包含TLR4激动剂的改进佐剂制剂及其使用方法
阅读：2发布：2020-06-24
专利汇可以提供包含TLR4激动剂的改进佐剂制剂及其使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了用于诱导或增强免疫应答的制剂和方法，包括 疫苗 和药学组合物。所述制剂通常包含TLR4激动剂和浓度为约0.01％-1％v/v的可代谢油，其中所述乳剂的疏 水 :亲水平衡(HLB)大于约9。，下面是包含TLR4激动剂的改进佐剂制剂及其使用方法专利的具体信息内容。
1.水包油乳剂，其包含TLR4激动剂和可代谢油，其中所述可代谢油以0.01％-1％v/v的浓度存在于所述水包油乳剂中，并且其中所述水包油乳剂的疏水:亲水平衡(HLB)大于9。
2.如权利要求1所述的水包油乳剂，其中所述可代谢油以0.01％-0.5％v/v的浓度存在于所述水包油乳剂中。
3.如权利要求1所述的水包油乳剂，其中所述乳剂还包含1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)。
4.如权利要求3所述的水包油乳剂，其中所述乳剂不包含抗氧化剂。
5.如权利要求1所述的水包油乳剂，其中所述乳剂的HLB大于10。
6.如权利要求1所述的水包油乳剂，其中所述乳剂的HLB为9-12。
7.如权利要求1所述的水包油乳剂，其中所述TLR4激动剂包括MPL、3D-MPL或合成GLA佐剂。
8.如权利要求7所述的水包油乳剂，其中所述合成GLA佐剂具有以下结构：
其中：R1、R3、R5和R6为C11-C20烷基；并且R2和R4为C12-C20烷基。
9.如权利要求8所述的水包油乳剂，其中R1、R3、R5和R6为C11烷基；并且R2和R4为C13烷基。
10.如权利要求7所述的水包油乳剂，其中所述合成GLA佐剂具有以下结构：
其中R1、R3、R5和R6为C10烷基；并且R2和R4为C8烷基。
11.如权利要求1所述的水包油乳剂，其中所述乳剂还包含表面活性剂。
12.如权利要求11所述的水包油乳剂，其中所述表面活性剂为普朗尼克F68。
13.如权利要求1所述的水包油乳剂，其中所述可代谢油为角鲨烯。
14.如权利要求1所述的水包油乳剂，其中所述乳剂还包含抗氧化剂。
15.如权利要求14所述的水包油乳剂，其中所述抗氧化剂为维生素E。
16.如权利要求1所述的水包油乳剂，其中所述乳剂还包含至少一种抗原。
17.水包油乳剂，其包含合成GLA佐剂、浓度为0.01％-1％v/v的可代谢油和浓度为
0.002％-2％DMPC的DMPC，其中所述乳剂的HLB大于10。
18.如权利要求17所述的水包油乳剂，其中所述合成GLA佐剂具有以下结构：
其中：R1、R3、R5和R6为C11-C20烷基；并且R2和R4为C12-C20烷基。
19.如权利要求18所述的水包油乳剂，其中R1、R3、R5和R6为C11烷基；并且R2和R4为C13烷基。
20.如权利要求17所述的水包油乳剂，其中所述合成GLA佐剂具有以下结构或其药学可接受的盐：
其中：
L1、L2、L3、L4、L5和L6相同或不同，并独立地为-O-、-NH-或-(CH2)-；
L7、L8、L9和L10相同或不同，并独立地为不存在或为-C(＝O)-；
Y1是酸官能团；
Y2和Y3相同或不同，并独立地为-OH、-SH或酸官能团；
Y4为-OH或-SH；
R1、R3、R5和R6相同或不同，并独立地为C8-13烷基；以及
R2和R4相同或不同，并独立地为C6-11烷基。
21.如权利要求20所述的水包油乳剂，其中R1、R3、R5和R6为C10烷基；并且R2和R4为C8烷基。
22.权利要求1至21中任一项所述的水包油乳剂在制备用于刺激个体的免疫应答的药物中的用途。
23.如权利要求22所述的用途，其中所述免疫应答为非特异性免疫应答。
24.如权利要求22所述的用途，其中所述免疫应答为抗原特异性免疫应答。
25.如权利要求22所述的用途，其中真皮内给予所述水包油乳剂。
26.如权利要求7所述的水包油乳剂，其中所述合成GLA佐剂具有以下结构或其药学上可接受的盐：
其中：R1、R3、R5和R6为C11-C20烷基；并且R2和R4为C9-C20烷基。
27.如权利要求7所述的水包油乳剂，其中所述合成GLA佐剂具有以下结构或其药学上可接受的盐：
其中：R1、R3、R5和R6为C11-C20烷基；并且R2和R4为C9-C20烷基。
28.如权利要求7所述的水包油乳剂，其中所述合成GLA佐剂具有以下结构或其药学上可接受的盐：
29.如权利要求17所述的水包油乳剂，其中所述合成GLA佐剂具有以下结构或其药学上可接受的盐：
其中：R1、R3、R5和R6为C11-C20烷基；并且R2和R4为C9-C20烷基。
30.如权利要求17所述的水包油乳剂，其中所述合成GLA佐剂具有以下结构或其药学上可接受的盐：
其中：R1、R3、R5和R6为C11-C20烷基；并且R2和R4为C9-C20烷基。
31.如权利要求17所述的水包油乳剂，其中所述合成GLA佐剂具有以下结构或其药学上可接受的盐：
包含TLR4激动剂的改进佐剂制剂及其使用方法
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求于2012年2月7日提交的第61/596,066号美国临时申 请的优先权，该临时申请的内容以引用方式全部并入本文。
[0004] 发明背景发明领域
[0005] 本发明涉及药物和疫苗制剂领域。更具体地，本文描述的实施方 案涉及药物和疫苗制剂，特别是水包油乳剂，其中所述组合物包含诸 如吡喃葡萄糖脂佐剂(glucopyranosyl lipid adjuvant，GLA)的TLR4激 动剂。
[0006] 相关技术描述
[0007] 高级生物体的免疫系统特征在于为区分外源物(或“非己”物)与亲 近的或“自身”组分，这使得外源物诱发免疫应答而“自身”组分被忽略 或耐受。免疫应答传统上被表征为体液应答或细胞介导的应答，其中 在体液应答中由称为浆细胞的分化的B淋巴细胞产生抗原特异性抗 体，在细胞介导的应答中不同类型的T淋巴细胞通过多种机制作用于 清除抗原。例如，能识别特异性抗原的CD4+辅助T细胞可以通过释 放诸如细胞因子的可溶性介质来募集免疫系统的其他细胞从而作出应 答以参与免疫应答。同样，也能识别特异性抗原的CD8+细胞毒性T 细胞可以通过结合到携带抗原的细胞或颗粒并破坏或损伤所述细胞或 颗粒来作出应答。通常为诱导宿主所需的免疫应答，提供根据多种不 同制剂的某些疫苗，这在免疫学领域是已知的。
[0008] 例如，已经描述了用于配制佐剂组合物的某些乳剂系统，包括单 相或多相乳剂系统。已建议水包油乳剂佐剂自身可用作佐剂组合物(EP 0399843 B)，水包油乳剂和其他活性剂的组合也已经被描述为用于疫 苗的佐剂(WO 95/17210；WO 98/56414；WO 99/12565；WO 99/11241)。 已描述了其他油乳剂佐剂，诸如油包水乳剂(美国专利第5,422,109号； EP
0480982 B2)和水包油包水乳剂(美国专利第5.424,067号；EP 0480981 B)。
0480982 B2)和水包油包水乳剂(美国专利第5.424,067号；EP 0480981 B)。
[0009] 尽管这些已知方法用于生产乳剂系统以制备佐剂组合物，但当前 的乳剂佐剂组合物仍存在诸多缺点。因此，需要其他改进的乳剂佐剂 组合物，例如包含TLR4激动剂的水包油乳剂制剂。如本文所述，本 发明满足这些需求并提供了其他相关优点。
[0010] 发明简述
[0011] 根据一方面，本发明提供了包含TLR4激动剂和可代谢油的水包 油乳剂，其中所述可代谢油以约0.01％-1％v/v或优选约0.01％-0.5％ v/v的浓度存在于所述水包油乳剂中，其中所述水包油乳剂的疏水:亲 水平衡(HLB)大于约9、或大于约10、或为约9-12。
[0012] 本文还提供了包含TLR4激动剂、可代谢油和表面活性剂的水包 油乳剂，其中所述可代谢油以约0.01％-1％v/v或优选约0.01％-0.5％ v/v的浓度存在于所述水包油乳剂中。在一些实施方案中，可代谢油浓 度低于1％v/v。在一些实施方案中，水包油乳剂的疏水:亲水平衡(HLB) 大于约9、或大于约10、或为约9-12。
[0013] 用于本发明水包油乳剂的TLR4激动剂可以选自本领域已知且可 得的TLR4激动剂。在某些具体实施方案中，TLR4激动剂选自MPL、 3D-MPL或合成GLA佐剂。
[0014] 在一些实施方案中，合成GLA佐剂具有以下结构或其药学可接受 的盐：
[0015]
[0016] 其中：
[0017] L1、L2、L3、L4、L5和L6相同或不同，并独立地为-O-、-NH-或-(CH2)-；
[0018] L7、L8、L9和L10相同或不同，并独立地为不存在或为-C(＝O)-；
[0019] Y1是酸官能团；
[0020] Y2和Y3相同或不同，并独立地为-OH、-SH或酸官能团；
[0021] Y4为-OH或-SH；
[0022] R1、R3、R5和R6相同或不同，并独立地为C8-13烷基；以及
[0023] R2和R4相同或不同，并独立地为C6-11烷基。
[0024] 在合成GLA结构的一些实施方案中，R1、R3、R5和R6为C10烷 基；并且R2和R4为C8烷基。
[0025] 例如，在更具体的实施方案中，水包油乳剂包含具有以下结构的 合成GLA佐剂：
[0026]
[0027] 在上述GLA结构的某些实施方案中，R1、R3、R5和R6为C11-C20烷基；并且R2和R4为C12-C20烷基。在更具体的实施方案中，R1、R3、 R5和R6为C11烷基；并且R2和R4为C13烷基。在另一更具体的实施 方案中，R1、R3、R5和R6为C10烷基；并且R2和R4为C8烷基。
[0028] 在上述GLA结构的某些实施方案中，R1、R3、R5和R6为C11-C20烷基；并且R2和R4为C9-C20烷基。在某些实施方案中，R1、R3、R5和R6为C11烷基；并且R2和R4为C9烷基。
[0029] 在某些实施方案中，水包油乳剂包含具有以下结构的合成GLA佐 剂：
[0030]
[0031] 在上述GLA结构的某些实施方案中，R1、R3、R5和R6为C11-C20烷基；并且R2和R4为C9-C20烷基。在某些实施方案中，R1、R3、R5和R6为C11烷基；并且R2和R4为C9烷基。
[0032] 在某些实施方案中，水包油乳剂包含具有以下结构的合成GLA佐 剂：
[0033]
[0034] 在上述GLA结构的某些实施方案中，R1、R3、R5和R6为C11-C20烷基；并且R2和R4为C9-C20烷基。在某些实施方案中，R1、R3、R5和R6为C11烷基；并且R2和R4为C9烷基。
[0035] 在某些实施方案中，水包油乳剂包含具有以下结构的合成GLA佐 剂：
[0036]
[0037] 在上述GLA结构的某些实施方案中，R1、R3、R5和R6为C11-C20烷基；并且R2和R4为C9-C20烷基。在某些实施方案中，R1、R3、R5和R6为C11烷基；并且R2和R4为C9烷基。
[0038] 在某些实施方案中，水包油乳剂包含具有以下结构的合成GLA佐 剂：
[0039]
[0040] 在某些实施方案中，水包油乳剂包含具有以下结构的合成GLA佐 剂：
[0041]
[0042] 在某些实施方案中，水包油乳剂包含具有以下结构的合成GLA佐 剂：
[0043]
[0044] 应理解，本发明的乳剂可以包含对预期作用所必要或所需要的其 他组分。例如，在某些实施方案中，本发明的水包油乳剂还包含1,2- 二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)。在一些实施方案中，水包油 乳剂中的DMPC是合成的。在一些实施方案中，水包油乳剂包含1- 棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)。在一些实施方案中，水包 油乳剂中的POPC是合成的。在一些实施方案中，水包油乳剂包含1,2- 二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)。在一些实施方案中，水包油乳剂 中的DOPC是合成的。在其他实施方案中，乳剂还包含表面活性剂， 例如普朗尼克F68。在其他实施方案中，乳剂还包含抗氧化剂，例如 维生素E。
[0045] 用于本发明乳剂的可代谢油可以选自多种可得来源中的任一种。 在某些实施方案中，可代谢油包括角鲨烯。在其他实施方案中，可代 谢油包括源自酵母的角鲨烯。在其他实施方案中，可代谢油包括源自 酵母的类异戊二烯，其在结构上与角鲨烯不同。
[0046] 当然，应理解，可以在存在一种或多种抗原的情况下使用乳剂， 从而诱发抗原特异性免疫应答。或者，可以在不存在抗原的情况下使 用乳剂，从而诱发非特异性免疫应答。
[0047] 在另一方面，本发明提供了包含TLR4激动剂(例如合成GLA佐 剂)、可代谢油、以及DMPC或DOPC的水包油乳剂。在一些实施方 案中，水包油乳剂中的可代谢油浓度为约0.01％-20％(例如约10％、 约5％、约2％、约1％、约0.5％、约0.2％)。在一些实施方案中，水 包油乳剂中的DMPC或DOPC浓度为约0.002％-2％。在一些实施方案 中，乳剂的HLB大于约9或约10。在一些实施方案中，DMPC或DOPC 浓度为约0.015％-0.25％。在一些实施方案中，乳剂中的DMPC或DOPC 是合成的。
[0048] 在本发明的一个具体实施方案中，提供了水包油乳剂，其包含合 成GLA佐剂、浓度为约0.01％-1％v/v的可代谢油、以及浓度为约 0.002％-2％DMPC的DMPC，其中该乳剂的HLB大于约10。在一些 实施方案中，DMPC浓度为约0.015％-0.25％。
[0049] 本发明还提供了用于刺激个体的免疫应答的方法，其包括向所述 个体给予本文所述的水包油乳剂，由此刺激所述个体的免疫应答。当 然，所述方法可以用于诱发非特异性免疫应答，其中所述乳剂不包含 抗原。更典型地，所述乳剂将包含一种或多种抗原，以使免疫应答为 抗原特异性免疫应答。
[0051] 附图简述
[0052] 图1.如HPLC-CAD所测量的在GLA-AF批次中随时间的GLA 浓度。点线表示HPLC方法的规格上限和规格下限。
[0053] 图2.对包含乳剂剂量为0.02％-2％v/v油的各种佐剂制剂的 PfCelTOS疫苗的抗体应答，在第2次和第3次免疫接种之后所测量。 上格从左向右：(a-c)IgG、IgG1和IgG2a抗体终点滴度，在第2次免 疫接种后3周测量。下格从左向右：(d-f)IgG、IgG1和IgG2a抗体终 点滴度，在第3次免疫接种后3周测量。(g)在第3次免疫接种后3 周检测的骨髓中长期存活的分泌抗体的细胞。
[0054] 图3.对包含乳剂剂量为0.5％-2％v/v油的各种佐剂制剂的 PfCelTOS疫苗的抗体应答，在第2次和第3次免疫接种之后所测量。 上格从左向右：(a-c)IgG、IgG1和IgG2a抗体终点滴度，在第2次免 疫接种后3周测量。下格从左向右：(d-f)IgG、IgG1和IgG2a抗体终 点滴度，在第3次免疫接种后3周测量。(g)在第3次免疫接种后3 周检测的骨髓中长期存活的分泌抗体的细胞。
[0055] 图4.在第3次免疫接种后3周由ELISPOT测定所检测的产生抗 原特异性细胞因子的细胞。(a)产生IFN-γ的细胞。(b)产生IL-5的细 胞。
[0056] 图5.在第3次免疫接种后3周由多重微珠测定(multiplex bead assay，)检测的抗原特异性细胞因子产生。(a)IL-2(b)IL-5(c) IL-10(d)IL-13(e)IL-17(f)IFN-γ(g)TNF-α。
[0057] 图6.佐剂制剂的粒径和多分散度。
[0058] 图7.在各种贮存温度下的乳剂粒径稳定性。示出了在(a)5℃(顶 部左图)，(b)RT(顶部右图)，(c)37℃(底部左图)和(d)60℃(底部右图) 下贮存之后的结果。使用Malvern Instruments APS测量粒径，并且误 差条表示来自各乳剂的一批次的三个单独等分部分的标准尺寸偏差。
[0059] 图8.乳剂稳定性的激光散射光学分布分析。包含乳剂的比色杯的 25-30mm区域的积分透射曲线，在60℃下4小时内测量。
[0060] 图9.乳剂对通过用重组疟疾抗原免疫接种而诱导的抗体应答的 作用。用与乳剂一起配制的PbCSP抗原对BALB/c小鼠进行免疫两次， 所述乳剂包含蛋黄PC或合成PC，包括POPC、DOPC和DMPC。通 过ELISA测定抗原特异性IgG(a)、IgG1(b)和IgG2a(c)。n＝5个/组， 并且数据示为来自单个小鼠的数值(Log10)和表示均值的条。*＝相对于 仅用蛋白的免疫接种p-值<0.05。
[0061] 图10.佐剂制剂在通过用失活裂解-病毒流感疫苗(Fluzone)免疫 接种而诱导的体液免疫应答中的作用。用与乳剂一起配制的Fluzone 对BALB/c小鼠进行免疫，所述乳剂包含蛋黄PC或合成PC，包括 POPC、DOPC和DMPC。通过ELISA测定抗原特异性IgG(a)、IgG1(b) 和IgG2a(c)。通过ELISPOT测定针对Fluzone的分泌IgG的骨髓浆细 胞(d)。(a-c)的结果示为终点滴度(Log10)，每一点表示单个小鼠并且条 表示均值。(d)的结果也表示各组中的单个小鼠，条表示均值ASPC/组。 *＝相对于仅用疫苗的免疫接种p-值<0.05，而#＝相对于用包含DMPC 乳剂的疫苗的免疫接种p-值<0.05。
[0062] 图11.通过用与蛋黄PC或合成PC一起配制的Fluzone免疫接种 来增强HI滴度。用Fluzone和各种乳剂对BALB/c小鼠进行免疫，然 后在加强后4周测定血清HI滴度。(a)针对Fluzone的A/所罗门岛(Solomon Islands)/3/2006(H1N1)组分的HI滴度。(b)针对Fluzone的 A/威斯康辛州(Wisconsin)/67/2005(H3N2)组分的HI滴度。数据示为每 一单个动物的(Log2)滴度，条表示均值。*＝相对于仅用疫苗的免疫接 种p-值<0.05，而#＝相对于用包含POPC乳剂或DMPC乳剂的疫苗的 免疫接种p-值<0.05。
[0063] 图12.在用与乳剂一起配制的Fluzone免疫接种之后，产生IL-5 的细胞增加。用(a)5HAU的失活A/所罗门岛/3/2006(H1N1)或(b)2 HAU的失活A/威斯康辛州/67/2005(H3N2)刺激用Fluzone和各种乳剂 进行免疫的BALB/c小鼠的脾细胞，并且通过ELISPOT测定产生IL-5 的细胞。数据表示为单个小鼠/组的每百万个脾细胞的斑点形成单位 (SFU)的数量，条表示均值，n＝5个/组。*＝相对于仅用疫苗的免疫接 种p-值<0.05，而#＝相对于用包含DMPC乳剂的疫苗的免疫接种p-值 <0.05。
[0064] 发明详述
[0065] 本发明在其诸多方面提供了包含TLR4激动剂的乳剂组合物，特 别是包含TLR4激动剂的水包油乳剂，以及将其用作佐剂和免疫刺激 组合物的相关方法。
[0066] 如本文所讨论的，本发明的制剂通常包含含有TLR4激动剂和可 代谢油的水包油乳剂，其中所述可代谢油以约0.01％-1％v/v或约 0.01％-0.5％v/v的浓度存在于所述水包油乳剂中，并且其中所述水包 油乳剂的疏水:亲水平衡(HLB)大于约9、或大于约10、或为约9-12。
[0067] 用于测定乳剂的HLB的方法是本领域已知的。参见例如万维网 firp.ula.ve/archivos/historicos/76_Book_HLB_ICI.pdf和 chemistscorner.com/hlb-the-easiest-way-to-create-an-emulsion/。
[0068] 用于本发明的油乳剂佐剂可以是天然的或合成的，并且可以是矿 物的或有机的。矿物油和有机油的实例对本领域技术人员是显而易见 的。
[0069] 在特定实施方案中，本发明的组合物包含水包油乳剂，其中将 TLR4激动剂并入油相。为了使水包油组合物适于人类给药，乳剂系 统的油相优选包含可代谢油。术语可代谢油的含义是本领域熟知的。 可代谢可以定义为“能够通过代谢而转化”(Dorland’s illustrated Medical Dictionary,W.B.Saunders Company,第25版(1974))。油可以 为任何植物油、食用植物油(vegetable oil)、鱼油、动物油或合成油， 其对接受者是无毒的并且能够通过代谢而转化。坚果(例如花生油)、 种子和谷物是食用植物油的常见来源。还可以使用合成油。
[0070] 在某些例示的实施方案中，本发明的制剂包含以约0.01％-1％v/v、 约0.01％-0.5％v/v、约0.5％v/v或约0.2％v/v的浓度存在的可代谢油。 在一些实施方案中，可代谢油以低于1％v/v的浓度存在。本发明可用 的例示的可代谢油包括但不限于角鲨烯、大豆油、芝麻油和辛酸/癸酸 甘油三酯(MIGLYCOL 810油)。在一优选的实施方案中，可代谢油包 括角鲨烯。在更具体的实施方案中，可代谢油包括一种或多种源自酵 母的类异戊二烯，例如源自酵母的角鲨烯或源自酵母的相关类异戊二 烯结构。
[0071] 例如，角鲨烯(2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六 烯)是不饱和油，其在鲨鱼肝油中大量得到，并且在橄榄油、麦芽(wheat germ nil)、米糠油和酵母中少量得到，并且所述角鲨烯是用于本发明 的优选的油。角鲨烯是由于以下事实而成为可代谢油，即，其是胆固 醇生物合成中的中间体(默克索引,第10版,登记号8619)。
[0072] 在其他例示的实施方案中，本发明的某些制剂包含抗氧化剂。可 用于本发明的乳剂的例示的抗氧化剂包括但不限于生育酚和抗坏血 酸，并且生育酚是优选的。
[0073] 在其他例示的实施方案中，本发明的某些制剂包含表面活性剂。 可用于本发明的表面活性剂是Pluronic F68、Tween 80、聚山梨醇酯 80(CAPMUL POE-O低PV表面活性剂,ABITEC Corp.,Janesville, Wis.)、聚乙烯660 12-羟基硬脂酸酯(SOLUTOL HS15,BASF Corp., Chicago,Ill.)以及泊洛沙姆188(PLURONIC Q F68嵌段共聚物,BASF Corp.,Chicago,Ill.)、胆酸钠、甘氨脱氧胆酸盐、磷脂酰胆碱，并且泊 洛沙姆188是优选的。其他合适的表面活性剂包括鞘脂如鞘磷脂和鞘 氨醇，以及磷脂如蛋黄磷脂酰胆碱、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙 醇胺、L-α-磷脂酰乙醇胺和1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC) 或其混合物。DPPC对于用于人类是可接受的。在一些实施方案中， 表面活性剂是DMPC、DOPC和/或POPC(包括合成的DMPC、DOPC 和POPC)。可以使用一种或多种表面活性剂。
[0074] 此外，在其他例示的实施方案中，本发明的某些制剂具有大于约 9或大于约10或大于约11的疏水:亲水平衡(HLB)。在其他相关实施 方案中，制剂具有约9-12、约10-12或约10-11的HLB。
[0075] 在某些其他例示的实施方案中，本发明的制剂包括磷脂1,2-二肉 豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)，特别是合成的DMPC。此外，在 其中乳剂包含DMPC的一些实施方案中，乳剂不包含抗氧化剂。此外， 在其中乳剂包含DMPC的一些实施方案中，乳剂具有大于约9、或大 于约10、或大于约11的HLB，或具有约9-12、约10-12、或约10-11 的HLB。在制剂包含DMPC的情况下，该制剂通常不包含蛋黄磷脂酰 胆碱(PC)。
[0076] 可以向本发明的乳剂添加以使佐剂等渗的试剂包括葡萄糖、甘油、 甘露醇、山梨醇、PEG 300、PEG 400和聚乙二醇。
[0077] 例示的油乳剂是水包油乳剂，并且特别是水包角鲨烯乳剂。此外， 本发明的最优选的油乳剂包含抗氧化剂，其优选为油α-生育酚(维生素 E，EP 0 382 271B1)。WO 95/17210和WO 99/11241公开了基于角鲨 烯、α-生育酚和 80的任选与免疫刺激剂QS21和/或3D-MPL 一起配制的乳剂佐剂(其如上所讨论)。WO 99/12565公开了通过向油 相添加固醇的对这些角鲨烯乳剂的改进。此外，可以向油相添加甘油 三酯如三辛精(C27H5006)，从而使乳剂稳定(WO 98/56414)。
[0078] 在稳定的水包油乳剂内得到的油滴的尺寸优选小于1微米，其直 径可以为基本30-600nm，优选为基本约30-500nm，并且最优选为基 本150-500nm，并且特别为约150nm，如光子相关频谱法所测量的。 对此，80％的油滴(以数量计)应在优选的范围内，更优选大约
90％且最 优选大于95％的油滴(以数量计)在定义的尺寸范围内。
90％且最 优选大于95％的油滴(以数量计)在定义的尺寸范围内。
[0079] 制备水包油乳剂的方法是本领域技术人员熟知的。通常，该方法 包括将油相与合适的表面活性剂如 溶液混合，然后使 用均化器进行均化。例如，包括使混合物一次、两次或三次通过注射 器针头的方法将适于均化小体积的液体。同样地，在微流化器(M110S 微流体机，最大50个通路，在6巴的最大压力输入(输出压力为约850 巴)下持续2分钟时段)中的乳化过程可以经改变而用于制备更小或更 大体积的乳剂。这种改变可以通过常规实验而实现，所述常规实验包 括测量所得的乳剂，直至获得具有所需直径的油滴的制剂。
[0080] TLR4激动剂
[0081] 在某些实施方案中，用于本发明制剂的TLR4激动剂包括吡喃葡 萄糖脂佐剂(GLA)，例如在第US2007/021017、US2009/045033、 US2010/037466和US 2010/0310602号美国专利公开中所描述的那些， 所述专利的内容通过引用全部并入本文。
[0082] 例如，在某些实施方案中，TLR4激动剂是具有以下结构的合成 GLA佐剂或其药学可接受的盐：
[0083]
[0084] 其中：
[0085] L1、L2、L3、L4、L5和L6相同或不同，并独立地为-O-、-NH-或-(CH2)-；
[0086] L7、L8、L9和L10相同或不同，并独立地为不存在或为-C(＝O)-；
[0087] Y1是酸官能团；
[0088] Y2和Y3相同或不同，并独立地为-OH、-SH或酸官能团；
[0089] Y4为-OH或-SH；
[0090] R1、R3、R5和R6相同或不同，并独立地为C8-13烷基；以及
[0091] R2和R4相同或不同，并独立地为C6-11烷基。
[0092] 在合成GLA结构的一些实施方案中，R1、R3、R5和R6为C10烷 基；并且R2和R4为C8烷基。
[0093] 例如，在某些实施方案中，TLR4激动剂是具有以下结构的合成 GLA佐剂：
[0094]
[0095] 在具体的实施方案中，R1、R3、R5和R6为C11-C20烷基；并且R2和R4为C12-C20烷基。
[0096] 在另一具体实施方案中，GLA具有上述通式，其中R1、R3、R5和R6是C11烷基；并且R2和R4是C13烷基。
[0097] 在另一具体实施方案中，GLA具有上述通式，其中R1、R3、R5和R6是C10烷基；并且R2和R4是C8烷基。
[0098] 在另一具体实施方案中，GLA具有上述通式，其中R1、R3、R5和R6是C11-C20烷基；并且R2和R4是C9-C20烷基。在某些实施方案 中，R1、R3、R5和R6为C11烷基；并且R2和R4为C9烷基。
[0099] 在某些实施方案中，TLR4激动剂是具有以下结构的合成GLA佐 剂：
[0100]
[0101] 在上述GLA结构的某些实施方案中，R1、R3、R5和R6为C11-C20烷基；并且R2和R4为C9-C20烷基。在某些实施方案中，R1、R3、R5和R6为C11烷基；并且R2和R4为C9烷基。
[0102] 在某些实施方案中，TLR4激动剂是具有以下结构的合成GLA佐 剂：
[0103]
[0104] 在上述GLA结构的某些实施方案中，R1、R3、R5和R6为C11-C20烷基；并且R2和R4为C9-C20烷基。在某些实施方案中，R1、R3、R5和R6为C11烷基；并且R2和R4为C9烷基。
[0105] 在某些实施方案中，TLR4激动剂是具有以下结构的合成GLA佐 剂：
[0106]
[0107] 在上述GLA结构的某些实施方案中，R1、R3、R5和R6为C11-C20烷基；并且R2和R4为C9-C20烷基。在某些实施方案中，R1、R3、R5和R6为C11烷基；并且R2和R4为C9烷基。
[0108] 在某些实施方案中，TLR4激动剂是具有以下结构的合成GLA佐 剂：
[0109]
[0110] 在某些实施方案中，TLR4激动剂是具有以下结构的合成GLA佐 剂：
[0111]
[0112] 在某些实施方案中，TLR4激动剂是具有以下结构的合成GLA佐 剂：
[0113]
[0114] 在另一实施方案中，将变性脂质A衍生物(ALD)并入本发明的组 合物。ALD是脂质A样分子，其经改变或构造以使分子呈现脂质A 的较小副作用或不同副作用。这些副作用包括产热原性、局部 Shwarzman反应性和毒性，所述毒性是在鸡胚50％致死剂量测定 (CELD50)所评估的，本发明可用的ALD包括单磷酰基脂质A(MLA) 和3-脱酰基单磷酰基脂质A(3D-MLA)。MLA和3D-MLA是已知的， 并且无需在本文详述。参见例如转让给Ribi ImmunoChem Research, Inc.的1984年3月13日公开的美国专利第4,436,727号，其公开了单磷 酰基脂质A及其加工。同样转让给Ribi ImmunoChem Research,Inc.的 Myers等人的美国专利第4,912,094号和再审查证书B1美国专利第 4,912,094号实施了3-脱酰基单磷酰基脂质A及其制造方法。这些专利 关于MLA和3D-MLA的公开内容通过引用并入本文。
[0115] 抗原
[0116] 在一些实施方案中，本发明的制剂还包含一种或多种抗原。
[0117] 用于本文描述的疫苗组合物和应用GLA的方法的某些实施方案 中的抗原可以是个体内免疫应答的诱发或增强所针对的任一靶抗原决 定部位、分子(包括生物分子)、分子复合物(包括含有生物分子的分子 复合物)、亚细胞集群、细胞或组织。通常，术语抗原指所关注的多肽 抗原。然而，如本文所使用的，抗原也可以指编码所关注的多肽抗原 的重组构建体(例如，表达构建体)。在某些优选的实施方案中，所述 抗原可以是或可以来自与感染、癌症、自身免疫疾病、过敏症、哮喘 症或任何其他的状态(其中，抗原特异性免疫应答的激活是理想的或有 益的)相关的传染性病原体和/或抗原决定部位、生物分子、细胞或组 织，或者与其在免疫学上交叉反应。
[0118] 优选地，在某些实施方案中，本发明的疫苗制剂含有能够诱发针 对人类或其他哺乳动物病原体的免疫应答的抗原或抗原成分，所述抗 原或抗原成分可以包括来自病毒的成分，诸如来自HIV-1(如tat,nef, gp120或gp160)、人类疱疹病毒(如gD或其衍生物或如来自HSV1或 HSV2的ICP27的即刻早期蛋白)、巨细胞病毒((特别是人类)(如gB或 其衍生物)、轮状病毒(Rotavirus)(包括活力减弱病毒)、爱泼斯坦-巴尔 氏病毒(如gp350或其衍生物)、水痘带状疱疹病毒(诸如gpl,II和IE63) 或者来自诸如乙型肝炎病毒(例如乙型肝炎表面抗原或其衍生物)、甲 型肝炎病毒、丙型肝炎病毒以及戊型肝炎病毒的肝炎病毒，或者来自 其他的病毒病原体，诸如副粘病毒：呼吸道合胞病毒(如F和G蛋白 或其衍生物)、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒(例 如HPV6,11,16,18等)、虫媒病毒(例如黄热病毒(Yellow Fever Virus)、 登革热病毒(Dengue Virus)、蜱传脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus)、日本脑炎病毒或流感病毒(全活或灭活病毒、接种在鸡胚或 MDCK细胞内的裂解流感病毒，或完整流感病毒体(如由Gluck, Vaccine,1992,10,915-920所描述的)或者是其纯化的或重组的蛋白， 诸如HA,NP,NA或M蛋白或者其组合)。
[0119] 在某些其他优选的实施方案中，本发明的疫苗制剂含有能够诱发 针对人类或其他哺乳动物病原体的免疫应答的抗原或抗原成分，所述 抗原或抗原成分可以包括来自一种或多种细菌病原体的成分，所述病 原体例如奈瑟菌属某些种(Neisseria spp)，包括淋病奈瑟菌(N. gonorrhea)和脑膜炎奈瑟菌(N.meningitides)(例如荚膜多糖和其偶联 物、转铁蛋白结合蛋白、乳铁蛋白结合蛋白、PilC、黏附素)；化脓链 球菌(S.pyogenes)(例如M蛋白或其片段、C5A蛋白酶、脂磷壁酸质)， 无乳链球菌(S.agalactiae)，变异链球菌(S.mutans)：杜克雷嗜血杆菌(H. ducreyi)；莫拉菌属某些种(Moraxella spp)，包括粘膜炎莫拉菌(M catarrhalis)，也称为粘膜炎布兰汉球菌(Branhamella catarrhalis)(例如 高和低分子量的黏附素及透明质酸酶)；博德特菌属某些种(Bordetella spp)，包括百日咳博德特菌(B.pertussis)(例如百日咳杆菌粘附素、百 日咳毒素或其衍生物、丝状血凝素、腺苷酸环化酶、菌毛)，副百日咳 博德特菌(B.parapertussis)和支气管败血症博德特菌(B. bronchiseptica)；分枝杆菌属某些种(Mycobacterium spp)，包括肺结 核分枝杆菌(例如ESAT6,抗原85A、-B或-C)、牛型分枝杆菌(M. bovis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、鸟分枝杆菌(M.avium)、副结核分枝 杆菌(M.paratuberculosis)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)；军团病杆菌 属某些种(Legionella spp)，包括嗜肺军团菌
(L.pneumophila)；埃希氏 菌属某些种(Escherichia spp)，包括肠毒素性大肠埃希菌(enterotoxic E. coli)(例如定居因子、不耐热毒素或其衍生物、耐热毒素或其衍生物)、 肠出血性大肠埃希菌(enterohemorragic E.coli)、肠致病性大肠埃希菌
(enteropathogenic E.coli)(例如志贺(Shiga)毒素样毒素或其衍生物)；弧 菌属某些种(Vibrio spp)，包括霍乱弧菌(V.cholera)(例如霍乱毒素或其 衍生物)；志贺菌属某些种(Shigella spp)，包括索氏志贺菌(S.sonnei)、 痢疾志贺菌(S.dysenteriae)、弗氏志贺菌(S.flexnerii)；耶尔森菌属某些 种(Yersinia spp)，包括小肠结肠炎耶尔森菌(Y.enterocolitica)(例如Yop 蛋白)、鼠疫耶尔森菌(Y.pestis)、假结核耶尔森菌(Y. pseudotuberculosis)；弯曲杆菌属某些种(Campylobacter spp)，包括空 肠弯曲杆菌(C.jejuni)(例如毒素、黏附素和透明质酸酶)和结肠弯曲杆 菌(C.coli)；沙门菌属某些种(Salmonella spp)，包括伤寒沙门菌(S. typhi)、副伤寒沙门菌(S.paratyphi)、猪霍乱沙门菌(S.choleraesuis),肠 炎沙门菌(S.enteritidis)；利斯特菌属某些种(Listeria spp.)，包括单核细 胞增生利斯特菌(L.monocytogenes)；螺杆菌属某些种(Helicobacter spp)，包括幽门螺杆菌(H.pylori)(例如尿素酶、过氧化氢酶、空泡素)； 假单胞菌属某些种(Pseudomonas spp)，包括铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)；葡萄球菌属某些种(Staphylococcus spp.)，包括金黄色葡 萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌
(S.epidermidis)；肠球菌属某些种 (Enterococcus spp.)，包括粪肠球菌(E.faecalis)、屎肠球菌(E.faecium)； 梭菌属某些种(Clostridium spp.)，包括破伤风梭菌(C.tetani)(例如破伤 风毒素及其衍生物)、肉毒梭菌(C.botulinum)(例如肉毒菌毒素及其衍 生物)、艰难梭菌(C.difficile)(例如梭菌毒素类A或B及其衍生物)；芽 孢杆菌属某些种(Bacillus spp.)，包括炭疽杆菌(B.anthracis)(例如肉毒 菌毒素及其衍生物)；棒杆菌属某些种(Corynebacterium spp.)，包括白 喉棒杆菌(C.diphtheriae)(例如白喉毒素及其衍生物)；疏螺旋体属某些 种(Borrelia spp.)，包括伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)(例如OspA,OspC, DbpA,DbpB)、伽氏疏螺旋体(B.garinii)(例如OspA,OspC,DbpA, DbpB)、阿弗西尼疏螺旋体(B.afzelii)(例如OspA,OspC,DbpA,DbpB)、 安德森疏螺旋体
(B.Andersonii)(例如OspA,OspC,DbpA,DbpB)、赫姆 斯疏螺旋体(B.hermsii)；埃里希体属某些种(Ehrlichia spp.)，包括马埃 里希体(E.equi)和人类粒细胞埃里希体病(the Human Granulocytic Ehrlichiosis)的媒介；立克次体属某些种(Rickettsia spp)，包括立氏立克 次体(R.rickettsii)；衣原体属某些种(Chlamydia spp.)包括沙眼衣原体 (C.trachomatis)(例如MOMP,肝素结合蛋白)，肺炎衣原体(C. pneumoniae)(例如MOMP，肝素结合蛋白)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)； 钩端螺旋体属某些种(Leptospira spp.)，包括问号钩端螺旋体(L. interrogans)；密螺旋体属某些种(Treponema spp.)，包括苍白球密螺旋 体(T.pallidum)(例如罕见的外膜蛋白)，齿垢密螺旋体(T.denticola)、 猪痢疾密螺旋体(T.hyodysenteriae)；或其他细菌病原体。
(L.pneumophila)；埃希氏 菌属某些种(Escherichia spp)，包括肠毒素性大肠埃希菌(enterotoxic E. coli)(例如定居因子、不耐热毒素或其衍生物、耐热毒素或其衍生物)、 肠出血性大肠埃希菌(enterohemorragic E.coli)、肠致病性大肠埃希菌
(enteropathogenic E.coli)(例如志贺(Shiga)毒素样毒素或其衍生物)；弧 菌属某些种(Vibrio spp)，包括霍乱弧菌(V.cholera)(例如霍乱毒素或其 衍生物)；志贺菌属某些种(Shigella spp)，包括索氏志贺菌(S.sonnei)、 痢疾志贺菌(S.dysenteriae)、弗氏志贺菌(S.flexnerii)；耶尔森菌属某些 种(Yersinia spp)，包括小肠结肠炎耶尔森菌(Y.enterocolitica)(例如Yop 蛋白)、鼠疫耶尔森菌(Y.pestis)、假结核耶尔森菌(Y. pseudotuberculosis)；弯曲杆菌属某些种(Campylobacter spp)，包括空 肠弯曲杆菌(C.jejuni)(例如毒素、黏附素和透明质酸酶)和结肠弯曲杆 菌(C.coli)；沙门菌属某些种(Salmonella spp)，包括伤寒沙门菌(S. typhi)、副伤寒沙门菌(S.paratyphi)、猪霍乱沙门菌(S.choleraesuis),肠 炎沙门菌(S.enteritidis)；利斯特菌属某些种(Listeria spp.)，包括单核细 胞增生利斯特菌(L.monocytogenes)；螺杆菌属某些种(Helicobacter spp)，包括幽门螺杆菌(H.pylori)(例如尿素酶、过氧化氢酶、空泡素)； 假单胞菌属某些种(Pseudomonas spp)，包括铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)；葡萄球菌属某些种(Staphylococcus spp.)，包括金黄色葡 萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌
(S.epidermidis)；肠球菌属某些种 (Enterococcus spp.)，包括粪肠球菌(E.faecalis)、屎肠球菌(E.faecium)； 梭菌属某些种(Clostridium spp.)，包括破伤风梭菌(C.tetani)(例如破伤 风毒素及其衍生物)、肉毒梭菌(C.botulinum)(例如肉毒菌毒素及其衍 生物)、艰难梭菌(C.difficile)(例如梭菌毒素类A或B及其衍生物)；芽 孢杆菌属某些种(Bacillus spp.)，包括炭疽杆菌(B.anthracis)(例如肉毒 菌毒素及其衍生物)；棒杆菌属某些种(Corynebacterium spp.)，包括白 喉棒杆菌(C.diphtheriae)(例如白喉毒素及其衍生物)；疏螺旋体属某些 种(Borrelia spp.)，包括伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)(例如OspA,OspC, DbpA,DbpB)、伽氏疏螺旋体(B.garinii)(例如OspA,OspC,DbpA, DbpB)、阿弗西尼疏螺旋体(B.afzelii)(例如OspA,OspC,DbpA,DbpB)、 安德森疏螺旋体
(B.Andersonii)(例如OspA,OspC,DbpA,DbpB)、赫姆 斯疏螺旋体(B.hermsii)；埃里希体属某些种(Ehrlichia spp.)，包括马埃 里希体(E.equi)和人类粒细胞埃里希体病(the Human Granulocytic Ehrlichiosis)的媒介；立克次体属某些种(Rickettsia spp)，包括立氏立克 次体(R.rickettsii)；衣原体属某些种(Chlamydia spp.)包括沙眼衣原体 (C.trachomatis)(例如MOMP,肝素结合蛋白)，肺炎衣原体(C. pneumoniae)(例如MOMP，肝素结合蛋白)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)； 钩端螺旋体属某些种(Leptospira spp.)，包括问号钩端螺旋体(L. interrogans)；密螺旋体属某些种(Treponema spp.)，包括苍白球密螺旋 体(T.pallidum)(例如罕见的外膜蛋白)，齿垢密螺旋体(T.denticola)、 猪痢疾密螺旋体(T.hyodysenteriae)；或其他细菌病原体。
[0120] 在某些其他优选的实施方案中，本发明的疫苗制剂含有能够诱发 针对人类或其他哺乳动物病原体的免疫应答的抗原或抗原成分，所述 抗原或抗原成分可以包括来自一种或多种寄生虫的成分(参见,例如，John,D.T.and Petri,W.A.,Markell and Voge's thMedical Parasitology-9 Ed.(Markell和Voge的医学寄生虫学-第9版),2006,WB Saunders, Philadelphia；Bowman,D.D.,Georgis'Parasitology for Veterinarians-8th Ed.(Georgis的兽医寄生虫学-第8版),2002,WB Saunders, Philadelphia)，所述寄生虫例如疟原虫属某些种(Plasmodium spp.)，包 括恶性疟原虫(P.falciparum)；弓形虫属某些种(Toxoplasma spp.)，包 括人刚地弓形虫(T.gondii)(例如SAG2,SAG3,Tg34)；内阿米巴属某 些种(Entamoeba spp.)，包括溶组织内阿米巴(E.histolytica)；巴贝虫属 某些种(Babesia spp.)，包括田鼠巴贝虫(B.microti)；锥虫属某些种 (Trypanosoma spp.),包括克氏锥虫(T.cruzi)；贾第虫属某些种(Giardia spp.)，包括蓝氏贾第虫(G.lamblia)；利什曼虫某些种，包括硕大利什 曼虫(L.major)；肺囊虫属某些种(Pneumocystis spp.)，包括卡氏肺囊虫 (P.carinii)；毛滴虫属某些种(Trichomonas spp.)，包括鞘毛滴虫(T. vaginalis)；或者来自能够感染哺乳动物的蠕虫，诸如：(i)线虫感染(包 括，但不限于蠕形住肠蛲虫(Enterobius vermicularis)、人蛔虫(Ascaris lumbricoides)、毛首鞭形线虫(Trichuris trichuria)、美洲板口线虫 (Necator americanus)、十二指肠钩虫(Ancylostoma duodenale)、班氏吴 策线虫(Wuchereria bancrofti)、马来丝虫(Brugia malayi)、旋盘尾丝虫 (Onchocerca volvulus)、麦地那龙线虫(Dracanculus medinensis)、旋毛 线虫(Trichinella spiralis)和粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis))；(ii) 吸虫感染(包括，但不限于曼森血吸虫(Schistosoma mansoni)、埃及血 吸虫(Schistosoma haematobium)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum)、 湄公河裂体吸虫(Schistosoma mekongi)、中华后睾吸虫(Opisthorchis sinensis)、并殖吸虫属(Paragonimus sp)、肝片形吸虫(Fasciola hepatica)、姜片吸虫(Fasciola magna)、大片吸虫(Fasciola gigantica))； 以及(iii)绦虫感染(包括但不限于牛肉绦虫和猪肉绦虫)。
因此某些实施 方案可以涉及包括来自血吸虫属某些种(Schistosoma spp.)或来自酵母 的抗原的疫苗组合物，血吸虫属某些种如曼氏血吸虫、埃及血吸虫和/ 或日本血吸虫，酵母诸如假丝酵母属(Candida spp.)，包括白假丝酵母 (C.albicans)；隐球菌属(Cryptococcus spp.)，包括新型隐球酵母(C. neoformans)。
因此某些实施 方案可以涉及包括来自血吸虫属某些种(Schistosoma spp.)或来自酵母 的抗原的疫苗组合物，血吸虫属某些种如曼氏血吸虫、埃及血吸虫和/ 或日本血吸虫，酵母诸如假丝酵母属(Candida spp.)，包括白假丝酵母 (C.albicans)；隐球菌属(Cryptococcus spp.)，包括新型隐球酵母(C. neoformans)。
[0121] 对于结核分枝杆菌，其他优选的特异性抗原例如Th Ra12、Tb H9、 Tb Ra35、Tb38-1、Erd 14、DPV、MTI、MSL、mTTC2和hTCC1(WO 99/51748)。针对结核分枝杆菌的蛋白还包括融合蛋白及其变体，其中 结核分枝杆菌的至少两种、优选三种多肽融合成较大的蛋白。优选的 融合物包括Ra12-TbH9-Ra35、Erd14-DPV-MTI、DPV-MTI-MSL、 Erd14DPV-MTI-MSL-mTCC2、Erd14-DPV-MTI-MSL、DPV-MTI-MSL- mTCC2、TbH9-DPV-MTI(WO 99151748)。可以使用的其他抗原包括 US 2010/0129391和WO 2008/124647所述的抗原、抗原合并物和融合 蛋白。
[0122] 对于衣原体最优选的抗原包含例如高分子量蛋白(HWMP)(WO 99/17741)、ORF3(EP 366 412)以及推定的膜蛋白(Pmps)。疫苗制剂的 其他衣原体抗原可以选自在WO 99128475中描述的组。优选的细菌疫 苗包含来自包括肺炎链球菌的链球菌属某些种的抗原(例如荚膜多糖 及其偶联物、PsaA、PspA、链球菌溶血素、胆碱结合蛋白)和蛋白抗 原肺炎链球菌溶血素(Biochem Biophys Acta,1989,67,1007；Rubins等 人,Microbial Pathogenesis(微生物致病机理),25,337-342)，以及其突 变的去毒衍生物(WO 90/06951；WO 99/03884)。其他优选的细菌疫苗 包含来自嗜血菌属(Haemophilus spp.)的抗原，包括流感嗜血杆菌B型 (H.influenzae type B)(例如PRP及其偶联物)，不可分型流感嗜血杆菌， 例如OMP26、高分子量黏附素、P5、P6、蛋白质D和脂蛋白D，以 及丝束蛋白和丝束蛋白衍生肽(美国专利第5,
843,464号)或多重拷贝变 体或其融合蛋白。
843,464号)或多重拷贝变 体或其融合蛋白。
[0123] 乙型肝炎表面抗原衍生物在本领域是公知的，其包括在欧洲专利 申请EP-A414 374、EP-A-0304 578和EP 198474中描述的那些PreS1、 Pars2S表面抗原等。在一个优选方面，本发明的疫苗制剂包含HIV-1 抗原、gp120，特别是在CHO细胞中表达时。在另外的实施方案中， 本发明的疫苗制剂包含本文上面限定的gD2t。
[0124] 在本发明优选的实施方案中，含有要求保护的佐剂的疫苗包含的 抗原来自被认为是生殖器疣病因的人类乳头瘤病毒(HPV)(HPV 6或HPV 11及其他)，以及是宫颈癌病因的HPV病毒(HPV16、HPV18及 其他)。生殖器疣预防或治疗性疫苗的特别优选形式包含L1颗粒和壳 粒，以及包含选自HPV6和HPV11蛋白E6、E7、L1和L2的一个或 多个抗原的融合蛋白。融合蛋白某些优选的形式包括WO 96/26277中 公开的L2E7，以及GB 9717953.5(PCT/EP98/05285)中公开的蛋白 D(1/3)-E7。优选的HPV宫颈感染或癌症的预防性或治疗性疫苗组合 物可以包含HPV 16或18的抗原。例如，L1或L2抗原单体，或者作 为病毒样颗粒(VLP)共同呈现的L1或L2抗原，或者在VLP或壳粒结 构内单独呈现的单独的L1蛋白。这些抗原、病毒样颗粒和壳粒本身 是已知的。参见例如WO94/00152,WO94/20137,WO94/05792和 WO93/02184。
[0125] 其他早期蛋白可以单独地被包括或者作为诸如E7、E2或优选例 如F5的融合蛋白；特别优选的实施方案包括包含L1E7融合蛋白的 VLP(WO 96/11272)。特别优选的HPV16抗原包含与蛋白D载体融合 的早期蛋白E6或E7以形成来自HPV16的蛋白D-E6或E7融合物， 或其组合；或者包含E6或E7与L2的组合(WO 96/11272)。可选择地， HPV16或18的早期蛋白E6和E7可以呈现为单分子，优选蛋白 D-E6/E7融合物。这类疫苗可任选地包含来自HPV18的E6和E7蛋白 的任一者或两者，优选以蛋白D-E6或蛋白D-E7融合蛋白或蛋白D E6/E7融合蛋白的形式。本发明的疫苗另外还包含来自其他HPV菌株 的抗原，优选来自HPV 31或33菌株。
[0126] 本发明的疫苗还包含来自导致疟疾的寄生虫的抗原。例如，来自 恶性疟原虫的优选抗原包括RTS,S和TRAP。RTS是杂交蛋白，包含 恶性疟原虫的环子孢子(CS)蛋白的基本上全部的C-末端部分，后者通 过乙型肝炎表面抗原的preS2部分的四个氨基酸连接于乙型肝炎病毒 表面(S)抗原。其完整结构在国际专利申请号PCT/EP92/02591中公开， 该国际申请公布号为WO 93/10152，要求英国专利第9124390.7号申 请的优先权。当在酵母中表达时，RTS作为脂蛋白颗粒产生，且当它 与来自HBV的S抗原共表达时，它产生了称为RTS,S的混合颗粒。
[0127] 在以WO 90/01496公布的国际专利申请号PCT/GB89/00895中描 述了TRAP抗原。本发明的优选实施方案是疟疾疫苗，其中抗原制剂 包含RTS,S和TRAP抗原的组合。可能是多级疟疾疫苗的组分的候选 物的其他疟原虫抗原是恶性疟原虫MSP1,AMA1,MSP3,EBA, GLURP,RAP1,RAP2,钳合蛋白(Sequestrin),PfEMPI,Pf332,LSA1, LSA3,STARP,SALSA,PfEXP1,Pfs25,Pfs28,PFS27125,Pfs16, Pfs48/45,Pfs230，以及在疟原虫属某些种中的它们的类似物。
[0128] 因此，本文公开的某些实施方案涉及来自诸如细菌、病毒或真菌 的至少一种传染型病原体的抗原，所述病原体包括放线细菌，诸如结 核分支杆菌和麻风分支杆菌或另外的分支杆菌；细菌诸如沙门菌属、 奈瑟球菌属、疏螺旋体属、衣原体属或博德特菌属的成员；病毒诸如 单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、巨 细胞病毒、水痘带状疱疹、肝炎病毒、爱泼斯坦-巴尔氏病毒(EBV)、 呼吸道合胞病毒、人乳头状瘤病毒(HPV)以及巨细胞病毒；HIV诸如 HIV-1或HIV-2；真菌诸如曲霉菌、芽生菌、球孢菌和肺孢子菌，或 者酵母，包括假丝酵母属，诸如白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠 菌、葡萄牙念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌；寄生虫诸如原生动 物，例如疟原虫属，包括恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵 圆疟原虫；或者另外的寄生虫，诸如棘阿米巴、溶组织内阿米巴、管 圆线虫、曼氏血吸虫、日本血吸虫、隐孢子虫(Cryptosporidium)、埃及 吸血虫、钩虫线虫、溶组织内阿米巴、结肠内阿米巴、迪斯帕内阿米 巴、哈特曼内阿米巴、波氏内阿米巴、班氏吴策线虫、贾第虫以及利 什曼虫的一种或多种。
[0129] 例如，在含GLA的疫苗实施方案中含有来自疏螺旋体属的抗原， 所述抗原可以包括核酸、病原体来源的抗原或抗原制剂、重组产生蛋 白或肽，以及嵌合融合蛋白。一种这样的抗原是OspA。OspA借助其 在宿主细胞内的生物合成可以是载脂形式的完全成熟的蛋白 (Lipo-OspA)，或者可选择地可以是非载脂的衍生物。这种非载脂衍生 物包括非载脂NS1-OspA融合蛋白，其具有流感病毒的非结构蛋白 (NS1)的N-末端的前81个氨基酸，以及完整的OspA蛋白，且另一种 MDP-OspA是携带3个附加的N-末端氨基酸的OspA的非载脂形式。
[0130] 鉴别具有或疑似有患本文所述传染性病原体感染的危险的个体的 组合物和方法在本领域是已知的。
[0131] 例如，细菌结核分支杆菌导致肺结核(TB)。该细菌通常侵袭肺脏， 但也可以侵袭肾脏、脊柱和脑。如果不能恰当治疗的话，TB疾病可以 是致死性的。当被传染的人打喷嚏或咳嗽时，这种疾病可以在人与人 之间播散。在2003年，美国报道的TB病例超过了14,000例。
[0132] 尽管结核通常可以采用长期的抗生素治疗来控制，但这种治疗不 足以预防该疾病的播散并引起了关于抗生素抗性菌株的潜在选择的担 忧。被传染的个体在一段时间内可以是无症状的，但有传染性。此外， 尽管依从治疗方案是关键的，但患者行为难以监测。一些患者不能完 成治疗过程，这导致了无效治疗和耐药性的发生(例如美国专利 7,087,
713)。
713)。
[0133] 目前，活细菌疫苗是诱导针对肺结核的保护性免疫的最有效的方 法。用于这一目的的最常见的分支杆菌(Mycobacterium)是卡介菌 (Bacillus Calmette-Guerin)(BCG)，牛型分支杆菌的无毒力株。然而， BCG的安全性和功效是争议的来源，且有些国家，如美国并不给全民 接种。通常使用皮肤测试来完成诊断，其包括结核菌素PPD(蛋白纯 化的衍生物)的皮内暴露。抗原特异性T细胞反应导致了注射后48、 72小时在注射部位的可测量的硬结，这提示已暴露于分支杆菌抗原。 但是敏感性和特异性一直是该测试的难题，并且接种了BCG的个体不 能与受感染的患者区分开(例如，美国专利7,087,713)。
[0134] 尽管巨噬细胞一直作为肺结核杆菌免疫的主要效应器，但T细胞 是所述免疫的优势诱导细胞。T细胞在保护肺结核杆菌感染中的重要 作用在AIDS患者中被示例：由于与人类免疫缺陷病毒(HIV)感染有关 的CD4T细胞的耗竭，AIDS患者体内通常会出现肺结核分支杆菌。 已表明，分支杆菌反应性CD4T细胞是干扰素-γ(IFN-γ)强大的产生细 胞，其也已被进一步表明触发小鼠体内巨噬细胞的抗分支杆菌效应。 尽管IFN-γ在人体内的作用是不清楚的，但已有研究表明1,25-二羟基 -维生素D3单独地或与IFN-γ或肿瘤坏死因子-α联用激活人巨噬细胞 以抑制肺结核分支杆菌感染。此外，已知IFN-γ激活人巨噬细胞以产 生1,25-二羟基-维生素D3。类似地，已表明，IL-12在激发对肺结核 分支杆菌感染的抗性中发挥作用。对肺结核分支杆菌感染的免疫学的 综述，参见Chan and Kaufmann,in Tuberculosis:Pathogenesis, Protection and Control(肺结核：发病机理、保护和控制),Bloom(ed.), ASM Press.Washington,D.C.(1994)。
[0135] 诊断肺结核或诱导抗肺结核的保护性免疫的现有的化合物和方法 包括多肽和编码这种多肽的DNA分子的应用，所述多肽含有一种或 多种分支杆菌蛋白的至少一种免疫原部分。含有这种多肽或DNA序 列以及适当的检测试剂的诊断试剂盒可以用于检测患者和生物样本中 的分支杆菌感染。也提供了针对这种多肽的抗生素。此外，这种化合 物可以配制于疫苗和/或药物组合物中，用于抗分支杆菌感染的免疫。 (美国第6,949,246和6,555,653号专利)。
[0136] 二十世纪60年代，在世界上很多地方都消灭了疟疾，但这种疾病 仍持续存在，并出现了耐药的新致病株。疟疾在90多个国家是主要的 公共卫生问题。10例疟疾中有9例出现在撒哈拉以南非洲(sub-Saharan Africa)。超过1/3的世界人口正面临危险，且每年有350至500百万 的人感染疟疾。今年有45百万怀孕妇女面临感染疟疾的危险。在那些 已经被感染的个体中，每年有超过1百万被感染个体死于可预防的疾 病。那些死亡者中主要是非洲的儿童。
[0137] 疟疾通常是在人被受感染的雌疟蚊(Anopheles mosquito)叮咬时传 播。蚊子必须通过汲取已经感染了疟疾的人的血被感染后才能传播疟 疾。疟疾由寄生虫导致，且该病的临床症状包括发热和流感样不适， 诸如寒战、头痛、肌肉疼痛和疲倦。这些症状可以伴有恶心、呕吐和 腹泻。疟疾也可以导致由红细胞的损失引起的贫血和黄疸。一种类型 的疟疾，恶性疟疾，如果不能及时治疗的话，可能导致肾衰、惊厥、 意识模糊、昏迷和死亡。
[0138] 个体中疟疾的体外诊断方法是已知的，其包括将从个体采集的组 织或生物学流体与分子或多肽组合物接触(在允许体外免疫应答在所 述组合物和存在于组织或生物流体中的抗体之间发生的条件下)，以及 形成的抗原抗体复合物的体外检测(参见，例如，美国专利7,087,231)， 其中所述分子或多肽组合物包括一个或多个多肽序列，其携带由恶性 疟原虫的传染活性导致的蛋白的一个或多个T抗原决定部位的全部或 部分。
[0139] 已经描述了重组恶性疟原虫(3D7)AMA-1胞外区的表达和纯化。 先前的方法已经产生了高纯化的蛋白，其保留了天然分子的折叠和二 硫键。重组的AMA-1可以用作诊断试剂以及用于抗体制备，和作为 蛋白单独用于或作为疫苗的一部分用于预防疟疾。(美国专利 7,029,685)
[0140] 本领域已经描述了编码种属特异性的间日疟原虫疟疾肽抗原的多 核苷酸，所述抗原是分泌入感染后的易感哺乳动物宿主血浆内的蛋白 或蛋白片段，这样产生针对这些抗原的单克隆或多克隆抗体。所述肽 抗原、单克隆抗体和/或多克隆抗体用于诊断疟疾的测定中被利用，以 及用于确定是否间日疟原虫是导致感染的种属。(美国专利6,706,872) 也已经报道了种属特异性的间日疟原虫疟疾肽抗原，其是分泌入感染 后的敏感哺乳动物宿主血浆内的蛋白或蛋白片段，这样产生针对这些 抗原的单克隆或多克隆抗体。所述肽抗原、单克隆抗体和/或多克隆抗 体在用于诊断疟疾的测定中被利用，以及被用于确定是否间日疟原虫 是导致感染的种属(参见，例如，美国专利6,231,861)。
[0141] 通过产生高纯度蛋白的方法也已经表达了重组的恶性疟原虫(3D7) AMA-1胞外区，其保留了天然分子的折叠和二硫键。所述重组的 AMA-1用作诊断试剂，以及用作疫苗用于抗体产生(美国专利 7,060,276)。同样已知的是重组恶性疟原虫(3D7)MSP-142的表达和纯 化，其保留了天然分子的折叠和二硫键。重组的MSP-142用作诊断试 剂以及用作疫苗用于抗体产生。(美国专利6,855,322)。
[0142] 因此根据这些和相关的公开内容，已知检测人类疟疾感染的诊断 方法，以鉴定具有或疑似有患疟疾传染性病原体感染的危险的个体。 具体地，例如，将血液样本与含有3-乙酰基嘧啶腺嘌呤二核苷酸 (APAD)、底物(例如，乳酸盐或乳酸)以及缓冲液合并。该试剂被设计 为检测由疟疾寄生虫产生的独特的糖分解酶的存在。已知该酶是寄生 虫乳酸脱氢酶(PLDH)。使用上述试剂，很容易区别PLDH与宿主的LDH。所述试剂与寄生虫感染的血液样本合并导致了APAD的还原。 但是APAD不被宿主LDH还原。然后可以通过多种技术，包括光谱、 荧光测定、电泳或比色分析来检测还原的APAD。以上述方式检测还 原的APAD提供了疟疾感染的阳性指示(例如美国专利5,124,141)。在 另一种诊断疟疾的方法学中，包含特征性氨基酸序列的多肽源自恶性 疟原虫抗原GLURP，并可在检测样本中被针对所述多肽或与其反应的 特异性抗体所识别。(美国专利5,231,168)
[0143] 利什曼病是世界范围内的寄生虫病，在印度次大陆、非洲和拉丁 美洲频繁流行，是世界卫生组织开发疫苗的优先考虑对象。不同疾病 的复合，利什曼寄生虫导致了内脏器官的致命感染以及严重的皮肤病。 利什曼病最具破坏性的形式中的一种是鼻和嘴的毁容感染。利什曼病 例的数量越来越多，目前在许多地区以难于控制。作为HIV感染的结 果，利什曼病在一些发达地区也处于上升状态，特别是在南欧。可利 用的药物是有毒性的、昂贵的，并需要长期的每日注射。
[0144] 利什曼虫是定居于免疫系统的巨噬细胞或白血细胞的原生动物寄 生虫。这种寄生虫通过小的吸血昆虫(沙蝇)的叮咬传播，所述昆虫由 于定居于地球上的广大地区，难以控制。
[0145] 内脏利什曼病是该病三种表现形式中最危险的。据估计每年发生 约500,000例内脏形式(黑热病(kala-azar)或"致死疾病")的新病例。超 过200百万的人目前处于感染内脏利什曼病的危险中。超过90％的内 脏利什曼病例发生在印度、孟加拉国、苏丹、巴西和尼泊尔。大多数 死亡发生在儿童。患有皮肤形式的那些人通常是永久的毁容。
[0146] 利什曼虫感染难以诊断，并且通常涉及组织活检样本的组织病理 学分析。然而已经开发了几种血清学和免疫学诊断测定。(美国专利 7,008,774；Senaldi等人,(1996)J.Immunol.Methods 193:9 5；Zijlstra 等人,(1997)Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg.91:671 673；Badaro等人, (1996)J.Inf.Dis.173:758 761；Choudhary,S.等人,(1992)J.Comm. Dis.24:32 36；Badaro,R.等人,(1986)Am.J.Trop.Med.Hyg.35:72 78； Choudhary,A.等人,(1990)Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg.84:363 366； 和Reed,S.G.等人,(1990)Am.J.Trop.Med.Hyg.43:632 639)。前鞭毛 体释放代谢产物进入培养基以产生条件培养基。这些代谢产物是宿主 免疫原性的。参见Schnur,L.F.等人,(1972)Isrl.J.Med.Sci.8:
932 942； Sergeiev,V.P.等人,(1969)Med.Parasitol.38:208 212；El-On,J.等人, (1979)Exper.Parasitol.47:254 269；和Bray,R.S.等人,(1966)Trans.R.
Soc.Trop.Med.Hyg.60:605 609；美国专利第6,846,648号,美国专利 5,912,166；美国专利
5,719,263；美国专利5,411,865)。
932 942； Sergeiev,V.P.等人,(1969)Med.Parasitol.38:208 212；El-On,J.等人, (1979)Exper.Parasitol.47:254 269；和Bray,R.S.等人,(1966)Trans.R.
Soc.Trop.Med.Hyg.60:605 609；美国专利第6,846,648号,美国专利 5,912,166；美国专利
5,719,263；美国专利5,411,865)。
[0147] 世界范围内大约有40百万人感染导致AIDS的病毒HIV。每年约 3百万人死于该病，他们中的95％是在发展中国家。每年有接近5百 万的人感染HIV。目前在撒哈拉以南非洲，该病的负担最重，但它正 在向诸如印度、中国和俄罗斯的其他国家快速传播。这种流行病在少 数民族人口中蔓延最快。在美国，从1981年起，已经报道了超过 950,000例的AIDS。AIDS袭击处于多产的年纪的人。由于生物学和 社会原因，妇女患HIV/AIDS的危险增加。
[0148] AIDS由人类免疫缺陷病毒(HIV)导致，所述病毒杀死和破坏人体 免疫系统的细胞，并且进行性破坏人体对抗感染和某些癌症的能力。 HIV最普遍的传播是通过与受感染的伴侣进行无保护的性交。对这一 问题最有力的解决方案是预防病毒的播散。实现这一目的的一条途径 是制备安全、有效和负担得起的HIV疫苗。在世界范围内，处于HIV 感染高危险中的5个患者中不到1个采取了有效的预防。
[0149] 诊断HIV感染的方法是已知的，包括通过患者样本的病毒培养、 确定的核酸序列的PCR，以及检测患者血清中抗-HIV抗体的存在的抗 体测试(参见例如,美国专利第6,979,535号,第6,544,728号,第 6,316,183号,第6,261,762号,第4,743,540号)。
[0150] 根据本文公开的某些其他实施方案，疫苗组合物和相关的制剂以 及应用方法可以包括来自癌细胞的抗原，其可以用于癌症的免疫治疗 学治疗。例如，佐剂制剂可以利用肿瘤排斥抗原，诸如前列腺癌、乳 腺癌、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、肾癌或黑色素瘤癌的排斥抗原。 示例性的癌症或癌细胞来源的抗原包括MAGE 1、3和MAGE 4或其 他MAGE抗原如在WO99/40188中公开的那些、PRAME、BAGE、Lage (也被称为NY Eos 1)SAGE和HAGE(WO 99/53061)或GAGE(Robbins and Kawakami,1996Current Opinions in Immunology 8,pps
628-636； Van den Eynde等人,International Journal of Clinical&Laboratory Research(1997&1998)；Correale等人(1997),Journal of the National Cancer Institute 89,p.293。癌抗原的这些非限定性实例表达于诸如黑 色素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌的多种肿瘤类型中。参见，例如美国专 利第6,544,518号。
628-636； Van den Eynde等人,International Journal of Clinical&Laboratory Research(1997&1998)；Correale等人(1997),Journal of the National Cancer Institute 89,p.293。癌抗原的这些非限定性实例表达于诸如黑 色素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌的多种肿瘤类型中。参见，例如美国专 利第6,544,518号。
[0151] 依照某些本文公开的实施方案，适于与GLA一起使用的其他肿瘤 特异性抗原包括但不限于肿瘤特异性或肿瘤相关性神经节苷脂类，如 GM2和GM3或其与载体蛋白的偶联物；或者在GLA疫苗组合物中使 用的用于诱发或增强抗癌症免疫应答的抗原可以是自身肽激素，诸如 用于许多癌症的治疗的全长促性腺激素释放激素(GnRH,WO 95/20600)，一种10个氨基酸长的短肽。在另一个实施方案中，使用 了前列腺抗原，诸如前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、PSCA(例如，Proc. Nat.Acad.Sci.USA 95(4)1735-1740 1998)、PSMA或在优选的实施方 案中的称为前列腺酶(Prostase)的抗原。(例如,Nelson等人,Proc.Natl. Acad.Sci.USA(1999)96:3114-3119；Ferguson等人Proc.Natl.Acad. Sci.USA 1999.96,
3114-3119；WO 98/12302；美国专利第5,955,306号； WO 98/20117；美国专利第5,840,871号和第5,786,148号；WO/004149。 从WO98/137418和WO/004149中可知其他的前列腺特异性抗原。另 一种是STEAP(PNAS 96 14523 14528 7-12 1999)。
3114-3119；WO 98/12302；美国专利第5,955,306号； WO 98/20117；美国专利第5,840,871号和第5,786,148号；WO/004149。 从WO98/137418和WO/004149中可知其他的前列腺特异性抗原。另 一种是STEAP(PNAS 96 14523 14528 7-12 1999)。
[0152] 用于本发明的背景下的其他肿瘤相关抗原包括：Plu-1(J Biol. Chem 274(22)15633-15645,1999)、HASH-1、HasH-2、Cripto(Salomon et al Bioessays 199,21:61-70,美国专利第5,654,140号)和Criptin(美国 专利第5,981,215号)。此外与癌症治疗疫苗特别相关的抗原也包括酪 氨酸酶和存活蛋白。
[0153] 本文公开的涉及包含癌抗原的含有GLA的疫苗组合物的实施方 案可以用于对抗由肿瘤相关抗原表达表征的任何癌症，诸如 HER-2/neu表达或其他癌症特异性或癌症相关抗原。
[0154] 诊断具有或疑似有患癌症危险的个体中的癌症可以通过众多本领 域公认的方法学中的任一种来完成，这可以依赖于包括临床表现、癌 症的进展程度、癌症类型或其他因素而变化。癌症诊断学的实例包括 患者样本(例如，血液、皮肤活检、其他组织活检、手术样本等)的组 织病理学检测、组织细胞化学检测、免疫组织细胞化学检测和免疫组 织病理学检测，对限定的遗传(例如，核酸)标志物的PCR检测，对循 环中的癌相关抗原或携带所述抗原的细胞的血清学检测，或对限定的 特异性抗体的血清学检测，或者本领域技术人员熟悉的其他方法学。 参见，例如，美国专利第6,734,172号；6,770,445号；6,893,820号； 第6,979,730号；第7,060,802号；第7,030,232号；第6,933,123号； 第6,682,901号；第6,587,
792号；第6,512,102号；第7,078,180号； 第7,070,931号；JP5-328975；Waslylyk等人,
1993Eur.J Bioch. 211(7):18。
792号；第6,512,102号；第7,078,180号； 第7,070,931号；JP5-328975；Waslylyk等人,
1993Eur.J Bioch. 211(7):18。
[0155] 本发明的某些实施方案的疫苗组合物和方法可以用于预防或治疗 自身免疫疾病，其包括疾病、状态或病症，其中宿主或个体的免疫系 统不利地介导针对“自身”组织、细胞、生物分子(例如，肽、多肽、蛋 白、糖蛋白、脂蛋白、蛋白脂质、脂质、糖脂、诸如RNA和DNA的 核酸、低聚糖、多聚糖、蛋白聚糖、糖胺聚糖等等，以及个体细胞和 组织的其他分子组分)或抗原决定部位(例如，特异性的免疫限定识别 结构，诸如被抗体可变区互补决定区(CDR)或被T细胞受体CDR识别 的那些)的免疫应答。
[0156] 因此自身免疫疾病的特征在于涉及细胞或抗体的异常免疫应答， 其在任一种情形下都针对正常的自组织。哺乳动物的自身免疫疾病通 常分类为两种不同类型中的一种：细胞介导的疾病(即T-细胞)或抗体 介导的病症。细胞介导的自身免疫疾病的非限定性实例包括多发性硬 化、风湿性关节炎、桥本甲状腺炎、I型糖尿病(青少年型糖尿病)和自 身免疫性葡萄膜视网膜炎(uvoretinitis)。抗体介导的自身免疫病症包括 但不限于重症肌无力、系统性红斑狼疮(或SLE)、甲状腺机能亢进、 自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、自身免疫性哮喘、 冷球蛋白血症、血栓性血小板减少性紫癜、原发性胆管纤维硬化和恶 性贫血。与系统性红斑狼疮有关的抗原是小核核糖核酸蛋白(snRNP)； 与甲状腺机能亢进有关的抗原是促甲状腺激素受体、甲状腺球蛋白和 甲状腺上皮细胞的其他组分(Akamizu等人,1996；Kellerman等人, 1995；Raju等人,1997和Texier等人,1992)；与天疱疮有关的抗原是 类钙粘蛋白(cadherin-like)天疱疮抗原，诸如桥粒芯糖蛋白3和其他黏 附分子(Memar等人,1996:Stanley,1995；Plott等人,1994；and Hashimoto,1993)；以及与血栓性血小板减少性紫癜有关的抗原是血小 板抗原。(参见,例如,美国专利6,929,796；
Gorski等人(Eds.), Autoimmunity(自身免疫),2001,Kluwer Academic Publishers,Norwell, MA；Radbruch and Lipsky,P.E.(Eds.)Current Concepts in Autoimmunity and Chronic Inflammation(自身免疫和慢性炎症的现代 观点)(Curr.Top.Microbiol,and Immunol.(微生物学和免疫学的现代观 点))2001,Springer,NY.)
Gorski等人(Eds.), Autoimmunity(自身免疫),2001,Kluwer Academic Publishers,Norwell, MA；Radbruch and Lipsky,P.E.(Eds.)Current Concepts in Autoimmunity and Chronic Inflammation(自身免疫和慢性炎症的现代 观点)(Curr.Top.Microbiol,and Immunol.(微生物学和免疫学的现代观 点))2001,Springer,NY.)
[0157] 自身免疫参与80多种不同的疾病，包括1型糖尿病、多发性硬化、 狼疮、风湿性关节炎、硬皮病和甲状腺疾病。对于大多数自身免疫疾 病缺乏有关发病率的有力的量化评估。20世纪90年代末完成的最新 研究表明自身免疫疾病是美国第三位最常见的主要疾病；且最常见的 自身免疫疾病影响了超过8.5百万美国人。该疾病流行的目前估值是 美国人口的5％到8％。大多数自身免疫疾病倾向于侵袭女性。可能获 得自身免疫疾病的女性是男性的2.7倍多。女性更易感自身免疫疾病； 男性看起来比女性具有更高水平的天然杀伤细胞活性。(Jacobsen et al, Clinical Immunology and Immunopathology,84:223-243,
1997.)
1997.)
[0158] 当免疫系统将自身组织错认为异物而启动不恰当的攻击时，就发 生了自身免疫疾病。机体可受到自身免疫疾病不同方式的侵袭，包括， 例如肠道(克罗恩氏疾病)和脑(多发性硬化)。已知自身抗体攻击自身细 胞或自身组织以损伤它们的功能，并由此导致自身免疫疾病，并且已 知在自身免疫疾病真正发生(例如，临床体征和症状出现)之前就可以 在患者的血清中检测出自身抗体。因此自身抗体的检测可以早期发现 或识别自身免疫疾病的存在或发展为自身免疫疾病的风险。基于这些 发现，已经发现了针对自身抗原的多种自身抗体，并且在临床检验中 已经测量了针对自身抗原的自身抗体(例如，美国专利6,919,210, 6,596,501,7,012,134,6,919,078)，而其他的自身免疫诊断学可能涉及 相关代谢产物的检测(例如,美国专利第4,659,659号)或免疫学活性(例 如,美国专利第4,614,
722号和第5,147,785号，第4,420,558号，第 5,298,396号，第5,162,990号，第4,420,461号，第4,595,654号，第 5,846,758号，第6,660,487号)。
722号和第5,147,785号，第4,420,558号，第 5,298,396号，第5,162,990号，第4,420,461号，第4,595,654号，第 5,846,758号，第6,660,487号)。
[0159] 在某些实施方案中，本发明的组合物特别适用于治疗老人和/或免 疫低下患者，包括肾透析个体、化疗和/或放疗个体、接受移植者等。 这些个体通常显示对疫苗的减弱的免疫应答，因此使用本发明的组合 物能够增强这些个体达到的免疫应答。
[0160] 在其他实施方案中，用于本发明的组合物中的一种抗原或多种抗 原包括与呼吸系统疾病有关的抗原，诸如由细菌感染(例如，肺炎球菌 感染)导致或加剧的那些疾病，用于预防和治疗诸如慢性阻塞性肺疾病 (COPD)的状态。COPD的生理学定义是在患慢性支气管炎和/或肺气肿 的患者存在不可逆的或部分可逆的呼吸道阻塞(Am J Respir Crit Care Med.1995Nov；152(5Pt 2):S77-121)。COPD的恶化经常是由细菌(例 如，肺炎球菌)感染引起的(Clin Microbiol Rev.2001Apr；14(2):336-63)。
[0161] TLR
[0162] 如本文描述的，本发明的某些实施方案涉及疫苗组合物和免疫佐 剂组合物，包括药物组合物，所述组合物包括一种或多种钟样受体激 动剂(TLR激动剂)。钟样受体(TLR)包括天然免疫系统的细胞表面跨膜 受体，其赋予宿主细胞早期识别多种保守的微生物分子结构的能力， 所述分子结构可以存在于众多传染性病原体内或表面。(例如,Armant 等人,2002Genome Biol.3(8):reviews(综述)3011.1-3011.6；Fearon等人, 1996Science 272:
50；Medzhitov等人,1997Curr.Opin.Immunol.9:4； Luster 2002Curr.Opin.Immunol.14:
129；Lien等人2003Nat.Immunol. 4:1162；Medzhitov,2001Nat.Rev.Immunol.1:135；
Takeda等人,2003 Ann Rev Immunol.21:335；Takeda等人2005Int.Immunol.17:1； Kaisho等人,2004Microbes Infect.6:1388；Datta等人,2003J.Immunol. 170:4102)。
50；Medzhitov等人,1997Curr.Opin.Immunol.9:4； Luster 2002Curr.Opin.Immunol.14:
129；Lien等人2003Nat.Immunol. 4:1162；Medzhitov,2001Nat.Rev.Immunol.1:135；
Takeda等人,2003 Ann Rev Immunol.21:335；Takeda等人2005Int.Immunol.17:1； Kaisho等人,2004Microbes Infect.6:1388；Datta等人,2003J.Immunol. 170:4102)。
[0163] 诱导TLR-介导的信号转导以促进通过天然免疫系统的免疫应答 的启动可以通过TLR激动剂来实现，所述TLR激动剂与细胞表面的 TLR结合。例如，脂多糖(LPS)可以是通过TLR2或TLR4的TLR激 动剂(Tsan等人,2004J.Leuk.Biol.76:514；Tsan等人,2004Am.J. Physiol.Cell Phsiol.286:C739；Lin等人,2005Shock 24:206)；聚(肌苷- 胞苷)(聚I:C)可以是通过TLR3的TLR激动剂(Salem等人,2006 Vaccine 24:5119)；CpG序列(含有未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤或“CpG” 二核苷酸基序的寡聚脱氧核苷酸，例如，CpG 7909,Cooper等人,2005 AIDS 19:1473；CpG 10101Bayes等人Methods Find Exp Clin Pharmacol 27:193；Vollmer等人Expert Opinion on Biological Therapy 5:673；Vollmer等人,
2004Antimicrob.Agents Chemother.48:2314；Deng 等人,2004J.Immunol.173:5148)可以是通过TLR9的TLR激动剂 (Andaloussi et a.,2006Glia 54:526；Chen等人,
2006J.Immunol. 177:2373)；肽聚糖可以是TLR2和/或TLR6的激动剂(Soboll等人,2006 Biol.Reprod.75:131；Nakao等人,2005J.Immunol.174:1566)；3M003 (4-氨基-2-(乙氧甲基)-α,α-二甲基-6,7,8,9-四氢-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-1- 乙醇水合物，分子量318Da，来自
3M Pharmaceuticals,St.Paul,MN,其 也是相关化合物3M001和3M002的来源；Gorden等人,
2005J. Immunol.174:1259)可以是TLR7激动剂(Johansen 2005Clin.Exp. Allerg.35:
1591)和/或TLR8激动剂(Johansen 2005)；鞭毛蛋白可以是 TLR5激动剂(Feuillet等人,
2006Proc.Nat.Acad.Sci.USA 103:12487)； 且丙肝抗原可以作为通过TLR7和/或TLR9的TLR激动剂(Lee等人, 2006Proc.Nat.Acad.Sci.USA 103:1828；Horsmans等人,
2005Hepatol. 42:724)。其他的TLR抗原是已知的(例如，Schirmbeck等人,2003J. Immunol.171:5198)，且依照本文描述的某些实施方可以使用其他的 TLR抗原。
2004Antimicrob.Agents Chemother.48:2314；Deng 等人,2004J.Immunol.173:5148)可以是通过TLR9的TLR激动剂 (Andaloussi et a.,2006Glia 54:526；Chen等人,
2006J.Immunol. 177:2373)；肽聚糖可以是TLR2和/或TLR6的激动剂(Soboll等人,2006 Biol.Reprod.75:131；Nakao等人,2005J.Immunol.174:1566)；3M003 (4-氨基-2-(乙氧甲基)-α,α-二甲基-6,7,8,9-四氢-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-1- 乙醇水合物，分子量318Da，来自
3M Pharmaceuticals,St.Paul,MN,其 也是相关化合物3M001和3M002的来源；Gorden等人,
2005J. Immunol.174:1259)可以是TLR7激动剂(Johansen 2005Clin.Exp. Allerg.35:
1591)和/或TLR8激动剂(Johansen 2005)；鞭毛蛋白可以是 TLR5激动剂(Feuillet等人,
2006Proc.Nat.Acad.Sci.USA 103:12487)； 且丙肝抗原可以作为通过TLR7和/或TLR9的TLR激动剂(Lee等人, 2006Proc.Nat.Acad.Sci.USA 103:1828；Horsmans等人,
2005Hepatol. 42:724)。其他的TLR抗原是已知的(例如，Schirmbeck等人,2003J. Immunol.171:5198)，且依照本文描述的某些实施方可以使用其他的 TLR抗原。
[0164] 例如，借助于背景知识(参见，例如，美国专利第6,544,518号申 请)，已知含有未甲基化的CpG二核苷酸("CpG")的免疫激活型寡核苷 酸可以作为通过全身和粘膜两种途径给药时的佐剂(WO 96/02555,EP 468520,Davis等人,J.Immunol,1998.160(2):870-876；McCluskie and Davis,J.Immunol.,1998,161(9):4463-6)。CpG是存在于DNA中的胞嘧 啶-鸟嘌呤二核苷酸基序的缩写。CG基序在免疫激活中的重要作用由 Krieg,Nature 374,p546
1995阐明。详细的分析已经表明CG基序必须 是在某一序列背景下，且这些序列在细菌DNA中是常见的，但在脊 椎动物DNA中罕见。所述免疫激活序列通常是：嘌呤、嘌呤、C、G、 嘧啶、嘧啶；其中所述二核苷酸CG基序不是甲基化的，但已知其他 未甲基化CpG序列具有免疫激活性，且可以用于本发明的某些实施方 案中。当CpG配制于疫苗中时，它可以在游离的溶液中与游离的抗原 (WO 96/02555；McCluskie and Davis,见上述)一起给药，或与抗原共价 偶联(PCT公布号WO 98/16247)，或者与诸如氢氧化铝的载体配制(例 如,Davis等人见上述,Brazolot-Millan等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 1998,95(26),15553-8)。
1995阐明。详细的分析已经表明CG基序必须 是在某一序列背景下，且这些序列在细菌DNA中是常见的，但在脊 椎动物DNA中罕见。所述免疫激活序列通常是：嘌呤、嘌呤、C、G、 嘧啶、嘧啶；其中所述二核苷酸CG基序不是甲基化的，但已知其他 未甲基化CpG序列具有免疫激活性，且可以用于本发明的某些实施方 案中。当CpG配制于疫苗中时，它可以在游离的溶液中与游离的抗原 (WO 96/02555；McCluskie and Davis,见上述)一起给药，或与抗原共价 偶联(PCT公布号WO 98/16247)，或者与诸如氢氧化铝的载体配制(例 如,Davis等人见上述,Brazolot-Millan等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 1998,95(26),15553-8)。
[0165] 用于本发明的佐剂或疫苗的优选寡核苷酸优选包含由至少三个、 更优选至少6个或多个核苷酸分开的两个或多个二核苷酸CpG基序。 本发明的寡核苷酸通常是脱氧核苷酸。在优选的实施方案中，寡核苷 酸中的核苷酸间是二硫代磷酸酯或更优选硫代磷酸键，尽管磷酸二酯 和其他的核苷酸间键都在包括带有混合核苷酸间键合的寡核苷酸的本 发明的范围内。在美国专利第5,666,153,5,278,302和WO95/26204中 描述了产生硫代磷酸寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法。
[0166] 优选的寡核苷酸的实例具有在下述公开文献中公开的序列；对于 某些本文公开的实施方案，所述序列优选含有硫代磷酸修饰的核苷酸 间键合：
[0167] CPG 7909:Cooper等人,"CPG 7909adjuvant improves hepatitis B virus vaccine seroprotection in antiretroviral-treated HIV-infected adults. (CPG 7909佐剂在抗逆转录病毒治疗的HIV感染的成年人中改善乙型 肝炎病毒疫苗的血清保护)."AIDS,2005Sep 23；19(14):1473-9。
[0168] CpG 10101:Bayes等人,"Gateways to clinical trials(临床试验途 径)."Methods Find.Exp.Clin.Pharmacol.2005Apr；27(3):193-219。
[0169] Vollmer J.,"Progress in drug development of immunostimula-tory CpG oligodeoxynucleotide ligands for TLR9(TLR9的免疫激活性CpG 寡聚脱氧核苷酸配体的药物开发进展)",Expert Opinion on Biological Therapy.2005May；5(5):673-682。
[0170] 可选择的CpG寡核苷酸可以包括上文引用的公开文献中描述的 优选序列变体，其不同在于具有无意义(inconsequential)的核苷酸序列 置换、插入、删除和/或添加。本发明的某些实施方案中使用的CpG 寡核苷可以通过本领域已知的任何方法合成(例如EP 468520)。可以利 用自动合成仪方便地合成这些寡核苷酸。所述寡核苷酸通常是脱氧核 苷酸。在优选的实施方案中，寡核苷酸中的核苷酸间键是二硫代磷酸 酯，或更优选地是硫代磷酸键，尽管磷酸二酯也在本发明涉及的实施 方案范围内。也涉及包含不同核苷酸间键合的寡核苷酸，例如，混合 的硫代磷酸磷酸二酯。也可以使用稳定寡核苷酸的其他核苷酸间键。
[0171] 辅佐剂
[0172] 本文提供的某些实施方案包括疫苗组合物和免疫佐剂组合物，包 括药物组合物，所述组合物除了GLA，含有至少一种辅佐剂，该辅佐 剂指这种组合物中具有不同于GLA的佐剂活性的组分。具有所述佐剂 活性的辅佐剂包括一种成份，其在给予诸如人类(例如人类患者)、非 人类的灵长类、哺乳动物或具有公认的免疫系统的另一种高等真核生 物体的个体时能够改变(即，以统计学上显著的方式增加或降低；以及 在某些优选的实施方案中，增强或增加)免疫应答的能力和寿命。(参 见，例如，Powell and Newman,"Vaccine design-The Subunit and Adjuvant Approach(疫苗设计-亚单位和佐剂方法)",1995,Plenum Press,New York)。在本文公开的某些实施方案中，GLA和期望的抗原， 以及任选地一种或多种辅佐剂可以因此改变，例如诱发或增强针对期 望的抗原的免疫应答，所述抗原可以与GLA同时给药，或者可以在时 间和/或空间上(例如，在不同的解剖学部位)分开给药。但某些发明实 施方案并不限制于此，还涉及在不包括指定抗原的组合物中的GLA的 给药，但所述组合物还可以包括一种或多种TLR激动剂、辅佐剂、咪 唑并喹啉免疫应答调节剂以及双茎环免疫调节剂(dSLIM)。
[0173] 因此如上所述，辅佐剂包括除了GLA之外具有佐剂作用的成分， 诸如皂苷和皂苷类似物，包括QS21和QS21类似物(参见,例如,美国 专利第5,057,540号；EP0362279B1；WO95/17210)、明矾、诸如番茄 素的植物碱、诸如(但不限于)皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰 酪氨酸的去垢剂、一种或多种细胞因子(例如,GM-CSF,IL-2,IL-7, IL-12,TNF-α,IFN-γ)、咪唑并喹啉免疫应答调节剂以及双茎环免疫调 节剂(dSLIM,例如,Weeratna等人,2005Vaccine 23:5263)。
[0174] 在例如美国专利6,544,518，Lacaille-Dubois,M and Wagner H. (1996Phytomedicine 2:363-386)，美国专利第5,057,540号,Kensil,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst,1996,12(1-2):1-55和EP 0 362 279 B1中 讲述了包含皂苷的去垢剂。包含Quil A部分(皂苷)的称为免疫激活复 合物(ISCOMS)的微粒结构是溶血的，且已经用于疫苗的制备中 (Morein,B.,EP 0 109 942 B1)。据报道，这些结构具有佐剂活性(EP 0 109
942 B1；WO 96/11711)。这些溶血皂苷QS21和QS17(Quil A的 HPLC纯化部分)已经作为有效的系统佐剂被描述，且在U.S.Pat. No.5,057,540和EP 0 362 279 B1中公开了它们的制备方法。这些参考 文献中也描述了QS7(Quil-A的非溶血部分)作为系统疫苗的有效佐剂 的用途。在Kensil等人(1991.J.Immunology 146:431-437)中还描述了 QS21的用途。QS21和聚山梨醇酯或环式糊精的组合也是已知的(WO 99/10008)。在WO 96/33739和WO 96/11711中描述了包含诸如QS21 和QS7的QuilA部分的微粒佐剂系统。已经用于系统接种疫苗研究的 其他皂苷包括来自诸如丝石竹属(Gypsophila)和肥皂草属(Saponaria)的 其他植物品种的那些(Bomford等人,Vaccine,10(9):572-577,1992)。
942 B1；WO 96/11711)。这些溶血皂苷QS21和QS17(Quil A的 HPLC纯化部分)已经作为有效的系统佐剂被描述，且在U.S.Pat. No.5,057,540和EP 0 362 279 B1中公开了它们的制备方法。这些参考 文献中也描述了QS7(Quil-A的非溶血部分)作为系统疫苗的有效佐剂 的用途。在Kensil等人(1991.J.Immunology 146:431-437)中还描述了 QS21的用途。QS21和聚山梨醇酯或环式糊精的组合也是已知的(WO 99/10008)。在WO 96/33739和WO 96/11711中描述了包含诸如QS21 和QS7的QuilA部分的微粒佐剂系统。已经用于系统接种疫苗研究的 其他皂苷包括来自诸如丝石竹属(Gypsophila)和肥皂草属(Saponaria)的 其他植物品种的那些(Bomford等人,Vaccine,10(9):572-577,1992)。
[0175] 七叶树皂角素(Escin)是与用于本文公开的实施方案的佐剂组合物 中的皂苷有关的另一种去垢剂。七叶树皂角素在默克索引(第12版： 第3737条目)中被描述为皂苷的混合物，存在于马栗树(horse chestnut tree)，欧洲七叶树(Aesculus hippocastanum)的籽中。描述了它通过层析 和纯化(Fiedler,Arzneimittel-Forsch.4,213(1953))，以及通过离子交换 树脂(Erbring等人,美国专利第3,238,190号)的分离。七叶树皂角素部 分(也称为七叶皂甙)已经被纯化并已显示出具有生物学活性 (Yoshikawa M等人(Chem Pharm Bull(Tokyo)1996August；44(8): 1454-1464))。毛地黄皂苷是另一种去垢剂，也在默克索引(第12版， 第3204条目)中被描述为皂苷，其来自毛地黄(Digitalis purpurea)的籽， 并依照Gisvold等人,J.Am.Pharm.Assoc,1934,23,664和 Rubenstroth-Bauer,Physiol.Chem.,1955,301,621描述的方法被纯化。
[0176] 用于本文公开的某些实施方案中的其他辅佐剂包括嵌段共聚物或 生物可降解聚合物，其涉及本领域相关技术人员熟悉的一类聚合化合 物。可以包括在GLA疫苗组合物内或GLA免疫佐剂内的嵌段共聚物 或生物可降解聚合物的实例包括 L121(BASF Corp., Mount Olive,NJ；参见，例如,Yeh等人,1996Pharm.Res.13:1693；美 国专利第5,565,209号)、CRL1005(例如,Triozzi等人,1997Clin Canc. Res.3:2355)、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)、聚(乳酸)(PLA)、聚 -(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)、以及聚I:C。(参见,例如,Powell and Newman,"Vaccine design-The Subunit and Adjuvant Approach(疫苗设 计-亚单位和佐剂方法)",1995,Plenum Press,New York)
[0177] 某些实施方案涉及包括油的GLA疫苗和GLA免疫佐剂，所述油 在某些此类实施方案中可以促进辅佐剂活性，在其他的此类实施方案 中可以附加地或选择地提供药学上可接受的载体或赋形剂。已知许多 合适的油，基于本发明公开内容其可以被选择包含在疫苗组合物和免 疫佐剂组合物中。举例来说，此类油的实例包括但不限于角鲨烯、角 鲨烷、矿物油、橄榄油、胆固醇和二缩甘露醇单油酸酯。
[0178] 诸如咪唑并喹啉免疫应答调节剂的免疫应答调节剂在本领域也是 已知的，并可以作为辅佐剂包括在本发明公开的某些实施方案中。某 些优选的咪唑并喹啉免疫应答调节剂包括(作为非限定性实例)雷西莫 特(R848)、咪喹莫特和嘎德莫特(Hemmi等人,2002Nat.Immunol. 3:196；Gibson等人,2002Cell.Immunol.218:74；Gorden等人,2005J. Immunol.174:1259)；这些和其他的咪唑并喹啉免疫应答调节剂在适当 的条件下，也可以具有本文描述的TLR激动剂活性。其他的免疫应答 调节剂是基于核酸的双茎环免疫调节剂(dSLIM)。可以在Schmidt等人, 2006Allergy 61:56；Weihrauch等人2005Clin Cancer Res. 11(16):5993-6001；Modern Biopharmaceuticals,J.Knablein(Editor). John Wiley&Sons,December 6,2005.(183至约200页讨论了dSLIM) 中，以及从Mologen AG(Berlin,FRG:[2006年8月18日在 http://www.mologen.com/English/04.20-dSLIM.shtml的在线检索]中发 现被涉及用于本发明公开的某些实施方案中的dSLIM的具体实例。
[0179] 如上文所述，与本文所述的GLA一起使用的一种辅佐剂可以是铝 辅佐剂，其通常被称为“明矾”。明矾辅佐剂基于下述：羟基氧化铝、 磷酸羟铝，或各种专利盐(proprietary salts)。使用明矾辅佐剂的疫苗可 以包括用于破伤风菌株、HPV、甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒的疫 苗以及本文描述的其他抗原。铝辅佐剂是有优势的，因为它们具有良 好的安全记录、能放大抗体应答、稳定抗原并且用于大规模生产相对 简单。(Edelman 2002Mol.Biotechnol.21:129-148；Edelman,R.1980 Rev.Infect.Dis.2:370-383.)[0180] 可以与GLA结合用于有效的免疫刺激的其他辅佐剂包括皂苷和 皂苷类似物，包括QS21以及在本文被称为QS21类似物的产生相似作 用的结构相关化合物。QS21已经被公认为是优选的辅佐剂。QS21可 以包含来自智利皂荚树(Quillaja Saponaria Molina)的树皮、经HPLC纯 化的非毒性部分。在美国专利第5,057,540号中公开了QS21的制备。 (还可参见美国专利第6,936,255号,第7,029,678号和第6,932,972号)
[0181] 在某些实施方案中，GLA也可以与被称为ISCOMS的“免疫激活 复合物”(例如美国专利第6,869,607号，第6,846,489号，第6,027,732 号，第4,981,684号)结合，包括皂苷来源的 其可以 从例如Iscotec(Stockholm,Sweden)和CSL Ltd.(Parkville,Victoria, Australia)商购。
[0182] 重组表达构建体
[0183] 依照本文公开的某些实施方案，GLA疫苗组合物可以含有至少一 种重组表达构建体，其包含可操作连接于编码抗原的核酸序列的启动 子。在某些另外的实施方案中，所述重组表达构建体存在于诸如腺病 毒、腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒或逆转录酶病毒载体的 病毒载体中。制备和使用这些表达构建体和载体的组合物和方法是本 领域已知的，例如依照Ausubel等人(Eds.),Current Protocols in Molecular Biology(新编分子生物学实验指南),2006John Wiley& Sons,NY，用于本文提供的多肽抗原的表达。通常可以在例如美国专 利第6,844,192号；第7,037,712号；第7,052,904号；第7,001,770号； 第6,106,824号；第5,693,531号；第6,613,892号；第6,875,610号； 第7,067,310号；第6,218,
186号；第6,783,981号；第7,052,904号； 第6,783,981号；第6,734,172号；第6,713,068号；
第5,795,577和 6,770,445号以及别处找到用于某些本发明公开的实施方案中的重组 表达构建体的非限定性实例，以及适用于本文提供的多肽抗原表达的 教导。
186号；第6,783,981号；第7,052,904号； 第6,783,981号；第6,734,172号；第6,713,068号；
第5,795,577和 6,770,445号以及别处找到用于某些本发明公开的实施方案中的重组 表达构建体的非限定性实例，以及适用于本文提供的多肽抗原表达的 教导。
[0184] 免疫应答
[0185] 本发明因此提供了在能够启动免疫应答的宿主内改变(即，例如， 相对于本领域的技术人员熟悉的适当对照，以统计学上显著的方式增 强或降低)免疫应答的组合物。正如本领域的普通技术人员已知的，免 疫应答可以是宿主免疫状态的任何积极的改变，其可以包括参与宿主 免疫状态的维持和/或调节的一种或多种组织、器官、细胞或分子的结 构或功能的任何改变。通常，可以通过多种公知的参数的任一种检测 免疫应答，这些参数包括但不限于体内或体外的下述检测：可溶性免 疫球蛋白或抗体的检测；诸如细胞因子、淋巴因子、趋化因子、激素、 生长因子等可溶性介质以及其他可溶性小肽、碳水化合物、核苷和/ 或脂质介质的检测；由免疫系统中细胞改变的功能或结构特性确定的 细胞激活状态的变化，例如细胞增殖、改变的运动性、诸如特异性基 因表达或溶细胞行为的专门活性诱导；通过免疫系统的细胞的细胞分 化，包括改变的表面抗原表达谱或凋亡的启动(程序性细胞死亡)；或 者任何其他可以检测免疫应答存在的标准。
[0186] 免疫应答通常被认为是，例如，通过宿主免疫系统的细胞和组织 在分子和细胞水平上区分自身结构和异已结构，但本发明不应局限于 此。例如，免疫应答还可以包括由自身分子、细胞或组织的免疫识别 导致的免疫系统状态变化，这可以伴随诸如免疫系统组分的典型调节 的许多正常状态，或者可以存在于诸如在自身免疫和退行性疾病中观 测到的不适当的自身免疫应答的病理状态。作为另一个实例，除了诱 导特定免疫系统活性的上调(诸如抗体和/或细胞因子产生，或者细胞 介导的免疫激活)外，免疫应答还可以包括可检测的免疫的抑制、消弱 或任何其他的下调，这可以是由选择的抗原、抗原给药途径、特异耐 受诱导或其他因素导致的。
[0187] 可以通过本领域的普通技术人员易于熟悉的许多公知的免疫学测 定的任一种来建立由本发明的疫苗诱导的免疫应答的检测。这些测定 包括，但不必限于体内或体外的下述检测：可溶性抗体的检测；诸如 细胞因子、淋巴因子、趋化因子、激素、生长因子等可溶性介质以及 其他可溶性小肽、碳水化合物、核苷和/或脂质介质的检测；由免疫系 统中细胞改变的功能或结构特性来确定的细胞激活状态的变化，例如 细胞增殖、改变的运动性、诸如特异性基因表达或溶细胞行为的专门 活性诱导；通过免疫系统的细胞的细胞分化，包括改变的表面抗原表 达谱或凋亡的启动(程序性细胞死亡)。进行这些和类似测定的操作步 骤是公知的，并且可以在例如Lefkovits(Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques(免疫学方法手册:全面的 技术读物资料),1998；也可参见Current Protocols in Immunology(免疫 学实验指南)；还可参见,例如,Weir,Handbook of Experimental Immunology(实验免疫学手册),1986Blackwell Scientific,Boston,MA； Mishell and Shigii(eds.)Selected Methods in Cellular Immunology(细胞 免疫学方法精选),1979Freeman Publishing,San Francisco,CA；Green and Reed,1998Science 281:1309和其中引用的参考文件)中找到。
[0188] 抗原反应性T细胞增殖的检测可以通过多种已知的技术实现。例 如，T细胞增殖可以通过测量DNA合成的速率来检测，且抗原特异性 可以通过控制暴露于候选的抗原反应性T细胞的刺激物(诸如，例如， 特异性期望的抗原-脉冲抗原呈递细胞或对照抗原-脉冲抗原呈递细胞) 来测定。被刺激增殖的T细胞显示了增加的DNA合成速率。测量DNA 合成速率的经典方式是，例如，通过用含氚的胸腺嘧啶脉冲标记T细 胞培养物，所述含氚的胸腺嘧啶是掺入新合成的DNA的核苷前体。 掺入的含氚胸腺嘧啶的量可以用液体闪烁谱仪来测定。检测T细胞增 殖的其他方式包括测量白介素-2(IL-2)产生的增加、Ca2+流出或染料摄 取，诸如3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-联苯-四唑。可选择地，可以测 量淋巴因子(诸如干扰素-γ)的合成，或者可以定量应答特定抗原的T 细胞的相对数目。
[0189] 例如，可以通过采用诸如放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定 (ELISA)、平衡透析或包括Western印迹的固相免疫印迹的体外方法学， 测定来自用本发明的疫苗处理的宿主的样本(例如，包含免疫球蛋白的 样本，诸如血清、血浆或血液)来检测抗原特异性抗体的产生。在优选 的实施方案中，ELISA测定还可以包括用靶抗原特异性的固相单克隆 抗体进行靶抗原的抗原捕获固定，例如，以增加该测定的敏感性。例 如，使用商业途径容易得到的方法、装置和试剂(例如Sigma,St.Louis, MO；还参见R&D Systems 2006Catalog,R&D Systems,Minneapolis, MN)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)也可以容易地检测可溶性介质 (例如，细胞因子、趋化因子、淋巴因子、前列腺等)的详细结果。
[0190] 许多其他的免疫学参数可以使用本领域公知的常规测定来监测。 这些可以包括，例如，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC) 测定、继发性体外抗体应答、利用已确立的标志物抗原系统进行各种 外周血细胞或淋巴样单核细胞亚群的流式免疫细胞荧光测定分析、免 疫组织化学或其他相关的测定。例如，可以在Rose等人(Eds.),Manual of Clinical Laboratory Immunology,5th Ed.(临床实验室免疫学手册，第 5版),1997American Society of Microbiology,Washington,DC中找到 这些和其他测定。
[0191] 因此，本发明涉及本文提供的疫苗和佐剂组合物能够诱发或增强 宿主的至少一种免疫应答，所述免疫应答选自TH1-型T淋巴细胞反应、 TH2-型T淋巴细胞反应、细胞毒T淋巴细胞(CTL)反应、抗体应答、 细胞因子反应、淋巴因子反应、趋化因子反应以及炎症反应。在某些 实施方案中，免疫应答可以包含下述中的至少一种：一种或多种细胞 因子的产生，其中所述细胞因子选自干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子 -α(TNF-α)；一种或多种白介素的产生，其中所述白介素选自IL-1、 IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-
16、IL-18 和IL-23；一种或多种趋化因子的产生，其中所述趋化因子选自 MIP-1α、MIP-1β、RANTES、CCL4和CCL5；以及选自记忆性T细 胞反应、记忆性B细胞反应、效应T细胞反应、细胞毒性T细胞反应 以及效应B细胞反应的淋巴细胞反应。参见，例如WO 94/00153；WO 95/
17209；WO 96/02555；U.S.6,692,752；U.S.7,084,256；U.S. 6,977,073；U.S.6,749,856；
U.S.6,733,763；U.S.6,797,276；U.S. 6,752,995；U.S.6,057,427；U.S.6,472,515；U.S.6,
309,847；U.S. 6,969,704；U.S.6,120,769；U.S.5,993,800；U.S.5,595,888；Smith等 人,
1987J Biol Chem.262:6951；Kriegler等人,1988Cell 53:45 53；Beutler等人,
1986Nature 320:584；U.S.6,991,791；U.S.6,654,462； U.S.6,375,944。
16、IL-18 和IL-23；一种或多种趋化因子的产生，其中所述趋化因子选自 MIP-1α、MIP-1β、RANTES、CCL4和CCL5；以及选自记忆性T细 胞反应、记忆性B细胞反应、效应T细胞反应、细胞毒性T细胞反应 以及效应B细胞反应的淋巴细胞反应。参见，例如WO 94/00153；WO 95/
17209；WO 96/02555；U.S.6,692,752；U.S.7,084,256；U.S. 6,977,073；U.S.6,749,856；
U.S.6,733,763；U.S.6,797,276；U.S. 6,752,995；U.S.6,057,427；U.S.6,472,515；U.S.6,
309,847；U.S. 6,969,704；U.S.6,120,769；U.S.5,993,800；U.S.5,595,888；Smith等 人,
1987J Biol Chem.262:6951；Kriegler等人,1988Cell 53:45 53；Beutler等人,
1986Nature 320:584；U.S.6,991,791；U.S.6,654,462； U.S.6,375,944。
[0192] 药物组合物
[0193] 本文提供了包含本文所述的水包油乳剂的组合物(包括药物组合 物)。在一些实施方案中，组合物还包含药物可接受的载体、赋形剂或 稀释剂。在一些实施方案中，药物组合物是疫苗组合物。向个体给予 本文所述的组合物以刺激个体的免疫应答(包括非特异性反应和抗原 特异性反应)。在一些实施方案中，个体是哺乳动物(例如包括家畜(牛、 猪、山羊、马等)和宠物(猫、狗等)或人)。在一些实施方案中，个体为 恒温动物。
[0194] 药物组合物通常包含GLA(可从Avanti Polar Lipids,Inc., Alabaster,AL购买；产品号699800)，且还可以包含本文提供的与药学 上可接受的载体、赋形剂或稀释剂结合的一种或多种组分，其选自抗 原、TLR激动剂、辅佐剂(任选地包括细胞因子、咪唑并喹啉免疫应答 调节剂和/或dSLIM)和/或重组表达构建体。
[0195] 因此，在某些方面，本发明涉及GLA“单治疗”，其中如本文所述 的，GLA被配制于基本上没有其他抗原的乳剂中，并被给予个体以激 活免疫应答，例如非特异性免疫应答，由此治疗或预防疾病或其他状 态，诸如生物体导致的感染。在一个实施方案中，例如，本发明的组 合物和方法采用了单磷酰二糖用于激活个体的免疫应答。在另一特定 实施方案中，所述组合物和方法使用脂质A的2-单酰形式来激活个体 的免疫应答。在另一特定实施方案中，GLA采用了喷雾形式，任选地 以试剂盒的形式提供。
[0196] GLA可以优选配制于本文所述的稳定的乳剂中。在一个特定的实 施方案中，例如，提供了在基本上没有其他抗原的稳定乳剂中包含脂 质A衍生物的组合物。在另一个特定的实施方案中，提供了适用于哺 乳动物的包含3-酰基单磷酸脂质A的衍生物的组合物，其中2位氨基 具有单酰链，且该组合物基本上没有其他抗原。
[0197] 在某些其他实施方案中，药物组合物是包含GLA和抗原的疫苗组 合物，另外还可以包含本文提供的与药学上可接受的载体、赋形剂或 稀释剂结合的一种或多种组分，其选自TLR激动剂、辅佐剂(包括例 如细胞因子、咪唑并喹啉免疫应答调节剂和/或dSLIM)等和/或重组表 达构建体。
[0198] 示例性的载体在使用的剂量和浓度对受者无毒。对于基于GLA加 核酸的疫苗，或者对于包含GLA和抗原的疫苗，每千克体重给予约 0.01μg至约100mg，通常是通过皮内、皮下、肌肉内或静脉内途径或 通过其他途径给予。
[0199] 优选的剂量是约1μg/kg至约1mg/kg，特别优选的是约5μg/kg 至约200μg/kg。对本领域的技术人员显而易见的是，给药的数量和频 率依赖于宿主的反应。用于治疗用途的“药学上可接受的载体”是药学 领域公知的，且在例如Remingtons Pharmaceutical Sciences(雷明顿药 物科学),Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中被描述。例 如，可以使用生理学pH的无菌盐水和磷酸缓冲盐。防腐剂、稳定剂、 染料以及甚至调味剂都可以提供在药物组合物中。例如，苯甲酸钠、 山梨酸和对羟基苯甲酸酯可以作为防腐剂加入。同上在1449。此外， 可以使用抗氧化剂和悬浮剂。同上。
[0200] “药学上可接受的盐”指本发明的化合物的盐，其来自所述化合物 和有机酸或无机酸(酸加成盐)或者有机或无机碱(碱加成盐)的合并物。 本发明的组合物可以以游离碱或盐的形式使用，两种形式都被认为是 在本发明的范围内。
[0201] 药物组合物可以是允许该组合物给予患者的任何形式。例如，所 述组合物可以是固体、液体或气体(气溶胶)的形式。给药的典型途径 包括，但不限于，口部的、表面的、肠胃外的(例如舌下的或经颊的)、 舌下的、直肠的、阴道的以及鼻内的(例如作为喷雾剂)。本文使用的 术语肠胃外的包括电离子导入(例如U.S.7,033,598；7,018,345； 6,970,739)、超声波导入(例如，U.S.4,780,212；4,767,402；4,948,587； 5,618,275；5,656,016；5,722,397；6,322,532；6,018,678)、热的(例如 U.S.5,885,211；6,685,699)、被动透皮(例如U.S.3,598,122；3,598,123； 4,286,592；4,314,557；4,379,454；4,568,343；5,464,387；UK Pat.Spec. No.2232892；U.S.6,871,477；6,974,588；6,676,961)、微针(例如U.S. 6,908,
453；5,457,041；5,591,139；6,033,928)给药，且还包括皮下注 射、静脉内、肌肉内、胸骨内、海绵窦内(intracavernous)、鞘内 (intrathecal)、外耳道内(intrameatal)、尿道内注射或输注方法。在特定 的实施方案中，本文描述的组合物(包括疫苗和药物组合物)通过选自 电离子导入、微气穴(microcavitation)、超声波导入或微针的技术皮内 给药。
453；5,457,041；5,591,139；6,033,928)给药，且还包括皮下注 射、静脉内、肌肉内、胸骨内、海绵窦内(intracavernous)、鞘内 (intrathecal)、外耳道内(intrameatal)、尿道内注射或输注方法。在特定 的实施方案中，本文描述的组合物(包括疫苗和药物组合物)通过选自 电离子导入、微气穴(microcavitation)、超声波导入或微针的技术皮内 给药。
[0202] 如此配制药物组合物以使在将该组合物给予患者时，包含其中的 活性成分是生物可利用的。给予患者的组合物采用一个或多个剂量单 位的形式，其中，例如，药片可以是单一剂量单位，以气溶胶形式的 本发明的一种或多种化合物的容器可以有多个剂量单位。
[0204] 组合物可以是液体形式，例如酏剂、糖浆、溶液、乳剂或悬浮剂。 作为两个实例，所述液体可以口服给药或通过注射递送。当意欲口服 给药时，优选的组合物包含甜味剂、防腐剂、染色/着色剂以及增味剂 的一种或多种。在意欲通过注射给药的组合物中，可以包括表面活性 剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲液、稳定剂和等渗剂的 一种或多种。
[0205] 本文使用的液体药物组合物药物组合物，无论是以溶液、悬浮液 的形式或其他相似的形式，都可以包括下述载体或赋形剂的一种或多 种：诸如注射水、盐水溶液、优选生理盐水、林格液、等渗氯化钠的 无菌稀释液，诸如角鲨烯、角鲨烷、矿物油、二缩甘露醇单油酸酯、 胆固醇和/或合成的单和二甘油酯的可以作为溶剂或悬浮介质的不挥 发性油，聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其他溶剂；诸如苯甲醇或尼泊 金甲酯的抗菌剂；诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠的抗氧化剂；诸如乙二 胺四乙酸的螯合剂；诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐的缓冲液以及诸 如氯化钠或葡萄糖的张力调节剂。肠胃外制剂可以装入安瓿、一次性 注射器或由玻璃或塑料制成的多次剂量瓶内。可注射的药物组合物优 选是无菌的。
[0206] 在特别的实施方案中，本发明的药物或疫苗组合物包含小于0.2 um的稳定水悬浮液，且进一步包含选自磷脂、脂肪酸、表面活性剂、 去垢剂、皂苷、含氟脂(fluorodated lipids)等的至少一种组分。
[0207] 在另一个实施方案中，本发明的组合物以可以雾化的方式配制。
[0208] 在疫苗或药物组合物中包括诸如递送载体的其他组分也可以是理 想的，所述递送载体包括但不限于铝盐、油包水型乳剂、生物可降解 油载体、水包油型乳剂、生物可降解微胶囊以及脂质体。在上文也描 述了用于所述载体中的另外免疫激活物质(辅佐剂)的实例，其可以包 括N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸-D-异谷酰胺(MDP)、葡聚糖、IL-12、 GM-CSF、γ干扰素和IL-12。
[0209] 尽管本发明的药物组合物可以使用本领域的技术人员已知的任何 合适的载体，但载体的类型依赖给药方式和是否需要持续释放而变化。 对于肠胃外给药，诸如皮下注射，载体优选包含水、盐水、乙醇、脂 肪、蜡或缓冲液。对于口服给药，可以使用上述载体的任一种或固体 载体，诸如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、 葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。也可以使用生物可降解的微球体(例如聚乳交 酯(polylactic galactide))作为本发明的药物组合物的载体。例如在美国 专利第4,897,268号和第5,075,109号中公开了合适的生物可降解的微 球体。在这点上，大于约25微米的微球体是优选的。
[0210] 药物组合物(包括GLA疫苗和GLA免疫佐剂)也可以含有诸如缓 冲液的稀释液，诸如抗坏血酸的抗氧化剂、低分子量(少于约10个残 基)的多肽、蛋白质、氨基酸、包括葡萄糖、蔗糖或糊精的碳水化合物， 诸如EDTA的螯合剂，谷胱甘肽和其他稳定剂和赋形剂。中性缓冲盐 水或与非特异性血清白蛋白混合的盐水是示例性的适当的稀释液。优 选地，使用适当的赋形剂溶液(例如，蔗糖)作为稀释液可以将产品配 制成冷冻干产物。
[0211] 如上文所述，在某些实施方案中，本发明包括能够递送编码期望 的抗原的核酸分子的组合物。这种组合物包括重组病毒载体(例如，逆 转录病毒(参见WO 90/07936,WO 91/02805,WO 93/25234,WO 93/25698和WO 94/03622)、腺病毒(参见Berkner,Biotechniqυes
6:616-627,1988；Li等人,Hum.Gene Ther.4:403-409,1993；Vincent 等人,Nat.Genet.5:
130-134,1993；and Kolls等人,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 97:215-219,1994)，痘病毒(参见美国专利第4,769,330号；美国专 利第5,017,487号；和WO 89/01973))、络合到聚阳离子分子的重组表 达构建体核酸分子(参见WO 93/03709)，以及与脂质体结合的核酸(参 见Wang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7851,1987)。在某些实施 方案中，DNA可以连接到杀死的或灭活的腺病毒(参见Curiel等人, Hum.Gene Ther.3:147-154,1992；Cotton等人,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:6094,1992)。其他合适的组合物包括DNA-配体(参见Wu等人, J.Biol.Chem.264:16985-16987,1989)和脂质-DNA组合物(参见 Feigner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7417,1989)。
6:616-627,1988；Li等人,Hum.Gene Ther.4:403-409,1993；Vincent 等人,Nat.Genet.5:
130-134,1993；and Kolls等人,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 97:215-219,1994)，痘病毒(参见美国专利第4,769,330号；美国专 利第5,017,487号；和WO 89/01973))、络合到聚阳离子分子的重组表 达构建体核酸分子(参见WO 93/03709)，以及与脂质体结合的核酸(参 见Wang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7851,1987)。在某些实施 方案中，DNA可以连接到杀死的或灭活的腺病毒(参见Curiel等人, Hum.Gene Ther.3:147-154,1992；Cotton等人,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:6094,1992)。其他合适的组合物包括DNA-配体(参见Wu等人, J.Biol.Chem.264:16985-16987,1989)和脂质-DNA组合物(参见 Feigner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7417,1989)。
[0212] 除了直接的体内操作，也可以采用间接体内(ex vivo)操作,其中将 细胞从宿主取出，修饰并置入相同的宿主动物或另外的宿主动物。显 然，本领域技术人员可以利用上述组合物的任一种将编码抗原的核酸 分子导入间接体内环境中的组织细胞。用于病毒的、物理的和化学的 摄取方法的操作是本领域公知的。
[0213] 因此，本发明用于增强或诱发宿主、患者或细胞培养物的免疫应 答。如本文使用的，术语“患者”指任何温血动物，优选人类。患者可 以罹患传染性疾病、诸如乳腺癌的癌症或自身免疫疾病，或者可以是 正常的(即，没有可检测的疾病和/或感染)。“细胞培养物”是含有免疫 活性细胞或免疫系统的分离的细胞(包括，但不限于，T细胞、巨噬细 胞、单核细胞、B细胞和树突状细胞)的任何制备物。所述细胞可以通 过本领域普通技术人员公知的多种技术来分离(例如聚蔗糖-泛影葡胺 (Ficoll-hypaque)密度离心)。细胞可以(但不必须)从罹患癌症的患者中 分离出，且可以重新导入治疗后的患者。
[0214] 在某些实施方案中，意欲肠胃外或口服给药的液体组合物应该含 有一定量的GLA疫苗组合物以达得合适的剂量。通常，该量是组合物 中抗原重量的至少0.01％。当意欲口服给药时，该量可以在组合物重 量的0.1％至约70％变动。优选的口服组合物含有约4％至约50％的抗 原。优选的组合物和制剂如下制备：使肠胃外剂量单位含有0.01％至 1％重量比的活性成分。
[0215] 药物组合物可以用于表面给药，在这种情况下，载体可以适宜地 包括溶液、乳剂、药膏或凝胶基质。所述基质，例如，可以包括下述 中的一种或多种：矿脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、诸如水 和乙醇的稀释液，以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可以存在于用于表面 给药的药物组合物中。如果计划透皮给药，组合物可以包括透皮贴片 或电离子导入装置。表面制剂可以含有来自约0.1％至约10％w/v(每 单位体积的重量)的抗原(例如GLA-抗原疫苗组合物)或GLA(例如免 疫佐剂组合物；GLA可以从Avanti Polar Lipids,Inc.,Alabaster,AL处 得到；例如产品号699800)的浓缩物。
[0216] 意欲直肠给药的组合物，可以采用例如栓剂的形式，其在直肠内 溶化并释放出药物。用于直肠给药的组合物可以含有作为合适的无刺 激赋形剂的油脂性基质。这种基质包括，但不限于，羊毛脂、可可油 和聚乙二醇。在本发明的方法中，疫苗组合物/佐剂可以通过使用插入 物、珠子、延时释放制剂、贴片或快速释放制剂来给药。
[0217] 某些实施方案也涉及包含本文描述的GLA疫苗组合物和/或GLA 免疫佐剂组合物的试剂盒，其可以以一种或多种容器提供。在一个实 施方案中，GLA疫苗组合物和/或GLA免疫佐剂组合物的所有组分共 同存在于单个容器内，但本发明的实施方案并不限制于此，还可以涉 及两个或多个容器，其中，例如，GLA免疫佐剂组合物与抗原组分分 离，互不接触。通过非限定的理论，认为在一些情况下，GLA免疫佐 剂组合物的单独给药是有益的，而在另一些情况下，这种给药与抗原 的给药在时间上和/或空间(例如在不同的解剖部位)上分开是有益的， 仍在另一些情况下，个体的给药是有益地给予本文所述的GLA疫苗组 合物，其包含抗原和GLA，以及任选地，最好还是本文所述的其他组 分。
[0218] 所述试剂盒实施方案的容器可以是任何合适的容器，器皿、小瓶、 安瓿、管子、杯子、盒子、瓶子、长颈瓶、罐、盘、单孔或多孔器械 的孔、槽、桶等等，或者其他装置，本文公开的组合物可以在其中放 置、储存和/或转运，并易于移走其中的内容物。通常，这种容器可以 由与目的用途相兼容的材料制造，从中可以容易地实现包含的内容物 的回收。这种容器的优选实例包括玻璃和/或塑料密封的或可重新密封 的管子和安瓿，包括具有橡胶隔膜的那些或其他密封的装置，其使用 针和注射器与内容物的回抽兼容。例如，这样的容器可以由玻璃或化 学兼容的塑料或树脂制成，该玻璃或化学兼容的塑料或树脂可以由一 种材料制成，也可以是涂覆由这种材料，该材料允许容器中的物质的 有效回收和/或保护这种物质免受例如诸如紫外线或温度极限的降解 条件的影响，或防止包括微生物污染物的不必要的污染物进入。容器 优选地为无菌的或可灭菌的，并且由可与任何载体、赋形剂、溶剂、 媒介物等兼容的材料制成，这样可被用于悬浮或溶解本文所描述的疫 苗组合物和/或免疫佐剂组合物和/或抗原和/或重组表达构建体等等。
[0219] 下面提供的实施例用于说明而非限制。实施例
[0220] 实施例1
[0221] 乳剂佐剂剂量滴定及TLR4激动剂制剂对重组疟疾疫苗免疫原性的作 用
[0222] 导论
[0223] 水包油(o/w)乳剂已经安全且成功地用作现代疫苗中的佐剂。最显 著的o/w乳剂是 和 其分别由Novartis和GSK Biologicals生产。这两种佐剂均包含在最终疫苗制剂中约2.5％v/v的 角鲨烯[1]。然而，直至最近，仅公开了少数与选择这种角鲨烯浓度的 启示相关的报道[2-4]。此外，最近的研究表明MF59的稀释不损害流 行性流感疫苗临床试验中的免疫应答[5]。如果通过降低角鲨烯剂量来 维持佐剂活性，则可能会降低o/w乳剂的局部反应原性。此外，疫苗 成本会降低，同时可用的佐剂供应会增加，由此在资源贫乏的国家中 使疫苗和佐剂生产变得更切实可行。
[0224] 重组疟疾抗原PfCelTOS(用于动合子和孢子体的遍布恶性疟原虫 (Plasmodium falciparum)细胞的蛋白)与乳剂佐剂( ISA 720) 的组合已经在异源攻击模型的60％的小鼠中表现出保护效能[6]。 PfCelTOS抑制孢子体运动和肝细胞感染性，并且可成为下一代疟疾疫 苗的重要组分。细胞免疫应答和体液免疫应答对保护效能均为重要的 [6,7]。
[0225] 在这项工作中，我们评价了基于角鲨烯的稳定乳剂(SE)佐剂在对 PfCelTOS的体液细胞免疫应答和细胞免疫应答方面的剂量作用。此 外，我们研究了在疫苗制剂中包含合成TLR4激动剂(吡喃葡萄糖脂佐 剂，GLA)的作用。我们表明在GLA-SE中小于2％v/v的角鲨烯浓度 可以诱发与2％v/v角鲨烯浓度相同的佐剂应答。该发现对于疫苗佐剂 生产和给药以及可能对油浓度更敏感的给药新途径(例如皮内给药)而 言具有重大意义。此外，我们表明存在GLA使免疫应答朝向Th1-型 应答发展，诱发更高水平的IgG2a抗体滴度、产生IFN-γ的细胞和长 期存活的分泌抗体的浆细胞，这对于疫苗效能可能是重要的。
[0226] 材料和方法
[0227] 免疫制剂。鲨鱼肝脏角鲨烯(≥98％纯度)购自Sigma-Aldrich(St. Louis,MO)。甘油和α-生育酚购自Spectrum Chemical(Gardena,CA)。 泊洛沙姆188( F68)得自BASF(Ludwigshafen,Germany)或 Spectrum Chemical。蛋黄磷脂酰胆碱(蛋黄PC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油 -3-磷酸胆碱(DPPC)和吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)得自Avanti Polar Lipids,Inc.(Alabaster,AL)。磷酸铵缓冲剂组分也得自J.T.Baker。可 以通过制成单独的水相和油相来制备乳剂制剂。将泊洛沙姆188、甘 油和缓冲剂组分通过搅拌来溶解在水相中，而蛋黄磷脂酰胆碱通过超 声处理和加热来溶解在油相中。然后用Silverson Heavy Duty Laboratory Mixer Emulsifier(3/4英寸管状方形孔高剪切筛选附加装 置；East Longmeadow,MA)以约7,000RPM将水相和油相(10％v/v油) 混合10分钟，从而产生粗制乳剂。通过Microfluidics M110P(Newton, MA)高压均化器以约207MPa(约30,000psi)处理粗制乳剂，持续12 个工作循环。通过在有机溶剂中将GLA与DPPC以4.2:1摩尔比预混 合，然后溶剂蒸发和用超纯水水合，从而形成GLA的水性悬浮液。约 70℃的水浴超声处理形成纳米颗粒水性悬浮液GLA-AF。在整个免疫 接种方案期间，在5℃通过尺寸和GLA浓度来监测制剂。通过前述 的动态光散射来测量粒径[8]。GLA浓度由HPLC-CAD监测[9]。在免 疫接种当天，将乳剂用PBS稀释至指定的油浓度，并且与抗原和 GLA-AF(若适用的话)混合。ISA 720购自Seppic Inc. (Fairfield,NJ)，并且通过在免疫接种前与30％
v/v水相混合而制备。 整个文本中，乳剂剂量是指油在最终疫苗制剂中的％v/v；油与乳化剂 之比在所有剂量下保持恒定。在Walter Reed Army Institute of Research 开发并生产密码子协调化的重组抗原PfCelTOS，并将其提供至IDRI 作为磷酸盐缓冲剂中的纯化主体，这承蒙Dr.Evelina Angov的好意。
v/v水相混合而制备。 整个文本中，乳剂剂量是指油在最终疫苗制剂中的％v/v；油与乳化剂 之比在所有剂量下保持恒定。在Walter Reed Army Institute of Research 开发并生产密码子协调化的重组抗原PfCelTOS，并将其提供至IDRI 作为磷酸盐缓冲剂中的纯化主体，这承蒙Dr.Evelina Angov的好意。
[0228] 免疫学方法
[0229] 使用Prism(GraphPad软件,La Jolla,CA)测定终点滴度，然后在稀 释下测定曲线拟合(可变斜率)值，终点滴度对应于如之前[10]所述的以 C＝X+SDf测定的截止值(C)，其中X是平均值且SD是负血浆对照 板的标准偏差，且f是99.9％置信水平下的乘数。如果上述测定的截 止值小于0.1OD，则指定该截止值为0.1OD。在个别情况下，单个板 的孔显示在最高稀释附近的异常高的读数。通过采用Grubb检验在 99％置信水平，对疑似值与上述稀释附近的4次稀释进行对比，从曲 线拟合排除这些值[11]。
[0230] 结果
[0231] GLA-AF和SE是稳定的纳米颗粒制剂[12]。GLA-AF是GLA和 磷脂颗粒的水性纳米悬浮液。SE是基于角鲨烯的纳米乳剂，通常以 2％v/v角鲨烯用于免疫接种。为了促进乳剂剂量滴定并同时保持GLA 浓度恒定，将GLA-AF添加至指定浓度的SE，然后立即对标记为 GLA-SE的实验组进行免疫接种。用于本研究的制剂批次的平均粒径 为88nm-98nm，并示于表1中。在图1中示出GLA在不同批次的 GLA-AF中随时间的浓度，证明了在下述体内研究的持续时间及至少 6个月内TLR激动剂浓度的稳定性。 ISA 720是油包水佐 剂，其通常以70％v/v角鲨烯用于免疫接种，并且先前表明在疟疾攻 击模型中PfCelTOS的显著无菌保护[6]。 ISA 720因此用 作下述免疫原性研究的正对照。
[0232] 用PfCelTOS疫苗组合物对BALB/c小鼠进行免疫3次，并且注射 之间为3周。图2示出在第2次和第3次免疫接种之后全部IgG、IgG1 和IgG2a抗体终点滴度。在第3次免疫接种(图2d-f)之后，SE剂量滴 定的影响是明显的，即，0.02％SE组与2％SE组相比，全部IgG、IgG1 和IgG2a应答降低。0.1％和0.5％SE组也表现出比2％SE组更低的 IgG2a应答。然而，添加GLA可能消除这种SE剂量滴定作用：所有 GLA-SE组不管乳剂剂量如何，均诱发相同的IgG、IgG1和IgG2a应 答。实际上，GLA-AF组(不含乳剂)与GLA-SF组相比诱发相同的抗体 应答。明显地，与不含GLA的相同疫苗组合物相比，GLA(无论是SE 还是AF)的存在诱发更强的IgG2a应答。 组表现出最高的 IgG1应答，尽管与2％SE或0.5％GLA-SE组相比并非显著不同。在 第2次免疫接种之后的抗体应答表现出与上述类似的形式，尽管总体 滴度略微更低(图2a-c)。此外，多个GLA-SE组与GLA-AF相比表现 出显著更高的IgG2a和IgG1应答。最后，与仅抗原的组相比，包含 GLA(SE或AF)、 或2％SE的疫苗诱发骨
髓中较高数量的 分泌抗体的浆细胞(图2g)。有趣地，与最大2％SE剂量相比，0.02％SE 表现出降低水平的分泌抗体的浆细胞，反映出IgG抗体终点滴度。
髓中较高数量的 分泌抗体的浆细胞(图2g)。有趣地，与最大2％SE剂量相比，0.02％SE 表现出降低水平的分泌抗体的浆细胞，反映出IgG抗体终点滴度。
[0233] 在另一实验中，采用较窄范围的SE剂量滴定(0.5％-2％)，并且 研究细胞应答及体液应答。在图3中，示出在第2次和第3次免疫接 种之后测量的全部IgG、IgG1和IgG2a抗体终点滴度。在第3次免疫 接种(图3d-f)之后，所有佐剂的组与单独抗原相比表现出更高的总IgG 应答。然而，0.5％剂量的SE与单独抗原相比不能诱发更高的IgG1抗 体，并且所有SE剂量与单独抗原相比不能诱发更高的IgG2a应答。 相反，所有含GLA的组与单独抗原相比表现出更高的IgG、IgG1和 IgG2a应答。与不含GLA的相同组合物相比，GLA显著增加所有组中 的IgG2a应答。尽管 组与所有其他组相比表现出显著更高 的IgG1滴度，但0.5％和1％SE剂量的GLA-SE组与 组相 比诱发更高的IgG2a应答。相似的形
式在第2次免疫接种(图3a-c)之 后是明显的，但与第3次免疫接种后的结果相反，0.5％SE剂量诱发 了高IgG1应答。由含GLA或 的疫苗诱发更高数量的分泌 抗体的浆
细胞(图3g)，尽管在多个SE浓度中剂量滴度作用是不明显 的。
式在第2次免疫接种(图3a-c)之 后是明显的，但与第3次免疫接种后的结果相反，0.5％SE剂量诱发 了高IgG1应答。由含GLA或 的疫苗诱发更高数量的分泌 抗体的浆
细胞(图3g)，尽管在多个SE浓度中剂量滴度作用是不明显 的。
[0234] 通过细胞因子ELISPOT测定来研究细胞应答。与单独抗原、 GLA-AF、不含GLA的SE、或 组相比，1％或2％SE剂量 的GLA-SE组诱发更高水平的产生IFN-γ的细胞(图4a)。相反，GLA-SE 组表现出可忽略水平的分泌IL-5的细胞(图4b)，而2％SE组与单独抗 原的组或 组相比诱发更高水平的分泌IL-5的细胞。相似 趋势在多重细胞因
子微珠分析结果中是明显的，其中由GLA-SE组诱 导Th1细胞因子IFN-γ的产生，而增加的Th2细胞因子如IL-5、IL-10 和IL-13与不含GLA的乳剂组相关(图5)。2％SE剂量诱发最高的Th2 细胞因子细胞应答(例如IL-5和IL-13)。
子微珠分析结果中是明显的，其中由GLA-SE组诱 导Th1细胞因子IFN-γ的产生，而增加的Th2细胞因子如IL-5、IL-10 和IL-13与不含GLA的乳剂组相关(图5)。2％SE剂量诱发最高的Th2 细胞因子细胞应答(例如IL-5和IL-13)。
[0235] 讨论
[0236] 将GLA包含在上述疫苗组合物中使免疫应答朝向Th1偏性发展， 如显著更高的IgG2a抗体和IFN-γ产生所证明。尽管在先前CelTOS 研究中未发现总抗体产生与保护效能相关，但未进行抗体同种型分析 [6,7]。因此，不清楚更高的IgG2a抗体产生是否表示保护能力的增加。 然而，IFN-γ产生可能与疫苗效能相关[6,7]。因此，GLA-SE佐剂可 以是用于在CelTOS疫苗中产生保护效能的良好候选者。我们此处注 意到乳剂对于IFN-γ产生可能是必要的(即，GLA-SE组)，而GLA-AF 组诱发的抗体滴度在第3次免疫接种之后与GLA-SE组相似。有趣地， 乳剂剂量从2％降低至1％未降低GLA-SE组中的IFN-γ或抗体产生。 最后，与单独抗原相比，包含GLA还诱导显著更高的长期存活的分泌 抗体的细胞。整体上，GLA使免疫应答朝向Th1偏性发展，并且在骨 髓中诱导更高数量的分泌抗体的浆细胞，尽管似乎小于2％的乳剂浓度 对于这些作用可为足够的。
[0237] 在不含GLA的乳剂组中，降低的佐剂浓度的作用更加不明显。因 此，与在2％SE组中相比，在1％SE组中产生IL-5的细胞的水平更 低，并且与仅用抗原相比，仅2％SE组表现出更高量的IL-13。在抗 体终点滴度、尤其在最低乳剂浓度组(0.02％SE)中展示出乳剂剂量滴 定的作用。所述最低乳剂浓度组与2％SE组相比诱发更低的IgG、IgG1 和IgG2a以及更低水平的分泌抗体的浆细胞。然而，0.5％和1％的SE 浓度与最大2％SE剂量相比诱发相似水平的IgG和IgG1抗体滴度以 及相似水平的分泌抗体的浆细胞。然而，对于更低浓度的SE、尤其在 0.02％的最高稀释下，总体免疫应答可能略微降低。
[0238] 疫苗中乳剂浓度的降低可具有多种应用，例如节约成本、降低局 部反应原性、供替代的递送途径以及促进幼儿的免疫。我们已经表明 在存在TLR激动剂的情况下，包含低量乳剂的佐剂可产生与最大2％ 油乳剂剂量相同的免疫应答。最近临床研究已评价了使用著名的水包 油乳剂产品 和AS03(二者均准许在欧洲使用)的佐剂剂量作 用，尽管两种制剂都不包含TLR激动剂。因此，流行性流感疫苗临床 试验发现典型的约2.3％油剂量的 佐剂可降低一半(但不降低到 1/4)而不损害免疫原性，并仍满足流行性疫苗许可的欧洲标准[5]。此 外，在试验参与者中未指出注射位点疼痛的剂量依赖性降低。相反， 在6-36月龄的儿童中采用季节性流感抗原和剂量为0.125、0.25、0.5 或全剂量的的研究在不同佐剂剂量之间未发现反应原性差异 [4]。抗体应答遵循依照佐剂浓度的剂量反应，但所有制剂在第2次免 疫接种之后均满足欧洲人用医药产品委员会(CHMP)标准。
[0239] 在另一流感临床试验中评价了两种不同剂量的AS03(包含全剂量 的2.5％角鲨烯和2.5％α-生育酚的AS03A对包含半剂量的AS03B)， 其中推断尽管由两种不同佐剂剂量诱发的初始免疫应答是相同的，但 更高佐剂剂量在接种疫苗后第182天测量的反应持久性略微更好[3]。 此外，41-64年龄组在更低佐剂剂量下表现出显著降低的抗体应答。最 后，与全剂量相比，在更低佐剂剂量下记录了中等的疼痛降低。总之， 和AS03临床研究证明佐剂剂量滴定的作用可依赖于每一疫苗 组合物及其预期接受者。
[0240] 结论
[0241] 含GLA-SE佐剂的PfCelTOS疫苗在BALB/c小鼠中诱发强Th1- 型免疫应答(包括与包含 ISA 720的PfCelTOS疫苗相比更 高的IFN-γ产生)。乳剂剂量可以从2％降低至1％，而不损害GLA-SE 佐剂组的免疫原性。总之，SE组(不含TLR4激动剂GLA)中乳剂剂量 的降低表现出稍微降低的免疫原性，尤其在最低的佐剂剂量稀释 (0.02％)下。来自使用具有GLA-SE佐剂的PfCelTOS的保护研究的结 果正被编辑成后续出版物，并且2012年正制订I期临床试验的计划。
[0242] 参考文献
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[0256] 磷脂组合物在疫苗佐剂乳剂中的免疫调节和物理作用
[0257] 导论
[0258] 水包可代谢油的乳剂已证明是安全且有效的疫苗佐剂、营养补充 剂和药物递送载体。存在各种乳化剂组合物，并且角鲨烯是优选的用 于疫苗佐剂应用的可代谢油(1-3)。常用的乳化剂包括 和磷脂。乳化剂选择基于乳化剂稳
定能力和/或生物 活性，因为乳化剂按照定义是膜活性的，并且已表明具有与免疫刺激 相关的多种生物活性(4)。
定能力和/或生物 活性，因为乳化剂按照定义是膜活性的，并且已表明具有与免疫刺激 相关的多种生物活性(4)。
[0259] 卵磷脂及其主要组分磷脂酰胆碱(PC)已成功用作安全且有效胃肠 外递送的乳剂中的乳化剂。或许磷脂乳化剂最广泛的用途是施用静脉 内营养物补充剂(5)，例如在(即大豆油/蛋黄卵磷脂乳剂)中。 然而，可存在与作为乳化剂的蛋黄卵磷脂(或蛋黄PC)相关的一些缺点， 并且用合成磷脂替代源自蛋黄的磷脂是有利的。首先，存在显著结构 异质性：蛋黄PC包含至少17种不同的PC物质(6)，而各种合成PC 以99％纯度市售。其次，蛋黄卵磷脂由多个单不饱和及多不饱和酰基 链构成，其易于氧化降解，而各种合成PC由饱和酰基链构成，并且 因此是化学更稳定的(7)。再次，蛋黄磷脂源自动物来源，而非合成生 产的。
[0260] 我们先前已公开了由蛋黄PC稳定的角鲨烯乳剂的物理稳定性曲 线(8,9)。此外，我们表明合成POPC(蛋黄PC的主要成分)与蛋黄PC 相比向角鲨烯乳剂提供相同的稳定性。然而，未评价其他合成PC。合 成的均质磷脂已变成广泛可得的，并且现在相对廉价。通过适当选择 合成磷脂，可以优化乳化剂的化学稳定性及乳剂的物理稳定性。还必 须解决生物等效性；先前已经表明疫苗佐剂乳剂中乳化剂的来源或纯 度的变化显著影响疫苗效力(10,11)。在本稿件中，我们寻求1)通过 评价包含其他合成PC(除POPC外)的角鲨烯乳剂的物理稳定性来扩展 我们先前的工作；以及2)在疟疾和流感疫苗制剂的情形下比较合成 PC乳剂以及蛋黄PC乳剂的生物活性。
[0261] 材料和方法
[0262] 佐剂制剂。从Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)购买鲨鱼肝脏角鲨烯 (≥98％纯度)。蛋黄磷脂酰胆碱(蛋黄PC)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3- 磷酸胆碱(POPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二硬脂 酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 (DPPC)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)和1,2-二月桂酰 -sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)以99％纯度得自Avanti Polar Lipids (Alabaster,AL)。
所有乳剂制剂通过高压均化器高速混合油相(包含角 鲨烯和磷脂)和水相制备，如先前所述(8)。磷脂的最终浓度为25mM。 在5℃、室温(RT)、37℃和60℃下监测制剂的稳定性6个月。
如先 前所述的那样进行粒径、ζ电位、粘度、溶血性和光散射光学分布测 量(8)。简言之，通过将每一乳剂的等分部分以1:100倍稀释于水中并 通过动态光散射(Malvern Zetasizer APS)来测量散射强度-偏差尺寸平 均值(Z-avg)，从而在指定的时点下测定粒径。通过将每一乳剂的等分 部分以1:20倍稀释于水中，并通过微量电泳(Malvern Zetasizer Nano-ZS)来测量ζ电位，从而在乳剂制造后立即测量ζ电位。从5℃ 贮存中取出每一乳剂的20mL样品，并使其平衡至室温，然后通过旋 转粘度计(Brookfield DV-E)来测量粘度。按照先前公开的技术(12)的修 改版本来分析乳剂溶血活性；将来自人类志愿者的红血球悬浮液在盐 水中与每一乳剂混合约20min，然后将样品离心，将上清液稀释入乙 醇:HCl(39:1,v:v)混合物，并且在398nm测量吸光度。使用870-nm 激光和电荷耦合检测器(LUMiReader)，在60℃下，对未稀释的乳剂样 品每10min采集激光散射光学分布测量值，持续4小时。
所有乳剂制剂通过高压均化器高速混合油相(包含角 鲨烯和磷脂)和水相制备，如先前所述(8)。磷脂的最终浓度为25mM。 在5℃、室温(RT)、37℃和60℃下监测制剂的稳定性6个月。
如先 前所述的那样进行粒径、ζ电位、粘度、溶血性和光散射光学分布测 量(8)。简言之，通过将每一乳剂的等分部分以1:100倍稀释于水中并 通过动态光散射(Malvern Zetasizer APS)来测量散射强度-偏差尺寸平 均值(Z-avg)，从而在指定的时点下测定粒径。通过将每一乳剂的等分 部分以1:20倍稀释于水中，并通过微量电泳(Malvern Zetasizer Nano-ZS)来测量ζ电位，从而在乳剂制造后立即测量ζ电位。从5℃ 贮存中取出每一乳剂的20mL样品，并使其平衡至室温，然后通过旋 转粘度计(Brookfield DV-E)来测量粘度。按照先前公开的技术(12)的修 改版本来分析乳剂溶血活性；将来自人类志愿者的红血球悬浮液在盐 水中与每一乳剂混合约20min，然后将样品离心，将上清液稀释入乙 醇:HCl(39:1,v:v)混合物，并且在398nm测量吸光度。使用870-nm 激光和电荷耦合检测器(LUMiReader)，在60℃下，对未稀释的乳剂样 品每10min采集激光散射光学分布测量值，持续4小时。
[0263] 免疫接种、血清采集和免疫学分析。雌性6-7周龄BALB/c小鼠 (Charles River Laboratories,Wilmington,MA)通过在每一后四头肌肌肉 注射来进行免疫。测试两种不同的抗原：1)2007-2008Fluzone失活裂 解病毒疫苗，包含典型的流感病毒株A/所罗门岛/2/2006(H1N1)、A/ 威斯康辛州/67/2005(H3N2)和B/马来西亚(Malaysia)/2506/2004；以及
2)重组伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)环子孢子蛋白(PbCSP)，其是 使用由Walter Reed Army Institute of Research开发的密码子协调化构 建体而内部生产的。流感和疟疾疫苗制剂、免疫接种方案和血清采集 如先前所述(8)，但流感抗原剂量为0.02μg总HA。在特定无病原体条 件下并依据IDRI动物护理和使用委员会的规程和指导来进行所有步 骤。
2)重组伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)环子孢子蛋白(PbCSP)，其是 使用由Walter Reed Army Institute of Research开发的密码子协调化构 建体而内部生产的。流感和疟疾疫苗制剂、免疫接种方案和血清采集 如先前所述(8)，但流感抗原剂量为0.02μg总HA。在特定无病原体条 件下并依据IDRI动物护理和使用委员会的规程和指导来进行所有步 骤。
[0264] 抗体应答。使小鼠免疫两次，间隔三周。分析血清的抗原特异性 IgG、IgG1、IgG2a抗体，以及血细胞凝聚抑制(HI)抗体活性，如先前 所述，通过与标准曲线比较来指定主观抗PbCSP单位，而测定流感抗 体的终点滴度(8)。骨髓ELISPOT测定用于测定在使用或不使用前述 佐剂(具有小幅修改)的Fluzone加强免疫接种之后四周采集的样品中 疫苗特异性的长期存在的分泌抗体的浆细胞的诱导(13)。
[0265] 抗原特异性细胞因子反应。用大鼠抗-小鼠IL-5捕获Ab (eBioscience,San Diego,CA)来涂覆MultiScreen 96-孔过滤板(Millipore, Bedford,MA)，并在4℃孵育过夜。将板用PBS洗涤，在室温下用RPMI 1640和10％FBS封闭至少1小时，然后再次洗涤。在第二次Fluzone 注射之后四周，收集脾脏。制备单细胞悬浮液，使用单独培养基、 concanavilin A(0.75μg/ml)、5血细胞凝聚单位(HAU)失活A/所罗门岛 /2/2006(H1N1)或2HAU失活A/威斯康辛州/67/2005(H3N2)一式两份 地以2×105个细胞/孔接种，在37℃ 48小时。然后，将板用0.1％ PBS-Tween 20洗涤，并与生物素结合的大鼠抗-小鼠IL-5二级Ab (eBioscience)一起孵育过夜。使用VectaStain ABC抗生物素蛋白过氧 化物酶结合物和Vectastain AEC底物试剂盒，根据制造商的规程 (Vector Laboratories)来开发过滤器。
通过用去离子水洗涤板来停止反 应，在黑暗中干燥板，并使用自动ELISPOT读数器(C.T.L.Serie3A Analyzer,Cellular Technology Ltd.)计数斑点。使用
软件 (CTL Analyzer LLC)分析数据。
通过用去离子水洗涤板来停止反 应，在黑暗中干燥板，并使用自动ELISPOT读数器(C.T.L.Serie3A Analyzer,Cellular Technology Ltd.)计数斑点。使用
软件 (CTL Analyzer LLC)分析数据。
[0266] 统计学分析.所有小鼠实验分析每时点每组的5个单独的动物。 使用ANOVA和Tukey多次比较检验，比较ELISPOT计数和log10-转 化抗体滴度。使用log2-转化HI滴度，通过ANOVA和Tukey多次比 较检验来比较HI滴度。
[0267] 结果
[0268] 乳剂的物理稳定性。表1描述了用于该研究的乳化剂的组成。蛋 黄PC是具有多种酰基链长度和饱和度的异质磷脂酰胆碱混合物，尽 管主要组分已确定为POPC(6,14)。相反，表1所示的合成磷脂是高 度纯的(≥99％)，并且作为脂质集合具有明确的主相转变温度(Tm)。均 包含单不饱和酰基链的DOPC和POPC具有低相转变温度(<0℃)，这 是因为不饱和链给予的堆积无序。包含单不饱和及多不饱和酰基链的 蛋黄PC也具有低Tm。DLPC由饱和酰基链组成，但其长度仅为12个 碳，这导致低Tm。DMPC、DPPC和DSPC具有更长的饱和酰基链(分 别为14、16和18个碳)，并且其相转变温度根据链长而增加。例如， DPPC构型在室温下为高度有序的凝胶相，而在41℃以上，脂质形成 特征为更加堆积无序的液晶相，这归因于温度诱导的酰基链构型变化 (15)。
[0269] 表2显示乳剂在其制造后即刻的物理和血液相容性。粘度值与水 相似(约1cP)，表明这些乳剂中的低油含量(当测量粘度是为10％v/v， 但稀释至2％v/v以用于免疫接种)。ζ电位值对于采用低Tm值磷脂(例 如DOPC、DLPC)的乳剂是负的，而具有较高Tm磷脂的乳剂是正的 (DSPC、DPPC)。当与RBC悬浮液一起孵育时乳剂均不显示显著的溶 血活性，尽管DLPC乳剂与其他乳剂相比似乎是稍微更加溶血的。
[0270] 我们最近报道了在5℃或室温下贮存的合成POPC-角鲨烯乳剂的 粒径稳定性与蛋黄PC-角鲨烯乳剂相比是相同或改进的(9)。我们寻求 通过用除POPC之外的其他合成磷脂制造角鲨烯乳剂来扩展该工作； 图1示出在不同温度下贮存的乳剂的粒径稳定性。早前报道了POPC 的初始尺寸(9)；此处，我们已监测此相同批号的长期稳定性，以与其 他合成PC乳剂比较。物理外观的明显的异常现象(例如相分离)将乳剂 描述为直观不稳定。考虑到来自所有温度的数据，DMPC和POPC乳 剂展示出与所研究的其他乳剂相比更大的粒径稳定性。最小粒径变化 在5℃是明显的，并且粒径渐变随着温度增加而明显(图1)。相对地， DOPC乳剂液滴尺寸变化在5℃是最小的，但在更高的贮存温度下是 显著的。DPPC乳剂稳定性高度依赖于温度。当在DPPC Tm(41℃)以 上贮存时，DPPC乳剂与其他乳剂相比表现出良好的稳定性。然而， 在低于Tm的三个贮存温度下，DPPC乳剂是直观不稳定的，或表现出 与更稳定的乳剂相比更大的粒径变化。有趣地，包含最短的饱和链乳 化剂的DLPC乳剂在所有四种贮存温度下于早期时点是直观不稳定 的。DSPC乳剂在所有贮存温度下于6个月时点之前也变成直观不稳 定的。尺寸多分散性值在更稳定的乳剂之间是相似的(补充图1)。
[0271] 激光散射光学分布提供了与乳剂稳定性相关的补充信息。乳剂由 于乳油化、凝聚等产生的变化被检测为通过乳剂的垂直剖面的光透射 的变化(8)。在60℃下，每10分钟测量乳剂的激光散射光学分布，持 续4小时的时段(补充图2)。为了比较来自不同乳剂的数据，在图2中 绘制样品垂直剖面的特定区域(25mm至30mm)之间的积分透射。积 分透射的降低表明凝聚或粒径生长，因为更大的颗粒会散射更多的光， 使更少的光传输至检测器。积分透射的增加通常代表乳油化或相分离。 DMPC乳剂与POPC或DOPC乳剂相比表现出微小变化，表明在该温 度下的优异稳定性。这些光学分布数据证实了上述粒径和直观稳定性 观察结果。未示出DLPC、DPPC和DSPC乳剂，因为这些乳剂在进行 光学分布测量之前已被归类为在5℃下直观不稳定的。
[0272] 总之，物理稳定数据表明在合成脂质中，DMPC和POPC，以及 DOPC(在较少程度上)是角鲨烯油的最有效乳化剂。在混合乳剂与失活 流感疫苗之后的粒径和SDS-PAGE分析表明良好的相容性(数据未示 出)。因此，随后评价上述稳定的合成PC乳剂连同蛋黄PC乳剂在小 鼠模型中的生物活性。
[0273] 乳剂选择性增强对重组疟疾蛋白的抗体应答。在仅使用蛋白的第 二次免疫接种或使用蛋白与乳剂制剂的组合的第二次免疫接种之后2 周，在单独的小鼠血清中测量针对重组疟疾抗原伯氏疟原虫环子孢子 蛋白(PbCSP)的抗体应答。与仅接受蛋白的小鼠相比，在存在乳剂的情 况下注射PbCSP来免疫的小鼠中，抗-PbCSP IgG抗体水平显著更高(图 3a，p-值<0.05)。与仅用蛋白来免疫的小鼠相比，在用PbCSP和蛋黄 PC、POPC和DMPC乳剂进行免疫的小鼠中，IgG1抗体也更高(图3b, p-值<0.05)。相反，在抗PbCSP IgG2a抗体水平中未检测到各组之间 的差异(图3c,p-值>0.05)。这些数据表明通过在暴露于抗原期间包含 乳剂来选择性增强抗原特异性IgG1抗体。
[0274] 乳剂增强对流感蛋白的抗体应答。我们先前观察到用与包含源自 蛋黄的PC的乳剂一起配制的Fluzone注射的动物中的抗体应答提升(8, 13)，但未研究当包含合成脂质时是否观察到这些作用。为确定乳剂是 否提升对天然流感蛋白的抗体应答，我们在存在或不存在包含天然或 合成脂质的乳剂制剂的情况下用低剂量的Fluzone疫苗来免疫小鼠。 与仅用流感疫苗的疫苗接种相比，接受Fluzone和乳剂配制剂的所有 组的全部IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度是更高的(图4)。
[0275] 我们还评估了乳剂制剂对骨髓内分泌抗原特异性抗体的浆细胞 (ASPC)的产生的作用，因为这些长期存活的细胞在抗原暴露之后长时 段分泌抗体并可提供长期保护的基础。整体上，我们的结果表明在多 种乳剂制剂组中产生相似数量的ASPC。然后，仅有包含DOPC乳剂 的疫苗与单独的Fluzone疫苗相比诱导显著更高数量的长期存活的浆 细胞。
[0276] 血细胞凝聚抑制(HI)试验是流感疫苗效能的有意义的预测指标， 并且所述HI具有通常认为足以提供保护的滴度(16)。为测定乳剂制剂 是否可以产生能增强Fluzone疫苗所提供保护的更高品质抗体，我们 比较了仅用Fluzone，或Fluzone和多种乳剂制剂接种疫苗的小鼠的 HI滴度。当在最终免疫接种之后4周进行测量时，乳剂制剂的添加与 单独Fluzone疫苗相比诱导了针对A/所罗门岛/3/2006(H1N1)和A/威 斯康辛州/67/2005(H3N2)疫苗组分的更高的HI滴度(图5)。针对A/所 罗门岛/3/2006(H1N1)组分，包含乳剂的所有疫苗诱导比单独Fluzone 更高的HI滴度。针对A/威斯康辛州/67/2005(H3N2)组分，蛋黄PC和 DOPC乳剂诱导比单独Fluzone更高的HI滴度。
[0277] 另外实验表明，除了DMPC乳剂之外，来自通过Fluzone加乳剂 进行免疫的小鼠的增加数量的抗原特异性T细胞与来自仅通过 Fluzone免疫的小鼠的细胞相比分泌更高水平的IL-5(图6,p-值< 0.05)。总之，抗体和细胞因子分泌数据表明由包含这些乳剂的疫苗诱 发了增加的Th2型免疫应答。
[0278] 讨论
[0279] 不管合成或源自蛋黄的PC用作乳化剂组分，在等同物中提高了 用疟疾和流感疫苗诱发的抗体应答。该发现对于基于合成组分(而非天 然组分)持续开发PC-乳化乳剂而言是有意义的。文献已经表明该类型 的组分替代的生物等效性为何不应认为是准许的；存在多个实例，当 一种磷脂乳化剂被另一种磷脂乳化剂替代时已导致生物活性的差异。 例如，Yasuda等人发现由合成磷脂酰胆碱组成的脂质体当与基于合成 脂质的抗原一起腹腔内免疫小鼠时表现出免疫原性(如脾脏中分泌抗 体的细胞的数量所指示的)与脂质相转变温度之间的直接关联；发现更 高的相转变与增加的免疫原性直接相关(17)。相转变温度与免疫原性 之间的这种关联在当前工作中是不明显的，尽管由于乳剂稳定性差而 在免疫学方面未评价具有最高相转变温度的磷脂(DPPC和DSPC)。在 乳化剂来源的重要性的另一实例中，对水包油疫苗佐剂乳剂 ISA 51的最近临床试验结果揭示用植物来源的材料替换 动物来源的乳化剂可能已成为显著降低体内效能的原因(11)。在本工 作中的免疫学数据证明用由不同天然或合成磷脂酰胆碱制成的乳剂辅 助的流感和疟疾疫苗诱发相似的抗体应答。此外，用于该工作的乳剂 的定性免疫原性与文献报道相符；例如，乳剂(包含TLR激动剂)与单 独抗原相比可能仅诱导IgG2a反应的适度增加(18)。在使用流感疫苗 的实验中的乳剂之间的细微差异是明显的，表明脂质乳化剂可以在生 物作用方面略微不同。
然而，总之，可能的是，在简单重组抗原疟疾 疫苗或更复杂的失活裂解病毒流感疫苗的情形下，蛋黄PC可以被合 成磷脂替换而对生物活性没有不利作用。
然而，总之，可能的是，在简单重组抗原疟疾 疫苗或更复杂的失活裂解病毒流感疫苗的情形下，蛋黄PC可以被合 成磷脂替换而对生物活性没有不利作用。
[0280] 除了生物活性，考虑物理乳剂稳定性也是重要的，因为其涉及乳 化剂酰基链结构。已经偶尔报道了纯化PC分子不能有效地稳定乳剂 (19)。例如，DOPC:DPPC:DPPE合成混合物当用于乳化全氟化碳时不 产生与用蛋黄卵磷脂观察到乳剂同样稳定的乳剂(20)。然而，其他报 道(21)容易地驳倒了纯合成PC不能有效地乳化的断言，所述其他报道 澄清稳定性取决于油和乳剂二者的结构和性质(22)。乳化剂的自发曲 率或堆积结构决定了其在稳定乳剂方面的效力(21)。乳化剂自发曲率 或堆积受以下影响：a)磷脂相行为；b)脂质酰基链的不饱和度；和 c)磷脂在油中的混溶性(21)。在本工作中，脂质相转变的重要性是明 显的，因为基于尺寸和视觉外观，具有最高相转变温度的包含磷脂的 乳剂(DPPC和DSPC)在大部分贮存温度下不是稳定的。有趣地，DPPC 仅当在其主相转变温度以上贮存时才产生稳定的乳剂。然而，相转变 温度并非是物理稳定性的唯一决定因素；注意的是，即使DMPC具有 更高的相转变温度，DMPC乳剂与DLPC乳剂相比表现出良好的稳定 性(在所有贮存温度下，包括相转变以上和以下的温度)。因此，由以 下事实证明了乳化剂-油相互作用的复杂性，即，不能仅基于磷脂相转 变温度、酰基链长度或饱和来预测本工作所述的乳化剂的稳定性。同 样地，在三辛酸甘油酯乳剂的情形中难以预测脂质相转变温度和酰基 链结构对乳剂稳定性的作用：DLPC、DMPC和DPPC乳剂与DSPC、 1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱和DOPC乳剂相比更加稳定(23)。
[0281] 可以通过两种机制发生乳剂液滴尺寸生长：Ostwald熟化(Laplace 压差使油分子从较小液滴扩散至较大液滴)或凝聚(分开的油液滴合并 且形成单个液滴)(24)。因为角鲨烯在水中是基本不溶的，因此Ostwald 熟化不太可能是本工作乳剂中尺寸生长的原因(25-28)。因此，凝聚可 能是此处报道的尺寸生长的机制。预期凝聚速率随温度变高而增加， 这归因于扩散速率增加和液滴相互作用事件，并且此处所示的尺寸数 据与该预期相符。经由良好堆积的界面层向油滴未提供有效的空间或 静电稳定的乳化剂可能是凝聚速率增加的原因。我们的发现表明，总 体上，不饱和脂质乳化剂比饱和脂质乳化剂在稳定角鲨烯乳剂方面更 有效，但产生高度稳定的乳剂的DMPC例外，尽管其仅包含饱和酰基 链。这再次强调了仅基于磷脂乳化剂的相转变和酰基链结构难以预测 乳化剂稳定性。
[0282] 最后，我们注意到，在该稿件中示出的多个物理表征数据与先前 文献报道充分相关。例如，先前已经报道了液晶相脂质对凝胶相脂质 的更大负ζ电位值的关系；这归因于在液相膜中增加的无序和堆积缺 陷导致极性首基暴露并允许溶液氟离子的更多可用的结合位点(29, 30)。此外，DLPC乳剂的稍微增加的溶血趋势符合来自文献的另一报 道，即，DLPC和其他短链磷脂通过脂质相分离经由在脂质双层中产 生非特异性孔来诱导溶血，允许离子渗透(31)。
[0283] 结论
[0284] 在本工作中，表明包含角鲨烯油和合成磷脂乳化剂(即DMPC或 POPC)的疫苗佐剂制剂在多个温度下展现出长期粒径稳定性。通常， 蛋黄PC和合成PC乳剂与简单重组疟疾抗原或失活裂解病毒流感疫苗 的组合诱导相似的免疫应答。因此，用合成磷脂酰胆碱替代蛋黄磷脂 酰胆碱不导致疫苗佐剂生物活性损失。我们实验室正在进行的工作将 比较角鲨烯-磷脂乳剂与其他类型的非磷脂表面活性剂结构(即聚山梨 醇酯80和泊洛沙姆188)的稳定性和免疫原性。
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