疾病检测方法
阅读：383发布：2020-05-08
专利汇可以提供疾病检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 为使用LC-MS对于 生物 试样所包含的作为生物标志物的肽的量进行测定、并基于该结果检测特定 疾病 的方法；在使用LC-MS的测定之前所进行的前处理工序具备如下工序：向生物试样中添加用稳定同位素对所述肽进行标记而得到的稳定同位素 试剂 和三氟乙酸，从而制备混合试样液的工序；将混合试样液煮沸的工序；将经煮沸的混合试样液注入固相提取柱中，并且使该固相提取柱保持所述肽的工序；向固相提取柱中流入 水 溶性 有机 溶剂 ，将该固相提取柱所保持的肽洗脱的工序。，下面是疾病检测方法专利的具体信息内容。
1.一种疾病检测方法，其为使用色谱-质谱装置对生物试样所包含的作为生物标志物的肽的量进行测定、并基于其结果来检测特定疾病的方法，其中，
使用了所述色谱-质谱装置的测定之前进行的前处理工序具备如下工序：
a)向所述生物试样中添加用稳定同位素对所述肽进行标记而得到的稳定同位素试剂和三氟乙酸，从而制备混合试样液的工序；
b)将所述混合试样液煮沸的工序；
c)将所述经煮沸的混合试样液注入固相提取柱中，并且使该固相提取柱保持所述肽的工序；
d)向所述固相提取柱中流入水溶性有机溶剂，将该固相提取柱所保持的所述肽洗脱并采集洗脱液的工序。
2.根据权利要求1所述的疾病检测方法，其中，所述水溶性有机溶剂为50％-100％的甲醇时，所述洗脱的工序之后，还具备：
使所述洗脱液所包含的所述水溶性有机溶剂蒸发而使所述肽干固的工序；和使所述干固后的所述肽溶解于包含0.1％-1％的三氟乙酸和5％-50％的乙腈的水溶液而制备质谱用试样液的工序。
3.根据权利要求1所述的疾病检测方法，其中，所述水溶性有机溶剂包含0.1％-1％的三氟乙酸和5％-99.9％的乙腈，
所述乙腈的浓度为50％-99.9％时，在所述洗脱工序之后还具备：
进行稀释以使所述洗脱液所包含的所述乙腈的浓度低于50％，从而制备质谱用试样液的工序。
4.根据权利要求2所述的疾病检测方法，其中，所述色谱-质谱装置具备：液相色谱部和能够进行MRM(多反应监测)测定的质谱部，
使用了所述色谱-质谱装置的测定具备如下工序：
在所述液相色谱部按照时间对所述质谱用试样液进行分离的工序；和
在所述质谱部实施以多个MRM跃迁作为测定条件的MRM测定的工序，所述MRM跃迁对应于：在所述液相色谱部按照时间分离的、所述质谱用试样液所包含的所述肽进行离子化而生成的前体离子；该前体离子在不同的部位发生氨基酸裂解而形成的多种产物离子。
5.根据权利要求3所述的疾病检测方法，其中，所述色谱-质谱装置具备：液相色谱部和能够进行MRM(多反应监测)测定的质谱部，
使用了所述色谱-质谱装置的测定具备：
在所述液相色谱部按照时间对所述质谱用试样液进行分离的工序；和
在所述质谱部实施以多个MRM跃迁作为测定条件的MRM测定的工序，所述MRM跃迁对应于：在所述液相色谱部按照时间分离的、所述质谱用试样液所包含的所述肽进行离子化而生成的前体离子；该前体离子在不同的部位发生氨基酸裂解而形成的多种产物离子。
6.根据权利要求1所述的疾病检测方法，其中，所述特定的疾病为认知功能障碍疾病，所述肽包含作为选自由凝血酶原、凝溶胶蛋白、补体C4A和补体C3中的一种乃至多种蛋白质的一部分的肽。
疾病检测方法
技术领域
背景技术
[0002] 存在于从罹患了特定疾病的人采集到的血液、尿等生物试样中并且在从除此以外的人采集的生物试样中完全不存在、或者几乎不存在的物质，可以成为表示罹患了该疾病的生物标志物。因此，对于成为生物试样所包含的生物标志物的物质的量进行测定，由该结果进行诊断各种疾病。一直以来，在生物试样中的生物标志物的测定中，一直使用体外诊断试剂。
[0003] 作为使用体外诊断试剂的生物标志物的测定方法之一，有将生物试样直接地、或者预先进行稀释，对于其中所包含的特定的蛋白质或肽利用抗原抗体反应进行测定的方法。例如，酶联免疫吸附测定法(ELISA)和化学发光免疫测定法(CLIA)使试样中的特定蛋白质或肽、与利用和底物反应时显色的酶进行了标记的第一抗体或第二抗体结合，以与蛋白质或肽结合了的抗体的显色量测定该蛋白质或肽量。另外，放射性免疫测定法(RIA)中，将第一抗体或第二抗体用放射性同位素进行标记，用与特定蛋白质或肽结合了的抗体的辐射线量测定该特定蛋白质或肽的量。进一步，特定的蛋白质等为酶的情况下，使用使该蛋白质与底物反应、并对由此产生的产物的量进行测定的酶活性测定法。
[0004] 近年来明确的是，生物体处于正常状态时，在该生物体内以完全的状态存在的蛋白质(以下称为“完整蛋白质”)，在处于罹患特定疾病状态(疾病状态)的生物体中被消化分解而生成作为各种消化分解产物肽(或者消化分解产物蛋白质)的部分肽(或者部分蛋白质)；或者，由于蛋白质的翻译合成中的剪切异常等而以部分蛋白质或部分肽的形式被翻译合成。另外，明确的是，在疾病状态中，随着该疾病的加剧而被消化分解或翻译合成的部分蛋白质、部分肽的种类、量变化。因此，不仅诊断生物试样中完整蛋白质的量，也在摸索由该完整蛋白质与其部分蛋白质、部分肽的量、种类诊断疾病、其进行程度的方法。然而，利用了上述抗原抗体反应、酶与底物的反应的现有的测定方法均是单独测定蛋白质、肽的方法，因此，对于完整的蛋白质、其部分蛋白质、部分肽分别进行测定需要时间、花费功夫。另外，测定对象变多时，相应地需要从被检者(罹患疾病的人)采集很多生物试样。
[0005] 对此提出了如下方法：使用液相色谱-质谱装置，网罗地测定生物试样中的多种蛋白质及其部分蛋白质、部分肽的量，基于该蛋白质、部分蛋白质、部分肽的存在图案、谱图来诊断疾病。例如，专利文献1中记载了如下方法：对于健康人与非酒精性脂肪性肝疾病患者或者脂肪肝与非酒精性脂肪性肝炎患者，由使用质谱装置对于是否存在、存在量不同的蛋白质及其部分肽进行了测定的结果，检测包含非酒精性脂肪性肝炎的非酒精性肝疾病。另外，专利文献2、3中记载了如下方法：对于健康人和肝癌患者，由使用质谱装置对于是否存在、存在量不同的蛋白质及其部分肽进行了测定的结果，检测肝癌。
[0006] 现有技术文献
[0007] 专利文献
[0008] 专利文献1：日本特开2010-071900号公报
[0009] 专利文献2：日本特开2006-308533号公报
[0010] 专利文献3：日本特开2006-284389号公报
发明内容
[0011] 发明要解决的问题
[0012] 用于疾病的诊断中的生物试样是在各种医院、诊所等医疗机构中从被检者采集到的，在所有的机构用完全相同的顺序、相同的条件、品质采集生物试样是困难的。因此，即便是来自同一蛋白质的峰，由于这样的生物试样的采集顺序、条件、品质等的偏差，有时该峰的信号强度会存在差异。
[0013] 对于疾病、其进行程度的诊断可以例如基于对完整蛋白质及其部分蛋白质以及部分肽各自的量、存在比(量比)等进行分析的结果来进行。因此，各成分峰的信号强度产生差异时，不仅蛋白质、部分蛋白质、部分肽的各自的量产生差异，这些蛋白质与部分蛋白质、部分肽的量比也会产生差异，从而不能进行正确的诊断。
[0014] 需要说明的是，上述说明中，为了方便，将完整蛋白质的一部分称为“部分蛋白质”、“部分肽”，但通常蛋白质的一部分被称为“肽”。
[0015] 本发明要解决的课题是提供用于使用质谱装置正确地测定成为特定疾病的生物标志物的肽的技术。
[0016] 用于解决问题的方案
[0017] 为了解决上述课题而做成的本发明的疾病检测方法的特征在于，其是使用色谱-质谱装置对于生物试样所包含的作为生物标志物的肽的量进行测定、并基于其结果来检测特定疾病的方法，其中，
[0018] 使用了所述色谱-质谱装置的测定之前进行的前处理工序具备如下工序：
[0019] a)向所述生物试样中添加用稳定同位素对所述肽进行标记而得到的稳定同位素试剂和三氟乙酸，从而制备混合试样液的工序；
[0020] b)将所述混合试样液煮沸的工序；
[0021] c)将所述经煮沸的混合试样液注入固相提取柱中，并且使该固相提取柱保持所述肽的工序；
[0023] 此处，生物试样是指血液、血浆、血清、脑髓液、尿等。
[0024] 另外，作为生物标志物的肽是指：从罹患特定疾病的人采集的生物试样液中的存在量、与从没有罹患该特定疾病的人采集的生物试样液中的存在量之间具有差异的肽。例如，在没有罹患特定疾病状态的生物体中以完整蛋白质形式存在、在罹患特定疾病状态的生物体中以作为该完整的蛋白质的一部分的肽的形式被生成或合成的情况下，该肽相当于生物标志物。
[0025] 进而，用稳定同位素对所述肽进行了标记而得到的稳定同位素试剂是指：将构成所述肽的几个原子用该原子的稳定同位素元素置换而成的试剂。
[0026] 在前处理工序中，向生物试样中添加的三氟乙酸具有在生物试样中将纤维蛋白原、白蛋白等缠绕在基质上的状态的肽从该基质分离的作用。另外，对混合试样液进行煮沸的工序具有在肽为团块状时将该肽解开的作用。对混合试样液进行煮沸的时间优选为1分钟～30分钟，但不限于此。例如，可以根据生物试样的种类、利用质谱的作为测定対象的生物标志物(肽)的种类而设定合适的煮沸时间。
[0027] 生物试样中所添加的稳定同位素试剂的质荷比的值和与其对应的肽几乎相同，另外，物理/化学性质类似。因此，在对生物试样用色谱质谱装置进行测定时，稳定同位素试剂和与其对应的肽的行为类似。色谱质谱分析的结果，在得到的质谱上可见稳定同位素试剂的峰和与其对应的肽的峰接近。前处理时的回收率存在偏差的情况下，其影响为：稳定同位素试剂的峰和与其对应的肽的峰接近，由于稳定同位素试剂的添加量是已知的，因此能够由两者的峰强度对比准确地求出某肽的量。
[0029] 使所述洗脱液所包含的所述水溶性有机溶剂蒸发而使所述肽干固的工序；和[0030] 使所述干固后的所述肽溶解于包含0.1％-1％的三氟乙酸和5％-50％的乙腈的水溶液而制备质谱用试样液的工序。
[0031] 另外，优选本发明中，所述水溶性有机溶剂包含0.1％-1％的三氟乙酸和10％-99.9％的乙腈，
[0032] 所述乙腈的浓度为50％-99.9％时，在所述洗脱工序之后还具备：
[0033] 进行稀释以使所述洗脱液所包含的所述乙腈的浓度低于50％，从而制备质谱用试样液的工序。
[0035] 在使用甲醇由固相提取柱洗脱所述肽的情况下，将该洗脱液直接供于色谱质谱装置时，有生物试样的分离被所述甲醇妨碍的可能性，因此需要使所述甲醇蒸发，使用包含0.1％-1％的三氟乙酸和10％-99.9％的乙腈的水溶性有机溶剂进行洗脱的情况下，可以节省使该水溶性有机溶剂蒸发的处理。其中，乙腈的浓度为50％-99.9％时，分离被该乙腈妨碍，因此可以对洗脱液进行稀释以使乙腈的浓度低于50％，从而制成质谱用试样液。
[0036] 所述色谱-质谱装置还具备：液相色谱部和能够进行MRM(多反应监测)测定的质谱部，
[0037] 使用了所述色谱-质谱装置的测定具备：
[0038] 在所述液相色谱部按照时间对所述质谱用试样液进行分离的工序；和[0039] 在所述质谱部实施以多个MRM跃迁作为测定条件的MRM测定的工序，所述MRM跃迁对应于：在所述液相色谱部按照时间分离的、所述质谱用试样液所包含的所述肽进行离子化而生成的前体离子、该前体离子在不同的部位发生氨基酸裂解而形成的多种产物离子。
[0040] 作为本发明的疾病检测方法对象的疾病之一，有如下疾病：在正常状态下完整蛋白质在特定的疾病状态下作为该完整蛋白质的一部分的肽的形式被生成或合成。作为这样的疾病的例子，可列举出认知功能障碍疾病、肝疾病(非酒精性脂肪性肝疾病、脂肪肝、肝癌)。作为所述特定疾病为认知功能障碍疾病的情况下的所述完整蛋白质，可列举出凝血酶原、凝溶胶蛋白、补体C4A和补体C3。另外，除了蛋白质以外，还有转录因子AP-2γ、催产素受体、E3泛素蛋白连接酶HERC2、肿瘤坏死因子受体超家族成员16、轴突蛋白-2-β前体、轴突蛋白1-β、原钙黏蛋白γA-10包含于所述完整的蛋白质中。
[0041] 发明的效果
[0042] 本发明在向生物试样中添加三氟乙酸而制备混合试样液之后进行煮沸，因此能够将肽从生物试样中的基质(纤维蛋白原、白蛋白等)分离，从而能够解开团块状的肽。因此，将混合试样液注入固相提取柱时，能够将生物试样中的肽稳定地保持于该固相提取柱。因此，之后、向固相提取柱中流入水溶性有机溶剂能够将保持于该固相提取柱中的肽洗脱。
[0044] 图1是用于实施本发明的疾病检测方法的质谱装置的一实施方式的概略构成图。
[0045] 图2是用于说明前处理步骤的图。
[0046] 图3是表示液相色谱部的分析的梯度曲线的图。
[0047] 图4是表示14种认知功能障碍疾病的生物标志物肽的MRM跃迁的图。
[0048] 图5是使用本实施方式的液相色谱-质谱装置进行某生物试样的测定的结果、得到的MRM色谱图。
具体实施方式
[0049] 以下，对于本发明的疾病检测方法的一实施方式参照附图进行说明。
[0050] 图1是用于实施本发明的疾病检测方法的液相色谱-质谱装置(LC-MS/MS)的概略构成图。
[0051] 液相色谱-质谱装置包含液相色谱部(LC部)10和质谱部(MS/MS部)20。
[0052] LC部10包含：贮存有流动相的流动相容器11；吸引流动相且以恒定流量供给的泵12；向流动相中注入各规定量预先准备的试样的注射器13；在时间方向上将试样所包含的各种化合物分离的柱14。需要说明的是，在进行边使多个流动相的组成连续地变化边将试样所包含的化合物分离的、所谓的梯度分离时，LC部10分别设有两个以上的流动相容器11和泵12。
[0053] MS/MS部20由串联四极杆质谱装置构成，是在大气压下的离子化室21与被未图示的高性能的真空泵真空排气的高真空的分析室24之间具备了真空度阶段性地提高了的第1、第2中间真空室22、23的多级差动排气系统的构成。离子化室21设置有边对试样溶液赋予电荷边进行喷雾的电喷雾离子化用探针25，离子化室21与下一阶段的第1中间真空室22之间通过细径的加热毛细管26联通。第1中间真空室22与第2中间真空室23之间被顶部具有小孔的分离器28隔开，在第1中间真空室22与第2中间真空室23分别设置有用于使离子收集并且向后段输送的离子导向器27、29。分析室24中，夹有内部设置有多极离子导向器32的碰撞单元31，并且设置有：根据质荷比对离子进行分离的前段四极质量过滤器30、同样地根据质荷比对离子进行分离的后段四极质量过滤器33、以及离子检测器34。CID气体供给部35用于向碰撞单元31的内部供给氩气、氮气等CID气体。另外，电源部36对于电喷雾电离用探针25、离子导向器27、29、32、四极质量过滤器30、33等分别施加规定的电压。
[0054] 数据处理部40作为功能块具备：数据收集部41、数据存储部42、图表制作部43、定量分析部44等。附设有输入部52、显示部53的控制部50具备处理条件参数存储部51，基于预先存储在该存储部51的处理条件参数，分别控制液相色谱部10的泵12、注射器13、质谱部20的电源部36、CID气体供给部35等各部的工作。需要说明的是，控制部50和数据处理部40的功能的至少一部分以个人计算机作为硬件资源，通过在计算机上实施预先安装于该计算机的专用的控制·处理软件来实现。
[0055] 本实施方式的LC-MS/MS中的基本的MS/MS测定工作如下。
[0056] 首先，泵12由流动相容器11吸引流动相，以恒定流量供给至柱14。由注射器13将一定量的试样液导入至流动相中时，随着流动相的流动，试样被导入至柱14，在通过柱14期间，试样中的各种化合物在时间方向上被分离，从柱14出口洗脱，被导入至MS/MS部20。
[0057] 在MS/MS部20，来自柱14的洗脱液到达电喷雾电离用探针25时，在该探针25的前端一边被赋予电荷一边被喷雾洗脱液。通过喷雾而形成的带电液滴由于被赋予的电荷带来的静电力的作用而边分裂边被微细化，在该过程中，溶剂气化而来自化合物的离子飞出。
[0058] 这样生成的离子通过加热毛细管26被送至第1中间真空室22，被离子导向器27收集，经过分离器28顶部的小孔被送至第2中间真空室23。接着，源自化合物的离子被离子导向器29收集而被送至分析室24，被导入至前段四极质量过滤器30的长轴方向的空间中。需要说明的是，离子化法不限定于电喷雾电离法，当然也可以使用大气压化学离子化法、大气压光离子化法等。
[0059] 在MS/MS部20进行MS/MS分析时，对于前段四极质量过滤器30和后段四极质量过滤器33的各杆电极，分别由电源部36施加规定的电压(高频电压与直流电压重叠而成的电压)，对于碰撞单元31内，由CID气体供给部35连续或间歇地供给CID气体。由此，被送入至前段四极质量过滤器30的各种离子中，仅与施加于前段四极质量过滤器30的各杆电极的电压对应的、具有特定质荷比的离子通过该过滤器30，作为前体离子被导入至碰撞单元31。碰撞单元31内，前体离子与CID气体冲突而开裂，生成各种产物离子。生成的各种产物离子被导入至后段四极质量过滤器33时，仅与施加于后段四极质量过滤器33的各杆电极的电压对应的、具有特定质荷比的产物离子通过该过滤器33，到达离子检测器34而被检测。离子检测器34可以使用脉冲计数型检测器，该情况下，输出与入射的离子个数对应个数的脉冲信号作为检测信号。
[0060] 离子检测器34的检测信号被输入至数据处理部40，制成质谱图、色谱图，同时实施这些质谱图、色谱图的分析处理。然后，基于该分析结果，进行作为该生物试样提供者的被检者是否罹患特定疾病的诊断、或者在罹患特定疾病时对于其进行程度进行判定。
[0061] 与通常的LC-MS/MS同样地，在本实施方式中，作为MS/MS测定的模式，准备了多反应监测(MRM)测定、产物离子扫描测定、前体离子扫描测定、中性丢失扫描测定。
[0062] MRM测定中，前段四极质量过滤器30和后段四极质量过滤器33中，分别仅使规定质荷比的离子通过而进行MS/MS测定，由此，对于源自目标化合物的特定前体离子检测特定产物离子。MRM测定中，可以设定多个将前体离子的质荷比(m/z)与产物离子的质荷比(m/z)作为1组的通道来进行测定，将前体离子的质荷比与产物离子的质荷比的组称为“MRM跃迁”。以下说明的疾病检测处理中，使用MRM测定作为MS/MS测定。
[0063] 接着，为了进行特定疾病的检测，对于使用上述LC-MS/MS而实施的测定处理进行说明。此处，对于为了检测认知功能障碍疾病而实施的测定处理列举例子进行说明。
[0064] ＜1试剂·用具等的准备＞
[0065] 准备以下所示的试剂和用具等。
[0066] (1)标准曲线用标准溶液(STD溶液)：各以规定量包含如下肽的试剂：由成为认知功能障碍疾病的生物标志物的完整的蛋白质(凝血酶原、凝溶胶蛋白、补体C4A、补体C3)的氨基酸序列的一部分形成的肽，具体而言，选自表1所列举的14种肽中的1种乃至多种肽。也可以是在标准血清中各以规定量包含选自14种肽中的1种乃至多种肽。使用规定的稀释液将STD溶液梯度地稀释，由此制作标准曲线上的各校准点用溶液(例如，6点的校准点用的溶液)。需要说明的是，表1中示出了14种肽的序列号(No.1～14)、识别号(ID)、该肽的本来的蛋白质的名称、以及该肽的氨基酸序列。
[0067] [表1]
[0068]
[0069] (2)精度管理用标准溶液(QC溶液)：将由STD溶液制作的校准点用溶液混合而制成的溶液。例如，是6点校准点的情况下，分别地将混合了校准点1的溶液和校准点2的溶液而制成的溶液、混合了校准点3的溶液和校准点4的溶液而制成的溶液、混合了校准点5的溶液和校准点6的溶液而制成的溶液作为QC溶液而使用。
[0070] (3)稳定同位素试剂：各以规定量包含将上述14种肽的一部分原子用稳定同位素置换而得到的物质的试剂。
[0071] (4)溶剂A：包含0.1％-1％TFA)和5％-50％乙腈(ACN)的水溶性有机溶剂[0072] (5)溶剂B：50％-100％甲醇
[0073] (6)溶剂C：包含0.1％-1％TFA的水溶液
[0074] (7)溶剂D：包含0.1％-1％TFA和5％-50％甲醇的水溶性有机溶剂
[0076] (9)96孔(well)的样品板
[0077] (10)防止蒸发用板垫
[0078] ＜2.生物试样(血清)的准备＞
[0079] 从被检者采集血液，将其放置规定时间之后，进行离心分离、采集上清(血清)。
[0080] ＜3.试样的制备＞
[0081] 按照图2所示的步骤进行前处理。
[0082] 首先，向96孔的样品板的各孔中加入作为生物试样的血清各25μL。另外，在与注入了血清的孔不同的孔中各注入STD溶液、QC溶液25μL。
[0083] 接着，向注入了血清、STD溶液、QC溶液的样品板的各孔中添加各475μL溶剂C(包含0.1％-1％TFA的水溶液)，进而，添加稳定同位素试剂各20μL。由此，各孔中成为注入了520μL液体(混合液)的状态。
[0084] 接着，用铝制密封对样品板的上面进行封装，对其用平板振动器进行搅拌。之后，用与样品板对应的离心机进行第1次离心分离(100g,2分钟,4℃)、热处理(100℃,15分钟)、冰中保管(10分钟)、第2次离心分离(100g,2分钟,4℃)。
[0085] ＜4.利用固相提取柱(固相提取板)的处理＞
[0086] 首先，向与96孔板对应的固相提取柱(商品名Oasis HLBμElution Plate、Water公司制、以后称为“固相提取板”)的各孔中流入溶剂B(500μL的50％-100％甲醇)而去除不溶成分，接着，流入500μL的溶剂C(包含0.1％-1％TFA的水溶液)来调节所述固相提取板。
[0087] 接着，使前处理的第2次离心分离后的样品板的各孔中的上清液500μL流入固相提取板的对应的孔中。接着，将500μL的溶剂D(包含[0.1％-1％TFA]+[5％-50％甲醇]的水溶性有机溶剂)流入该固相提取板的各孔，将与固相提取板非特异地吸附的基质成分洗涤排出。之后，向固相提取板的各孔中添加50μL的溶剂A(包含[0.1％-1％TFA]+[5％-50％ACN]的水溶性有机溶剂)，将吸附于固相提取板的肽洗脱至质谱用的96孔样品板的各孔中。通过以上得到的、收纳在96孔样品板的各孔中的液体成为质谱用试样液。
[0088] ＜5.利用色谱-质谱装置的测定＞
[0089] 将收纳有通过利用固相提取柱的处理而得到的质谱用试样液的96孔样品板设置于上述LC-MS/MS的注射器13的试样载置部，实施色谱-质谱分析。将LC部10、MS/MS部20的具体的装置名以及各部的处理条件等、其分析结果示于以下。
[0090] ＜5.1LC部＞
[0091] ·装置名：使用了能进行梯度分析的高效液相色谱装置(商品名Nexera XR(株式会社岛津制作所制)。
[0092] ·柱：使用了肽、蛋白质的分析用反相柱(商品名Aeris(注册商标)peptide(Phenomenex公司)、柱尺寸；2.1×50mm,2.6μm(MAX Pressure:1000bar(100MPa))。
[0093] ·分析方式：采用了一边使以下的溶剂E与溶剂F的混合比随着时间变化、一边使质谱用试样液随着时间分离的梯度分析。图3中示出了梯度曲线。
[0094] [溶剂]水：ACN：甲酸＝98：2：0.1
[0095] [溶剂]水：ACN：甲酸＝10：90：0.1
[0096] 加热温度：55℃
[0097] 采样器温度；5℃
[0098] ＜5.2MS/MS部＞
[0099] ·装置名：使用作为能够进行MRM分析的质谱装置的三重四极杆型质谱装置(商品名LCMS-8060(株式会社岛津制作所制))。分析时的各部的测定值如下。
[0100] CID气压：270kPa
[0102] 雾化器气体流量：3L/分钟
[0103] 加热气体(heating gas)流量：10L/分钟
[0104] 接口温度：300℃
[0105] DL温度：250℃
[0106] 加热块温度：400℃
[0107] 干燥气体(drying gas)流量：10L/分钟
[0109] ＜5.3测定结果＞
[0110] 图5是对于从某被检者采集的生物试样进行液相色谱-质谱分析的结果、基于得到的14种肽的离子强度作成的基峰色谱图。图5所示的各符号与表1所示的符号相对应。如图5所示，分别观测到来源于14种肽的峰。
[0111] 需要说明的是，上述的实施方式不过是本发明的一例，例如，也可以代替液相色谱而使用气相色谱。另外，在上述实施方式中，为了将吸附于固相提取板的肽洗脱使用了溶剂A(包含[0.1％-1％TFA]+[5％-50％ACN]的水溶性有机溶剂)，也可以取而代之使用溶剂B(50％-100％甲醇)。在使用了溶剂B的情况下，优选在将所述肽洗脱的工序之后，进一步使所述洗脱液所包含的所述溶剂B蒸发而使肽干固。
[0112] 另外，上述实施方式中使用的用具、装置不过是一例，不限定于这些。例如，作为液相色谱的反相柱也可以使用一般的C18柱来构成固相提取板。
[0114] 附图标记说明
[0115] 10…液相色谱部
[0116] 14…柱
[0117] 20…MS/MS部
[0118] 30…四极质量过滤器
[0119] 30…前段四极质量过滤器
[0120] 31…碰撞单元
[0121] 32…多极离子导向器
[0122] 34…离子检测器
[0123] 35…CID气体供给部
[0124] 36…电源部
[0125] 40…数据处理部
[0126] 41…数据收集部
[0127] 42…数据存储部
[0128] 43…图表制作部
[0129] 44…定量分析部
[0130] 50…控制部
[0131] 52…输入部
[0132] 53…显示部
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