技术领域
[0001] 本
发明涉及
发酵曲酸生产技术领域，具体为一种增加次生代谢产物曲酸含量的培养基方法及其应用。
背景技术
[0002] 亚麻酸(linolenic acid，LA)是一类具有三个双键的多元不饱和
脂肪酸，具有
加速人体吸收脂溶性维他命、可以减低心
血管疾病的死亡率、减少2型糖尿病的发生率等功效，对维持人体健康具有非常重要作用，通常被视为人体健康的必需品。因其双键
位置不同又可以分为α-亚麻酸和γ-亚麻酸。其中，α- 亚麻酸是构成人体组织细胞的主要成分，在体内参与磷脂合成、代谢调控，转化为
机体必须的生命活性因子DHA、DPA和EPA，是人体健康不可少的ω-3必须脂肪酸，同时，它也是
植物受到胁迫时产生
信号分子的一种前体分子。其化学名称：顺-9-顺-12-顺-15-十八
碳三烯酸(Allcis-9,12,15-Octadecatrienoic acid)，分子式：C18H30O2。
[0003] 而曲酸(kojic acid)是
微生物利用
淀粉糖原料好
氧发酵产生的一种具有抗菌作用的弱酸性化合物，化学名称5-羟基-2-羟甲基-4-吡喃
酮 (5-hydroxy-2-hydroxymethyl-4-pyrone)，具有抗菌防腐、保鲜、护色、可做为头孢类抗生素的中间体、对人畜安全无害等作用，因此有许多用途，可广泛应用于食品、日化和医药工业等领域。目前，日本是世界上主要曲酸生产国，也是曲酸消费国。而我国国内曲酸生产量远远低于以15-20％速度递增的需求量，究其原因主要是由于曲酸产量低，生成成本高，导致曲酸及其衍生产品用途开发
力度不够，为此我们提出一种增加次生代谢产物曲酸含量的培养基方法及其应用用于解决上述问题。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种增加次生代谢产物曲酸含量的培养基方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
[0005] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种增加次生代谢产物曲酸含量的培养基方法，向GMS合成培养基中添加α-亚麻酸制成目标培养基T2，其制备方法如下：先将200微升250毫摩尔每升溶于无
水乙醇的α-亚麻酸母液，至无菌三
角瓶中，在超净
工作台内自然挥干，加入18毫升的GMS合成培养基混合均匀制成目标培养基T2。
[0006] 优选的一种实施案例，所述α-亚麻酸在目标培养基T2中的浓度为0.695毫克/毫升。
[0007] 优选的一种实施案例，所述GMS合成培养基以
质量百分比计，其原料组成包括：3％-9％
葡萄糖、0.2％-0.5％(NH4)2SO4、0.1％-0.4％MgSO4·7H2O、 0.5％-1％KH2PO4、
0.05％-0.1％Na2B4O7·10H2O、0.03％-0.08％NaMoO4·2H2O、 0.001％-0.003％FeSO4·
7H2O、0.02％-0.04％CuSO4·5H2O、0.1％-2％ ZnSO4·7H2O和0.01％-0.02％MnSO4·H2O，加水至100％。
[0008] 优选的一种实施案例，所述GMS合成培养基以质量百分比计，其原料组成包括：5％葡萄糖、0.3％(NH4)2SO4、0.2％MgSO4·7H2O、1％KH2PO4、0.07％ Na2B4O7·10H2O、0.068％NaMoO4·2H2O、0.001％FeSO4·7H2O、0.03％ CuSO4·5H2O、0.176％ZnSO4·7H2O和0.011％MnSO4·H2O，加水至100％。
[0009] 优选的一种实施案例，所述GMS合成培养基以质量百分比计，其原料组成包括：7％葡萄糖、0.4％(NH4)2SO4、0.3％MgSO4·7H2O、0.7％KH2PO4、0.09％ Na2B4O7·10H2O、0.045％NaMoO4·2H2O、0.002％FeSO4·7H2O、0.035％CuSO4·5H2O、0.14％ZnSO4·7H2O和
0.016％MnSO4·H2O，加水至100％。
[0010] 一种增加次生代谢产物曲酸含量的培养基应用，包括如下步骤：
[0011] S1、选取黄曲霉(CGMCC NO.3.2890)，取少量-80℃甘油冻存的菌种均匀涂布于PDA培养基上活化，在37℃透气条件下培养4天，可以观察到有大量绿色的孢子产生；
[0012] S2、采用血球计数法确定黄曲霉孢子
密度，用0.05％吐温水稀释获得密度为 1×107孢子/毫升的孢子悬液；
[0013] S3、将黄曲霉孢子悬液接种到目标培养基T2中进行培养，可以促进黄曲霉代谢产生次生代谢产物曲酸。
[0014] 优选的一种实施案例，步骤S1中，所述PDA培养基的制备方法如下：称取200克
马铃薯，洗净去皮切成小
块，加水煮烂(煮沸30分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用四层纱布过滤，再加20克葡萄糖和15克琼脂，继续加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，透气膜封口，高压(121℃)灭菌15分钟后取出，分装到一次性塑料培养皿(9厘米直径)，每个皿倒入25毫升无菌培养基， 4℃
冰箱贮存备用。
[0015] 优选的一种实施案例，步骤S2中，确定孢子数方法如下：用细胞刮刀轻轻刮取培养基表层的黄曲霉孢子至0.05％吐温水中，反复搅拌，孢子最终呈均匀分散状态，倍比稀释，最后用血球计数板计数，使其终浓度为1×107孢子/毫升。
[0016] 优选的一种实施案例，步骤S3中，黄曲霉孢子悬液接种量为：取2ml黄曲霉孢子悬液1×107孢子/毫升至18毫升含有0.695毫克/毫升α-亚麻酸的目标培养基T2中，使其终浓度为1×106孢子/毫升，且培养时的容器均为50毫升规格的无菌三角瓶，用透气膜将三角瓶封口，在培养容器与外界进行气体交换条件下进行培养，并将其置于28℃避光摇床中培养2-7天，且摇床转速为180rpm。
[0017] 与
现有技术相比，本发明的有益效果是：通过PDA培养基充分活化黄曲霉，从而得到大量高活性的黄曲霉孢子；通过向GMS合成培养基中添加α-亚麻酸制成的目标培养基T2培养活化后的黄曲霉，不仅可抑制黄曲霉毒素的合成，还可以增加黄曲霉菌的次生代谢产物曲酸的含量，从而可以合理有效的提高生产过程中曲酸的产量，降低生产成本，大力提升曲酸及其衍生产品用途的开发力度。该方案整体措施简便，生产成本低，具有推广价值。
附图说明
[0018] 图1为α-亚麻酸处理后的培养基中曲酸的含量；
[0019] 图2为α-亚麻酸处理后的菌丝体中曲酸的含量；
[0020] 图3为α-亚麻酸处理后的培养基中黄曲霉毒素的含量；
具体实施方式
[0021] 下面将对本发明
实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0022] 实施例一
[0023] 本发明提供一种技术方案：一种增加次生代谢产物曲酸含量的培养基方法，向GMS合成培养基中添加α-亚麻酸制成目标培养基T2，其制备方法如下：先将200微升250毫摩尔每升溶于无水乙醇的α-亚麻酸母液，至无菌三角瓶中，在超净工作台内自然挥干，加入18毫升的GMS合成培养基混合均匀制成目标培养基T2。使得α-亚麻酸在目标培养基T2中的终浓度为0.695毫克/毫升。
[0024] 1升GMS合成培养基按照如下方法制备：将50克葡萄糖、3克 (NH4)2SO4、2克MgSO4·7H2O、10克KH2PO4、700毫克Na2B4O7·10H2O、680毫克NaMoO4·2H2O、10毫克FeSO4·7H2O、300毫克CuSO4·5H2O、1.76 克ZnSO4·7H2O和110毫克MnSO4·H2O溶于水中，用水补至1升，得到GMS 合成培养基。
[0025] 一种增加次生代谢产物曲酸含量的培养基应用，包括如下步骤：
[0026] S1、称取200克马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮烂(煮沸30分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用四层纱布过滤，再加20克葡萄糖和15克琼脂，继续加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，透气膜封口，高压(121℃) 灭菌15分钟后取出，分装到一次性塑料培养皿(9厘米直径)，每个皿倒入25 毫升无菌培养基，4℃冰箱贮存备用。选取黄曲霉(CGMCC NO.3.2890)，取少量-80℃甘油冻存的菌种均匀涂布于PDA培养基上活化，在37℃透气条件下培养4天，可以观察到有大量绿色的孢子产生；
[0027] S2、用细胞刮刀轻轻刮取黄曲霉孢子至0.05％吐温水中，反复冲洗搅拌，孢子最终呈均匀分散状态，倍比稀释，最后用血球计数板计数，获得密度为1×107 孢子/毫升的孢子悬液；
[0028] S3、取2毫升黄曲霉孢子悬液接种于18毫升含有0.695毫克/毫升α-亚麻酸的目标培养基T2中，使其孢子悬液终浓度为1×106孢子/毫升，且培养时的容器均为50毫升规格的无菌三角瓶，用透气膜将三角瓶封口，在培养容器与外界进行气体交换条件下进行培养，并将其置于28℃避光摇床中培养2-7天，且摇床转速为180rpm，不仅可抑制黄曲霉毒素的合成，还可以增加黄曲霉菌的次生代谢产物曲酸的含量。
[0029] 实施例二
[0030] 本发明提供一种技术方案：一种增加次生代谢产物曲酸含量的培养基方法，向GMS合成培养基中添加α-亚麻酸制成目标培养基T2，其制备方法如下：先将200微升250毫摩尔每升溶于无水乙醇的α-亚麻酸母液，至无菌三角瓶中，在超净工作台内自然挥干，加入18毫升的GMS合成培养基混合均匀制成目标培养基T2。使得α-亚麻酸在目标培养基T2中的终浓度为0.695毫克/毫升。
[0031] 1升GMS合成培养基按照如下方法制备：将70克葡萄糖、4克(NH4)2SO4、 3克MgSO4·7H2O、7克KH2PO4、900毫克Na2B4O7·10H2O、450毫克 NaMoO4·2H2O、20毫克FeSO4·7H2O、350毫克CuSO4·5H2O、1.4克 ZnSO4·7H2O和116毫克MnSO4·H2O溶于水中，用水补至1升，得到GMS合成培养基。
[0032] 一种增加次生代谢产物曲酸含量的培养基应用，包括如下步骤：
[0033] S1、称取200克马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮烂(煮沸30分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用四层纱布过滤，再加20克葡萄糖和15克琼脂，继续加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，透气膜封口，高压(121℃) 灭菌15分钟后取出，分装到一次性塑料培养皿(9厘米直径)，每个皿倒入25 毫升无菌培养基，4℃冰箱贮存备用。选取黄曲霉(CGMCC NO.3.2890)，取少量-80℃甘油冻存的菌种均匀涂布于PDA培养基上活化，在37℃透气条件下培养4天，可以观察到有大量绿色的孢子产生；
[0034] S2、用细胞刮刀轻轻刮取黄曲霉孢子至0.05％吐温水中，反复冲洗搅拌，孢子最终呈均匀分散状态，倍比稀释，最后用血球计数板计数，获得密度为1×107 孢子/毫升的孢子悬液；
[0035] S3、取2毫升黄曲霉孢子悬液接种于18毫升含有0.695毫克/毫升α-亚麻酸的目标培养基T2中，使其孢子悬液终浓度为1×106孢子/毫升，且培养时的容器均为50毫升规格的无菌三角瓶，用透气膜将三角瓶封口，在培养容器与外界进行气体交换条件下进行培养，并将其置于28℃避光摇床中培养2-7天，且摇床转速为180rpm，不仅可抑制黄曲霉毒素的合成，也还可以增加黄曲霉菌的次生代谢产物曲酸的含量。
[0036] 结合实施例一和实施例二，通过对比实验检测目标培养基T2对曲酸产生的促进效果。
[0037] 分别将黄曲霉孢子悬液接种到纯GMS合成培养基和目标培养基T2上进行培养，具体分为2组培养：
[0038] 0毫克/毫升亚麻酸即纯GMS合成培养基培养(对照组，CK组)：取2ml 黄曲霉孢子悬液接种于18毫升含有0毫克/毫升α-亚麻酸的培养基中，使黄曲霉孢子的终浓度为1×106孢子/毫升；
[0039] 0.695毫克/毫升亚麻酸(实验组，LA组)即目标培养基T2培养：取2毫升黄曲霉孢子悬液接种于18毫升含有0.695毫克/毫升α-亚麻酸的目标培养基T2中，使黄曲霉孢子密度终浓度为1×106孢子/毫升；以上2组的培养容器均为50毫升规格的无菌三角瓶，用透气膜将三角瓶封口，将其置于28℃避光摇床中培养7 天，转速为180rpm。提取以上2组培养物中的次生代谢产物曲酸，用于检测培养基中添加0.695毫克/毫升浓度的α-亚麻酸对曲酸形成的影响，用漏斗和
滤纸将菌丝球过滤后收集滤液，滤液可直接用于曲酸测定，菌丝体
冷冻干燥后液氮
研磨用于菌丝体曲酸提取，实验设三次重复，结果取平均值±标准差。
[0040] 采用上述培养方法，比较添加0毫克/毫升(对照组，CK组)和0.695毫克 /毫升α-亚麻酸(实验组，LA组)处理后的培养基和菌丝体样品中曲酸的差异。采用96孔-多功能酶标仪法，对培养2天、3天、4天和5天，6天，7天后的
真菌菌丝体和GMS培养基中提取的曲酸进行测定，实验设三次重复，结果取平均值±标准差，另外，采用薄层层析法对培养基中毒素进行测定，具体检测方法如下：
[0041] 1、96孔-多功能酶标仪法测定曲酸(见图1、2)。
[0042] (1)制备标准曲线。制备0.02克每毫升(20毫克每毫升)曲
酸溶液。称量曲酸0.02克(曲酸购于源叶生物，AR,货号：S30151-100g)，加1毫升纯水。稀释5个浓度梯度点，从20毫克每毫升逐级稀释得到五个浓度点，分别为2毫克每毫升、1毫克每毫升、0.5毫克每毫升、0.2毫克每毫升和0.1毫克每毫升。
[0043] (2)配制显色液0.75％FeCl3溶液。称量0.375克固体FeCl3(购于台山市粤侨
试剂塑料有限公司，AR，批号：20161201)，加50毫升纯水溶解。
[0044] (3)样品测试。培养基曲酸测定：取5微升培养基滤液或曲酸标准品到 96孔板中，加195微升显色液；菌丝体曲酸测定：取冷冻干燥后的菌丝体0.2克，加入1毫升纯水，超声10分钟，离心12000rpm，5分钟，取上清液测定。
[0045] (4)仪器测定-全
波长或多功能酶标仪。样品加完后，室温反应10分钟，仪器490nm测吸光度值。
[0046] 2、薄层层析法测定黄曲霉毒素(见图3，图中Std代表10ug/ml四种黄曲霉毒素混合标准品)。
[0047] (1)玻璃板画线。在长方形层析板上做标记，一块完整的层析板可以点样 19个。在玻璃板上下边缘0.5厘米处用铅笔轻轻的分别划一条直线(展板液体扩散印迹到达的位置和点样位置线)；两边选择玻璃板边缘光滑的一边作为点样线，并做标记，用铅笔每1厘米划一个点，作为点样位置标记。
[0048] (2)配置展开剂：氯仿比丙酮体积比9:1(10毫升，9毫升氯仿和1毫升丙酮)。Note:展开剂配置体积，取决于玻璃板块数，一块玻璃板需要5ml展开剂。
[0049] (3)取滤液：用枪头取培养基滤液0.2毫升至0.5毫升离心管中。
[0050] (4)氯仿提取：加入0.1毫升氯仿提取(滤液和氯仿体积比为2:1)。
[0051] (5)混匀：漩涡混匀仪，混匀，静止约5分钟，分层。
[0052] (6)点样：枪头取下层(氯仿层)10微升，垂直
接触点样标记位置(十字花)，缓慢排出液体。
[0053] (7)展板：玻璃展槽中有左右两部分凹槽，每个槽中加入5毫升展开剂。将玻璃板点样线的一边往下，未点样一边往上，用双手夹取垂直放于液体中，接触凹槽底面后，轻轻放手，将玻璃板斜倚展槽侧面。同样的方式，将玻璃板放于展槽的另外一个凹槽中。
[0054] (8)紫外检测：紫外仪365nm下，观察，拍照。
[0055] 结果如图1、2和3显示，其中图1结果为：与对照(0毫克/毫升组，CK 组)相比，加入0.695毫克/毫升浓度的α-亚麻酸(LA组)能明显促进培养基中曲酸的合成。曲酸的含量分别为：0毫克/毫升亚麻酸组(CK组)为2.9微克/ 毫升，0.695毫克/毫升亚麻酸组(LA组)为9.9微克/毫升。图2结果为：与对照(0毫克/毫升组，CK组)相比，加入0.695毫克/毫升浓度的α-亚麻酸能明显促进菌丝体中曲酸的合成。曲酸的含量分别为：0毫克/毫升亚麻酸组(CK组) 为0.99微克/毫克，0.695毫克/毫升亚麻酸组(LA组)为4.01微克/毫克。图3 结果为：与对照(0毫克/毫升组，CK组)相比，加入0.695毫克/毫升浓度的α- 亚麻酸组(LA组)毒素含量为0微克每毫升。
[0056] 从上述实验可以看出，通过向GMS合成培养基中添加α-亚麻酸制成的目标培养基T2，并利用该培养基培养黄曲霉菌，不仅可抑制黄曲霉毒素的合成，还可以增加黄曲霉菌的次生代谢产物曲酸的含量，从而可以合理有效的提高生产过程中曲酸的产量，降低生产成本，大力提升曲酸及其衍生产品用途的开发力度。
[0057] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、
修改、替换和变型，本发明的范围由所附
权利要求及其等同物限定。
