技术领域
[0001] 本
发明属于
化妆品制备技术领域，具体涉及一种抑制酪氨酸酶活性的
植物提取物及其应用。
背景技术
[0002] 人类
皮肤的
颜色取决于黑色素的含量与分布，黑色素形成的生理过程基本可以概括为3个阶段：黑色素细胞产生黑色素；黑色素颗粒通过黑色素细胞树枝状突起向
角朊细胞转移；转移至角朊细胞的黑色素颗粒随表皮细胞上行至角质层，并随角质层脱落而排泄。
[0003] 酪氨酸酶是
生物体合成黑色素的关键酶，常用的美白化妆品的主要作用在于影响酪氨酸酶、黑色素细胞及黑色素的新陈代谢。目前发现，多种植物提取物含有抑制酪氨酸酶活性的物质，如仙蜜果，繁缕，乌韭，垂盆草，葎草地上部分，大绿柄桑木，五倍子虫瘿，大蓟全草，黑米糠，活性物质被证明有效的有熊果苷，谷胱甘肽，壳低聚糖，
氧化
白藜芦醇等，除了熊果苷疗效显著以外，其他几种已知的活性分子效果较差，而工业化生产的熊果苷产率低，副反应较多，产生对人体不利的化学物质。
[0004] 在生物体内，抑制酪氨酸酶活性的小分子
代谢物异常复杂，往往有多种构象，不同构象的小分子活性不同，大部分植物提取物含有的活性小分子不明确，且活性较低，组合几种现有的植物提取物，往往会发生相互拮抗，活性更低，找到抑制酪氨酸酶活性高的植物提取物或者几种相互增效的植物提取物，是本领域内研究的一个难点。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种抑制酪氨酸酶活性的植物提取物。
[0006] 本发明的目的还在于从上述植物提取物中选取能协同增效的植物提取物组合。
[0007] 一种抑制酪氨酸酶活性的植物提取物，所述植物提取物为
银杏提取物、石榴皮提取物、火棘提取物、白芷提取物、小旋花提取物。
[0008] 所述植物提取物为银杏提取物和石榴皮提取物按照1：1的
质量比混合的混合物。
[0009] 所述植物提取物为火棘提取物和小旋花提取物按照1：1的质量比混合的混合物。
[0010] 所述银杏提取物的提取方法为：选取干燥的银杏叶，
粉碎，过80-120目筛，加入5-8倍的70％
乙醇回流提取3次，合并滤液，减压蒸馏回收乙醇，剩余滤液过大孔
吸附树脂柱色谱，收集75％乙醇洗脱部分，减压干燥，制成。
[0011] 所述石榴皮提取物的提取方法为：选取干燥的石榴皮，粉碎，过60-80目筛，加入6-9倍的70％乙醇回流提取3次，合并滤液，减压蒸馏回收乙醇，剩余滤液过大孔吸附树脂柱色谱，收集75％乙醇洗脱部分，减压干燥，制成。
[0012] 所述火棘提取物的提取方法为：将火棘干燥果实粉碎，过筛，制成30-60目火棘粉；
水与乙醇体积比为3:6的比例配制提取液；准确称重白芷粉以克计，提取液以毫升计，按固液比以克/毫升计1:8，将火棘粉浸泡于提取液中48小时；回流提取1小时，停止提取待降温至室温后再升温提取1次，提取
温度不超过80℃；冷却后
真空抽滤，滤液用
旋转蒸发仪将
溶剂蒸出后得到火棘提取物。
[0013] 所述白芷提取物的提取方法为：将白芷干燥根粉碎，过筛，制成20-40目白芷粉；水与乙醇体积比为3:7的比例配制提取液；准确称重白芷粉以克计，提取液以毫升计，按固液比以克/毫升计1:10，将白芷粉浸泡于提取液中24小时；回流提取1小时，停止提取待降温至室温后再升温提取1次，提取温度不超过80℃；冷却后真空抽滤，滤液用
旋转蒸发仪将溶剂蒸出后得到白芷提取物。
[0014] 所述小旋花提取物的提取方法为：选取干燥的小旋花茎叶，粉碎，过80-100目筛，加入5-8倍的70％乙醇回流提取3次，合并滤液，减压蒸馏回收乙醇，剩余滤液过大孔吸附树脂柱色谱，收集75％乙醇洗脱部分，减压干燥，制成。
[0015] 一种面霜，包含上述植物提取物。
[0016] 所述面霜的制备方法如下：
[0017] (1)精确称取植物提取物5-8g，放入烧杯中；
[0018] (2)量取100ml蒸馏水倒入烧杯中，放入磁石，在磁
力搅拌器中加热溶解1.5h；
[0019] (3)加热溶解完成后，先抽滤一次，后过滤一次，得植物提取物澄清液；
[0020] (4)取另一洁净烧杯，用量筒量取20ml植物提取物澄清液倒入烧杯，再加入200ml蒸馏水，搅拌；
[0021] (5)称取4g乳化剂、2g甘油，量取10ml二丙二醇一起倒入烧杯，搅拌5min；
[0022] (6)滴入100uL PCA-Na、10uL香精，搅拌5min；
[0024] 本发明的有益效果：本发明制备的银杏提取物、石榴皮提取物、火棘提取物、白芷提取物和小旋花提取物，单剂均具有抑制黑素瘤细胞内黑色素合成的的作用，其中，发现银杏提取物和石榴皮提取物以及火棘提取物和小旋花提取物混合使用，具有明显的协同增效作用，可以作为制备美白化妆品的活性物质原料。
具体实施方式
[0025] 下面结合具体
实施例对本发明做进一步说明。
[0026] 下述实施例中植物提取物采用如下方法制备：
[0027] 银杏提取物的提取方法：选取干燥的银杏叶，粉碎，过100目筛，加入6倍的70％乙醇回流提取3次，合并滤液，减压蒸馏回收乙醇，剩余滤液过大孔吸附树脂柱色谱，收集75％乙醇洗脱部分，减压干燥，制成。
[0028] 石榴皮提取物的提取方法：选取干燥的石榴皮，粉碎，过70目筛，加入8倍的70％乙醇回流提取3次，合并滤液，减压蒸馏回收乙醇，剩余滤液过大孔吸附树脂柱色谱，收集75％乙醇洗脱部分，减压干燥，制成。
[0029] 火棘提取物的提取方法：将火棘干燥果实粉碎，过筛，制成40目火棘粉；水与乙醇体积比为3:6的比例配制提取液；准确称重白芷粉以克计，提取液以毫升计，按固液比以克/毫升计1:8，将火棘粉浸泡于提取液中48小时；回流提取1小时，停止提取待降温至室温后再升温提取1次，提取温度不超过80℃；冷却后真空抽滤，滤液用旋转蒸发仪将溶剂蒸出后得到火棘提取物。
[0030] 白芷提取物的提取方法：将白芷干燥根粉碎，过筛，制成30目白芷粉；水与乙醇体积比为3:7的比例配制提取液；准确称重白芷粉以克计，提取液以毫升计，按固液比以克/毫升计1:10，将白芷粉浸泡于提取液中24小时；回流提取1小时，停止提取待降温至室温后再升温提取1次，提取温度不超过80℃；冷却后真空抽滤，滤液用旋转蒸发仪将溶剂蒸出后得到白芷提取物。
[0031] 小旋花提取物的提取方法：选取干燥的小旋花茎叶，粉碎，过100目筛，加入6倍的70％乙醇回流提取3次，合并滤液，减压蒸馏回收乙醇，剩余滤液过大孔吸附树脂柱色谱，收集75％乙醇洗脱部分，减压干燥，制成。
[0033] 熊果苷(sigma公司)；B16小鼠黑素瘤细胞购自中科院上海细胞生物学研究所；
[0034] RPMI-1640液体培养基(含HEPES、双抗)，4℃
冰箱保存；96孔培养板、24孔培养板、6孔培养板；计数板；0.20μ无菌滤头、冻存管、EP管；移液管；加样枪(Thermo)；离心管；振荡混合仪；酶标仪；匀浆器；台式高速冷冻离心机(上海市离心机械研究所)；
电子称；恒温水浴箱；细胞计数器；可见分光光度计(上海市离心机械研究所)。
[0035] 实施例1植物提取物对黑素瘤
细胞增殖的影响
[0036] 将各植物提取物样品用液体培养基分别稀释为6.25、12.5、25、50、100μg/mL的浓度,并用0.20μm的无菌滤头过滤后备用。
[0037] 选择对数生长期的B16小鼠黑素瘤细胞，用0.25％胰酶消化后,以RPMI-1640完全培养基配成
密度为1×105个的细胞悬液，接种于96孔培养板,每孔100μL，于37℃、5％CO2
培养箱内培养。贴壁后,分别加入含不同浓度样品的完全培养液,对照组加等体积的细胞悬液,并设空白对照组加等体积的完全培养基,每孔100μL。每一浓度设3个复孔，37℃、5％CO2培养箱内培养72h后,MTT法于酶标仪570nm处测定吸光度(OD)值。按下列公式计算细胞相对增殖率:
[0038] 细胞相对增殖率＝[(A-C)/(B-C)]×100％
[0039] 其中A为待筛物各浓度平均吸光度值,B为对照组平均吸光度值,C为空白组平均吸光度值。测试结果见表1：
[0040] 表1 5种植物提取物对黑素瘤细胞的相对增殖率
[0041]
[0042] 由表1可以看出，作为阳性对照的熊果苷在用量为100μg/mL时，对黑素瘤细胞的相对增殖率为85.31％，对B16小鼠黑素瘤细胞毒性微弱，银杏提取物，石榴皮提取物，火棘提取物，白芷提取物，小旋花提取物对B16小鼠黑素瘤细胞毒性均较微弱。
[0043] B16黑素瘤细胞株是一种具有树状突起的腺细胞，由于树状突起是黑素瘤细胞输送黑色素颗粒的通道，同时也是与角质形成细胞联系的
桥梁，因此，黑素瘤细胞的生长状况正常与否，黑素瘤细胞功能的发挥具有重要作用。本次实验证实本发明的植物提取物对B16黑素瘤细胞毒性作用甚小，对细胞无伤害，对于正常
体细胞也就更无害了，也进一步说明，本发明的植物提取物不是通过抑制细胞增殖作用来阻断黑素瘤细胞内黑色素合成，进而达到美白效果的。
[0044] 实施例2植物提取物对黑素瘤细胞内黑色素合成的影响
[0045] 将培养的第3代黑素瘤细胞以1×104个密度接孔于6孔板，24h后换液。添加受试样品每种药物3个孔,样品浓度同实施例1。对照组以RPMI1640培养液代替样品溶液。37℃、5％CO2孵育后72h，弃去上清液。每孔加入2.5g/L胰酶于室温下消化5min。加入4mL培养液中止消化,并吹打成单细胞悬液。取0.5mL作细胞计数，其余细胞悬液1500r/min离心10min，弃上清，加入1mL1mol/L的NaOH,并在90℃水浴中孵育2h后,在酶标仪490nm处测其吸光度值。按下列公式计算黑色素合成量及药物对黑色素合成的抑制率。
[0046] 黑素合成抑制率＝[1-(样品孔吸光度值/样品孔细胞密度)/(对照孔吸光度值/对照孔细胞密度)×100％,测试结果见表2：
[0047] 表2 5种植物提取物对黑素瘤细胞黑色素合成的抑制作用
[0048]
[0049] 由表2可以看出，熊果苷，石榴皮提取物，小旋花提取物对B16黑素瘤细胞黑色素合成的抑制作用很明显,在样品浓度为100μg/mL时,对黑色素合成的抑制率分别达到33.48％，30.82％和38.92％，银杏提取物，火棘提取物，白芷提取物也具有抑制作用，但抑制作用较弱。
[0050] 选取上述植物提取物两两混合，浓度均为50μg/mL，重复上述黑素瘤细胞黑色素合成抑制实验，实验结果见表3：
[0051] 表3混合植物提取物对黑素瘤细胞黑色素合成的抑制作用
[0052]
[0053] 由表3可以看出，大部分混合植物提取物相对单剂的抑制作用减弱，呈拮抗作用，银杏提取物和石榴皮提取物组合使用，火棘提取物和小旋花提取物组合使用，抑制作用增强，表现为协同增效。
[0054] 众所周知，酪氨酸酶是生物体内合成黑色素的关键酶，这种含
铜的金属酶能够催化单酚羟
化成二酚(单酚酶活性)，并把二酚氧化成醌(二酚酶活性)，醌在非酶促条件下形成最终的反应产物黑色素，植物提取物抑制黑色素合成是通过影响酪氨酸酶、多巴色素互变酶和二羟基吲哚
羧酸氧化酶等的表达水平和活性，或其它不为我们所了解的机制，最终达到美白皮肤的目的。
[0055] 实施例3
[0056] 面霜，其制备方法如下：
[0057] (1)精确称取银杏提取物3g，石榴皮提取物3g，放入烧杯中；
[0058] (2)量取100ml蒸馏水倒入烧杯中，放入磁石，在磁力搅拌器中加热溶解1.5h；
[0059] (3)加热溶解完成后，先抽滤一次，后过滤一次，得植物提取物澄清液；
[0060] (4)取另一洁净烧杯，用量筒量取20ml植物提取物澄清液倒入烧杯，再加入200ml蒸馏水，搅拌；
[0061] (5)称取4g乳化剂、2g甘油，量取10ml二丙二醇一起倒入烧杯，搅拌5min；
[0062] (6)滴入100uL PCA-Na、10uL香精，搅拌5min；
[0063] (7)包装。
[0064] 实施例4
[0065] 面霜，其制备方法如下：
[0066] (1)精确称取火棘提取物3g，小旋花提取物3g，放入烧杯中；
[0067] (2)量取100ml蒸馏水倒入烧杯中，放入磁石，在磁力搅拌器中加热溶解1.5h；
[0068] (3)加热溶解完成后，先抽滤一次，后过滤一次，得植物提取物澄清液；
[0069] (4)取另一洁净烧杯，用量筒量取20ml植物提取物澄清液倒入烧杯，再加入200ml蒸馏水，搅拌；
[0070] (5)称取4g乳化剂、2g甘油，量取10ml二丙二醇一起倒入烧杯，搅拌5min；
[0071] (6)滴入100uL PCA-Na、10uL香精，搅拌5min；
[0072] (7)包装。
