一种具有化学修饰基团的蛋白质及其制备方法
阅读：1发布：2020-08-24
专利汇可以提供一种具有化学修饰基团的蛋白质及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及利用 蛋白质 反式剪接技术将化学基团定点修饰到蛋白质C‑端的技术。具体地，本发明提供了利用蛋白质反式剪接技术将聚乙二醇(PEG)修饰到粒细胞集落刺激因子(G‑CSF)、人类生长 激素 (hGH)、人类干扰素α 2b(IFN α2b)、白细胞介素‑15(ILK‑15)和尿酸 氧 化酶 (UOX)C端的技术，以及提供了制备上述定点C‑端修饰的药物的方法。同时，还提供了用于定点修饰蛋白质多肽药物的蛋白质内含子序列。，下面是一种具有化学修饰基团的蛋白质及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种使用断裂蛋白内含子定点修饰蛋白质的方法，包括：
i.制备包括断裂蛋白内含子的C-段序列与第一氨基酸序列的C-蛋白并对所述C-蛋白进行化学修饰；
ii.制备包括断裂蛋白内含子的N-段序列与第二氨基酸序列的N-蛋白；
iii.通过反式剪切技术将所述C-蛋白与N-蛋白相连接，其中，所述第一、第二氨基酸序列通过肽键相连接，其特征在于，所述C-段序列如SEQ ID NO :1所示，所述N-段序列如SEQ ID NO :2所示，
其中，所述第一氨基酸序列的序列如SEQ ID NO :3所示，且所述第一氨基酸序列的第四位点为化学修饰位点，所述第二氨基酸序列代表一种蛋白多肽类药物的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述C-蛋白还包括组氨酸标签以及选自硫氧还蛋白(T蛋白)，麦芽糖结合蛋白(MBP蛋白)，SUMO蛋白（S蛋白），以及谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的标签蛋白。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述N-蛋白还包括组氨酸标签。
4. 一种具有化学修饰基团的蛋白质，所述蛋白质由第一氨基酸序列以及第二氨基酸序列组成，所述第一、第二氨基酸序列通过肽键相连接，其特征在于，所述第一氨基酸序列的序列如SEQ ID NO :3所示，且所述第一氨基酸序列的第四位点为化学修饰位点，所述第二氨基酸序列代表一种蛋白多肽类药物的氨基酸序列。
5. 如权利要求4所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白多肽类药物包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人类生长激素(hGH)、人类干扰素α 2b(IFN α 2b)、白细胞介素-15(ILK-
15)和尿酸氧化酶(UOX)。
6.如权利要求4所述的蛋白质，其特征在于，所述第四位点修饰有水溶性化合物。
7.如权利要求6所述的蛋白质，其特征在于，所述水溶性化合物为聚乙二醇或聚乙二醇衍生物、MMAE和DM1。
8. 包含C-段序列和N-段序列的断裂蛋白内含子，其中，所述C-段序列如SEQ ID NO :1所示，所述核苷酸序列如SEQ ID NO :4；所述N-段序列如SEQ ID NO :2所示，所述核苷酸序列如SEQ ID NO :5所示。
一种具有化学修饰基团的蛋白质及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及蛋白质药物修饰领域。本发明涉及利用蛋白质反式剪接技术将化学基团定点修饰到蛋白质C-端的技术。还提供了制备多种聚乙二醇化药物，以及制备方法。同时，还提供了用于定点修饰蛋白质多肽药物的蛋白质内含子序列。
背景技术
[0002] 聚乙二醇(PEG)化学修饰是延长蛋白多肽类药物在体内半衰期的一个有效途径。修饰了聚乙二醇的蛋白质的构象、静电吸附和亲疏水性等物理化学性质会发生变化。这些物理和化学的变化使聚乙二醇化的药物蛋白质明显优于普通的蛋白质多肽类药物。聚乙二醇化的蛋白质多肽类药物的优点主要体现在：增加了药物溶解性，提高了药物稳定性，降低了免疫原性，减少肾的过滤作用和有效的保护蛋白质多肽药物免遭蛋白水解酶将其分解。
[0003] 在聚乙二醇化的过程中，最大的技术挑战之一就是特异性。在很多情况下要求将聚乙二醇修饰到蛋白的特定位点，而且修饰后聚乙二醇分子和蛋白质的分子比例应该为1：1。然而，在蛋白质分子中通常会出现多个修饰位点(-SH,-NH2等)，由于是随机修饰，修饰的位点不均一，修饰聚乙二醇的数目也不均一，导致PEG修饰产物是混合物。而且，这些异构体的生物活性也不相同，导致规模化制备时难以实现批次间的稳定性，有时难以达到药物生产和新药申报的要求。
[0004] 为了解决这个问题，目前有些研究做了定点修饰方面的研究。例如，有些方法是蛋白质N-末端的聚乙二醇修饰(例如美国专利NO.6077939；美国专利NO.7090835；美国专利NO.5621039)。此外，还有一种方法是像蛋白质药物中引入游离的半胱氨酸，用来进行定点修饰(美国专利NO.7214779)。还有一种方法是向蛋白质中引入非天然氨基酸，作为定点修饰的位点(美国专利NO.7230068)。
[0005] 然而这些方法都有局限性，例如，这些方法的步骤复杂，费时费力。而且修饰效率很低，降低了药物蛋白的活性(蛋白没有正确折叠)。同时，这些方法还会产生副产物，这样会导致药物的活性受影响，去除这些副产物的工作也同样巨大。而且为了优化这些过程，可能要突变一些氨基酸作为多聚物的靶点。然而，突变的氨基酸可能会导致药物多肽丧失活性(例如，二级结构和蛋白构象的变化)。
[0006] 所以，需要一种新型的定点修饰方法用来克服上述困难。基于蛋白质反式剪接技术，本发明提供了一种定点修饰蛋白质C-末端的技术。蛋白质反式剪接(protein trans-splicing)是由蛋白质内含子(intein)介导。蛋白质内含子是具有自我催化活性的蛋白质，翻译后，蛋白质内含子片段会从蛋白质前体中剪掉，并以肽键连接两侧蛋白质外显子(extein)，形成成熟蛋白质。断裂蛋白质内含子(split intein)在蛋白质内含子中部区域特定位点发生断裂，形成N端片段(IN，N part of intein)和C端片段(IC,C part of intein)，这种内含子可以结合重构形成有功能的蛋白质内含子，也可以催化蛋白分子间的反式剪接反应。此外，蛋白质反式剪接不但可以在生理条件下进行，而且可以在蛋白浓度相对较低的情况下进行。反式剪接为蛋白质特异位点修饰提供了一种新方法。
发明内容
[0007] 为了解决蛋白质多肽药物修饰领域的非特异性修饰问题和弥补现有技术的不足，本发明提供了利用蛋白质反式剪接技术将化学基团定点修饰到蛋白质多C-端的技术。本发明首次利用蛋白质反式剪接技术将聚乙二醇(poly ethylene glycol,PEG)修饰到蛋白多肽类药物的特定位点，得到了组分均一的长效重组蛋白药物。这些被修饰的药物包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人类生长激素(hGH)、人类干扰素α2b(IFNα2b)、白细胞介素-15(ILK-15)和尿酸氧化酶(UOX)。本发明还提供了制备上述定点C-端修饰的药物的方法。同时，还提供了用于定点修饰蛋白质多肽药物的蛋白质内含子序列。
[0008] 本申请的一方面，在于提供了一种仅含有一个化学修饰位点的化学修饰蛋白的方法，其可以提供均一的定点修饰的蛋白质。
[0009] 该方法使用断裂蛋白内含子定点修饰，具体方法包括：
[0010] i.制备C-蛋白(包括断裂蛋白内含子的C-段序列与第一氨基酸序列)并对所述C-蛋白进行化学修饰；
[0011] ii.制备N-蛋白(包括断裂蛋白内含子的N-段序列与第二氨基酸序列)；
[0012] iii.通过反式剪切技术将所述C-蛋白与N-蛋白相连接，其中，所述第一、第二氨基酸序列通过肽键相连接，其特征在于，所述C-段序列如SEQ ID NO:1所示，所述N-段序列如SEQ ID NO:2所示。需要说明的是，本申请中的断裂蛋白内含子并不限于如上序列，其他可行的序列包括：
[0013] a.一种Ssp DnaB人工断裂蛋白质内含子，以及其有蛋白质剪接活性的突变体；b.一种Sce VMA人工断裂蛋白质内含子，以及其有蛋白质剪接活性的突变体；c.一种Npu DnaE断裂蛋白质内含子，以及其有蛋白质剪接活性的突变体；d.一种Ter ThyX人工断裂蛋白质内含子，以及其有蛋白质剪接活性的突变体；e.一种Ssp DnaX人工断裂蛋白质内含子，以及其有蛋白质剪接活性的突变体；f.一种Ter DnaE-3人工断裂蛋白质内含子，以及其有蛋白质剪接活性的突变体；g.一种Cne PRP8人工断裂蛋白质内含子，以及其有蛋白质剪接活性的突变体；h.一种Rma DnaB人工断裂蛋白质内含子，以及其有蛋白质剪接活性的突变体[0014] 其中，第一氨基酸序列的序列如SEQ ID NO:3所示，且第四位点为唯一的化学修饰位点，第二氨基酸序列代表一种蛋白多肽类药物的氨基酸序列。这些蛋白类多肽类药物包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人类生长激素(hGH)、人类干扰素α2b(IFNα2b)、白细胞介素-15(ILK-15)和尿酸氧化酶(UOX)。然而，本领域技术人员可以理解的是，本申请旨在提供一种具有一个且仅有一个化学修改位点的方法及对应的序列(即第一氨基酸序列)，而通过断裂蛋白内含子以及反式剪切技术与该段第一氨基酸序列连接的蛋白，则并不限于这些蛋白多肽类药物。本领域技术人员根据常规技术手段，可自由设计其他蛋白类药物，并将这些多肽与第一氨基酸序列连接。这些多肽例如为纤维蛋白原、白蛋白、红血球生成素(EPO)、人凝血因子VIII。
[0015] 其中，C-蛋白还包括组氨酸标签以及选自硫氧还蛋白(T蛋白)，麦芽糖结合蛋白(MBP蛋白)，SUMO蛋白，以及谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的标签蛋白。同时，如前所述，由于C蛋白上具有化学修饰位点，该修饰位点上可修饰有本领域常见的用于提高蛋白性能或稳定性的化学基团，包括但不限于：聚乙二醇或聚乙二醇衍生物、MMAE和DM1。从而C(前体)蛋白可被标示为H(组氨酸标签)S(标签蛋白)IC(Ssp GyrB断裂蛋白质C-段序列)-SAGC(第一氨基酸序列)-mPEG(修饰的化学基团)
[0016] 其中，N-蛋白还包括组氨酸标签，即N(前体)蛋白可被标示为G-CSF(蛋白多肽，第二氨基酸序列)-IN(Ssp GyrB断裂蛋白质N-段序列)-H(组氨酸标签)。
[0017] 本申请的第二方面，在于提供一种使用如上方法所制备得到的，具有非常优异的均一性的修饰有化学基团的蛋白。
[0018] 该蛋白质由第一氨基酸序列以及第二氨基酸序列组成，第一、第二氨基酸序列通过肽键相连接，第一氨基酸序列的序列如SEQ ID NO:3所示，且所述第四位点为化学修饰位点(且唯一)，第二氨基酸序列代表一种蛋白多肽类药物的氨基酸序列。
[0019] 如前所述，蛋白类多肽类药物包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人类生长激素(hGH)、人类干扰素α2b(IFNα2b)、白细胞介素-15(ILK-15)和尿酸氧化酶(UOX)。但本领域技术人员可以理解的是，本申请中的第二氨基酸序列并不限于此。
[0020] 其中，第四位点修饰有水溶性化合物。水溶性化合物为聚乙二醇或聚乙二醇衍生物、MMAE和DM1。
[0021] 本申请的又一方面，在于设计出一种前述C-段序列的核苷酸序列，具体如SEQ ID NO:4所示。
[0023] 图1是实施例3中C蛋白聚乙二醇化产物的SDS-PAGE(图1A为包括S蛋白，[0024] 图1C为包括T蛋白)和MALDI-TOF MS(图1B为包括S蛋白，图1D为包括T蛋白)鉴定结果。
[0025] 在图1A中，各个泳道分别为：
[0026] 泳道1:C-蛋白(HSIC-SAGC)。
[0027] 泳道2:Maleimide PEG(20kD)。
[0028] 泳道3:聚乙二醇化反应结束后的样品。
[0029] 泳道4:纯化的聚乙二醇化的C蛋白(HSIC-SAGC-mPEG)。
[0030] 在图1C中，各个泳道分别为：
[0031] 泳道1:C-蛋白(HTIC-SAGC)。
[0032] 泳道2:Maleimide PEG(20kD)。
[0033] 泳道3:聚乙二醇化反应结束后的样品。
[0034] 泳道4:纯化的聚乙二醇化的C蛋白(HTIC-SAGC-mPEG)。
[0035] 图2是实施例4中蛋白质反式剪接(protein trans-splicing)介导的粒细胞集落刺激因子(Granulocyte Colony-Stimulating Factor，G-CSF)C末端聚乙二醇化产物的SDS-PAGE(图2A)和MALDI-TOF MS(图2B)鉴定结果。
[0036] 泳道1:N-前体蛋白(G-CSF-IN-H)。
[0037] 泳道2:C-前体蛋白(HSIC-SAGC-mPEG)。
[0038] 泳道3:N-前体蛋白和C-前体蛋白剪接结束后的样品。
[0039] 泳道4:纯化的剪接产物(G-CSF-SAGC-mPEG)。
[0040] 图3是实施例5中蛋白质反式剪接(protein trans-splicing)介导的人类生长激素(human Growth Hormone,hGH)C末端聚乙二醇化产物的SDS-PAGE(图3A)和MALDI-TOF MS(图3B)鉴定结果。
[0041] 泳道1:N-前体蛋白(hGH-IN-H)。
[0042] 泳道2:C-前体蛋白(HSIC-SAGC-mPEG)。
[0043] 泳道3:N-前体蛋白和C-前体蛋白剪接结束后的样品。
[0044] 泳道4:纯化的剪接产物(hGH-SAGC-mPEG)。
[0045] 图4是实施例6中蛋白质反式剪接(protein trans-splicing)介导的白细胞介素-15(Interleukin-15，ILK-15)C末端聚乙二醇化产物的SDS-PAGE鉴定结果。
[0046] 泳道1:N-前体蛋白(ILK-15-IN-H)。
[0047] 泳道2:C-前体蛋白(HTIC-SAGC-mPEG)。
[0048] 泳道3:N-前体蛋白和C-前体蛋白剪接结束后的样品，剪接产物为ILK-15-SAGC-mPEG
[0049] 图5是实施例7中蛋白质反式剪接(protein trans-splicing)介导的尿酸氧化酶(Urate oxidase，UOX)C末端聚乙二醇化产物的SDS-PAGE(图5A)和MALDI-TOF MS(图5B)鉴定结果。
[0050] 泳道1:N-前体蛋白(UOX-IN-H)。
[0051] 泳道2:C-前体蛋白(HSIC-SAGC-mPEG)。
[0052] 泳道3:N-前体蛋白和C-前体蛋白剪接结束后的样品。
[0053] 泳道4:纯化的剪接产物(UOX-SAGC-mPEG)。
[0054] 图6是实施例8中蛋白质反式剪接(protein trans-splicing)介导的干扰素α2b(interferonα2b，IFNα2b)C末端聚乙二醇化产物的SDS-PAGE(图6A)和MALDI-TOF MS(图6B)鉴定结果。
[0055] 泳道1:N-前体蛋白(IFNα2b-IN-H)。
[0056] 泳道2:C-前体蛋白(HSIC-SAGC-mPEG)。
[0057] 泳道3:N-前体蛋白和C-前体蛋白剪接结束后的样品。
[0058] 泳道4:纯化的剪接产物(IFNα2b-SAGC-mPEG)。
具体实施方式
[0059] 实施例1：制备C蛋白
[0060] 我们选择基因工程改造后的Ssp GyrB断裂蛋白质内含子用于构建C-蛋白。C-蛋白属于融合蛋白，它在本实施例中依次包含6×组氨酸标签，SUMO蛋白(SUMO,Small Ubiquitin-like Modifier protein)，SG(Ssp GyrB)蛋白质内含子的C段(SGsplit IC,SEQ ID NO:1)，以及只包含一个半胱氨酸的氨基酸序列SAGC(即第一氨基酸序列，SEQ ID NO:3)。此外，C-蛋白的另一选择是依次包含6×组氨酸标签，硫氧还蛋白(T蛋白)，SG(Ssp GyrB)蛋白质内含子的C段(SGsplit IC,SEQ ID NO:1)，以及只包含一个半胱氨酸的氨基酸序列SAGC(即第一氨基酸序列，SEQ ID NO:3)。当然，本领域技术人员可以理解的是，其他标签蛋白的选择还有麦芽糖结合蛋白(MBP蛋白)以及谷胱甘肽巯基转移酶(GST)等。
[0061] 具体来说，6×组氨酸标签用于C-蛋白的亲和层析纯化。SUMO蛋白或T蛋白用于提高C-蛋白的表达量和改善C-蛋白的可溶性。SG蛋白质内含子的C段(SGsplit IC)在后续的例4至例8中，与N段相互结合，并发生蛋白质反式剪接反应。SAGC被视为“蛋白质外显子”，剪接反应结束后会被连接到另一个“外显子”的C末端。其中，S会参与蛋白质反式剪接反应，是剪接反应中必需的原件。C用于修饰巯基活性的化学基团。AG作为一段氨基酸序列将S和C分隔开来，防止化学基团影响蛋白质反式剪接反应。
[0062] C-蛋白的核苷酸序列被克隆到PET-28载体中，即pE-HS(或T)IC-SAGC。用标准的转化方法，将质粒pE-HS(或T)IC-SAGC转化到BL21(DE3)感受态细胞中。将含有目的质粒的菌落转移到LB(10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl/L，50μg/mL)培养基中。在37℃摇床中培养6h，按1：100(v/v)接种于LB培养基中。培养致A600约0.6，加入终浓度为0.1～0.8mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside,IPTG)，16～25℃诱导12h。C-蛋白(HSIC-SAGC)采用Ni2+-NTA琼脂糖柱(Qiagen)纯化。首先通过离心(6000r/min，10min)收集菌体。用lysis buffer(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mM imidazole，pH 8.0)将菌体重悬，利用French Press(14,000PSI)破碎菌体。低温离心(15000r/min，
30min)，收集上清。将上清倒入Ni2+-NTA琼脂糖柱中，用Wash buffer(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM imidazole，pH 8.0)充分洗涤。用Elution buffer(250mM NaH2PO4，300mM NaCl，
250mM imidazole，pH 8.0)洗脱C-蛋白(HS(或T)IC-SAGC)。
30min)，收集上清。将上清倒入Ni2+-NTA琼脂糖柱中，用Wash buffer(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM imidazole，pH 8.0)充分洗涤。用Elution buffer(250mM NaH2PO4，300mM NaCl，
250mM imidazole，pH 8.0)洗脱C-蛋白(HS(或T)IC-SAGC)。
[0063] 实施例2：制备制备N-蛋白
[0064] 为了验证方法的通用性，分别将多种蛋白质多肽类药物被当作目标蛋白。这些蛋白多肽类药物包括粒细胞集落刺激因子(Granulocyte Colony-Stimulating Factor,G-CSF)、人类生长激素(human Growth Hormone,hGH)、人类干扰素α2b(interferon-α2b,IFNα2b)、白细胞介素-15(Interleukin 15,ILK-15)和尿酸氧化酶(Urate Oxidase,UOX)。各种上述蛋白质多肽类药物(即第二氨基酸序列，具体序列可见序列表中的SEQ ID NO:6-10)依次与蛋白质内含子的N片段(SGsplit IN)(SEQ ID NO:2)和6×His标签融合表达，即N蛋白(NdrugINH)。
[0065] 每个N-蛋白的核苷酸序列都被克隆到PET-28载体中，即pE-NdrugINH。按照标准的转化方法，分别将各种NdrugINH转化到BL21(DE3)感受态细胞中。将含有目的质粒的菌落转移到LB(10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl/L，50μg/mL)培养基中。在37℃摇床中培养6h，按1：100(v/v)接种于LB培养基中。培养致A600约0.6，加入终浓度为0.2～0.8mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside,IPTG)，16～25℃诱导12h。所有N-蛋白(NdrugINH)均采用Ni2+-NTA琼脂糖柱(Qiagen)纯化。首先通过离心(6000r/min，
10min)收集菌体。用lysis buffer(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mM imidazole，pH 8.0)将菌体重悬，利用French Press(14,000PSI)破碎菌体。低温离心(15000r/min，30min)，收集
2+
上清。将上清倒入Ni -NTA琼脂糖柱中，用Wash buffer(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM imidazole，pH 8.0)充分洗涤。用Elution buffer(250mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM imidazole，pH 8.0)洗脱N-蛋白(NdrugINH)。
10min)收集菌体。用lysis buffer(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mM imidazole，pH 8.0)将菌体重悬，利用French Press(14,000PSI)破碎菌体。低温离心(15000r/min，30min)，收集
2+
上清。将上清倒入Ni -NTA琼脂糖柱中，用Wash buffer(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM imidazole，pH 8.0)充分洗涤。用Elution buffer(250mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM imidazole，pH 8.0)洗脱N-蛋白(NdrugINH)。
[0066] 实施例3：C-蛋白的聚乙二醇化及纯化
[0067] C-蛋白的聚乙二醇化及纯化的示意图如图1所示。首先将实施例1中得到的C-蛋白(HS(或T)IC-SAGC)透析到标记缓冲液(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH 7.3)中,并加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP)致终浓度为1～10mM。加入巯基活性的聚乙二醇(PG1-ML-20k，NANOCS)，聚乙二醇与蛋白的摩尔比为3～10：1，室温放置2.5～12h。标记反应结束后，加入二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)致终浓度为1～10mM。由于在C-蛋白(HS(或T)IC-SAGC)中只存在一个半胱氨酸，所以带有巯基活性官能团的PEG被修饰到C-蛋白(HS(或T)IC-SAGC)的特定位点上，形成C-前体蛋白(HS(或T)IC-SAGC-mPEG)。用SDS-PAGE胶检测聚乙二醇修饰物(如图1A，C所示)。
[0068] 为了从上述修饰反应的混合物中纯化得到C-前体蛋白(HS(或T)IC-SAGC-mPEG)，混合物被加入到阴离子交换柱中(1×10cm)，随后进行洗脱。洗脱缓冲液为含有30～400mM NaCl的Tris缓冲液(pH＝7.0)，收集修饰产物的洗脱峰。分别用SDS-PAGE胶和MALDI-TOF-MS对修饰产物进行鉴定(如图1所示)。
[0069] C-蛋白的聚乙二醇化和C前体蛋白的纯化结果如图1B，D所示，在图中可以看出在修饰反应结束后，形成了一个分子量更大的条带，这说明C-蛋白成功的被PEG(PG1-ML-20k，NANOCS)修饰。并且MALDI-TOF-MS的结果再一次证明了这一点。
[0070] 实施例4：蛋白质反式剪接(protein trans-splicing)介导的粒细胞集落刺激因子(Granulocyte Colony-Stimulating Factor，G-CSF)C末端聚乙二醇化。
[0071] 为了实现粒细胞集落刺激因子(Granulocyte Colony-Stimulating Factor，G-CSF)C末端聚乙二醇化，实施例2中纯化得到的N-蛋白(G-CSFIN-H)与实施例3中的C-前体蛋白(HSIC-SAGC-mPEG)按照摩尔比为1：1混合。将混合物透析至剪接buffer中(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,1mM DTT,1mM EDTA,pH＝8.0)，在4～25℃条件下孵育过夜。在剪接反应之前和之后分别取样，并采用SDS-PAGE胶检测蛋白质反式剪接反应。
[0072] 为了从上述蛋白质反式剪接反应的混合物中纯化得到剪接产物(G-CSF-SAGC-mPEG)，混合物被加入到阴离子交换柱中(1×10cm)，随后进行洗脱。洗脱缓冲液为含有30～400mM NaCl的Tris缓冲液(pH＝8.0)，收集修饰产物的洗脱峰。分别用SDS-PAGE胶和MALDI-TOF-MS对修饰产物进行鉴定(如图2所示)。
[0073] 蛋白质反式剪接介导的粒细胞集落刺激因子C末端聚乙二醇化和剪接产物的纯化结果如图2A所示，在图中可以看出在蛋白质反式剪接反应结束后，形成了3个新条带，从这些条带的分子量大小可以判断出这几个新条带分别是剪接产物(G-CSF-SAGC-mPEG)和包括蛋白质内含子的N,C片段(INH和HSIC)，这说明成功的发生了蛋白质反式剪接。并且MALDI-TOF-MS的结果再一次证明了这一点。通过分析SDS-PAGE图中C-蛋白条带密度在蛋白质反式剪接反应前后的变化，计算出有80％的粒细胞集落刺激因子被PEG定点修饰。
[0074] 实施例5：蛋白质反式剪接(protein trans-splicing)介导的人类生长激素(human Growth Hormone,hGH)C末端聚乙二醇化。
[0075] 为了实现人类生长激素(human Growth Hormone,hGH)C末端聚乙二醇化，实施例2中纯化得到的N-蛋白(hGH-IN-H)与实施例3中的C-前体蛋白(HSIC-SAGC-mPEG)按照摩尔比为1：1混合。将混合物透析至剪接buffer中(20mM Tris-HCl,pH 8.0,150mM NaCl,1mM DTT,1mM EDTA)，在4～25℃条件下孵育过夜。在剪接反应之前和之后分别取样，并采用SDS-PAGE胶检测蛋白质反式剪接反应。
[0076] 为了从上述蛋白质反式剪接反应的混合物中纯化得到剪接产物(hGH-mPEG)，混合物被加入到阴离子交换柱中(1×10cm)，随后进行洗脱。洗脱缓冲液为含有30～400mM NaCl的Tris缓冲液(pH＝8.0)，收集修饰产物的洗脱峰。分别用SDS-PAGE胶和MALDI-TOF-MS对修饰产物进行鉴定(如图3所示)。
[0077] 蛋白质反式剪接介导的人类生长激素C末端聚乙二醇化和剪接产物的纯化结果如图3A所示，在图中可以看出在蛋白质反式剪接反应结束后，形成了3个新条带，从这些条带的分子量大小可以判断出这几个新条带分别是剪接产物(hGH-SAGC-mPEG)和包括蛋白质内含子的N,C片段(INH和HSIC)，这说明成功的发生了蛋白质反式剪接。并且MALDI-TOF-MS的结果再一次证明了这一点。通过分析SDS-PAGE图中C-蛋白条带密度在蛋白质反式剪接反应前后的变化，计算出有85％的人类生长激素被PEG定点修饰。
[0078] 实施例6：蛋白质反式剪接(protein trans-splicing)介导的白细胞介素-15(Interleukin-15，ILK-15)C末端聚乙二醇化。
[0079] 为了实现白细胞介素-15(Interleukin-15，ILK-15)C末端聚乙二醇化，实施例2中纯化得到的N-蛋白(ILK-15-IN-H)与实施例3中的C-前体蛋白(HTIC-SAGC-mPEG)按照摩尔比为1：1混合。将混合物透析至剪接buffer中(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,1mM DTT,1mM EDTA,pH＝8.0)，在4～25℃条件下孵育过夜。在剪接反应之前和之后分别取样，并采用SDS-PAGE胶检测蛋白质反式剪接反应。
[0080] 蛋白质反式剪接介导的白细胞介素-15C末端聚乙二醇化和剪接产物的纯化结果如图4所示，在图中可以看出在蛋白质反式剪接反应结束后，形成了3个新条带，从这些条带的分子量大小可以判断出这几个新条带分别是剪接产物(ILK-15-SAGC-mPEG)和包括蛋白质内含子的N,C片段(INH和HTIC)，这说明成功的发生了蛋白质反式剪接。通过分析SDS-PAGE图中C-蛋白条带密度在蛋白质反式剪接反应前后的变化，计算出有65％的白细胞介素-15被PEG定点修饰。
[0081] 实施例7：蛋白质反式剪接(protein trans-splicing)介导的尿酸氧化酶(Urate oxidase，UOX)C末端聚乙二醇化。
[0082] 为了实现尿酸氧化酶(Urate oxidase，UOX)C末端聚乙二醇化，实施例2中纯化得到的N-蛋白(UOX-IN-H)与实施例3中的C-前体蛋白(HSIC-SAGC-mPEG)按照摩尔比为1：1混合。将混合物透析至剪接buffer中(20mM Tris-HCl,pH 8.0,150mM NaCl,1mM DTT,1mM EDTA)，在4～25℃条件下孵育过夜。在剪接反应之前和之后分别取样，并采用SDS-PAGE胶检测蛋白质反式剪接反应。
[0083] 为了从上述蛋白质反式剪接反应的混合物中纯化得到剪接产物(UOX-SAGC-mPEG)，混合物被加入到阴离子交换柱中(1×10cm)，随后进行洗脱。洗脱缓冲液为含有30～400mM NaCl的Tris缓冲液(pH＝8.0)，收集修饰产物的洗脱峰。分别用SDS-PAGE胶和MALDI-TOF-MS对修饰产物进行鉴定(如图5所示)。
[0084] 蛋白质反式剪接介导的尿酸氧化酶C末端聚乙二醇化和剪接产物的纯化结果如图5A所示，在图中可以看出在蛋白质反式剪接反应结束后，形成了3个新条带，从这些条带的分子量大小可以判断出这几个新条带分别是剪接产物(UOX-SAGC-mPEG)和包括蛋白质内含子的N,C片段(INH和HSIC)，这说明成功的发生了蛋白质反式剪接。并且MALDI-TOF-MS的结果再一次证明了这一点。通过分析SDS-PAGE图中C-蛋白条带密度在蛋白质反式剪接反应前后的变化，计算出有95％的尿酸氧化酶被PEG定点修饰。
[0085] 实施例8：蛋白质反式剪接(protein trans-splicing)介导的干扰素α2b(interferonα2b，IFNα2b)C末端聚乙二醇化。
[0086] 为了实现干扰素α2b(interferonα2b，IFNα2b)C末端聚乙二醇化，实施例2中纯化得到的N-蛋白(IFNα2b IN-H)与实施例3中的C-前体蛋白(HSIC-SAGC-mPEG)按照摩尔比为1：1混合。将混合物透析至剪接buffer中(20mM Tris-HCl,pH 8.0,150mM NaCl,1mM DTT,1mM EDTA)，在4～25℃条件下孵育过夜。在剪接反应之前和之后分别取样，并采用SDS-PAGE胶检测蛋白质反式剪接反应。
[0087] 为了从上述蛋白质反式剪接反应的混合物中纯化得到剪接产物(IFNα2b-SAGC-mPEG)，混合物被加入到阴离子交换柱中(1×10cm)，随后进行洗脱。洗脱缓冲液为含有30～400mM NaCl的Tris缓冲液(PH 8.0)，收集修饰产物的洗脱峰。分别用SDS-PAGE胶和MALDI-TOF-MS对修饰产物进行鉴定(如图6所示)。
[0088] 蛋白质反式剪接介导的干扰素α2bC末端聚乙二醇化和剪接产物的纯化结果如图6A所示，在图中可以看出在蛋白质反式剪接反应结束后，形成了3个新条带，从这些条带的分子量大小可以判断出这几个新条带分别是剪接产物(IFNα2b-SAGC-mPEG)和包括蛋白质内含子的N,C片段(INH和HSIC)，这说明成功的发生了蛋白质反式剪接。并且MALDI-TOF-MS的结果再一次证明了这一点。通过分析SDS-PAGE图中C-蛋白条带密度在蛋白质反式剪接反应前后的变化，计算出有95％的干扰素α2b被PEG定点修饰。
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