技术领域
[0001] 本
发明涉及一种利用嗜胺甲基杆菌(Methylobacteriumaminovorans)，以甲醇为唯一碳源和能源产聚羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate，简称PHB)的方法及该菌的培养过程。
背景技术
[0002] 聚羟基
脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，缩写为PHAs)是
微生物合成的一类聚酯(PHB是PHA的一种)，由于其具有优良性质，如
生物可降解性、
生物相容性和光学性能等，有很广泛的用途。生物可降解性和热加工性使得其可制作塑料袋，农用
地膜及农用
除草剂、
杀虫剂、
肥料的载体，提高它们的利用效率而不会产生环境污染。生物相容性使得其可用作医用植入材料，药物载体，可调节药物的释放速率。
手性药物：其手性
单体(R型)可以作为手性药物或者手性药物合成的中间体。良好的气体相隔性使得其可用作食品等的
包装材料。此外PHA还可用于生产生物能源，具有可燃性，经甲酯化处理以后，可直接作为
生物燃料，只比柴油的
燃烧热低15％左右。由于其具有这些优良特性，所以现已吸引了科技界和工业界的广泛兴趣。
[0003] 目前主要利用微生物合成PHB，主要碳源为
葡萄糖，成本较高，用其制造塑料无法与化石塑料竞争，采用便宜的原料是一种减少成本的很好策略。
发明内容
[0004] 本发明的目的是要利用一株菌，以甲醇为原料产聚羟基丁酸酯(PHB)。在该菌的揺瓶阶段，利用连续补加甲醇的方式消耗掉培养液里面的镁离子，磷元素，氮元素，近似的创造出合成PHB的条件，而不再是通过换培养液的方法。由于在
发酵罐中很难换培养液，这样更有利于摸索出适合发酵的条件。
[0005] 本发明提供的生产聚羟基丁酸酯的方法以甲醇为原料，利用微生物发酵生产聚羟基丁酸酯。具体过程为：
[0006] (1)
土壤样品用
水稀释，取上清加入液体培养基中振荡培养。将培养液用灭菌水5-20倍进行梯度稀释，再取稀释液涂布于固态富集培养基平板上，25-40℃培养；所用液体培养基组分为：蛋白胨5-20g/L，
牛肉浸膏2-5g/L，NaCl3-10g/L；所用固体培养基组分为：
蛋白胨5-20g/L，牛肉浸膏2-5g/L，NaCl3-10g/L，15-25g/L琼脂；培养基pH值6.6-7.5。灭菌后加入体积分数0.3-0.7％的甲醇。；
[0007] (2)用接种环挑不同
颜色、形态的单菌落到新的固体培养基上面划线、培养；重复本步骤上述操作3-5次；
[0008] (3)将分离得到的菌株分别接种至选性择培养液中，于120-240rpm的摇床中培养，将能够生长的菌接到新的选择性培养液里面，每天测菌液在600nm下的吸光度值并加入培养液体积0.5％-1％的体积分数为40-80％的甲醇水溶液，以补充甲醇；所用选择性培养液的组分为：MgSO4·7H2O0.1-0.3g/L，(NH4)2HPO41.5-4.5g/L，NaCl0.8-2.0g/L，K2HPO41.0-3.0g/L，FeSO4·7H2O5.0-20.0mg/L，MnSO4·H2O2.0-5.0mg/L，CaCl2·2H2O2.0-5.0mg/L，ZnSO4·7H2O80.0-200.0ug/L，Na2MoO4·2H2O20.0-60.0ug/L，CuSO4·5H2O20.0-60.0ug/L，CoCl2·6H2O20.0-60.0ug/L，H3BO320.0-60.0ug/L，硫胺素5.0-20.0ug/L，核黄素10.0-30.0ug/L，
盐酸吡哆醇10.0-30.0ug/L，生物素0.5-2.0ug/L，对
氨基苯
甲酸5.0-20.0ug/L，烟酸10.0-30.0ug/L，调pH值为6.0-8.0，灭菌后加入体积分数0.3-1.0％的甲醇作为碳源。
[0009] (4)当菌液的吸光度值达到最大值后再培养48小时，离心菌液，取沉淀
真空冷冻干燥18-30小时得到干菌体。
[0010] 检测方法为：取干菌体到玻璃反应管中，每个菌取3个做平行，加入以干菌体计0.1mL/mg的氯仿，加入以干菌体计0.1mL/mg的含体积分数1-20％的
硫酸的甲醇溶液，在
100℃下反应1-4小时，冷却0加入去离子水，摇匀，静置使其分层，取层重相注入气相色谱柱，检测PHB。
[0011] 所述甲醇为唯一碳源和能源。
[0012] 所述的微生物为嗜胺甲基杆菌。
[0013] 所述取上清加入液体培养基中振荡培养，培养
温度是28—32℃，培养液pH值为6.8—7.2。
[0014] 本发明以甲醇为原料产聚羟基丁酸酯细菌通过选择性培养液筛选得到，其筛选方法包括步骤如下：
[0015] 1、土壤样品用水稀释，摇匀后静置分层。
[0016] 2、取1mL上清加入盛有50mL液体富集培养液的250mL锥形瓶中，30℃振荡培养3天。
[0017] 3、将培养液用灭菌水10倍进行梯度稀释,即稀释10、100、1000、10000、100000倍再取200ul稀释液涂布于5个固态富集培养基平板上，用
封口膜将口封上，并用牙签在边缘上扎几个小孔，放到28℃
培养箱里面培养24～36h。
[0018] 4、等菌长起来以后，用接种环挑不同颜色、形态的单菌落到新的平板上面划线。划线结束后用封口膜将口封上，并用牙签在边缘上扎几个小孔，放到28℃培养箱里面培养
24～36h。
[0019] 5、重复划线、培养5次。
[0020] 6、将分离得到的菌株分别接种至盛有50mL选择培养液的250mL锥形瓶中,如果菌能够生长起来，表明该菌可以利用甲醇为唯一碳源和能源。
[0021] 7、将能够生长的菌接到新的选择性培养液里面，每天测菌液在600nm下的吸光度值并加入800ul50％的甲醇水溶液，以补充甲醇。
[0022] 8、当菌液的吸光度值达到最大值后再培养48小时，离心菌液，真空冷冻干燥24小时。
[0023] 9、取10mg干菌体到玻璃反应管中，每个菌取3个做平行(同时也取10㎎PHB标准品)，加入1mL氯仿，1mL含3％硫酸的甲醇溶液，在100℃下反应1小时，冷却，加入1mL去离子水，摇匀，静置使其分层，取下层重相注入气相色谱柱，检测PHB。
[0024] 上述步骤中液体培养液培养条件都是30℃，摇床转速为170rpm。
[0025] 本发明具有的优点：该菌能以便宜的甲醇为原料合成聚羟基丁酸酯，可降低成本。
附图说明
[0026] 图1为基于16s基因序列以Neighbor-Joining法构建的系统发育树。
[0027] 图2为气相测定的PHB标准品气相色谱图，经试验确定保留时间为6.74min左右时为目标峰。
[0028] 图3为嗜胺甲基杆菌所产生样品的PHB测定的气相色谱图，在6.74min左右的保留时间处有明显的峰图，故可以确定为目标产物。
[0029] SEQ ID NO.1。
[0030] TGCAGTCGAGCGGGCACCTTCGGGTGTCAGCGGCAGACGGGTGAGTAACACGTGGGAACGTGCCCTTCGGTTCGGAATAACTCAGGGAAACTTGAGCTAATACCGGATACGCCCTTTTGGGGAAAGGTTTACTGCCGAAGGATCGGCCCGCGTCTGATTAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTGTCCGGGACGATAATGACGGTACCGGAAGAATAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATCACTGGGCGTAAAGGGCGCGTAGGCGGCCGATTAAGTCGGGGGTGAAAGCCTGTGGCTCAACCACAGAATTGCCTTCGATACTGGTTGGCTTGAGACCGGAAGAGGACAGCGGAACTGCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGCAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCCGGTTCTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGCCGTTGGTCTGCTTGCAGGTCAGTGGCGCCGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCATCCCTTGACATGGCATGTTACCTCGAGAGATCGGGGATCCTCTTCGGAGGCGTGCACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCACGTCCTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGGGAGACTGCCGGTGATAAGCCGCGAGGAAGGTGTGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGATGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAGTGGGACGCGAAACCGCGAGGTTGAGCAAATCCCCAAAAGCCGTCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGGGTGCATGAAGGCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCACGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTCTTACCCGACGGCGCTGCGCCAACCGCAA
具体实施方式
[0031] 下面结合
实施例对本发明做进一步的阐述，但不是对本发明内容的限定。
[0032] 以下实施例中富集培养基配方均为为：蛋白胨10g/L，牛肉浸膏3g/L，NaCl5g/L，(固体培养基还加入20g/L琼脂)，用玻璃杯搅拌均匀，调pH值＝7.0。灭菌后加入0.5％的甲醇。
[0033] 选择培养液配方均为：MgSO4·7H2O0.2g/L，(NH4)2HPO43.0g/L，NaCl1.0g/L，K2HPO42.0g/L，FeSO4·7H2O10mg/L，MnSO4·H2O3.5mg/L，CaCl2·2H2O3.3mg/L，ZnSO4·7H2O130ug/L，Na2MoO4·2H2O40ug/L，CuSO4·5H2O40ug/L，CoCl2·6H2O40ug/L，H3BO330ug/L，硫胺素10ug/L，核黄素20ug/L，盐酸吡哆醇20ug/L，生物素1ug/L，对氨基
苯甲酸10ug/L，烟酸20ug/L，调pH值为7.0，灭菌后加入体积分数为0.5％的甲醇作为碳源。
[0034] 实施例1：甲醇利用菌的筛选
[0035] 本发明以甲醇为原料进行合成聚羟基丁酸酯细菌的筛选，包括如下步骤：
[0036] (1)采集土壤样品：
[0037]
采样区域：①北方(大连)、②南方(四川)
[0038] 土壤类型：大连广鹿岛海边沙滩上选取4个不同的
位置取样；在
沼气池和
废水沟选取4个位置点取样。
[0039] (2)样品预处理：
[0040] 分别取不同的土壤样品各5g分别装入已灭菌并盛有40mL无菌水的离心管中，密封后剧烈震荡5分钟，静置分层。
[0041] (3)扩大培养
[0042] 待分层后分别取上清1mL分别接入100mL液体富集培养液中，，培养条件是30℃，摇床转速为170rpm，培养72小时。
[0043] (4)分别将培养液按照10倍的梯度用灭菌水进行稀释,即稀释10、100、1000、10000、100000倍，再分别取200uL稀释液涂布于5个固态富集培养基平板上，用封口膜将口封上，并用牙签在边缘上扎几个小孔，放到28℃培养箱里面培养24h。
[0044] (5)、等菌长起来以后，用接种环挑不同颜色、形态的单菌落分别到新的固态富集培养基平板上上面划线。划线结束后用封口膜将口封上，并用牙签在边缘上扎几个小孔，放到28℃培养箱里面培养24h。
[0045] (6)、菌长起来以后再挑单菌落划线，重复5次，以获得纯的菌并确定菌可以稳定地遗传。
[0046] (7)、挑分离得到的菌株分别接种至盛有50mL选择培养液的250mL锥形瓶中,如果菌能够生长起来，表明该菌可以利用甲醇为唯一碳源和能源。
[0047] (8)、将能够生长的菌按照1％的接种量接到新的选择性培养液里面，测菌液在600nm下的吸光度值，并每隔24小时加入800ul50％的甲醇水溶液，以补充甲醇。
[0048] (9)、当菌液的吸光度值达到最大值(吸光度值不再增长)后48小时，离心菌液，真空冷冻干燥24小时，保存备用。
[0049] 实施例2：菌体中PHB的检测
[0050] (1)、取实施例1制备的干菌体10mg到玻璃反应管中，另外取10㎎PHB标准品到另一支玻璃反应管作为参照，每管加入1mL氯仿和1mL含3％硫酸的甲醇溶液，在100℃下反应1小时，冷却，分别加入1mL去离子水，摇匀，静置使其分层，取下层重相注入气相色谱柱，检测PHB。
[0051] (2)、根据标准品的峰图可以看出PHB的保留时间在6.76min，样品的气
相图和标准图进行对比即可确定存在PHB。
[0052] 实施例3：菌种的鉴定
[0053] (1)、将实施例2检测PHB产物的一株菌在固态富集培养基平板上划线，长出单菌落以后挑单菌落接到液体富集培养液里面。
[0054] (2)、待菌
密度的OD600值达到0.7的时候，收集2ml菌液提基因组，提取过程参照Thermor公司的GeneJET Genomic DNA Purification Kit#0721for 50preps的
试剂盒的说明。
[0055] (3)、以提出的基因组为模板，利用16s序列的通用引物R27(引物序列为：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R(引物序列为：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’所用反应体系为：10倍PCR缓冲液10uL，dNTPs8uL，F27引物0.5uL，1492R引物0.5uL，DNA模板1uL，rTaq酶1uL，灭菌ddH2O79uL。所用PCR程序为：94℃5min；94℃30S；55℃30S；
72℃2min；共30个循环，最后72℃5min。扩增出16s序列，送华大基因测序。
[0056] (4)、测出的序列提交到到http://www.ezbiocloud.net/eztaxon进行对比，下载模式菌株，利用MEGA6
软件构建系统发育树，结果见图1，可以看出筛选出的菌与Methylobacteriumaminovorans最接近，基本可以确定筛选出的菌就是该菌。
[0057] (5)该菌的16S rRNA基因部分序列(1340bp)见SEQ ID NO.1。
[0058] 实施例4：将实施例1中的培养温度变为35℃，其它条件不变时，测得的PHB含量为0.479g/L，为菌体干重的16.87％。
[0059] 实施例5：将实施例1中摇床的转速变为150rpm，其它条件不变时，测得的PHB含量为0.577g/L，为菌体干重的18.81％。
