチン、トリアセチン、酢酸エチル、および乳酸エチルからなる群から選択される。最も好ましい実施形態では、適切な基質はトリアセチンを含む。

カルボン酸エステルは、酵素触媒による過加水分解の際に、所望の濃度のペルオキシカルボン酸を生成するのに十分な濃度で水性反応製剤中に存在する。カルボン酸エステルは、水性反応製剤中に完全に可溶性である必要はないが、ペルヒドロラーゼ触媒による、エステルの対応するペルオキシカルボン酸への変換を可能にするのに十分な溶解性を有する。カルボン酸エステルは、水性反応製剤の0.0005重量%〜40重量%の濃度、好ましくは水性反応製剤の0.01重量%〜20重量%の濃度、より好ましくは水性反応製剤の0.05重量%〜10重量%の濃度で水性反応製剤中に存在する。カルボン酸エステルの重量%は、任意選択で、カルボン酸エステルの溶解限度よりも大きくなることがあり、その結果、カルボン酸エステルの濃度は、水、酵素触媒、および過酸化物源で構成される水性反応製剤中で少なくとも0.0005重量%になるが、カルボン酸エステルの残りは、二相の水性/有機性反応製剤の第2の分離相として留まる。加えたカルボン酸エステルのすべてが、直ちに水性反応製剤中で溶解する必要はなく、すべての反応成分の最初の混合後、連続的または間欠的な混合をさらに行うことは、任意選択である。

本反応成分により生成されるペルオキシカルボン酸は、本酵素触媒を使用する限り、選択された基質に応じて異なり得る。一実施形態では、生成されるペルオキシカルボン酸は、過酢酸、過プロピオン酸、過酪酸、過オクタン酸、過乳酸、過グリコール酸、過メトキシ酢酸、過β−ヒドロキシ酪酸、またはそれらの混合物である。

過酸素源としては、これらに限定されるものではないが、過酸化水素、過酸化水素付加物(例えば、尿素−過酸化水素付加物(過酸化カルバミド))、過ホウ酸塩、および過炭酸塩を挙げることができる。あるいは、過酸化水素は、オキシダーゼ活性を有する酵素(例えば、これらに限定されるものではないが、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ソルビトールオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、グリコール酸オキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、オキサレートオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、カルボキシアルコールオキシダーゼ、L−アミノ酸オキシダーゼ、グリシンオキシダーゼ、グルタメートオキシダーゼ、リシンオキシダーゼ、およびウリカーゼ)により触媒される、基質と酸素の反応によって、その場で生成させることができる。反応製剤中の過酸素化合物の濃度は、0.0033重量%〜約50重量%の範囲、好ましくは0.033重量%〜約40重量%の範囲、より好ましくは0.33重量%〜約30重量%の範囲とすることができる。

多くのペルヒドロラーゼ触媒(全細胞、透過性になった全細胞、および部分精製された全細胞抽出物)は、カタラーゼ活性を有することが報告されている(EC 1.11.1.6)。カタラーゼは、過酸化水素の酸素および水への変換を触媒する。一態様では、ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素触媒には、カタラーゼ活性がない。別の態様では、ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素触媒のカタラーゼ活性が十分低いため、前記カタラーゼ活性の存在により、ペルヒドロラーゼに触媒されるペルオキシカルボン酸の生成が顕著に妨害されることはない。別の態様では、カタラーゼ阻害剤が水性反応製剤に添加される。適切なカタラーゼ阻害剤の例としては、これらに限定されるものではないが、アジ化ナトリウムおよび硫酸ヒドロキシルアミンが挙げられる。当業者は、必要に応じてカタラーゼ阻害剤の濃度を調節することができる。カタラーゼ阻害剤の濃度は、通常、0.1mM〜約1M;好ましくは約1mM〜約50mM;より好ましくは約1mM〜約20mMの範囲である。一態様では、アジ化ナトリウムの濃度は、通常、約20mM〜約60mMの範囲であり、一方硫酸ヒドロキシルアミンの濃度は、通常、約0.5mM〜約30mM、好ましくは10mMである。

宿主細胞中のカタラーゼ活性は、これらに限定されるものではないが、トランスポゾン変異誘発、RNAアンチセンス発現、標的化変異誘発、およびランダム変異誘発を含む周知の技術を使用して、カタラーゼ活性の原因遺伝子の発現を破壊することにより下方制御または除去することができる。好ましい実施形態では、内因性カタラーゼ活性をコードする遺伝子が下方制御または破壊(すなわち、「ノックアウト」)される。本明細書で使用する場合、「破壊された」遺伝子は、改変された遺伝子によってコードされるタンパク質の活性および/または機能がもはや存在しない遺伝子である。遺伝子を破壊する手段は、当技術分野において周知であり、対応するタンパク質の活性および/または機能が存在しなくなる限り、これらに限定されるものではないが、遺伝子への挿入、欠失、または突然変異を含むことができる。さらに好ましい実施形態では、産生宿主は、katGおよびkatEからなる群から選択されるカタラーゼ遺伝子の破壊を含む大腸菌(E.coli)産生宿主である(米国特許第7,951,566号明細書(DiCosimo et al.)を参照のこと)。別の実施形態では、産生宿主は、katGおよびkatEカタラーゼ遺伝子の両方における下方制御および/または破壊を含む大腸菌(E.coli)株である。katGおよびkatEの二重ノックアウトを含む大腸菌(E.coli)株が作製されており、大腸菌(E.coli)株KLP18(米国特許第7,951,566号明細書(DiCosimo et al.))として記載されている。

水性反応製剤中の触媒濃度は、触媒の比触媒活性に依存し、所望の反応速度を得るように選択される。過加水分解反応における触媒重量は、通常、全反応容積の1mL当たり0.0001mg〜50mg、好ましくは1mL当たり0.0005mg〜10mg、より好ましくは1mL当たり0.0010mg〜2.0mgの範囲である。触媒はまた、当業者に周知の方法を使用して可溶性または不溶性の支持体に固定化することができ;例えば、Immobilization of Enzymes and Cells(第2版);Jose M.Guisan編;Humana Press,Totowa,NJ,USA;2006を参照されたい。固定化触媒を使用すると、その後の反応における触媒の回収および再使用が可能になる。酵素触媒は、全微生物細胞、透過性になった微生物細胞、微生物細胞抽出物、部分精製酵素または精製酵素、およびそれらの混合物の形態とすることができる。

一態様では、カルボン酸エステルの化学的過加水分解と酵素的過加水分解を組み合わせることにより発生するペルオキシカルボン酸の濃度は、所望のpHでの消毒、漂白、衛生化、脱臭、または脱染のために、ペルオキシカルボン酸の有効濃度を供給するのに十分である。別の態様では、ペルオキシカルボン酸は、毛髪、皮膚、爪、または歯エナメル質、歯外皮、または歯茎などの口腔組織に適用されるパーソナルケア製品での使用に適した安全かつ効果的な濃度で発生される。別の態様では、本方法は、ペルオキシカルボン酸の所望の有効濃度を生成するための酵素と酵素基質の組合せを提供するが、この場合、酵素を添加しないと、極めて低濃度のペルオキシカルボン酸しか生成されない。無機過酸化物と酵素基質との直接化学反応により酵素基質が一部化学的過加水分解され得るが、所望の用途におけるペルオキシカルボン酸の有効濃度を供給するのに十分な濃度のペルオキシカルボン酸が発生されない可能性があり、全ペルオキシカルボン酸濃度の顕著な増加は、水性反応製剤に適切なペルヒドロラーゼ触媒を添加することにより達成される。

本発明の一態様では、酵素的過加水分解により発生するペルオキシカルボン酸(例えば、過酢酸)の濃度は、酵素的過加水分解反応の開始から5分以内、より好ましく1分以内に、少なくとも約2ppm、好ましくは少なくとも20ppm、好ましくは少なくとも100ppm、より好ましくは少なくとも約200ppmのペルオキシカルボン酸、より好ましくは少なくとも300ppm、より好ましくは少なくとも500ppm、より好ましくは少なくとも700ppm、より好ましくは少なくとも約1000ppmのペルオキシカルボン酸、より好ましくは少なくとも約2000ppmのペルオキシカルボン酸、最も好ましくは少なくとも10,000ppmのペルオキシカルボン酸である。本発明の第2の態様では、酵素的過加水分解により発生するペルオキシカルボン酸(例えば、過酢酸)の濃度は、酵素的過加水分解反応の開始から5分以内、より好ましくは1分以内に(すなわち、製剤を形成させるために反応成分を混合してから測定される時間)、少なくとも約2ppm、好ましくは少なくとも20ppm、好ましくは少なくとも30ppm、より好ましくは少なくとも約40ppmのペルオキシカルボン酸、より好ましくは少なくとも50ppm、より好ましくは少なくとも60ppm、より好ましくは少なくとも70ppm、より好ましくは少なくとも約80ppmのペルオキシカルボン酸、最も好ましくは少なくとも100ppmのペルオキシカルボン酸である。

ペルオキシカルボン酸を含む水性製剤は、任意選択で、所望の低い標的濃度のペルオキシカルボン酸製剤を生成するように、水を含む希釈剤または主として水で構成される溶液で希釈してもよい。一態様では、ペルオキシカルボン酸の所望の濃度(または濃度範囲)を生成するのに必要な反応時間は、約20分以内、好ましくは約5分以内、最も好ましくは約1分以内である。

他の態様では、ある濃度の生物学的汚染物質で汚染された表面または無生物体を、前記反応成分の混合から約1分〜約168時間以内もしくは約1分〜約48時間以内に、または前記反応成分の混合から約1分〜約2時間以内に、あるいはこの中の任意の時間間隔で、本明細書に記載する方法に従って形成されたペルオキシカルボン酸と接触させる。

別の態様では、本明細書に記載の方法に従って形成されたペルオキシカルボン酸をランドリーケア用途で使用し、そこでは、消毒、漂白、脱染、脱臭、および/またはそれらの組合せなどの有益性を供与するために、ペルオキシカルボン酸を衣類または織物と接触させる。ペルオキシカルボン酸は、これらに限定されるものではないが、ランドリー処理剤または織物予洗処理剤、ランドリー洗剤またはランドリー添加剤、染み抜き剤、漂白組成物、脱臭組成物、およびリンス剤を含む、種々のランドリーケア製品で使用することができる。一実施形態では、標的表面に対してペルオキシカルボン酸を生成する本方法は、その場で実行される。

ランドリーケア用途の文脈では、「衣類または織物に接触させる」という用語は、衣類または織物を本明細書に開示する製剤に曝露することを意味する。この目的のために、衣類または織物を処理するために使用することができる製剤にはいくつかの形態があり、例えば、これらに限定されるものではないが、液体、固体、ゲル、ペースト、バー、錠剤、スプレー、発泡体、粉末、または顆粒があり、手動投入、ユニット投入、基板からの投入、スプレー、ランドリー洗濯機または乾燥機からの自動投入を介して送達させることができる。粒状組成物も、コンパクトな形態にすることができ;液体組成物も、濃縮形態にすることができる。

本明細書に開示する製剤をランドリー洗濯機で使用する場合、製剤はランドリー洗剤に典型的な成分をさらに含有することができる。例えば、典型的な成分としては、これらに限定されるものではないが、界面活性剤、漂白剤、漂白活性化剤、追加の酵素、石鹸泡抑制剤、分散剤、石灰石鹸分散剤、土壌懸濁剤、および再付着防止剤、柔軟剤、腐食防止剤、変色防止剤、および殺菌剤、pH調整剤、非ビルダーアルカリ源、キレート剤、有機および/または無機の充填剤、溶媒、ヒドロトロープ、蛍光増白剤、染料、および香料が挙げられる。本明細書に開示する製剤はまた、固体または液体の形態で、洗剤添加物製品として使用することができる。そのような添加物製品は、従来の洗剤組成物の性能を補足または増強することを意図するものであり、クリーニングプロセスの任意の段階で添加することができる。

漂白、染み抜き、臭い低減の1つまたは複数のために過酸を発生させる、ランドリーケアのための本系および本方法に関連して、少なくとも1つのカルボン酸エステルの過加水分解により発生する過酸(例えば、過酢酸)の濃度は、少なくとも約2ppm、好ましくは少なくとも20ppm、好ましくは少なくとも100ppm、またより好ましくは少なくとも約200ppmの過酸とすることができる。消毒または衛生化のために過酸を発生させる、ランドリーケアのための本系および本方法に関連して、少なくとも1つのカルボン酸エステルの過加水分解により発生する過酸(例えば、過酢酸)の濃度は、過加水分解反応の開始から10分以内、好ましくは5分以内、より好ましくは1分以内に、少なくとも約2ppm、より好ましくは少なくとも20ppm、より好ましくは少なくとも200ppm、より好ましくは少なくとも500ppm、より好ましくは少なくとも700ppm、より好ましくは少なくとも約1000ppmの過酸、最も好ましくは少なくとも2000ppmの過酸である。過酸を含む製品製剤は、任意選択で、水、または主として水で構成される溶液で希釈して、所望の低濃度の過酸を含む製剤を生成することができる。本方法および本系の一態様では、所望の濃度の過酸を生成するのに必要な反応時間は、約2時間以内、好ましくは約30分以内、より好ましくは約10分以内、さらにより好ましくは約5分以内、また最も好ましくは約1分以内である。

反応の温度は、反応速度および酵素触媒活性の安定性の両方を制御するように選択される。反応の温度は、水性反応製剤の氷点のすぐ上(ほぼ0℃)から約85℃までの範囲とすることができ、反応温度の好ましい範囲は約5℃〜約75℃である。

ペルオキシカルボン酸を酵素的に生成する間の水性反応製剤のpHは、約5.0〜約10.0、好ましくは約6.5〜約8.5、またさらにより好ましくは約6.5〜約7.5の範囲のpHに維持される。一実施形態では、水性反応製剤のpHは、反応成分の混合後少なくとも30分間、約6.5〜約8.5の範囲にある。水性反応製剤のpHは、これらに限定されるものではないが、リン酸、ピロリン酸、重炭酸、酢酸、またはクエン酸を含む適切な緩衝剤の添加または組み込みにより調節または制御することができる。一実施形態では、緩衝剤は、リン酸緩衝剤、重炭酸緩衝剤、または硬水(ランドリーケア用途をシミュレートする水道水)と過炭酸(過酸化水素を発生するために使用される過炭酸ナトリウムに由来する)の組合せにより形成される緩衝剤から選択される。緩衝剤の濃度は、使用する場合、通常、0.1mM〜1.0M、好ましくは1mM〜300mM、最も好ましくは10mM〜100mMである。本発明の別の態様では、ペルオキシカルボン酸を酵素的に生成させる間、反応混合物に緩衝剤を添加しない。

さらに別の態様では、酵素的過加水分解の水性反応製剤は、分散剤として作用して水性反応製剤中のカルボン酸エステルの溶解速度を増強する有機溶媒を含有することができる。そのような溶媒としては、これらに限定されるものではないが、プロピレングリコールモノメチルエーテル、アセトン、シクロヘキサノン、ジエチレングリコールブチルエーテル、トリプロピレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールブチルエーテル、ジプロピレングリコールメチルエーテル、シクロヘキサノール、ベンジルアルコール、イソプロパノール、エタノール、プロピレングリコール、およびそれらの混合物が挙げられる。

別の態様では、酵素的過加水分解製品は、望ましい機能性を付与する追加の成分を含有することができる。これらの追加の成分としては、これらに限定されるものではないが、緩衝剤、洗剤ビルダー、増粘剤、乳化剤、界面活性剤、湿潤剤、腐食防止剤(例えば、ベンゾトリアゾール)、酵素安定剤、および過酸化物安定剤(例えば、金属イオンキレート剤)が挙げられる。追加の成分の多くは、洗剤産業で周知である(例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,932,532号明細書を参照のこと)。乳化剤の例としては、これらに限定されるものではないが、ポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンが挙げられる。増粘剤の例としては、これらに限定されるものではないが、LAPONITE(登録商標)RD(合成層状シリケート)、コーンスターチ、PVP、CARBOWAX(登録商標)(ポリエチレングリコールおよび/またはメトキシポリエチレングリコール)、CARBOPOL(登録商標)(アクリル酸架橋ポリマー)、CABOSIL(登録商標)(合成アムフォルマスヒュームド二酸化ケイ素)、ポリソルベート20、PVA、およびレシチンが挙げられる。緩衝系の例としては、これらに限定されるものではないが、一塩基性リン酸ナトリウム/二塩基性リン酸ナトリウム;スルファミン酸/トリエタノールアミン;クエン酸/トリエタノールアミン;酒石酸/トリエタノールアミン;コハク酸/トリエタノールアミン;および酢酸/トリエタノールアミンが挙げられる。界面活性剤の例としては、これらに限定されるものではないが、a)エチレンオキシドまたはプロピレンオキシドのブロックコポリマー、エトキシル化もしくはプロポキシル化の直鎖状および分枝状の第一級および第二級アルコール、ならびに脂肪族ホスフィンオキシドなどの非イオン性界面活性剤;b)第四級アンモニウム化合物、特に、3つのC1〜C2アルキル基に付加的に結合した窒素原子に結合したC8〜C20アルキル基を有する第四級アンモニウム化合物などの陽イオン性界面活性剤;c)アルカンカルボン酸(たとえば、C8〜C20脂肪酸)、アルキルホスホネート、アルカンスルホネート(たとえば、ドデシル硫酸ナトリウム「SDS」)または直鎖状もしくは分枝状のアルキルベンゼンスルホネート、アルケンスルホネートなどの陰イオン性界面活性剤;ならびにd)アミノカルボン酸、アミノジカルボン酸、アルキベタイン、およびそれらの混合物などの両性および双性イオン性界面活性剤が挙げられる。追加の成分としては、芳香剤、染料、過酸化水素の安定剤(例えば、1−ヒドロキシエチリデン−1,1−ジホスホン酸(DEQUEST(登録商標)2010、Solutia Inc,St.Louis,Mo)およびエチレンジアミン四酢酸(EDTA)などの金属キレート剤)、TURPINAL(登録商標)SL(エチドロン酸)、DEQUEST(登録商標)0520(ホスホネート)、DEQUEST(登録商標)0531(ホスホネート)、酵素活性の安定剤(例えば、ポリエチレングリコール(PEG))、ならびに洗剤ビルダーを挙げることができる。

別の態様では、酵素的過加水分解製品は、消毒すべき表面または無生物体に接触させる前に所望濃度のペルオキシカルボン酸を発生させるために、予め混合することができる。

別の態様では、消毒すべき表面または無生物体に接触させる前に所望濃度のペルオキシカルボン酸を発生させるために、酵素的過加水分解製品を予め混合しないが、その代わりに、所望濃度のペルオキシカルボン酸を発生する水性反応製剤の成分を消毒および/または漂白もしくは脱染すべき表面または無生物体と接触させて、所望濃度のペルオキシカルボン酸を発生させる。一部の実施形態では、水性反応製剤の成分をその場所で混合するかまたは混ぜる。一部の実施形態では、反応成分をその場所に送達または適用し、続いて混ぜるかまたは混合して、所望濃度のペルオキシカルボン酸を発生させる。

ペルヒドロラーゼ触媒を使用するペルオキシカルボン酸の生成 ペルオキシカルボン酸は、いったん生成すると、かなり反応性があり、これらに限定されるものではないが、温度およびpHを含む変数に依存して、長時間にわたって濃度が減少する可能性がある。そのため、特に液体製剤については、種々の反応成分を分離しておくことが望ましいことがある。一態様では、過酸化水素源を基質またはペルヒドロラーゼ触媒のいずれか、好ましくはその両方から分離する。このことは、これに限定されるものではないが、マルチコンパートメントチャンバーのあるディスペンサー(米国特許第4,585,150号明細書)の使用を含む、種々の手法を使用して達成することができ、使用時に過酸素源(過酸化水素など)および本基質とペルヒドロラーゼ触媒を物理的に混合して、水性酵素的過加水分解反応を開始させる。ペルヒドロラーゼ触媒は、任意選択で、反応チャンバーの本体内部に固定するか、または処理の対象となる表面および/または物体と接触させる前にペルオキシカルボン酸を含む反応生成物から分離(例えば、濾過等)することができる。ペルヒドロラーゼ触媒は、液体マトリックスまたは固体形態(例えば、粉末または錠剤)であっても、固体マトリックス内に埋め込まれていてもよく固体マトリックスをその後基質と混合して酵素的過加水分解反応を開始させる。さらなる態様では、ペルヒドロラーゼ触媒を、溶解性または多孔性のパウチ内に含有することができ、水性基質マトリックスに添加して、酵素的過加水分解を開始させることができる。さらにさらなる態様では、ペルヒドロラーゼ触媒は、溶解性または多孔性のパウチの別のコンパートメント内に含有される内容物を含むことができ、このパウチには、エステル基質および/または過酸化物源を含む封入内容物に対する少なくとも1つの追加のコンパートメントがある。追加のさらなる態様では、酵素触媒を含む粉末を基質(例えば、トリアセチン)中に懸濁し、使用時に水中の過酸素源と混合する。

ペルオキシカルボン酸および過酸化水素の濃度の決定方法 反応物および生成物を分析するために、本方法では種々の分析法を使用することができ、その方法としては、これらに限定されるものではないが、滴定、高速液体クロマトグラフィ(HPLC)、ガスクロマトグラフィ(GC)、質量分析(MS)、キャピラリー電気泳動法(CE)、U.Karstら(Anal.Chem.,69(17):3623−3627(1997))により記載されたHPLC分析法、および米国特許第7,951,566号明細書に記載される2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンゾタゾリン(ethylbenzothazoline))−6−スルホネート(ABTS)アッセイ(U.Pinkernell et al.,The Analyst 122:567−571(1997);S.Minning,et al.,Analytica Chimica Acta 378:293−298(1999)および国際公開第2004/058961A1号パンフレットを参照のこと)が挙げられる。

ペルオキシカルボン酸の最小殺生物濃度の決定 J.Gabrielsonら(J.Microbiol.Methods 50:63−73(2002))により記載される方法を、ペルオキシカルボン酸、または過酸化水素および酵素基質の最小殺生物濃度(MBC)の決定に使用することができる。このアッセイ法は、XTTの還元阻害に基づいており、ここで、XTT((2,3−ビス[2−メトキシ−4−ニトロ−5−スルホフェニル]−5−[(フェニルアミノ)カルボニル]−2H−テトラゾリウム、分子内塩、モノナトリウム塩)は、490nmまたは450nmで測定される光学密度(OD)の変化によって微生物の呼吸活性を示す酸化還元色素である。しかしながら、消毒剤および防腐剤の活性を試験するために利用可能な種々の他の方法があり、その方法としては、これらに限定されるものではないが、生菌プレートカウント、直接顕微鏡カウント、乾燥重量、濁度測定、吸光度、および生物発光が挙げられる(例えば、Brock,Semour S.,Disinfection,Sterilization,and Preservation,第5版,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA,USA;2001を参照のこと)。

酵素的に調製されたペルオキシカルボン酸組成物の使用 本方法に従って生成した、酵素触媒により発生のペルオキシカルボン酸は、生物学的汚染物質の濃度を低減するために、種々の硬質表面/無生物体に適用して使用することができ、例えば、医療機器(例えば、内視鏡)、織物(衣服およびカーペットなど)、食品調理表面、食品貯蔵および食品包装装置、食品包装に使用される材料、鶏の孵化場および成育施設、動物の囲い、ならびに微生物および/または殺ウイルス活性を有する使用済みプロセス水の汚染除去に使用することができる。酵素により発生のペルオキシカルボン酸は、プリオン(例えば、特定のプロテアーゼ)を不活性化し、さらに殺生物活性を示すように設計された製剤に使用することができる(米国特許第7,550,420号明細書(DiCosimo et al.)を参照のこと)。

一態様では、ペルオキシカルボン酸組成物は、オートクレーブができない医療機器および食品包装装置のための消毒剤として有用である。ペルオキシカルボン酸含有製剤は、GRAS(一般に安全と認識される)または食品用成分(酵素、酵素基質、過酸化水素、および緩衝剤)を使用して調製することができるので、酵素により発生のペルオキシカルボン酸はまた、動物の屠殺体、食肉、果物、および野菜の汚染除去のため、または加工食品の汚染除去のために使用することができる。酵素により発生のペルオキシカルボン酸は、その最終形態が粉末、液体、ゲル、フィルム、固体、またはエアロゾルである製品に組み込むことができる。酵素により発生のペルオキシカルボン酸は、効果的な汚染除去が依然として可能な濃度まで希釈することができる。

効果的な濃度のペルオキシカルボン酸を含む組成物は、表面または物体と本方法によって生成の生成物とを接触させることによって、病原性微生物汚染など生物学的汚染物質で汚染された(または汚染された疑いのある)表面および/または物体を消毒するために使用することができる。本明細書で使用する場合、「接触させる」とは、清浄化および消毒するのに十分な時間、有効濃度のペルオキシカルボン酸を含む消毒組成物と、生物学的汚染物質で汚染された疑いのある表面または無生物体とを接触させた状態に置くことを指す。接触には、スプレー、処理、浸漬、フラッシング、注入(上または中に)、混合、合体、ペインティング、コーティング、塗布、貼付、および効果的な濃度のペルオキシカルボン酸を含むペルオキシカルボン酸溶液もしくは組成物、または効果的な濃度のペルオキシカルボン酸を形成するペルオキシカルボン酸溶液もしくは組成物と、ある濃度の生物学的汚染物質で汚染された疑いのある表面また無生物体とを他の方法で連結することも含まれる。清浄化および消毒の両方を行うために、消毒組成物を清浄化組成物と組み合わせることができる。あるいは、単一組成物で清浄化および消毒の両方を行うために、清浄化剤(例えば、界面活性剤または洗剤)を製剤に組み込むことができる。

効果的な濃度のペルオキシカルボン酸を含む組成物はまた、少なくとも1つの追加の抗微生物剤、プリオン分解プロテアーゼの組合せ、殺ウイルス剤、殺胞子剤、または殺生物剤を含有することができる。生物学的汚染物質で汚染された(汚染された疑いのある)表面および/または物体を清浄化および消毒するために使用する場合、これらの薬剤と、特許請求の方法によって生成されるペルオキシカルボン酸とを組み合わせることにより、増大したおよび/または相乗的な効果を得ることができる。適切な抗微生物剤としては、所望する程度の微生物防御を得るのに十分な量の、カルボン酸エステル(例えば、p−ヒドロキシアルキルベンゾエートおよびアルキルシンナメート);スルホン酸(例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸);ヨード化合物または活性ハロゲン化合物(例えば、元素ハロゲン、ハロゲン酸化物(例えば、NaOCl、HOCl、HOBr、ClO₂)、ヨウ素、ハロゲン間化合物(interhalide)(例えば、一塩化ヨウ素、二塩化ヨウ素、三塩化ヨウ素、四塩化ヨウ素、塩化臭素、一臭化ヨウ素、または二臭化ヨウ素)、ポリハロゲン化物、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸、次亜臭素酸塩、次亜臭素酸、クロロ−およびブロモ−ヒダントイン、二酸化塩素、および亜鉛素酸ナトリウム);過酸化ベンゾイル、アルキル過酸化ベンゾイル、オゾン、一重項酸素発生剤、およびそれらの混合物を含む有機過酸化物;フェノール誘導体(例えば、o−フェニルフェノール、o−ベンジル−p−クロロフェノール、tert−アミルフェノール、およびC₁〜C₆アルキルヒドロキシベンゾエート);第四級アンモニウム化合物(例えば、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、およびそれらの混合物);ならびにこのような抗微生物剤の混合物が挙げられる。有効量の抗微生物剤としては、約0.001重量%〜約60重量%の抗微生物剤、約0.01重量%〜約15重量%の抗微生物剤、または約0.08重量%〜約2.5重量%の抗微生物剤が挙げられる。

一態様では、本方法によって形成されるペルオキシカルボン酸は、ある場所の上および/またはある場所で適用する場合、生存可能な生物学的汚染物質(微生物集団など)の濃度を低減するために使用することができる。本明細書で使用する場合、「場所」は、消毒または漂白に適した標的表面の一部またはすべてを含む。標的表面には、潜在的に生物学的汚染物質で汚染され得るすべての表面が含まれる。非限定的な例としては、食品または飲料産業において見られる装置の表面(タンク、コンベヤ、床、ドレーン、冷却器、冷凍庫、装置表面、壁、バルブ、ベルト、パイプ、ドレーン、ジョイント、割れ目、それらの組合せ等);建物の表面(壁、床、および窓など);非食品産業関連のパイプおよびドレーン、例えば、水処理施設、プールおよび温泉場、ならびに発酵タンク;病院または動物病院の表面(壁、床、ベッド、装置(内視鏡など)、病院/動物病院または他のヘルスケア環境で着用される衣類、例えば衣類、スクラブ(scrub)、靴、および病院または動物病院の他の表面など);レストランの表面;浴室の表面;トイレ;衣服および靴;家禽、ウシ、乳牛、ヤギ、ウマ、およびブタなどの家畜のための納屋または畜舎の表面;家禽またはエビのための孵化場;ならびに医薬品または生物医薬品の表面(例えば、医薬品または生物医薬品の製造装置、医薬品または生物医薬品の成分、医薬品または生物医薬品の賦形剤)が挙げられる。さらなる硬質表面としては、例えば牛肉、家禽、豚肉、野菜、果物、シーフード、およびそれらの組合せ等の食品が挙げられる。場所としては、感染したリネンまたは他の織物などの水吸収材料も挙げられる。さらに場所として、収穫した植物または植物製品、例えば種子、球茎、塊茎、果実、および野菜、生育中の植物、特に作物用に生育中の植物、例えば穀草類、葉野菜およびサラダ用作物、根菜、豆類、ベリー状果実、柑橘果実および堅い果物も挙げられる。

硬質表面材料の非限定例としては、金属(例えば、鋼、ステンレス鋼、クロム、チタン、鉄、銅、真鍮、アルミニウム、およびそれらの合金)、鉱物(例えば、コンクリート)、ポリマーおよびプラスチック(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ(メタ)アクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリブタジエン、ポリ(アクリロニトリル、ブタジエン、スチレン)、ポリ(アクリロニトリル、ブタジエン)、アクリロニトリルブタジエンなどのポリオレフィン;ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル、およびナイロンなどのポリアミド)がある。さらなる表面としては、レンガ、タイル、セラミック、磁器、木材、木材パルプ、紙、ビニル、リノリウム、およびカーペットが挙げられる。

本方法によって形成されるペルオキシカルボン酸は、これらに限定されるものではないが、消毒、衛生化、漂白、脱染、および脱臭を含む、衣類および織物に対する有益性を提供するために使用することができる。本方法によって形成されるペルオキシカルボン酸は、これらに限定されるものではないが、少し例を挙げると、織物予洗処理剤、ランドリー洗剤、ランドリー洗剤またはランドリー添加剤、染み抜き剤、漂白組成物、脱臭組成物、およびリンス剤を含む、多くのランドリーケア製品で使用することができる。

本方法により形成されるペルオキシカルボン酸は、特に過酢酸を使用する場合、木材パルプまたは製紙用パルプの漂白/脱リグニンプロセスの1つまたは複数のステップで使用することができる(例えば、欧州特許第1040222B1号明細書および米国特許第5,552,018号明細書(Devenyns,J)を参照のこと)。

パーソナルケア用途 本明細書に記載する過加水分解酵素は、少し例を挙げると、ヘアケア(漂白、脱毛)、スキンケア(皮膚美白、抗微生物)、および口腔ケア用途(歯のホワイトニング/漂白または消毒)など、パーソナル用途のための過酸有益薬剤を生成するために使用することができる。本明細書に記載する組成物および方法は、ヘアケア、スキンケア、ネイルケア、または他のパーソナルケア製品での使用が公知であるか、そうでなければそれらの使用に有効な1つまたは複数の皮膚科学的にまたは美容的に許容される成分をさらに含むことができる。ただし、この任意選択の成分は、本明細書に記載する必須成分と物理的および化学的に適合性があるか、そうでなければ製品の安定性、美観、または性能を過度に損なわないものである。そのような任意選択成分の非限定例が、International Cosmetic Ingredient Dictionary,第9版,2002,およびCTFA Cosmetic Ingredient Handbook,第10版,2004に開示されている。

一実施形態では、皮膚科学的/美容的に許容される担体は、約10重量%〜約99.9重量%、あるいは約50重量%〜約95重量%、またあるいは約75重量%〜約95重量%の皮膚科学的に許容される担体を含むことができる。組成物との使用に適した担体としては、例えば、ヘアスプレー、ムース、トニック、ゲル、皮膚保湿剤、ローション、およびリーブオンコンディショナーの製剤で使用されるものを挙げることができる。担体は、水;有機油;シリコーン、例えば、揮発性シリコーン、アミノまたは非アミノのシリコンガムまたは油、およびそれらの混合物;鉱油;植物油、例えば、オリーブ油、ヒマシ油、菜種油、ヤシ油、小麦麦芽油、甘扁桃油、アボカード油、マカダミア油、アプリコット油、サフラワー油、ククイ油、亜麻仁油、タマヌ油、レモン油、およびそれらの混合物;ワックス;および有機化合物、例えば、C₂〜C₁₀アルカン、アセトン、メチルエチルケトン、揮発性有機C₁〜C₁₂アルコール、C₁〜C₂₀酸およびC₁〜C₈アルコールのエステル(エステルの選択は、ペルヒドロラーゼに対するカルボン酸エステル基質として機能し得るか否かに依存し得るという理解の下で)、例えば、酢酸メチル、酢酸ブチル、酢酸エチル、およびミリスチン酸イソプロピル、ジメトキシエタン、ジエトキシエタン、C₁₀〜C₃₀脂肪アルコール、例えば、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、およびベヘニルアルコール;C₁₀〜C₃₀脂肪酸、例えば、ラウリン酸およびステアリン酸;C₁₀〜C₃₀脂肪アミド、例えば、ラウリン酸ジエタノールアミド;C₁₀〜C₃₀脂肪アルキルエステル、例えば、C₁₀〜C₃₀脂肪アルキル安息香酸エステル;ヒドロキシプロピルセルロース;ならびにそれらの混合物である。一実施形態では、担体は、水、脂肪アルコール、揮発性有機アルコール、およびそれらの混合物を含む。本発明の組成物はさらに、組成物に所望の粘度を付与する助けとなる、約0.1%〜約10%、あるいは約0.2%〜約5.0%のゲル化剤を含むことができる。適切な任意選択のゲル化剤の非限定例としては、架橋カルボン酸ポリマー;非中和型架橋カルボン酸ポリマー;非中和型修飾架橋カルボン酸ポリマー;架橋エチレン/無水マレイン酸コポリマー;非中和型架橋エチレン/無水マレイン酸コポリマー(例えば、Monsantoから市販されるEMA81);非中和型架橋アルキルエーテル/アクリレートコポリマー(例えば、Allied Colloidsから市販されるSALCARE(商標)SC90);ポリアクリル酸ナトリウム、鉱油、およびPEG−1 trideceth−6の非中和型架橋コポリマー(例えば、Allied Colloidsから市販されるSALCARE(商標)SC91);メチルビニルエーテルおよび無水マレイン酸の非中和型架橋コポリマー(例えば、International Specialty Productsから市販されるSTABILEZE(商標)QM−PVM/MAコポリマー);疎水的修飾非イオン性セルロースポリマー;疎水的修飾エトキシレートウレタンポリマー(例えば、Union Carbideから市販されるアルカリ膨潤性ポリマーのUCARE(商標)Polyphobe Series);ならびにそれらの組合せが挙げられる。この文脈において、「非中和型」という用語は、任意選択のポリマーおよびコポリマーゲル化剤材料が非中和型酸モノマーを含有することを意味する。好ましいゲル化剤としては、水溶性非中和型架橋エチレン/無水マレイン酸コポリマー、水溶性非中和型架橋カルボン酸ポリマー、水溶性疎水的修飾非イオン性セルロースポリマー、および界面活性剤/脂肪アルコールゲルネットワーク、例えば、ヘアコンディショニング製品での使用に適したものなどが挙げられる。

組換え微生物発現 本発明の配列の遺伝子および遺伝子産物は、異種宿主細胞、特に微生物宿主細胞において、生成させることができる。本発明の遺伝子および核酸分子の発現のための好ましい異種宿主細胞は、真菌または細菌ファミリーの中に見出すことができ、広範な温度、pH値、および溶媒耐性にわたって増殖する微生物宿主である。例えば、細菌、酵母、および糸状菌のいずれも本発明の核酸分子の発現の適切な宿主になり得ると考えられる。ペルヒドロラーゼは、細胞内、細胞外、または細胞内および細胞外の両方の組合せで発現され得るが、細胞外発現では、発酵産物からの所望のタンパク質の回収が、細胞内発現により産生されるタンパク質の回収方法よりも容易になる。転写、翻訳、およびタンパク質生合成装置は、細胞バイオマスを生成するために使用される細胞の供給原料に比較して、変化しないものであり、機能遺伝子はそれに関係なく発現される。宿主株の例としては、これらに限定されるものではないが、細菌、真菌、または酵母種、例えば、アスペルギルス属(Aspergillus)、トリコデルマ属(Trichoderma)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、ピキア属(Pichia)、ファフィア属(Phaffia)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、カンジダ属(Candida)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、ヤロウィア属(Yarrowia)、サルモネラ属(Salmonella)、バチルス属(Bacillus)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、ザイモモナス属(Zymomonas)、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)、エリスロバクター属(Erythrobacter)、クロロビウム属(Chlorobium)、クロマチウム属(Chromatium)、フラボバクテリウム属(Flavobacterium)、サイトファーガ属(Cytophaga)、ロドバクター属(Rhodobacter)、ロドコッカス属(Rhodococcus)、ストレプトミセス属(Streptomyces)、ブレビバクテリウム属(Brevibacterium)、コリネバクテリア属(Corynebacteria)、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)、ディノコッカス属(Deinococcus)、エシェリキア属(Escherichia)、エルウィニア属(Erwinia)、パンテア属(Pantoea)、シュードモナス属(Pseudomonas)、スフィンゴモナス属(Sphingomonas)、メチロモナス属(Methylomonas)、メチロバクター属(Methylobacter)、メチロコッカス属(Methylococcus)、メチロサイナス属(Methylosinus)、メチロミクロビウム属(Methylomicrobium)、メチロシスティス属(Methylocystis)、アルカリゲネス属(Alcaligenes)、シネコシスティス属(Synechocystis)、シネココッカス属(Synechococcus)、アナベナ属(Anabaena)、チオバチルス属(Thiobacillus)、メタノバクテリウム属(Methanobacterium)、クレブシエラ属(Klebsiella)、およびミキソコッカス属(Myxococcus)が挙げられる。一実施形態では、細菌宿主株には、エシェリキア属(Escherichia)、バチルス属(Bacillus)、およびシュードモナス属(Pseudomonas)が含まれる。好ましい実施形態では、細菌宿主細胞は、枯草菌(Bacillus subtilis)または大腸菌(Escherichia coli)である。

工業生産 ペルヒドロラーゼ触媒を製造するために種々の培養方法を適用することができる。組換え微生物宿主から過剰発現される特定の遺伝子産物の大規模生産は、バッチ培養、流加培養、および連続培養の方法によって行うことができる。バッチ培養法および流加培養法は一般的であり、当技術分野において周知であり、その例は、Thomas D.Brock in Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,第2版,Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA(1989)およびDeshpande,Mukund V.,Appl.Biochem.Biotechnol.,36:227(1992)に見出すことができる。

一実施形態では、所望のペルヒドロラーゼ触媒の商業的生産は連続培養で達成される。連続培養は、処理の間、合成培地をバイオリアクターに連続的に添加し、同時に等量の馴化培地を除去する開放系である。連続培養は、一般に、細胞が主に対数増殖期にあるときに、細胞を一定の高い液相密度に維持する。あるいは、連続培養は、固定化細胞を用いて実施することもでき、そこでは、炭素および栄養素を連続的に添加し、有用産物、副産物、または老廃物を細胞塊から連続的に取り出す。細胞の固定化は、天然および/または合成材料で構成される広範な固体支持体を使用して実施することができる。

バッチ発酵もしくは流加発酵または連続培養から所望のペルヒドロラーゼ触媒を回収することは、当業者に公知のいずれかの方法によって達成することができる。例えば、酵素触媒が細胞内で産生される場合、細胞ペーストを遠心分離または膜濾過によって培地から分離し、任意選択で水または所望のpHの緩衝水溶液で洗浄し、次いで、所望のpHの緩衝水溶液中の細胞ペースト懸濁液を、ホモジナイズして、所望の酵素触媒を含有する細胞抽出物を生成する。酵素触媒溶液から不要なタンパク質を沈殿させる加熱処理の前に、任意選択で、この細胞抽出物を、セライトまたはシリカなどの適切な濾過助剤を通して濾過して、細胞片を除去してもよい。次いで、所望の酵素触媒を含有する溶液を、加熱処理工程の間に生じた、細胞片およびタンパク質の沈殿から、膜濾過または遠心分離によって分離し、得られる部分精製酵素触媒溶液をさらなる膜濾過により濃縮し、次いで、任意選択で、適切な賦形剤(例えば、マルトデキストリン、トレハロース、スクロース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、またはそれらの混合物)と混合し、噴霧乾燥して、所望の酵素触媒を含む固体粉末を生成させることができる。あるいは、上記のように調製して得られる部分精製酵素触媒溶液を、任意選択で、さらなる膜濾過により濃縮してもよく、次いで、部分精製酵素触媒溶液または得られる酵素濃縮物を、任意選択で、1つまたは複数の安定化剤(例えば、グリセロール、ソルビトール、プロピレングリコール、1,3−プロパンジオール、ポリオール、ポリマーポリオール、ポリビニルアルコール、またはそれらの混合物)、1つまたは複数の塩(例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、またはそれらの混合物)、および1つまたは複数の殺生物剤を混合し、使用するまで水溶液として保持する。

量、濃度、または他の値もしくはパラメーターを、範囲、好ましい範囲、または好ましい上限値および好ましい下限値の一覧のいずれかとして与える場合、これは、範囲が別々に開示されているか否かにかかわらず、任意の上側の範囲限界または好ましい値と、任意の下側の範囲限界または好ましい値との任意の対から形成されるすべての範囲を具体的に開示するものと理解されるべきである。本明細書において数値の範囲を列挙する場合、他に記載されない限り、その範囲は、その両端点ならびに範囲内のすべての整数および分数を含むことを意図する。範囲を定義する場合、列挙される特定の値に本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

一般的方法 以下の実施例は、種々の実施形態を実証するために提供するものである。以下の実施例において開示される手法は、本明細書において開示される方法の実施において十分に機能することが発明者によって発見された手法であり、したがって、その実施のための好ましい方式を構成するものとみなされ得ることを、当業者は認識すべきである。しかしながら、当業者は、本発明の開示を考慮して、開示される特定の実施形態において多くの変更がなされ得るものであり、しかもそれでも本発明で開示される方法の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることを認識すべきである。

すべての試薬および材料は、他に記載がない限り、DIFCO Laboratories(Detroit,MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg,MD)、TCI America(Portland,OR)、Roche Diagnostics Corporation(Indianapolis,IN)、またはSigma−Aldrich Chemical Company(St.Louis,MO)から入手したものである。

本明細書における以下の略語は、以下のように、測定、手法、特性、または化合物の単位に相当する:「sec」または「s」は秒を意味し、「min」は分を意味し、「h」または「hr」は時間を意味し、「μL」はマイクロリットルを意味し、「mL」はミリリットルを意味し、「L」はリットルを意味し、「mM」はミリモル濃度を意味し、「M」はモル濃度を意味し、「mmol」はミリモルを意味し、「ppm」は100万分の1を意味し、「wt」は重量を意味し、「wt%」は重量パーセントを意味し、「g」はグラムを意味し、「μg」はマイクログラムを意味し、「ng」はナノグラムを意味し、

は重力を意味し、「HPLC」は高速液体クロマトグラフィを意味し、「ddH₂O」は蒸留および脱イオン水を意味し、「dcw」は乾燥細胞重量を意味し、「ATCC」または「ATCC(登録商標)」はAmerican Type Culture Collection(Manassas,VA)を意味し、「U」はペルヒドロラーゼ活性の単位を意味し、「rpm」は1分間の回転数を意味し、「EDTA」はエチレンジアミン四酢酸を意味し、「IPTG」はイソプロピル−β−D−チオ−ガラクトシドを意味し、「BCA」はビシンコニン酸を意味し、「ABTS」は2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホネートを意味する。

実施例1 大腸菌(E.coli)における、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)由来のCE−7アセチルキシランエステラーゼのクローニングおよび産生 GENBANK(登録商標)(受託番号ACU35776.1;GI:255920265)に報告される、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)由来のアセチルキシランエステラーゼ酵素をコードする遺伝子を、大腸菌(E.coli)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)における発現のために最適化されたコドンを使用して合成した。核酸生成物(配列番号3)を、PJEXPRESS404(登録商標)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)にサブクローニングして、pMP91として同定されるプラスミドを作製した。プラスミドpMP91を使用して大腸菌(E.coli)KLP18(米国特許第7,723,083号明細書に記載される)を形質転換して、KLP18/pMP91として同定される菌株を作製した。KLP18/pMP91を、LB培地中、37℃で振盪しながら、OD_600nm=0.4〜0.5になるまで増殖させ、その時点で、IPTGを最終濃度1mMになるように添加し、インキュベーションを2〜3時間継続した。細胞を

で15分間、遠心分離して回収した後、1.0mMジチオスレイトール添加の50mMリン酸カリウム緩衝液pH7.0に再懸濁した(20%w/v)。再懸濁した細胞を、フレンチプレスセルに2回通した。溶解した細胞を、

で30分間、遠心分離し、抽出物上清中のタンパク質濃度をBCAアッセイキット(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)を使用して決定した。SDS−PAGEを使用してCE−7酵素(配列番号4)の発現を確認し、ImageJ(パブリックドメインのJava画像処理プログラム)を使用してゲルを解析することにより、ペルヒドロラーゼが全可溶性タンパク質の11%を構成することが示された。

実施例2 大腸菌(E.coli)における、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)由来のCE−7アセチルキシランエステラーゼのクローニングおよび産生 GENBANK(登録商標)(受託番号AEE71478.1;GI:332674662)に報告される、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)由来のアセチルキシランエステラーゼ酵素をコードする遺伝子を、大腸菌(E.coli)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)における発現のために最適化されたコドンを使用して合成した。核酸生成物(配列番号5)を、PJEXPRESS404(登録商標)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)にサブクローニングして、pMP92として同定されるプラスミドを作製した。プラスミドpMP92を使用して大腸菌(E.coli)KLP18(米国特許第7,723,083号明細書に記載される)を形質転換して、KLP18/pMP92として同定される菌株を作製した。KLP18/pMP92を、LB培地中、37℃で振盪しながら、OD_600nm=0.4〜0.5になるまで増殖させ、その時点で、IPTGを最終濃度1mMになるように添加し、インキュベーションを2〜3時間継続した。細胞を

で15分間、遠心分離して回収した後、1.0mMジチオスレイトール添加の50mMリン酸カリウム緩衝液pH7.0に再懸濁した(20%w/v)。再懸濁した細胞を、フレンチプレスセルに2回通した。溶解した細胞を、

で30分間、遠心分離し、抽出物上清中の全可溶性タンパク質濃度をBCAアッセイキット(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)を使用して決定した。SDS−PAGEを使用してCE−7酵素(配列番号6)の発現を確認し、ImageJ(パブリックドメインのJava画像処理プログラム)を使用してゲルを解析することにより、ペルヒドロラーゼが全可溶性タンパク質の13%を構成することが示された。

実施例3 大腸菌(E.coli)における、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)由来のCE−7アセチルキシランエステラーゼのクローニングおよび産生 GENBANK(登録商標)(受託番号CAX00506.1;GI:225702544)に報告される、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)由来のアセチルキシランエステラーゼ酵素をコードする遺伝子を、大腸菌(E.coli)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)における発現のために最適化されたコドンを使用して合成した。核酸生成物(配列番号7)を、PJEXPRESS404(登録商標)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)にサブクローニングして、pMP93として同定されるプラスミドを作製した。プラスミドpMP93を使用して大腸菌(E.coli)KLP18(米国特許第7,723,083号明細書に記載される)を形質転換して、KLP18/pMP93として同定される菌株を作製した。KLP18/pMP93を、LB培地中、37℃で振盪しながら、OD_600nm=0.4〜0.5になるまで増殖させ、その時点で、IPTGを最終濃度1mMになるように添加し、インキュベーションを2〜3時間継続した。細胞を

で15分間、遠心分離して回収した後、1.0mMジチオスレイトール添加の50mMリン酸カリウム緩衝液pH7.0に再懸濁した(20%w/v)。再懸濁した細胞を、フレンチプレスセルに2回通した。溶解した細胞を、

で30分間、遠心分離し、抽出物上清中の全可溶性タンパク質濃度をBCAアッセイキット(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)を使用して決定した。SDS−PAGEを使用してCE−7酵素(配列番号8)の発現を確認し、ImageJ(パブリックドメインのJava画像処理プログラム)を使用してゲルを解析することにより、ペルヒドロラーゼが全可溶性タンパク質の26%を構成することが示された。

実施例4 大腸菌(E.coli)における、スタッケブランジチア・ナッソエンシス(Stackebrandtia nassauensis)由来のCE−7アセチルキシランエステラーゼのクローニングおよび産生 GENBANK(登録商標)(受託番号ADD42786.1;GI:290569821)に報告される、スタッケブランジチア・ナッソエンシス(Stackebrandtia nassauensis)由来のアセチルキシランエステラーゼ酵素をコードする遺伝子を、大腸菌(E.coli)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)における発現のために最適化されたコドンを使用して合成した。核酸生成物(配列番号9)を、PJEXPRESS404(登録商標)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)にサブクローニングして、pMP94として同定されるプラスミドを作製した。プラスミドpMP91を使用して大腸菌(E.coli)KLP18(米国特許第7,723,083号明細書に記載される)を形質転換して、KLP18/pMP94として同定される菌株を作製した。KLP18/pMP94を、LB培地中、37℃で振盪しながら、OD_600nm=0.4〜0.5になるまで増殖させ、その時点で、IPTGを最終濃度1mMになるように添加し、インキュベーションを2〜3時間継続した。細胞を

で15分間、遠心分離して回収した後、1.0mMジチオスレイトール添加の50mMリン酸カリウム緩衝液pH7.0に再懸濁した(20%w/v)。再懸濁した細胞を、フレンチプレスセルに2回通した。溶解した細胞を、

で30分間、遠心分離し、抽出物上清中の全可溶性タンパク質濃度をBCAアッセイキット(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)を使用して決定した。SDS−PAGEを使用してCE−7酵素(配列番号10)の発現を確認し、ImageJ(パブリックドメインのJava画像処理プログラム)を使用してゲルを解析することにより、ペルヒドロラーゼが全可溶性タンパク質の33%を構成することが示された。

実施例5 大腸菌(E.coli)における、ストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)由来のCE−7アセチルキシランエステラーゼのクローニングおよび産生 GENBANK(登録商標)(受託番号AAM98949.1;GI:22533045)に報告される、ストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)由来のアセチルキシランエステラーゼ酵素をコードする遺伝子を、大腸菌(E.coli)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)における発現のために最適化されたコドンを使用して合成した。核酸生成物(配列番号11)を、PJEXPRESS404(登録商標)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)にサブクローニングして、pMP95として同定されるプラスミドを作製した。プラスミドpMP95を使用して大腸菌(E.coli)KLP18(米国特許第7,723,083号明細書に記載される)を形質転換して、KLP18/pMP95として同定される菌株を作製した。KLP18/pMP95を、LB培地中、37℃で振盪しながら、OD_600nm=0.4〜0.5になるまで増殖させ、その時点で、IPTGを最終濃度1mMになるように添加し、インキュベーションを2〜3時間継続した。細胞を

で15分間、遠心分離して回収した後、1.0mMジチオスレイトール添加の50mMリン酸カリウム緩衝液pH7.0に再懸濁した(20%w/v)。再懸濁した細胞を、フレンチプレスセルに2回通した。溶解した細胞を、

で30分間、遠心分離し、抽出物上清中の全可溶性タンパク質濃度をBCAアッセイキット(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)を使用して決定した。SDS−PAGEを使用してCE−7酵素(配列番号12)の発現を確認し、ImageJ(パブリックドメインのJava画像処理プログラム)を使用してゲルを解析することにより、ペルヒドロラーゼが全可溶性タンパク質の7.3%を構成することが示された。

実施例6 ペルヒドロラーゼ活性のアッセイ 抽出物上清中のペルヒドロラーゼ活性は、22.5mMのトリアセチン、22.5mMの過酸化水素、および6.25μg/mLの抽出物上清全可溶性タンパク質を含有する反応物により決定した。外気温(22〜24℃)で10分間インキュベートした。反応を、100mMのオルト−フェニレンジアミンを含有する1.25Mのリン酸を等量加えることにより停止させた。30分後、458nmの吸光度を測定した(表1)。追加のペルヒドロラーゼ活性測定を、10mMのトリアセチンおよび10mMの過酸化水素、または50mMのトリアセチンおよび50mMの過酸化水素を含有する反応物中で行った(表1)。T.マリティマ(T.maritima)由来のCE−7アセチルキシランエステラーゼも大腸菌(E.coli)KLP18中で産生させ(米国特許出願公開第2008−0176299号明細書に記載される)、ペルヒドロラーゼアッセイに対する陽性対照として使用した。CE−7酵素を含有しない大腸菌(E.coli)KLP18抽出物を陰性対照として使用した。

実施例7 CE−7エステラーゼによる、トリアセチンおよび過酸化水素からの過酢酸の生成 反応(全容積10mL)は、トリアセチン(10mM)と、過酸化水素(20mM)と、実施例1〜5に記載するように調製された、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)(配列番号4)、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)(配列番号6)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)(配列番号8)、スタッケブランジチア・ナッソエンシス(Stackebrandtia nassauensis)(配列番号10)、またはストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)(配列番号12)に由来するCE−7エステラーゼを含有する、5.0μg/mLの抽出物上清全可溶性タンパク質とを含有するリン酸カリウム緩衝液(50mM、pH7.0)中、25℃で行った。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の45秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応は、大腸菌(E.coli)KLP18(CE−7エステラーゼを発現するために使用された)から単離された、5.0μg/mLの抽出物全可溶性タンパク質を使用して、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、抽出物上清は実施例1の手順に従って調製した。さらに、第2の比較対照反応は、抽出物上清全可溶性タンパク質を添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素によるトリアセチンの化学的過加水分解の結果であった。さらに、T.マリティマ(T.maritima)由来のCE−7アセチルキシランエステラーゼ(配列番号2)を、大腸菌(E.coli)KLP18(米国特許出願公開第2008−0176299号明細書に記載される)中に産生させ、比較反応における陽性対照として使用した(細胞抽出物上清中の全可溶性タンパク質の11%)。

過酢酸の生成についての反応試料の分析は、過酢酸によるABTS酸化の比色定量検出を使用して、Pinkernellら(Analyst,122:567(1997))に記載される方法に従って行った。反応試料50μLを5mMのH₃PO₄950μLに加え、酵素反応を停止し(最終pHはpH2〜3の間)、得られた溶液50μLを、0.25Mの酢酸、0.125g/LのABTS、および5.0mg/LのKIを含有する水溶液200μLを含有する、96ウェルマイクロタイタープレートウェルに加えた。この溶液を5分間、発色させた後、マイクロプレートリーダーを使用して、溶液の吸光度を405nmで測定した。各試料中の過酢酸濃度を、過酢酸試薬溶液を使用して同時に発色させて得られた標準曲線から算出した(表2)。

実施例8 CE−7エステラーゼによる、プロピレングリコールジアセテートおよび過酸化水素からの過酢酸の生成 反応(全容積10mL)は、プロピレングリコールジアセテート(10mM)と、過酸化水素(20mM)と、実施例1〜4に記載するように調製された、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)(配列番号4)、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)(配列番号6)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)(配列番号8)、またはスタッケブランジチア・ナッソエンシス(Stackebrandtia nassauensis)(配列番号10)に由来するCE−7エステラーゼを含有する、5.0μg/mLの抽出物上清全可溶性タンパク質とを含有するリン酸カリウム緩衝液(50mM、pH7.0)中、25℃で行った。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の45秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応は、大腸菌(E.coli)KLP18(CE−7エステラーゼを発現するために使用された)から単離された、5.0μg/mLの抽出物全可溶性タンパク質を使用して、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、抽出物上清は実施例1の手順に従って調製した。さらに、第2の比較対照反応は、抽出物上清全可溶性タンパク質を添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素によるプロピレングリコールジアセテートの化学的過加水分解の結果であった。さらに、T.マリティマ(T.maritima)由来のCE−7アセチルキシランエステラーゼ(配列番号2)を、大腸菌(E.coli)KLP18(米国特許出願公開第2008−0176299号明細書に記載される)中に産生させ、比較反応における陽性対照として使用した(細胞抽出物上清中の全可溶性タンパク質の11%)。過酢酸の生成についての反応試料の分析は、実施例7に記載される方法に従った(表3)。

実施例9 CE−7エステラーゼによる、α−D−グルコースペンタアセテートおよび過酸化水素か らの過酢酸の生成 反応(全容積10mL)は、α−D−グルコースペンタアセテート(10mM)と、過酸化水素(20mM)と、実施例1、3、および5に記載するように調製された、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)(配列番号4)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)(配列番号8)、またはストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)(配列番号12)に由来するCE−7エステラーゼを含有する、5.0μg/mLの抽出物上清全可溶性タンパク質とを含有するリン酸カリウム緩衝液(50mM、pH7.0)中、25℃で行った。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の45秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応は、大腸菌(E.coli)KLP18(CE−7エステラーゼを発現するために使用された)から単離された、5.0μg/mLの抽出物全可溶性タンパク質を使用して、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、抽出物上清は実施例1の手順に従って調製した。さらに、第2の比較対照反応は、抽出物上清全可溶性タンパク質を添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素によるα−D−グルコースペンタアセテートの化学的過加水分解の結果であった。さらに、T.マリティマ(T.maritima)由来のCE−7アセチルキシランエステラーゼ(配列番号2)を、大腸菌(E.coli)KLP18(米国特許出願公開第2008−0176299号明細書に記載される)中に産生させ、比較反応における陽性対照として使用した(細胞抽出物上清中の全可溶性タンパク質の11%)。過酢酸の生成についての反応試料の分析は、実施例7に記載される方法に従った(表4)。

実施例10 CE−7エステラーゼによる、D−ソルビトールヘキサアセテートおよび過酸化水素からの過酢酸の生成 反応(全容積10mL)は、D−ソルビトールヘキサアセテート(10mM)と、過酸化水素(20mM)と、実施例1および3に記載するように調製された、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)(配列番号4)またはストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)(配列番号8)に由来するCE−7エステラーゼを含有する、5.0μg/mLの抽出物上清全可溶性タンパク質とを含有するリン酸カリウム緩衝液(50mM、pH7.0)中、25℃で行った。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の45秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応は、大腸菌(E.coli)KLP18(CE−7エステラーゼを発現するために使用された)から単離された、5.0μg/mLの抽出物全可溶性タンパク質を使用して、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、抽出物上清は実施例1の手順に従って調製した。さらに、第2の比較対照反応は、抽出物上清全可溶性タンパク質を添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素によるD−ソルビトールヘキサアセテートの化学的過加水分解の結果であった。さらに、T.マリティマ(T.maritima)由来のCE−7アセチルキシランエステラーゼ(配列番号2)を、大腸菌(E.coli)KLP18(米国特許出願公開第2008−0176299号明細書に記載される)中に産生させ、比較反応における陽性対照として使用した(細胞抽出物上清中の全可溶性タンパク質の11%)。過酢酸の生成についての反応試料の分析は、実施例7に記載される方法に従った(表5)。

実施例11 CE−7エステラーゼによる、トリ−O−アセチル−D−グルカールおよび過酸化水素からの過酢酸の生成 反応(全容積50mL)は、トリ−O−アセチル−D−グルカール(2mM)と、過酸化水素(10mM)と、実施例1および3に記載するように調製された、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)(配列番号4)またはストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)(配列番号8)に由来するCE−7エステラーゼを含有する、5.0μg/mLの抽出物上清全可溶性タンパク質とを含有するリン酸カリウム緩衝液(10mM、pH7.0)中、25℃で行った。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の45秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応は、大腸菌(E.coli)KLP18(CE−7エステラーゼを発現するために使用された)から単離された、5.0μg/mLの抽出物全可溶性タンパク質を使用して、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、抽出物上清は実施例1の手順に従って調製した。さらに、第2の比較対照反応は、抽出物上清全可溶性タンパク質を添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素によるトリ−O−アセチル−D−グルカールの化学的過加水分解の結果であった。さらに、T.マリティマ(T.maritima)由来のCE−7アセチルキシランエステラーゼ(配列番号2)を、大腸菌(E.coli)KLP18(米国特許出願公開第2008−0176299号明細書に記載される)中に産生させ、比較反応における陽性対照として使用した(細胞抽出物上清中の全可溶性タンパク質の11%)。過酢酸の生成についての反応試料の分析は、実施例7に記載される方法に従った(表6)。

実施例12 CE−7エステラーゼによる、4−(アセチルオキシ)−安息香酸および過酸化水素からの過酢酸の生成 反応(全容積10mL)は、4−(アセチルオキシ)−安息香酸(CAS 2345−34−8;25mM)と、過酸化水素(20mM)と、実施例1〜4に記載するように調製された、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)(配列番号4)、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)(配列番号6)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)(配列番号8)、またはスタッケブランジチア・ナッソエンシス(Stackebrandtia nassauensis)(配列番号10)に由来するCE−7エステラーゼを含有する、5.0μg/mLの抽出物上清全可溶性タンパク質とを含有するリン酸カリウム緩衝液(50mM、pH7.0)中、20℃で行った。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の45秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応は、大腸菌(E.coli)KLP18(CE−7エステラーゼを発現するために使用された)から単離された、5.0μg/mLの加熱処理された抽出物全可溶性タンパク質を使用して、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、抽出物上清は実施例1の手順に従って調製した。さらに、第2の比較対照反応は、抽出物上清全可溶性タンパク質を添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素による4−(アセチルオキシ)−安息香酸の化学的過加水分解の結果であった。さらに、T.マリティマ(T.maritima)由来のCE−7アセチルキシランエステラーゼ(配列番号2)を、大腸菌(E.coli)KLP18(米国特許出願公開第2008−0176299号明細書に記載される)中に産生させ、比較反応における陽性対照として使用した(細胞抽出物上清中の全可溶性タンパク質の11%)。過酢酸の生成についての反応試料の分析は、実施例7に記載される方法に従った(表7)。

実施例13 アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)アセチルキシランエステラーゼ変異体のクローニングおよび産生 GENBANK(登録商標)(受託番号ACU35776.1;GI:255920265)に報告される、A.ミルム(A.mirum))由来のアセチルキシランエステラーゼ酵素の変異体をコードする遺伝子を、大腸菌(E.coli)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)における発現のために最適化されたコドンを使用して合成した。核酸生成物(配列番号13)を、PJEXPRESS404(登録商標)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)にサブクローニングして、pMP91aとして同定されるプラスミドを作製した。コードされた変異体タンパク質は、Ami_C276S(配列番号14)と呼ばれる。プラスミドpMP91aを使用して大腸菌(E.coli)KLP18(米国特許第7,723,083号明細書に記載される)を形質転換して、KLP18/pMP91aとして同定される菌株を作製した。KLP18/pMP91aを、LB培地中、37℃で振盪しながら、OD_600nm=0.4〜0.5になるまで増殖させ、その時点で、IPTGを最終濃度1mMになるように添加し、インキュベーションを2〜3時間継続した。細胞を

で15分間、遠心分離して回収した後、1.0mMジチオスレイトール添加の50mMリン酸カリウム緩衝液pH7.0に再懸濁した(20%w/v)。再懸濁した細胞を、フレンチプレスセルに2回通した。溶解した細胞を、

で30分間、遠心分離し、上清中のタンパク質濃度をBCAアッセイキット(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)を使用して決定した。SDS−PAGEを使用して酵素の発現を確認し、デンシトメトリー(ImageJソフトウェア、National Institutes of Health,Bethesda,MD)を使用して酵素タンパク質を全タンパク質の約16〜18%と算出した。

実施例14 アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)アセチルキシランエステラーゼ変異体のクローニングおよび産生 GENBANK(登録商標)(受託番号ACU35776.1;GI:255920265)に報告される、A.ミルム(A.mirum)由来のアセチルキシランエステラーゼ酵素の変異体をコードする遺伝子を、大腸菌(E.coli)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)における発現のために最適化されたコドンを使用して合成した。核酸生成物(配列番号15)を、PJEXPRESS404(登録商標)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)にサブクローニングして、pMP91bとして同定されるプラスミドを作製した。コードされた変異体タンパク質は、Ami_C276T(配列番号16)と呼ばれる。プラスミドpMP91bを使用して大腸菌(E.coli)KLP18(米国特許第7,723,083号明細書に記載される)を形質転換して、KLP18/pMP91bとして同定される菌株を作製した。KLP18/pMP91bを、LB培地中、37℃で振盪しながら、OD_600nm=0.4〜0.5になるまで増殖させ、その時点で、IPTGを最終濃度1mMになるように添加し、インキュベーションを2〜3時間継続した。細胞を

で15分間、遠心分離して回収した後、1.0mMジチオスレイトール添加の50mMリン酸カリウム緩衝液pH7.0に再懸濁した(20%w/v)。再懸濁した細胞を、フレンチプレスセルに2回通した。溶解した細胞を、

で30分間、遠心分離し、上清中のタンパク質濃度をBCAアッセイキット(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)を使用して決定した。SDS−PAGEを使用して酵素の発現を確認し、デンシトメトリー(ImageJソフトウェア、National Institutes of Health,Bethesda,MD)を使用して酵素タンパク質を全タンパク質の約16〜18%と算出した。

実施例15 ペルヒドロラーゼ活性のアッセイ 抽出物中のペルヒドロラーゼ活性は、22.5mMのトリアセチン、22.5mMの過酸化水素、および1.5μg/mLの全タンパク質を含有する反応物により決定した。外気温(22〜24℃)で10分間インキュベートした。反応を、100mMのオルト−フェニレンジアミンを含有する1.25Mのリン酸を等量加えることにより停止させた。30分後、458nmの吸光度を測定した(表8)。アセチルキシランエステラーゼ酵素を含有しない大腸菌(E.coli)KLP18抽出物を陰性対照として使用した。

実施例16 CE−7エステラーゼ変異体による、トリアセチンおよび過酸化水素からの過酢酸の生成 反応(10mL全容積)は、トリアセチン(0.75mM)と、過酸化水素(1.4mM)と、野生型アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)(配列番号4、実施例1に記載されるように調製された)、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)C276S変異体(配列番号14、実施例13に記載されるように調製された)、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)C276T変異体(配列番号16、実施例14に記載されるように調製された)、T.マリティマ(T.maritima)C277S(配列番号17、米国特許第8,062,875号明細書に記載される大腸菌(E.coli)KLP18中で産生された)、およびT.マリティマ(T.maritima)C277T(配列番号18、米国特許第8,062,875号明細書に記載される大腸菌(E.coli)KLP18中で産生された)に由来する、1.0μg/mLまたは2.0μg/mLのいずれかのCE−7エステラーゼとを含有するリン酸カリウム緩衝液(20mM、pH7.0)中、25℃で行った。ImageJ(パブリックドメインのJava画像処理プログラム)を使用するゲル分析と組み合わせてSDS−PAGEゲルによるCE−7エステラーゼ含有細胞抽出物の分析を使用して、全可溶性タンパク質のパーセントとして細胞抽出物中のCE−7エステラーゼ濃度を算出した。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の45秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応を、CE−7エステラーゼを添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素によるトリアセチンの化学的過加水分解の結果であった。過酢酸の生成についての反応試料の分析は、実施例7に記載される方法に従った(表9)。

実施例17 CE−7エステラーゼ変異体による、トリアセチンおよび過酸化水素からの過酢酸の生成 反応(10mL全容積)は、トリアセチン(10mM)と、過酸化水素(20mM)と、野生型アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)(配列番号4、実施例1に記載されるように調製された)、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)C276S変異体(配列番号14、実施例13に記載されるように調製された)、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)C276T変異体(配列番号16、実施例14に記載されるように調製された)、T.マリティマ(T.maritima)C277S(配列番号17)、およびT.マリティマ(T.maritima)C277T(配列番号18)に由来する、0.5μg/mLのCE−7エステラーゼとを含有するリン酸カリウム緩衝液(50mM、pH7.0)中、25℃で行った。ImageJ(パブリックドメインのJava画像処理プログラム)を使用するゲル分析と組み合わせてSDS−PAGEゲルによるCE−7エステラーゼ含有細胞抽出物の分析を使用して、全可溶性タンパク質のパーセントとして細胞抽出物中のCE−7エステラーゼ濃度を算出した。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の45秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応を、CE−7エステラーゼを添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素によるトリアセチンの化学的過加水分解の結果であった。過酢酸の生成についての反応試料の分析は、実施例7に記載される方法に従った(表10)。

実施例18 CE−7エステラーゼ変異体による、トリアセチンおよび過酸化水素からの過酢酸の生成 反応(10mL全容積)は、トリアセチン(0.75mM)と、過酸化水素(1.4mM、過炭酸ナトリウム由来)と、野生型アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)(配列番号4、実施例1に記載されるように調製された)、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)C276S変異体(配列番号14、実施例13に記載されるように調製された)、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)C276T変異体(配列番号16、実施例14に記載されるように調製された)、T.マリティマ(T.maritima)C277S(配列番号17)、およびT.マリティマ(T.maritima)C277T(配列番号18)に由来する、1.0μg/mLまたは2.0μg/mLのいずれかのCE−7エステラーゼとを含有する炭酸ナトリウム緩衝液(20mM、pH10.5)中、25℃で行った。ImageJ(パブリックドメインのJava画像処理プログラム)を使用するゲル分析と組み合わせてSDS−PAGEゲルによるCE−7エステラーゼ含有細胞抽出物の分析を使用して、全可溶性タンパク質のパーセントとして細胞抽出物中のCE−7エステラーゼ濃度を算出した。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の45秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応を、CE−7エステラーゼを添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素によるトリアセチンの化学的過加水分解の結果であった。過酢酸の生成についての反応試料の分析は、実施例7に記載される方法に従った(表11)。