저색소증 개선 및 지방 형성 억제 효능을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 {Peptides Having Activity for Increasing Melanin Synthesis and Inhibiting Fat Synthesis and Uses Thereof}

본 발명은 저색소증 개선 및 지방 형성 억제 효능을 갖는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

멜라닌은 표피 내 기저층에 존재하는 색소세포인 멜라닌 세포(Melanocyte)에서 티로신으로부터 도파를 거쳐 티로시나아제(tyrosinase)에 의해 생성되는데, 이러한 멜라닌 생합성 과정에는 티로시나제(Tyrosinase) 이외에도, Trp-1/2(티로시나제 연관 단백질-1/2)가 관여하는 것으로 알려져 있으며(Korner와 Pawelek, Science (1982) 217:1163-1165; Kobayashi 등, EMBO J (1994) 13:5818-5825; Yokoyama 등, Biochim Biophys Acta (1994) 1217:317-321), 또한 티로시나아제 발현의 상위 신호로서는 고리형 AMP(cAMP)와 그것에 의한 ERK1/2(Extracellular signal-activated kinases-1/2)의 지속적인 활성화가 관여하는 것으로 알려져 있다(Marshall, Cell (1995) 80:179-185; Busca와 Ballotti, Pigment Cell (2000) 13:60-69).

멜라닌 세포는 자외선, 염증 등의 외부조건, MSH(멜라닌 세포 자극 호르몬) TSH(갑상선 자극 호르몬) 등의 호르몬 등 여러 가지 인자의 영향을 받는다.

멜라닌은 햇빛 중 자외선의 빛 에너지를 흡수하여 피부 깊숙이 있는 세포들을 자외선에 의한 손상으로부터 보호하는 역할을 하지만, 멜라닌이 비정상적으로 과잉 생산되면 기미, 주근깨, 색소 침착 등과 같은 피부색소 이상침착 증상이 발생되며, 반대로 적게 생산되면 백반증(vitiligo), 탈색소 모반, 백색 비강진(pseudoleucoderma atopicum), 어루러기(Tinea versicolor), 반상 경피증, 알레르기, 염증 후 탈색증, 특발성 적상 저색소증, 탈색소 모반, 부분 백피증 등의 멜라닌 저색소증 질환(Leukoderma)이 발생한다(Bolognia와 Pawelek, J Am Acad Dermatol (1988) 19:217-255; Pinto와 Bolognia, Pediatr Clin North Am (1991) 38:991-1017).

상기 멜라닌 저색소증 질환 중 백반증은 멜라닌 세포가 파괴되어 발병하는 질환이고, 나머지의 질환은 멜라닌 세포에서 생성되는 멜라닌 양의 감소로 인해 발병하는 질환이다.

상기 질환의 치료법으로서는 소랄렌 등의 광감작제를 이용한 광화학적 방법, 수술 등의 외과적 방법, 그리고 포스에, 생강, 피팔리, 검은 후추의 성분(Ancient Science of Life, (1990) Vol. IV, No.4, 202-206) 등 멜라닌 세포의 증식 활성이나 멜라닌 생성 촉진 활성을 가진 약물 투여에 의해 피부의 재착색을 유도하는 방법 등이 있다.

한편, 비만은 다양한 질병의 원인질환으로 당뇨병환자의 80%, 심장질환자의 21%가 비만이 원인이고, 비만으로 인한 사회 경제적 손실이 막대하다. 따라서 안전하고 효과적인 비만치료제의 개발은 막대한 사회 경제적 손실을 줄일 수 있다. 그러나 시장상황을 해결할 수 있는 의약품은 식욕억제제 및 지방흡수 억제제에 국한되어 있어 기대에 미치지 못하고, 아래에 제시된 다양한 부작용이 존재한다. 제니칼(로슈)은 췌장 및 소화계에서 분비되는 리파아제 억제를 유도하여 지방흡수를 억제하는데, 2-3%의 낮은 체중감량효과 및 잦은 설사, 지방변 등 부작용을 동반한다. 또한, 리덕틸(애보트)은 세로토닌과 노르아드레날린의 재흡수 억제를 통해 식욕을 억제시키는데, 5-10%의 체중감량 효과가 있으나 뇌졸중과 심근경색 등 심혈관계 질환의 부작용이 있어, 2010년 유럽 의약품안전청(EMA)과 미국 식품의약품안전청(FDA)이 처방과 사용중지 및 자발적 회수 권고조치를 내려 시장에서 퇴출되었으며 국내에서는 2010년 10월식품의약품안전청에 의해 판매가 중단되었다. 이외에도 그동안 항비만 약제로 개발된 제품 중에는 심각한 부작용으로 인해 판매가 금지된 것들도 상당수에 이른다. 예를 들어, 아미노필린은 탁월한 체지방 분해효과에도 불구하고 정신신경계, 순환기계, 소화기계에 걸쳐 폭넓은 부작용이 보고된 바 있고, 펜프루라민, 덱스펜플루라민, 토피라메이, 에페드린 등도 비만치료 부적합 약물로 판정되어 판매가 금지되었다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 생물학적으로 유효한 활성을 갖는 우수한 펩타이드들을 개발하고자 노력한 결과, 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 멜라닌 형성 증가 및 지방 생성 억제 등 우수한 생리활성을 갖는다는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 멜라닌 생성 증가 활성 또는 지방 생성 억제 활성을 갖는 펩타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 멜라닌 저색소증(hypomelanosis)의 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 비만의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 멜라닌 생성 증가 활성을 갖는 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 지방 생성 억제 활성을 갖는 펩타이드를 제공한다.

본 발명자들은 생물학적으로 유효한 활성을 갖는 우수한 펩타이드들을 개발하고자 노력한 결과, 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 멜라닌 형성 증가 및 지방 생성 억제 등 우수한 생리활성을 갖는다는 것을 규명하였다.

본 발명의 펩타이드는 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 펩타이드는 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되어 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 펩타이드는 멜라닌 생성을 증가시키고 지방 생성을 억제하는 활성을 나타낸다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 멜라닌 합성 효소(티로시나아제)의 발현을 증가시키는 전사인자인 MITF(Microphthalmia-associated transcription factor)와 MITF의 발현을 증가시키는 CREB(cAMP-responsive element binding protein)의 인산화를 증가시켜 결과적으로 티로시나아제의 발현을 증가시키며 궁극적으로 멜라닌 합성을 증가시킨다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 세포 내 축적된 지방의 양을 감소시키며 지방 생성 기전에 관여하는 페릴리핀(perilipin) 및 PPARγperoxisome proliferator-activated receptor gamma)의 발현을 감소시킴으로써 궁극적으로 지방 생성을 억제한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques; Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis , 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) 또는 액상 합성 기술(US 등록특허 제5,516,891호)에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 펩타이드의 N- 또는 C-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합될 수 있다.

상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 언급되는 용어 “안정성”은 “ 인 비보 ”안정성 뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다. 상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 저색소증의 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에, 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 티로시나아제의 발현을 증가시켜 멜라닌 합성을 촉진시키기 때문에 저색소증의 치료 또는 예방에 매우 유효하다.

본 발명의 멜라닌 저색소증 질환 개선 또는 치료용 조성물은 멜라닌 세포의 손실이 원인이 되거나, 멜라닌 생성 저해가 원인이 되어 멜라닌 생성이 정상 수준에 이르지 못하여 발생하는 모든 질환에 사용될 수 있는데, 예컨대 백반증, 백색증, 탈색소 모반, 백색 비강진, 어루러기, 염증후 탈색증, 반상 경피증, 부분 백피증, 특발성 적상 저색소증, 또는 점상 백피증 등에 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 펩타이드의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.

본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 어떤 투여량은 1일 당 0.0001-200 ㎍이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 펩타이드의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장품 조성물이다.

본 명세서에서 용어 “화장품학적 유효량”은 상술한 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 펩타이드와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에, 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “비만”은 체내에 체지방이 과도하게 축적되는 것을 의미한다.

하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 서열목록 제1서열 또는 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 세포 내 축적된 지방을 감소시키며 지방 합성에 관여하는 유전자(예컨대, 페릴리핀, PPARγ)의 발현을 감소시킨다. 따라서, 본 발명의 조성물은 비만에 효과적으로 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 세포 내 축적된 지방을 감소시키며 지방 합성에 관여하는 유전자(예컨대, 페릴리핀, PPARγ)의 발현을 감소시킨다. 따라서, 본 발명의 조성물은 비만의 치료 또는 예방에 매우 유효하다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명의 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 멜라닌 생성 증가 활성 및 지방 생성 억제 활성을 나타낸다.

(ii) 본 발명의 펩타이드는 티로시나아제의 발현을 증가시키는 전사인자인 MITF와 MITF의 발현을 증가시키는 CREB의 인산화를 증가시켜 결과적으로 티로시나아제의 발현을 증가시키며 궁극적으로 멜라닌 합성을 증가시킨다.

(iii) 본 발명의 펩타이드는 세포 내 축적된 지방의 양을 감소시키며 지방 생성 기전에 관여하는 페릴리핀 및 PPARγ의 발현을 감소시킴으로써 궁극적으로 지방 생성을 억제한다.

(iv) 본 발명은 상술한 펩타이드를 포함하는 멜라닌 저색소증의 개선 또는 치료용 조성물 및 비만의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.

도 1a 및 도 1b는 본 발명의 펩타이드에 의한 멜라닌 세포에서의 멜라닌 생성량 변화를 측정한 그래프이다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 펩타이드에 의한 멜라닌 생성 신호 전달 물질의 발현 변화를 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이다.
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 펩타이드에 의한 멜라닌 생성 신호 전달 물질의 발현 변화를 RT-PCR로 측정한 결과이다.
도 4a 및 도 4b는 본 발명의 펩타이드에 의한 티로시나아제의 단백질 발현 레벨을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이다.
도 5a 및 도 5b는 본 발명의 펩타이드에 의한 지방세포에서의 중성지방양 변화를 측정한 결과이다.
도 6a 및 도 6b는 본 발명의 펩타이드에 의한 지방 생성 관련 유전자의 발현 정도를 RT-PCR로 측정한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

합성예 1: 펩타이드 합성

클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700 mg을 반응용기에 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 10 ml를 가하여 3분간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF) 10 ml를 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10 ml의 디클로로메탄용액을 넣고 Fmoc-Cys-OH(Bachem, Swiss) 200 mmole 및 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM(dichloromethane)에 녹여 10분간 반응시키고 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF)를 10 ml 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액(20%의 피페리딘(Piperidine)/DMF) 10 ml를 반응용기에 넣고 10분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분간 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 각각 3분씩 DMF로 2회, MC로 1회, DMF로 1회 세척하여 Cys-CTL 레진(Resin)을 제조하였다. 새로운 반응기에 10 ml의 DMF 용액을 넣고 Fmoc-Ala(Bachem, Swiss) 200 mmole, HoBt 200 mmole 및 Bop 200 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400 mmole DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분간 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrin Test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Ala-Cys-CTL 레진을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Arg(pbf), Fmoc-Phe, Fmoc-Phe, Fmoc-Arg(pbf), Fmoc-Cys(Trt) 및 Fmoc-Gln(Trt) 순으로 연쇄반응을 시켰다. Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 무수초산과 DIEA, HoBt를 넣어 한시간 동안 아세틸화를 수행한 뒤 제조된 펩티딜 레진을 DMF, MC 및 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, P ₂ O ₅ 하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한뒤 탈루 용액[트리플로로화 초산(Trifluroacetic acid) 81.5%, 증류수 5%, 티오아니졸(Thioanisole) 5%, 페놀(Phenol) 5%, EDT 2.5% 및 TIS 1%] 30 ml을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 NH ₂ -Gln-Cys-Arg-Phe-Phe-Arg-Ser-Ala-Cys-COOH 펩타이드 1을 0.75 g 합성(수율: 86.5%)하였고, 같은 방법으로 NH ₂ -Tyr-Cys-Arg-Phe-Phe-Asn-Ala-Phe-Cys-COOH 펩타이드 2를 0.70g 합성하였다(수율: 80.7%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 펩타이드 1의 분자량 1117.0(이론값 : 1117.3), 펩타이드 2의 분자량 1168.1(이론값: 1168.3)을 얻을 수 있었다.

실시예 1: 멜라닌 생성량 측정

6-웰 배양용 평판에 멜라닌형성 세포(B16F10 세포주)를 37℃ 배양기에서 24시간 배양한 후, 각 판의 배지를 제거하고 새로운 배지로 교체 후 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 펩타이드를 농도 별로 처리한다. 72시간 동안 배양 한 후 배양액을 제거 하고 세포를 떼어 낸 뒤 1.5 ml 튜브로 옮겨 13,000 rpm에서 3분간 원심분리 하여 상층액을 제거하고, 세포 펠렛을 회수하여 멜라닌을 측정한다. 세포 펠렛에 2 M NaOH를 150 μl씩 넣어 60℃에서 30분 동안 세포 내 멜라닌을 용해시킨다. 96-웰 평판 각 웰에 용해시켜 얻은 상층액을 100 μl 씩 넣어 490 nm에서 흡광도를 측정한다.

마우스 멜라닌 형성세포 B16F10에 본 발명의 펩타이드를 농도별로 각각 처리하고 72 시간 동안 배양하였을 때 농도 의존적인 멜라닌 형성 증가가 관찰되었다(도 1a 및 도 1b).

실시예 2: 멜라닌 형성 신호 전달 물질 관찰

멜라닌형성 세포(B16F10 세포주)를 6-웰 배양용 평판에 24시간 배양 후, 본 발명의 펩타이드를 농도별로 처리한다. 6시간에서 24시간까지 세포를 배양한 후 세포를 용해하여 멜라닌 형성에 관여 하는 신호전달 물질인 CREB 인산화와 MITF의 발현을 각각의 특이적인 항체를 이용한 웨스턴 블롯 방법을 이용하여 관찰한다. 항-pCREB 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국)와 항-MITF 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 이용하여 실험을 진행 하였다.

마우스 멜라닌 형성세포 B16F10에 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 각각 처리하고 시간별로 멜라닌 생성 신호 전달 물질의 발현 변화를 관찰하였을 때 멜라닌 형성 효소의 발현을 증가시키는 전사 인자인 MITF나 MITF의 발현을 증가시키는 CREB의 인산화 레벨이 증가되는 것을 확인하였다(도 2a 및 도 2b).

실시예 3: 멜라닌 형성 효소 유전자 레벨 변화 관찰

멜라닌형성 세포(B16F10 세포주)를 6-웰 배양용 평판에 24시간 배양 후, 본 펩타이드를 농도별로 처리한다. 24시간 동안 배양 한 후 세포를 떼어 내어 멜라닌 형성에 관여 하는 효소인 티로시나아제, TRP1에 대한 각각의 특이적인 프라이머를 이용하여 RT-PCR로 발현의 증가를 관찰한다.

멜라닌 형성에 관여하는 효소의 PCR에 이용된 타겟-특이적 프라이머 서열은 다음과 같다: 티로시나아제 정방향 프라이머 서열, 5'-GGCCAGCTTTCAGGCAGAGG-3' 및 티로시나아제 역방향 프라이머, 5'-TGGTGCTTCATGGGCAAAAT-3'(어닐링 온도, 51℃); TRP1 정방향 프라이머 서열, 5'-CCGAAACACAGTGGAAGGTT-3' 및 TRP1 역방향 프라이머, 5'-TCTGTGAAGGTGTGCAGGAG-3'(어닐링 온도, 60℃).

마우스 멜라닌 형성세포 B16F10에 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 각각 처리하고 멜라닌 형성에 관여하는 효소인 티로시나아제, TRP1 유전자의 발현 양상을 시간별로 관찰하였을 때 6시간, 24시간 처리 시 대조군에 비해 발현이 증가되는 것을 확인하였다(도 3a 및 도 3b).

실시예 4: 멜라닌 형성 효소 단백질 레벨 변화 관찰

멜라닌형성 세포(B16F10 세포주)를 6-웰 배양용 평판에 24시간 배양 후, 본 발명의 펩타이드를 농도별로 처리한다. 24시간 동안 배양한 후 세포를 용해하여 멜라닌 형성에 관여 하는 핵심 효소인 티로시나아제의 발현을 특이적인 항체를 이용한 웨스턴 블롯 방법을 이용하여 관찰 한다. 항-티로시나아제 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 이용하여 실험을 진행하였다.

마우스 멜라닌 형성세포 B16F10에 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 각각 처리하고 멜라닌 형성에 관여하는 효소인 티로시나아제 단백질의 발현 양상을 시간별로 관찰하였을 때 6시간, 24시간 처리 시 대조군에 비해 발현이 증가되는 것을 확인하였다(도 4a 및 도 4b).

실시예 5: 중성지방양 측정

지방전구세포(3T3-L1 세포주)를 24-웰 배양용 평판에 48시간 배양 후, 분화 조성물(0.5 mM IBMX, 0.25 mM 덱사메타손, 10 mg/ml 인슐린)과 함께 본 발명의 펩타이드를 농도별로 처리하여 7일간 배양한다.

세포를 떼어낸 후 용해 완충액(50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 단백질분해효소 억제제)을 넣고 얼음에 30분간 보관한다. 4℃에서 14,000 g로 10분간 원심 분리 후 기름층을 포함한 상층액을 수집하고 트리글리세리드 시약을 첨가하여 37℃ 배양기에서 5분간 반응시킨 후, 540 nM에서 흡광도를 측정하여 중성지방 양을 측정한다.

지방 전구 세포 3T3-L1에 분화 유도 물질 및 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 각각 처리하고 7일간 배양 시 지방 형성 기전이 억제되어 대조군에 비해 세포 내 축적된 지방인 트리글리세리드의 수치가 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다(도 5a 및 도 5b).

실시예 6: 지방 생성 관련 유전자 변화 관찰

지방전구세포(3T3-L1 세포주)를 6-웰 배양용 평판에 48시간 배양 후, 분화 조성물(0.5 mM IBMX, 0.25 mM 덱사메타손, 10 mg/ml 인슐린)과 함께 본 펩타이드를 농도별로 처리하여 7일간 배양한다. 배양 후 지방 생성 기전에 관여하는 유전자인 페릴리핀과 PPARγ에 대한 특이적인 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 진행한다. 페릴리핀과 PPARγ의 mRNA 값이 억제되었는지 확인한다.

지방 생성 기전에 관여하는 효소의 PCR에 이용된 타겟-특이적 프라이머 서열은 다음과 같다: 페릴리핀 정방향 프라이머 서열, 5'-AAGGATCCTGCACCTCACAC-3' 및 페릴리핀 역방향 프라이머, 5'-CCTCTGCTGAAGGGTTATCG-3'(어닐링 온도, 60℃); PPARγ 정방향 프라이머 서열, 5'-TTTTCAAGGGTGCCAGTTTC-3' 및 PPARγ 역방향 프라이머, 5'-AATCCTTGGCCCTCTGAGAT-3'(어닐링 온도, 60℃).

지방 전구 세포 3T3-L1에 분화 유도 물질 및 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 각각 처리하고 7일간 배양 시 지방 형성 기전에 관여하는 물질인 페릴리핀과 PPARγ의 유전자 발현이 대조군에 비해 감소한 것을 확인하였다(도 6a 및 도 6b).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 일 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Caregen Co. Ltd. <120> Peptides Having Activity for Increasing Melanin Synthesis and Inhibiting Fat Synthesis and Uses Thereof <130> PN130674 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 1 <400> 1 Gln Cys Arg Phe Phe Arg Ser Ala Cys 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 2 <400> 2 Tyr Cys Arg Phe Phe Asn Ala Phe Cys 1 5 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyrosinase Forward Primer <400> 3 ggccagcttt caggcagagg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyrosinase Reverse Primer <400> 4 tggtgcttca tgggcaaaat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRP1 Forward Primer <400> 5 ccgaaacaca gtggaaggtt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRP1 Reverse Primer <400> 6 tctgtgaagg tgtgcaggag 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Perilipin Forward Primer <400> 7 aaggatcctg cacctcac ac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Perilipin Reverse Primer <400> 8 cctctgctga agggttatcg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR gamma Forward Primer <400> 9 ttttcaaggg tgccagtttc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR gamma Reverse Primer <400> 10 aatccttggc cctctgagat 20