一种用于泪道栓塞的原位可注射温敏响应水溶性壳聚糖复合
水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 干眼病(dry eye disease)是由于先天性泪腺发育不全、沙眼及眼
角膜硬化等多种病因引起的泪膜
稳定性下降、泪液质或量异常等病状的眼部
疾病。该病发生的实质是泪膜中杯状细胞数量及
密度的减少,引起泪液分泌的质或量发生改变。临床症状主要为眼睛干涩、发痒等,症状长期累积会使得患者的角结膜发生深层病变,严重时引起视
力下降。流行病学调查结果表明,干眼病的患病率与地域、职业、年龄及性别相关,如亚洲人种发病率较高,以视频终端为职业如教师、职员与司机患病率较高。研究发现,干眼症患者会形成一种恶性循环,即泪液分泌减少→眼表敏感性下降→泪腺对眼表刺激的反应降低→泪液分泌减少。干眼病临床
治疗方法有人工泪液代替、手术移植及泪道栓塞植入等。在人工泪液研究中,景彩虹等发现卡波姆凝胶在眼表滞留时间较长,能有效缓解干眼症状;Matsuo等发现海藻糖眼药水能稳定角结膜上皮细胞的磷脂双分子层结构,增加结膜杯状细胞的密度,增强角结膜上皮细胞耐受干燥环境的能力。尽管如此,人工泪液在临床应用种存在的主要问题是:不能稳定维持眼表所需泪液生理量,制剂所含
抗菌剂和
防腐剂会加重眼表损害、频繁使用可降低患者的治疗
顺应性等。1998年,Murube等首次提出通过移植唇部小涎腺治疗干眼症,随后Geer-ling等也开展了相似研究。随访多例唇腺移植术治疗的干眼症患者,发现手术移植的腺体依然成活,患者的泪液分泌增加,紊乱的眼表结构得到改善,但是这种手术成功率极低。
[0003] 目前,疗效最为显著的
治疗方案是泪道栓塞术,采用微尺寸泪道栓对泪点栓塞后,可以增加自然泪液对眼表提供较长久的滋润;同时,增加的自然泪液能刺激泪液分泌和促进杯状细胞存活,从而增加泪膜的稳定性;通过栓塞泪道还可以减少药物流失,减少用药次数。在泪道栓塞术治疗中如果发生溢泪或其他并发症时,可以随时取出栓子,避免传统手术的不可逆性。对泪道栓的研究,始于20世纪初,1961年Foulds利用不可降解的凝胶内
植物对泪小管进行了阻塞,到1975年,Freeman设计的Freeman Plug成为以后泪道栓的制备
原型,目前国外品牌的泪道栓有:SmartPlugTM、Form FitTM、Snug PlugsTM、Soft PlugTM、Tears NaturaleTM ExtendTM、 等。目前,我国临床治疗干眼病所使用的泪道栓塞产品全部依赖进口,价格昂贵,极大增加了患者的经济负担。另外,基于欧美人群设计的进口泪道栓产品不能完全适应亚洲人群的眼睛解剖特征,在临床应用中经常存在栓子移位或脱落导致手术失败问题。
[0004] 因此,研制具有我国自主知识产权的、泪道栓塞效果良好、成本适中的泪道栓产品,具有重要意义和开发价值。
发明内容
[0005] 为了克服上述
现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种用于泪道栓塞的原位可注射温敏响应水溶性壳聚糖复合水凝胶及其制备方法和应用,该复合水凝胶在室温下流动性好,通过对环境
温度的响应发生凝胶化,该凝胶形状、尺寸均可控,具有较好的
生物相容性,抑菌性,低的毒
副作用;该制备方法原料价廉易得,反应条件温和、操作简便,栓塞性能稳定;该复合水凝胶能够作为治疗干眼症的药物应用。
[0006] 为了达到上述目的,本发明采用以下技术方案予以实现:
[0007] 本发明公开了一种用于泪道栓塞的原位可注射温敏响应水溶性壳聚糖复合水凝胶,以
质量百分比计,所述用于泪道栓塞的原位可注射温敏响应水溶性壳聚糖复合水凝胶中含有由以下原料:
[0008] 水溶性壳聚糖1%~15%、甘油
磷酸钠4%~10%、海藻酸盐1%~5%,氯化
钙0.03%~0.1%。
[0009] 优选地,所述水溶性壳聚糖的分子量为100000~200000,取代度为70%~95%。
[0010] 优选地,所述水溶性壳聚糖选用羧甲基壳聚糖、壳聚糖季铵盐或壳聚糖
盐酸盐。
[0011] 优选地,所述甘油磷酸钠选用β-甘油磷酸钠、α-甘油磷酸钠或αβ-甘油磷酸钠。
[0012] 优选地,海藻酸盐采用海藻酸钠或海藻酸钙。
[0013] 优选地,
氯化钙采用无水氯化钙或二水氯化钙。
[0014] 本发明还公开了上述的用于泪道栓塞的原位可注射温敏响应水溶性壳聚糖复合水凝胶的制备方法,包括以下步骤:
[0015] 1)按计量配比称取各原料,先将水溶性壳聚糖溶于去离子水中配制成水溶性壳聚糖水溶液;
[0016] 2)将甘油磷酸钠溶于去离子水中配制成甘油磷酸钠水溶液;
[0017] 3)将步骤1)制得的水溶性壳聚糖水溶液和步骤2)制得的甘油磷酸钠水溶液按1:(0.6~1.2)的体积比充分混合均匀,制得混合溶液A,然后向混合溶液A中加入海藻酸盐,搅拌使其充分溶解,制得混合溶液B;
[0018] 4)将氯化钙溶于去离子水中配制成氯化钙水溶液,将制得的氯化钙水溶液加入步骤3)制得的混合溶液B中,充分搅拌均匀,得到混合溶液C;
[0019] 5)将混合溶液C移入模具中,于35~39℃下进行凝胶化处理,制得用于泪道栓塞的原位可注射温敏响应水溶性壳聚糖复合水凝胶。
[0020] 优选地,步骤1)中,水溶性壳聚糖占所述水溶性壳聚糖水溶液的质量百分比为4%~15%;步骤2)中,甘油磷酸钠占所述甘油磷酸钠水溶液的质量百分比为8%~20%;步骤4)中,氯化钙占所述氯化钙水溶液的质量百分比为0.5%~5%。
[0021] 本发明还公开了上述的用于泪道栓塞的原位可注射温敏响应水溶性壳聚糖复合水凝胶在制备治疗干眼症的药物中的应用。
[0022] 优选地,所述药物为利用所述的原位可注射温敏响应水溶性壳聚糖复合水凝胶堵塞泪小管缓解干眼症的药物。
[0023] 优选地,该用于泪道栓塞的原位可注射温敏响应水溶性壳聚糖复合水凝胶室温下为具有流动性的液态溶胶,且对生理温度具有敏感响应的凝胶
相变特性,能够在泪道中发生凝胶化相转
变形成原位凝胶化栓塞。
[0024] 与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
[0025] 本发明公开的用于泪道栓塞的原位可注射温敏响应水溶性壳聚糖复合水凝胶在室温下为具有流动性的液态溶胶,该复合水凝胶材料利用水溶性壳聚糖和甘油磷酸钠复合物在生理温度下的敏感响应特性,向该体系中加入氯化钙与海藻酸盐来改变其溶胶-凝胶相转变速率及机械强度等,体外通过泪小点注射将流动性的溶胶置入泪道中,溶胶体系通过对温度的变化响应发生凝胶化转变,该方法操作手术
费用较低、对患者的创伤较小、且溶胶可填充任意形状及大小的泪道腔、抑菌性能较好且毒副作用低,对于干眼症患者有很好的缓解治疗作用。
[0026] 本发明公开的上述复合水凝胶的制备方法成本低廉,操作简单,反应条件温和,可以根据需求填充任意形状及大小的泪道腔,从而达到缓解治疗干眼症患者病症的目的。
[0027] 进一步地,该用于泪道栓塞的原位可注射温敏响应水溶性壳聚糖复合水凝胶室温下为具有流动性的液态溶胶,且对生理温度具有敏感响应的凝胶相变特性,能够在泪道中发生凝胶化相转变形成原位凝胶化栓塞。
附图说明
[0028] 图1为本发明的样品制备的实验
流程图;
[0029] 图2为壳聚糖季铵盐(HTCC)-GP凝胶化机理图;
[0030] 图3为Na-Alg-Ca2+的凝胶化机理图;
[0031] 图4为HTCC-GP与Na-Alg-Ca2+的凝胶化机理图;
[0033] 图6为凝胶化后的聚合物形态照片;
[0034] 图7为HTCC浓度对凝胶化时间的影响结果图;
[0035] 图8为凝胶截面的微观结构(100×)图;
[0036] 图9为凝胶对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌活性抑制的结果图;
[0037] 图10为水凝胶泪道栓对兔眼下泪河高度的影响结果图;
[0038] 图11为未置入水凝胶栓塞的兔右眼结膜印记细胞检查图;
[0039] 图12为置入水凝胶栓塞的兔右眼结膜印记细胞检查图。
具体实施方式
[0040] 为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案,下面将结合本发明
实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本发明保护的范围。
[0041] 需要说明的是,本发明的
说明书和
权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象,而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换,以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外,术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形,意图在于
覆盖不排他的包含,例如,包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元,而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
[0042] 下面结合附图对本发明做进一步详细描述:
[0043] 实施例1
[0044] 参见图1,为本发明的实验流程,具体方法如下:准确称取6wt%的HTCC粉末溶于去离子水中配制得到HTCC)水溶液,同理制备得到14wt%的β-甘油磷酸钠(GP)水溶液,将体积比为1:0.7的HTCC水溶液与GP水溶液混合搅拌均匀,之后向上述的HTCC-GP混合水溶液中加入2%的Na-Alg粉末,充分搅拌溶解。向实施例1的HTCC-GP-Na-Alg混合水溶液中加入3%的CaCl2水溶液,搅拌均匀后移入模具中,将模具置于37℃的恒温水浴锅中,使其发生凝胶化转变为水凝胶。
[0045] 凝胶化过程中的机理如图2、图3及图4,图2为HTCC-GP的凝胶化机理图,室温下水分子在HTCC长链上通过氢键的结合形成一层水膜;GP分子的加入使得体系具有温度敏感性,GP分子中带有负电荷的磷酸基团不仅与HTCC分子上带正电的季
氨基基团间有静电相互作用,还通过与HTCC分子上部分质子化的氨基通过静电相互作用相结合,使得HTCC长链上附着较多的GP分子。GP分子中,由于
电子的诱导效应磷酸基团相邻的C
原子带正电荷,C原子相连的O原子带有负电荷,与O原子相连的H原子带有正电荷。附着在HTCC链上GP分子间带负电荷的O原子与另一分子GP带正电的H原子之间形成更加稳定的氢键。
[0046] 图3为Na-Alg-Ca2+凝胶化机理图,1个Ca2+与Na-Alg分子链段中2个古罗糖
醛酸(G单元)G
片段通过4个配位键形成配合物,即“蛋格”结构(图3)。图4为HTCC-GP体系与Na-Alg-Ca2+体系通过随机互穿形成互穿网络结构。
[0047] 实施例2
[0048] 将实施例1的HTCC-GP-Na-Alg-Ca2+混合水溶液移入西林瓶中,结果从图5中可以看出,室温下为具有流动性的混合溶液,在37℃下发生凝胶化后得到失去流动性的用于泪道栓塞的原位可注射温敏响应壳聚糖季铵盐复合水凝胶(图6)。
[0049] 实施例3
[0050] 将1wt%、3wt%、5wt%、7wt%及9wt%的HTCC粉末分别溶于去离子水中配制得到HTCC水溶液,同理配制得到15%的GP水溶液,按体积比为1:0.8配制HTCC-GP混合水溶液,将其移入模具中,经37℃下发生凝胶化得到用于泪道栓塞的原位可注射温敏响应壳聚糖季铵盐水凝胶,并通过实施例1中的试管倒置法体系失去流动性的现象来观测其凝胶化时间,具体的实施方法为:将装有相同配方的平行西林瓶置于37℃的恒温中,每隔10s用秒表计时将西林瓶倾斜,观察体系的流动现象,若倾斜后体系失去流动性或液面没有发生变化时,将此时间记为凝胶的相转化时间。观察组分HTCC浓度变化对凝胶化时间的影响(图7),从图7可知凝胶化时间随着HTCC浓度的增加先缩短后增长,说明由体系的凝胶化时间判断出该体系的HTCC浓度有最适値,进而说明该体系可通过调整组分的比例浓度从而达到调节凝胶化速率的目的。
[0051] 实施例4
[0052] 将实施例3中制备得到的样品进行
冷冻干燥,取干燥后的凝胶样品的截面,喷金后通过扫描电子
显微镜来观察HTCC凝胶样品的微观形貌(图8扫描电镜图(×100)),图8可以观察到HTCC水凝胶具有三维网状多孔结构,该结构使得较多的小分子的运动不受阻碍,从而不影响人体正常的生理代谢。
[0053] 实施例5
[0054] 将实施例3中制备得到的HTCC-GP-Na-Alg-Ca2+混合水溶液注入边长为1cm的模具中,然后将其置于37℃恒温中一段时间后取出凝胶。通过万能材料试验机在一定的压缩速率下压缩凝胶样品至原始尺寸的70%,得到压缩
弹性模量分别为53kPa,51.9kPa,52.4kPa,压缩弹性模量数值可以用来代表凝胶样品的机械强度,进而说明在人体泪小管振动或收缩时HTCC水凝胶具有足够的机械强度保持其在泪小管中稳定存在。
[0055] 实施例6
[0056] 取1g Yeast extract、0.5g Tpyptone和1g NaCl粉末加到100mL蒸馏水中搅拌溶解制备得到液体培养基,然后将液体培养基放入立式压力
蒸汽灭菌器中121℃下灭菌30min,然后将液体培养基放在超净
工作台待用。
[0057] 将大肠杆菌与金黄色葡萄球菌分别用无菌接种针接种到2个灭菌后的液体培养基中,在恒温
振荡器中37℃培养24h,然后放到-4℃的
冰箱中待用。
[0058] 将实施例5制备得到的水凝胶切成形状大小均相等的凝胶薄片,分别称量重量使其各片重量近似相同,将样品在紫外灯下照射灭菌30min(两面均要灭菌)。向50mL的无菌锥形瓶中加入20mL的灭菌后的培养液和0.1mL的菌液,然后再分别加入凝胶薄片样品并分别做标记,留一瓶不加样品和菌液的做空白样,然后放入37℃的恒温振荡器中培养24小时,在紫外分光光度计上650nm分别测量各样品的吸光度值。测试结果如图9所示,HTCC水凝胶在不同时刻下对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的活性均有抑制作用,且随着时间的增长,HTCC凝胶对于细菌的抑制效果随着时间的延长而趋于稳定。
[0059] 实施例7
[0060] 将实施例3制备得到的各原料水溶液均通过无菌过滤混合得到HTCC-GP-Na-Alg-Ca2+混合水溶液,用灭菌之后的
注射器吸取一定量的混合溶液。
[0061] 选择3只角膜及结膜等未发生病变或
炎症的新西兰大白兔,采取自身对照,通过向结膜囊内滴加
荧光素溶液探索新西兰大白兔的泪道是否通畅,剔除泪道有阻碍的新西兰大白兔。通过泪小点注射将HTCC混合水溶液置入右眼泪道中,左眼泪道做对照,注射后HTCC混合水溶液先充满泪道,之后对温度变化的响应发生凝胶化堵塞泪道。植入一段时间后,通过眼前节相干光
断层扫描仪(AS-OCT)对兔眼的下泪河高度进行检测分析,结果如图10所示,从图10看出兔眼的下泪河高度随着植入水凝胶栓塞所增高,且与自身对照的左眼的下泪河高度相比较高,31天后实验组的泪河高度为286μm,仍高于未植入前的泪河高度,所以可以得到植入HTCC水凝胶后,兔眼的泪液积累量增多进而达到缓解治疗干眼症的效果。
[0062] 实施例8
[0063] 将实施例3制备得到的各原料水溶液均通过无菌过滤混合得到HTCC-GP-Na-Alg-Ca2+混合水溶液,用灭菌之后的注射器吸取一定量的混合溶液。
[0064] 选择3只角膜及结膜等未发生病变或炎症的新西兰大白兔,采取自身对照,通过向结膜囊内滴加荧光素溶液探索新西兰大白兔的泪道是否通畅,剔除泪道有阻碍的新西兰大白兔。
[0065] 通过泪小点注射将HTCC混合水溶液置入右眼泪道中,左眼泪道做对照,注射后HTCC混合水溶液先充满泪道,之后对温度变化的响应发生凝胶化堵塞泪道。一段时间后通过结膜印迹细胞学检查(CIC)观测兔眼的泪膜黏液层的病理变化情况。首先用卡因将兔眼开睑,用
醋酸纤维滤纸印取结膜上皮细胞,将其置入10%福尔
马林中;经过PAS
染色、脱水干燥后
光学显微镜下观察。未置入水凝胶栓塞兔右眼的结膜印迹细胞检查图(图11)与置入水凝胶栓塞兔右眼的结膜印迹细胞检查图(图12)相比较抽样区的结膜杯状细胞变多,均存在,大量的中性粒细胞及嗜酸性粒细胞,胞浆内有少量的包涵体,可见少量核线。所以可得出置入水凝胶泪道栓后对于兔眼结膜杯状细胞的增殖有促进作用,且无炎症反应。
[0066] 以上内容仅为说明本发明的技术思想,不能以此限定本发明的保护范围,凡是按照本发明提出的技术思想,在技术方案
基础上所做的任何改动,均落入本发明权利要求书的保护范围之内。